Giá trị của kỹ thuật multiplex realtime pcr phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ thường gặp ở trẻ em
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (8.36 MB, 102 trang )
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN THẾ ANH
GIÁ TRỊ CỦA KỸ THUẬT MULTIPLEX REALTIME-PCR
PHÁT HIỆN CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG
NÃO MỦ THƯỜNG GẶP Ở TRẺ EM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC
Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2020
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------
NGUYỄN THẾ ANH
GIÁ TRỊ CỦA KỸ THUẬT MULTIPLEX REALTIME-PCR
PHÁT HIỆN CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG
NÃO MỦ THƯỜNG GẶP Ở TRẺ EM
Chuyên nghành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
Mã số : 8720601
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Người hướng dẫn thứ I: TS.BS. Hà Mạnh Tuấn
Người hướng dẫn thứ II: PGS.TS.BS. Phùng Nguyễn Thế Nguyên
Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2020
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các tài
liệu trích dẫn, các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và tuân theo
đúng yêu cầu của một luận văn nghiên cứu. Luận văn này là duy nhất và chưa
từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả luận văn
NGUYỄN THẾ ANH
.
.
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................ i
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH .............................................................. iii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Bệnh Viêm màng não mủ ................................................................................. 4
1.2. Các vi khuẩn gây bệnh VMNM thường gặp ở trẻ em .................................... 13
1.3. Sơ lược về kỹ thuật PCR ................................................................................ 34
1.4. Các nghiên cứu liên quan ............................................................................... 43
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................ 45
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 45
2.2. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 45
2.3. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 45
2.4. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................................ 45
2.5. Cỡ mẫu ........................................................................................................... 45
2.6. Tiêu chuẩn chọn mẫu...................................................................................... 46
2.7. Tổ chức thực hiện nghiên cứu ........................................................................ 46
2.8. Vật liệu và quy trình thực hiện realtime PCR ................................................ 48
2.9. Các biến số trong nghiên cứu. ........................................................................ 58
2.10. Phân tích, xử lý số liệu và đánh giá kết quả. ................................................ 58
2.11. Đạo đức trong nghiên cứu. ........................................................................... 60
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 61
3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu .............................................................................. 61
3.2. Xét nghiệm phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não mủ ................................ 63
3.3. So sánh kết quả các kỹ thuật xét nghiệm với kết quả m-qPCR...................... 66
3.4. Giá trị chẩn đoán phát hiện vi khuẩn của m-qPCR khi tham chiếu với kết quả
Cấy
.................................................................................................................... 67
.
.
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................. 69
4.1. Các đặc điểm dịch tễ, dịch não tủy và các loại vi khuẩn gây VMNM ........... 69
4.2. Đánh giá giá trị chẩn đoán của xét nghiệm Multiplex realtime PCR ............. 71
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 76
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 77
.
.
i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Tiếng Anh
1.
Chữ viết tắt
Từ nguyên
BAP
Blood agar plate
2.
CAP
Chocolate agar plate
3.
CIE
Counterimmunoelectrophoresis
4.
Ct
Threshold cycle
5.
CTA
Cystine trypticase agar
6.
CSF
Cerebrospinal fluid
7.
DNA
Deoxyribonucleic Acid
8.
EC K1
Escherichia coli K1
9.
EQAs
External Quality assessment scheme
10.
Hib
Haemophilus influenzae
11.
LM
Listeria monocytogenes
12.
m-qPCR
Multiplex realtime PCR
13.
MTM
Modified Thayer-Martin
14.
NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide
15.
Nm
Neisseria meningitidis
16.
Pneu
Streptococcus pneumoniae
17.
PCR
Polymerase Chain Reaction
18.
QC
Quality Control
19.
CDTS
Chọc dò tủy sống
20.
DNT
Dịch não tủy
21.
KTC
Khoảng tin cậy
22.
TPV
Tứ phân vị
23.
TV
Trung vị
24.
VMN
Viêm màng não
24.
VMNM
Viêm màng não mủ
Tiếng Việt
.
.
ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Điều trị ban đầu ở trẻ em ................................................................ 11
Bảng 1.2. Liều kháng sinh điều trị khi chức năng gan thận bình thường ....... 12
Bảng 1.3. Định danh Haemophilus influenzae bằng nhu cầu hemin và NAD đối
với sự tăng trưởng và sự ly giải máu ngựa...................................................... 15
Bảng 1.4. Đặc tính sử dụng carbohydrat của các lồi Nesseria ...................... 20
Bảng 2.1. Danh mục thuốc thử........................................................................ 52
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt .................................................................................... 56
Bảng 2.3. Kết quả phân tích ............................................................................ 57
Bảng 2.4. Phân tích một số nội dung khơng phù hợp. .................................... 57
Bảng 3.1. Phân bố tuổi của đối tượng nghiên cứu .......................................... 61
Bảng 3.2. Phân bố giới tính của đối tượng nghiên cứu ................................... 62
Bảng 3.3. Đặc điểm dịch não tủy .................................................................... 62
Bảng 3.4. Kết quả xét nghiệm phát hiện vi khuẩn .......................................... 64
Bảng 3.5. Các đặc điểm dịch não tủy liên quan đến nhiễm khuẩn ................. 65
Bảng 3.6. So sánh kết quả nhuộm Gram với kết quả m-qPCR....................... 66
Bảng 3.7. So sánh kết quả Latex với kết quả m-qPCR ................................... 66
Bảng 3.8. Giá trị chẩn đoán phát hiện vi khuẩn của m-qPCR khi tham chiếu với
kết quả cấy....................................................................................................... 67
Bảng 3.9. Kết quả định danh vi khuẩn của m-qPCR so với phương pháp Cấy.
......................................................................................................................... 68
.
.
iii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH
Biểu đồ 3.1. Phân bố tuổi của đối tượng nghiên cứu ...................................... 61
Hình 1.1. Sơ đồ phân lập và định danh Haemophilus influenzae ................... 14
Hình 1.2. Xác định nhu cầu hemin (X) và NAD (V) trong sự tăng trưởng của H.
Influenzae ........................................................................................................ 16
Hình 1.3. Một mẫu tăng trưởng của H. influenzae trên Haemophilus ID Quad
......................................................................................................................... 16
Hình 1.4. Cường độ của phản ứng ngưng kết ................................................. 17
Hình 1.5. Sơ đồ phân lập và định danh Neisseria meningitidis ...................... 19
Hình 1.6. Phương pháp CTA cho N. meningitidis.......................................... 20
Hình 1.7. Sơ đồ phân lập và định danh Streptococcus pneumoniae ............... 24
Hình 1.8. Phản ứng catalase ............................................................................ 25
Hình 1.9. Sử dụng optochin để xác định S.pneumoniae ................................. 25
Hình 1.10. Thử nghiệm tan trong muối mật của S. pneumoniae .................... 26
Hình 1.11. Các giai đoạn của chu kỳ nhiệt ..................................................... 36
Hình 1.12. Đường biểu diễn cường độ huỳnh quang theo chu kỳ nhiệt ......... 41
Hình 1.13. Đường biểu diễn sự phụ thuộc giá trị chu kỳ ngưỡng vào số lượng
DNA đích ban đầu ........................................................................................... 42
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................. 47
Hình 2.2. Bộ kit QIAamp MinElute Virus Spin ............................................. 49
Hình 2.3. Hướng dẫn pha thuốc thử ................................................................ 50
Hình 2.4. Quy trình ly trích DNA ................................................................... 51
Hình 2.5. Bộ kit AllplexTM Meningitis B Assay -Thực hiện m-qPCR ......... 53
.
.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm màng não mủ (VMNM) là một bệnh lý cấp tính đặc biệt nguy hiểm
nếu khơng điều trị kịp thời, có thể để lại các di chứng nặng nề như gây tổn
thương não, mất thính giác, di chứng vận động, chậm phát triển trí tuệ thậm
chí dẫn đến tử vong. Tỉ lệ VMNM trong cộng đồng vào khoảng 1 - 3/1000
dân với tỉ lệ tử vong có thể lên đến 50% [5], [12]. Theo số liệu của Viện Vệ
sinh Dịch tễ trung ương, tỷ lệ mắc bệnh từ 1991-2000 ở Việt Nam là 2,3/
100.000 dân và là bệnh xếp thứ 6 trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ chết
cao nhất (0,03/100.000 dân). Bệnh viêm màng não do não mô cầu xuất hiện
tản phát trong suốt năm. Tuy nhiên, ở Việt Nam có thể xảy ra dịch vào thời
tiết mùa thu, đông và xuân, nhất là ở các xã vùng núi biên giới. Nhóm tuổi
nguy cơ mắc bệnh cao nhất là lứa tuổi trẻ em và cũng ở nhóm tuổi này có số
người lành mang vi khuẩn nhiều nhất [5].
Bên cạnh việc sử dụng kháng sinh thích hợp, theo dõi liên tục, xử lí kịp
thời các biến chứng, một trong những yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu
quả việc điều trị là thời gian chẩn đoán xác định bệnh. Có nhiều vi khuẩn khác
nhau gây ra viêm màng não. Tuy nhiên, các tác nhân từ vi khuẩn như
Streptococcus pneumoniae, Neisseria menigitidis, Streptococcus agalactiae,
Haemophilus influenzae và Listeria monocytogenes là những mầm bệnh phổ
biến nhất trong viêm màng não được báo cáo trong những năm qua [20], [24],
[50], [23]. Xác định chính xác căn nguyên gây bệnh giúp cho các bác sĩ lâm
sàng lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp, đặc hiệu với từng vi khuẩn
nhằm giúp cho việc điều trị kịp thời, có hiệu quả, hạ thấp tỷ lệ tử vong và di
chứng của bệnh. Tuy nhiên, hiện nay việc chẩn đốn bệnh viêm VMNM vẫn
cịn mất nhiều thời gian và hạn chế bởi phương pháp cận lâm sàng lựa chọn.
Cụ thể, các phương pháp phổ biến là nhuộm Gram, xét nghiệm ngưng kết hạt
Latex và cấy dịch não tủy. Tuy nhiên các phương pháp này đều chưa đáp ứng
.
.
được vấn đề về thời gian trả kết quả và khả năng âm tính giả cao nếu bệnh
nhân đã từng sử dụng kháng sinh trước đó [42], [17], [33], [28].
Từ những hạn chế của các kỹ thuật xét nghiệm trên, chúng tôi triển khai
áp dụng kỹ thuật multiplex realtime PCR (m-qPCR) để chẩn đoán xác định
các tác nhân vi khuẩn gây bệnh VMNM ở trẻ em. M-qPCR là realtime PCR
sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho việc khuếch đại nhiều DNA đích đặc
hiệu từ nhiều vi sinh vật. Quan trọng nhất trong m-qPCR là thiết kế được các
mồi có cùng nhiệt độ bắt cặp (Ta) lên DNA đích, đồng thời các mồi này cũng
không bắt cặp với nhau, do đó độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích rất cao.
Bộ thuốc thử m-qPCR với 6 loại vi khuẩn thường gặp gồm Haemophilus
influenzae, Neisseria meningiditis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
agalactiae, Escherichia coli K1, Listeria monocytogenes có tiềm năng đưa
vào sử dụng trong thực tiễn kết hợp với các phương pháp chẩn đoán còn một
số hạn chế trên, tuy nhiên cần được đánh giá về độ nhạy và độ đặc hiệu của
m-qPCR với bộ kit này. Do đó, chúng tơi thực hiện nghiên cứu: “Giá trị của
kỹ thuật multiplex realtime PCR phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm
não mủ thường gặp ở trẻ em” kỳ vọng đưa ra một góc nhìn khách quan nhất
về hiệu quả chẩn đoán của kỹ thuật multiplex realtime PCR, từ đó có các kiến
nghị phù hợp tăng hiệu quả chẩn đoán viêm màng não mủ ở trẻ em.
.
.
CÂU HỎI NGHIÊN CỨU
Kỹ thuật multiplex realtime PCR có thực sự hiệu quả trong chẩn đoán viêm
màng não mủ ở trẻ em hay không?
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Xác định các đặc điểm dịch tễ học, dịch não tủy và các loại vi khuẩn gây
viêm màng não mủ trẻ em tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 thành phố Hồ Chí Minh
năm 2019-2020.
2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm
của của kỹ thuật m-qPCR.
.
.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh Viêm màng não mủ
1.1.1. Viêm màng não
1.1.1.1. Định nghĩa
Viêm màng não (VMN) là tình trạng viêm/nhiễm trùng những lớp
màng bao bọc não và tủy sống, được xác định bởi sự thay đổi bất thường của
số lượng bạch cầu trong dịch não tủy [2].
1.1.1.2. Phân loại
Có nhiều cách phân loại VMN dựa vào:
- Thời gian khởi phát bệnh: VMN cấp hay mãn tính.
- Nhóm nguyên nhân gây bệnh: VMN do vi khuẩn - VMN vơ khuẩn, VMN
do vi khuẩn cịn được gọi là viêm màng não mủ (VMNM), virus, nấm, các
loại VMN khác.
-
Chia cụ thể theo tác nhân gây bệnh: VMN Staphylococcus aureus, VMN
Streptococcus pneumoniae, VMN nấm Cryptococcus neoforman v.v…
1.1.2. Viêm màng não mủ
1.1.2.1. Định nghĩa
VMNM để chỉ tình trạng khi bất kỳ một phần nào của tổ chức màng
não bị tấn công bởi các vi khuẩn sinh mủ và phản ứng viêm của màng não sẽ
lan tỏa đi khắp nơi biểu hiện trên lâm sàng một hội chứng nhiễm trùng và hội
chứng màng não [43].
Hiện nay, việc điều trị VMNM vẫn còn phức tạp và tiên lượng dè dặt.
.
.
1.1.2.2. Dịch tễ học
Viêm màng não mủ là bệnh nguy hiểm và phổ biến ở 1/3 trong số bệnh
nhân viêm màng não trên toàn thế giới. Bệnh xảy ra chủ yếu vào mùa lạnh.
Tại Mỹ hằng năm cứ 105 người VMN thì có 10 người mắc VMNM, trong đó
trẻ dưới 6 tuổi chiếm tỷ lệ 80%. Tỷ lệ này cao hơn 3 - 4 lần ở các nước phát
triển. Bệnh khá phổ biến ở nước ta, vì các yếu tố gây viêm vào màng não qua
máu từ các ổ nhiễm tiên phát từ xa trên cơ thể. Ở nước ta, bệnh nhiễm trùng
cịn phổ biến do đó VMN chủ yếu là do vi khuẩn, khoảng 10% trường hợp
VMN khơng tìm ra tác nhân gây bệnh nên rất khó điều trị [1].
1.1.2.3. Tác nhân gây bệnh
Có rất nhiều loại vi khuẩn có thể gây nên VMN. Trong đó, ba tác nhân
Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis và Streptococcus pneumoniae
chiếm gần 95% các trường hợp bệnh [3] [25] [38]. Tần suất mắc phải từng
loại vi khuẩn tùy thuộc vào lứa tuổi bệnh nhân, các yếu tố liên quan sức đề
kháng của chủ thể và điều kiện môi trường nơi bệnh nhân tiếp xúc.
Khả năng nhiễm trùng dựa vào lứa tuổi:
- Ở lứa tuổi sơ sinh, trong một hai tháng đầu, vi khuẩn gây VMN
thường có liên quan đến các loại vi khuẩn bình thường của âm đạo người mẹ
hoặc tùy thuộc môi trường của đứa bé sinh sống (đặc biệt nhiễm từ khoa
dưỡng nhi): thường nhất là Streptococcus nhóm B và Escherichia coli. Các
trực trùng Gram âm khác (Klebsiella, Enterobacter, Serratia...) và vi khuẩn
Gram dương Listeria monocytogenes cũng rất quan trọng. Bệnh cảnh VMNM
thường hay đi kèm theo nhiễm trùng huyết [20], [24], [49].
- Ở trẻ nhũ nhi (trên 3 tháng tuổi đến 2 tuổi), tác nhân hàng đầu gây
VMNM là Haemophilus influenzae tuýp b, thường thứ phát sau nhiễm trùng
hô hấp do tác nhân trên [50], [23].
.
.
- Ở lứa tuổi đến trường và thiếu niên (hơn 5 tuổi, từ 12-15 tuổi) hoặc
thanh niên, các loại vi khuẩn Neisseria meningitidis và Streptococcus
pneumoniae chiếm tỉ lệ cao hơn.
- Đặc biệt ở người già trên 50 tuổi, nguyên nhân chủ yếu gây VMNM là
Streptococcus pneumoniae và các vi khuẩn Gram âm [21], [31].
Ngồi ra, trẻ ở mơi trường tập thể (nhà trẻ, mẫu giáo) dễ có nguy cơ
mắc hơn những trẻ được chăm sóc tại nhà. Yếu tố khuyết tật bẩm sinh hay có
bất thường về đáp ứng miễn dịch có khuynh hướng làm cho trẻ dễ nhiễm bệnh
VMN do Haemophilus influenzae tuýp b hơn các loại vi khuẩn khác.
1.1.2.4. Một số triệu chứng lâm sàng thường gặp
Các triệu chứng lâm sàng của bệnh VMNM rất đa dạng theo lứa tuổi.
Đối với trẻ dưới 2 tháng tuổi, triệu chứng thường không đặc hiệu: sốt hay hạ
thân nhiệt, lừ đừ hay quấy khóc, xanh tái, khó thở, giảm trương lực cơ, thóp
phồng, co giật. Đối với trẻ lớn hơn: sốt, ói, đau đầu, cứng gáy, thóp phồng, sợ
ánh sáng, thay đổi tri giác. Nếu nặng, trẻ sẽ có các dấu hiệu của tăng áp lực
nội sọ hay biến chứng nội sọ [3].
1.1.2.5. Các xét nghiệm đang được sử dụng để chẩn đốn VMNM
Cần chọc dị tuỷ sống (CDTS) khi đã có hướng chẩn đốn hoặc nghi
ngờ là VMNM. Việc thực hiện CDTS nên thực hiện càng sớm càng tốt khi
nghi ngờ bệnh nhân bị VMN sau khi thăm khám bệnh.
Chống chỉ định CDTS: các trường hợp tăng áp lực nội sọ, lở lt vùng
da nơi chọc dị, rối loạn đơng máu nặng, co giật kéo dài, suy hơ hấp có nguy
cơ ngưng thở, suy tuần hoàn.
Phải soi đáy mắt trước khi CDTS để phát hiện những trường hợp có
tăng áp lực nội sọ. Nếu có dấu hiệu tăng áp nội sọ hay có dấu thần kinh định
.
.
vị, bệnh nhân cần được chụp CT scan đầu để loại trừ u não, áp xe não, tai biến
mạch máu não v.v. Trong trường hợp kết quả CT scan não loại trừ những
bệnh lý kể trên, manitol 20% (liều 1-2 g/kg cân nặng) truyền tĩnh mạch nhanh
trong 30 - 60 phút để điều trị tăng áp lực nội sọ ngay trước khi tiến hành
CDTS. Chọc dò dịch não tủy lần 2 được thực hiện sau khi bắt đầu sử dụng
kháng sinh 48-72 giờ để đánh giá tình trạng đáp ứng điều trị. Việc lập lại thủ
thuật CDTS có thể thực hiện nhiều lần trong quá trình điều trị nếu dịch não
tủy hay lâm sàng không cải thiện.
Trên bệnh nhân VMNM, màu của dịch não tủy có thể lờ lờ hoặc đục
hẳn như nước vo gạo, dịch não tuỷ có thể có ánh vàng do xuất huyết cũ, hay
do tẩm bilirubin hay do tăng nồng độ protein. Ngoài ra, dịch não tủy lấy được
sẽ khảo sát về tế bào học, sinh hoá, vi khuẩn học [3], [40].
Khảo sát tế bào:
Tế bào dịch não tủy phải được khảo sát ngay lập tức, vì các bạch cầu
của dịch não tủy sẽ bắt đầu thối hóa sau 90 phút. Trong VMNM, tế bào dịch
não tuỷ có thể từ 100 – 1000/mm3, tế bào đa nhân trung tính chiếm đa số
(80%). Đơi khi có thể lên đến 5000–10000, nghi do áp-xe vỡ vào não thất.
Sinh hóa:
Xét nghiệm đường trong dịch não tuỷ, nồng độ đường trong dịch não
tuỷ giảm dưới 40 mg%, đôi khi chỉ còn vết. Tỷ lệ đường dịch não tuỷ trên
đường huyết đo cùng lúc thấp hơn 50%. Trị số đường thấp rất có giá trị để
phân biệt VMN do siêu vi. Đạm dịch não tuỷ: Tăng cao trên 100 mg%. Lactat
dịch não tủy: Tăng cao trên 4 mmol/l trong VMNM.
Vi khuẩn học:
.
.
- Nhuộm Gram tìm vi khuẩn: độ nhạy thấp. Tỷ lệ nhuộm dương tính tùy
thuộc vào loại vi khuẩn: 75% đối với N. meningitidis, 86% đối với H.
influenzae, gần 90% đối với S. pneumoniae.[3]
- Soi trực tiếp: độ nhạy thấp. Tùy thuộc số lượng vi khuẩn bị nhiễm,
nếu số lượng này lên đến 105/ml thì có thể soi dương tính trong 97% các
trường hợp. Nếu bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước đó, tỷ lệ soi sẽ giảm.
- Cấy dịch não tủy vào môi trường thạch máu hoặc thạch chocolate: nên
cấy ngay cả khi dịch có vẻ trong và khơng có bạch cầu. Phương pháp này cho
tỷ lệ dương tính thấp và chờ đợi cấy vi khuẩn trong dịch não tủy thường chậm
(sau 24-48 giờ) [18] [29].
- Điện di miễn dịch ngược chiều: xác định được VMN do N.
meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae A, B, C, Y và W135 trong vịng
một vài giờ, nhưng phản ứng này âm tính vẫn không cho phép loại trừ
VMNM.
- Phản ứng ngưng kết với latex: nhạy cảm hơn điện di miễn dịch ngược
chiều, có thể thực hiện ngay tại giường với mẫu dịch não tủy vừa rút ra được,
giúp phát hiện kháng nguyên polysaccharide trong N. meningitidis, S.
pneumoniae, H. influenzae tuýp b và Streptococci nhóm B. Chỉ hiệu quả khi
nồng độ vi khuẩn trong dịch não tủy cao (> 103 CFU/ml).
- Thử nghiệm dịch não tủy bằng thử nghiệm Limulus lysat: tìm nội độc
tố khi nghi ngờ nhiễm vi khuẩn Gram âm.
1.1.2.6. Chẩn đoán
Chẩn đốn xác định
Chẩn đốn VMNM khơng khó khăn khi trên bệnh nhân có đủ các triệu
chứng lâm sàng như nóng sốt, thay đổi tri giác, có dấu màng não và khảo sát
.
.
dịch não tuỷ có bạch cầu tăng, đường giảm, đạm tăng, soi và cấy dịch não tuỷ
dương tính [43].
Chẩn đốn phân biệt
Nếu không xác định được vi khuẩn trong dịch não tuỷ, cần phải loại trừ
một số VMN do các nhuyên nhân khác:
- Ổ nhiễm trùng cạnh màng não.
- VMN do các loại vi khuẩn không gây mủ: Leptospira, lao, giang mai,
bệnh Lyme.
- VMN do siêu vi: quai bị, Enterovirus, Arbovirus, Varicella zoster.
- VMN do nấm: Candida albicans, Crytococcus neoformans.
- Căn bệnh ác tính: Hodgkin, bạch huyết có di căn vào màng não.
- VMN hoá học : do các chất gây viêm sau gây tê tủy sống, các độc chất
như chì, thuỷ ngân.
1.1.2.7. Biến chứng của VMNM
VMNM là loại bệnh lí có thể có nhiều biến chứng, khơng chỉ tùy thuộc
vào điều trị sớm hay trễ, phù hợp hay không phù hợp, mà còn tùy thuộc theo
tác nhân gây bệnh.
- Vi khuẩn có thể lan tỏa theo đường máu đưa đến nhiễm trùng huyết,
hoặc vi khuẩn có thể khu trú lại gây viêm nội tâm mạc như đối với VMNM do
S. pneumoniae, hoặc gây viêm mủ khớp như N. meningitidis, S. pneumoniae,
H. influenzae.
- Biến chứng thần kinh thường gặp là sự ảnh hưởng đến các dây III, IV
(20%), rối loạn thị giác, liệt nửa người (15%). Ảnh hưởng lên dây VIII gây
.
0.
điếc thường là biến chứng của S. suis. Tùy theo trường hợp, các biểu hiện liệt
thần kinh này có thể biến mất sau khi lành bệnh [16], [29].
- Biến chứng co giật: co giật tồn phần hay cục bộ, có thể kèm nở đồng
tử một bên, tăng phản xạ gân xương không đồng đều…do phù não, do viêm
tắc tĩnh mạch vỏ não.
- Áp-xe não do nhiễm trùng lan tỏa theo đường máu, từ các xoang bị
viêm.
- Tràn dịch tràn mủ màng cứng, xảy ra ở những trẻ có vịng đầu lớn
nhanh, ói, sốt kéo dài, đạm dịch não tủy tiếp tục cao mặc dù tế bào giảm.
- VMNM tái phát nhiều lần xảy ra ở những bệnh nhân có khuyết tật cơ
thể học, do những ổ viêm kế cận còn tồn tại hoặc do giảm miễn dịch cơ thể
[43].
1.1.2.8. Điều trị
Kháng sinh giữ vai trị chính yếu trong điều trị VMNM. Nếu điều trị
chậm trễ sẽ dễ để lại các biến chứng và di chứng nặng nề, nhất là đối với trẻ
em. Một số nguyên tắc quan trọng trong việc lựa chọn kháng sinh điều trị
VMNM:
-
Kháng sinh có khả năng đi qua màng não.
-
Nồng độ thuốc đưa vào phải cao sao cho đạt được hoạt tính diệt khuẩn
trong dịch não tuỷ.
-
Sử dụng sớm ngay khi có chẩn đốn.
-
Lựa chọn loại kháng sinh thích hợp với độ nhạy cảm của vi khuẩn gây
bệnh.
-
Nên dùng loại kháng sinh diệt khuẩn.
.
1.
-
Thuốc dùng liều cao, không giảm liều ngay cả khi bệnh nhân có đáp ứng
[43].
Điều trị cụ thể ở trẻ:
Bảng 1.1. Điều trị ban đầu ở trẻ em
Lứa tuổi
0 – 4 tuần
Kháng sinh
Căn nguyên
thường gặp
Vi
khuẩn
ưu tiên
đường Cefotaxime +
ruột, S. agalactiae,
thay thế
Ampixilin* +
ampixilin
aminoglycoside
H. influenza,
Ampixilin* +
Vancomycin +
N. meningitidis,
ceftriaxone (hoặc
ceftriaxone (hoặc
S. pneumoniae,
cefotaxime)
cefotaxime)
Ceftriaxone (hoặc
Vancomycin +
cefotaxime)
ceftriaxone (hoặc
Listeria.
1 – 3 tháng
S. agalactiae,
E.coli, Listeria.
3 tháng
đến 18 tuổi
H. influenza,
N. meningitidis,
S. pneumoniae
* Chọn ampicillin khi nghi ngờ Listeria
.
cefotaxime)
2.
Liều kháng sinh
Bảng 1.2. Liều kháng sinh điều trị khi chức năng gan thận bình thường
Kháng sinh
Tổng liều/kg/ngày
Chia theo giờ/lần
Amikacin (c)
20 - 30 mg/kg
12
Gentamicin
5 mg/kg
12
Ampicilin
150 - 300 mg/kg
6
Cefotaxim
100 - 200 mg/kg
8
Ceftazidim
60 - 150 mg/kg
8
Ceftriazon
80 - 100 mg/kg
12
Penicillin G
150.000 - 250.000 đv/kg
6
Rifampin
10 - 20 mg/kg
12
Vancomycin
20 - 60 mg/kg
6
Theo dõi điều trị
Khi có kết quả nhuộm Gram cần điều chỉnh ngay kháng sinh phù hợp:
Cầu khuẩn Gram dương: ceftriazon hoặc cefotaxim + vancomycin.
Song cầu khuẩn Gram âm: penicillin G hoặc ceftriaxon.
Trực khuẩn Gram dương: ampicillin - aminoglycosid.
Trực khuẩn Gram âm: ceftriaxon - aminoglycosid.
Khi có kết quả cấy: thay đổi kháng sinh theo kháng sinh đồ.
Nếu khơng có kết quả cấy, hoặc lâm sàng không cải thiện cần xét nghiệm
lại DNT sau 48 giờ điều trị. DNT không cải thiện cần đổi sang phác đồ thay
thế.
.
3.
1.2. Các vi khuẩn gây bệnh VMNM thường gặp ở trẻ em
1.2.1. Haemophilus influenzae
H. influenzae là vi khuẩn thường trú ở mũi hầu và đường hơ hấp trên.
Lúc đó vi khuẩn thường ở dạng khơng có nang. Vi khuẩn gây bệnh thường là
vi khuẩn có nang và thuộc tuýp b. H. influenzae có thể gây các bệnh lý nhiễm
khuẩn tại đường hơ hấp trên, từ đây vi khuẩn có thể vào máu gây VMN.
1.2.1.1. Tính chất vi khuẩn học
Haemophilus influenzae là một vi khuẩn gram âm hình que. Khi mới
phân lập hay khảo sát trực tiếp, vi khuẩn có dạng que ngắn. Trong canh cấy
già, hình dạng vi khuẩn có thể thay đổi từ dạng hình que ngắn đến dài và hơi
cong.
H. influenzae được xếp vào nhóm vi khuẩn khó mọc. Vi khuẩn tăng
trưởng tốt nhất ở 35-37 oC với khoảng 5% CO2 và cần phải có hai yếu tố quan
trọng, đó là X (hemin) và V (NAD). Mơi trường thường được sử dụng cho sự
tăng trưởng của H. influenzae là đĩa thạch chocolate (CAP), có thể từ máu
ngựa – một nguồn giàu hemin và NAD, hoặc máu cừu. Khi được nuôi cấy
trên CAP, vi khuẩn sẽ mọc thành các khóm lớn, trịn, mịn, lồi, khơng màu
đến màu xám và đục nhẹ. Những chủng khơng có nang thường ít nhầy hơn,
khóm nhỏ và xám đục hơn những chủng có nang. H. influenzae không thể
phát triển trên môi trường thạch máu (BAP) mà khơng có các yếu tố bổ sung,
nhưng có thể có hiện tượng vệ tinh, đó là khi H. influenzae mọc quanh khóm
vi khuẩn tiết được NAD như Staphylococcus, Bacillus…hoặc mọc quanh các
đĩa giấy tẩm XV [4], [9], [48].
1.2.1.2. Vi sinh lâm sàng
Hộp thạch phân lập sau khi cấy xong được ủ trong bình nến rồi để
35-37oC trong 18-24 giờ. Sau đó chọn khóm nghi ngờ để định danh bằng
.
4.
nhu cầu XV, các phản ứng sinh hóa cơ bản khác như thử nghiệm oxy hóa
Kovac, định kiểu huyết thanh cũng như làm kháng sinh đồ, xác định bằng
phương pháp sinh học phân tử v.v… Ngoài ra, vi khuẩn trong bệnh phẩm có
thể xác định được bằng kỹ thuật nhuộm kháng thể gắn men hay gắn huỳnh
quang để tìm kháng nguyên. Trong bệnh phẩm là các chất dịch (dịch não tủy,
dịch màng phổi, dịch khớp), vi khuẩn phóng thích ra kháng ngun hịa tan,
có thể dùng các phản ứng hóa miễn dịch như tụ latex, điện di miễn dịch đối
lưu (CCIE), hay ngưng kết (coagglutination) để phát hiện.
Hình 1.1. Sơ đồ phân lập và định danh Haemophilus influenzae
Thử nghiệm Kovac
Phép thử Kovac được sử dụng để xác định sự hiện diện của men
cytochrome
oxidase
.
bằng
thuốc
thử
tetrametyl-p-phenylendiamin
5.
dihydroclorid. Hợp chất này sẽ được chuyển sang màu tím bởi men
cytochrom c – một phần của chuỗi hô hấp - trong cơ thể sinh vật. Thử nghiệm
này không đặc hiệu cho H. influenzae, bởi các vi khuẩn khác thuộc chi
Haemophilus cũng như các vi khuẩn không liên quan, cũng có thể cho phản
ứng dương tính.
Thử nghiệm nhu cầu hemin (X) và NAD (V)
H. influenzae là một vi khuẩn khó mọc, cần phải có đồng thời hai yếu
tố tăng trưởng là hemin (X) và NAD (V). Đây là điểm phân biệt với các vi
khuẩn cùng chi Haemophilus, trừ một ngoại lệ duy nhất là H. haemolyticus.
Tuy nhiên, H. haemolyticus có khả năng sản xuất men gây hiện tượng tán
huyết rõ ràng đối với máu ngựa hoặc thỏ, còn H. influenzae thì khơng [48].
Bảng 1.3. Định danh Haemophilus influenzae bằng nhu cầu hemin và NAD
đối với sự tăng trưởng và sự ly giải máu ngựa
Nhu cầu
Nhu cầu NAD β-hemolysis đối với
hemin(yếu tố X) (yếu tố V)
máu ngựa.
Vi khuẩn
H. influenzae
+
+
-
H. parainfluenzae
-
+
-
H. haemolyticus
+
+
+
H. parahaemolyticus
-
+
+
H. aphrophilus
+
-
-
H. paraphrophilus
-
+
-
.
6.
Thử nghiệm này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các đĩa giấy,
dựa trên nguyên tắc khuyếch tán của thạch, hoặc những đĩa có các phần tư
Haemophilus ID Quad .
Hình 1.2. Xác định nhu cầu hemin (X) và NAD (V) trong sự tăng trưởng
của H. Influenzae
Hình 1.3. Một mẫu tăng trưởng của H. influenzae trên Haemophilus ID
Quad
Xác định kiểu huyết thanh
Dựa vào kháng nguyên nang là polysaccharide, H. influenzae được chia
thành 6 serotype: a, b, c, d, e, f. H. influenzae cũng có thể khơng đóng nang,
và những chủng như vậy khơng có serotype. Các huyết thanh miễn dịch đặc
.
7.
hiệu xác định từng serotype và huyết thanh miễn dịch đa năng xác định cả 6
serotype đều có sẵn trên thị trường.Thử nghiệm ngưng kết huyết thanh (SATS
test): Sự ngưng kết xảy ra khi các huyết thanh miễn dịch gắn với các tế bào vi
khuẩn gây ra sự kết tụ hay kết thành từng khối, do đó tạo thành dịch treo tế
bào rõ hơn. Cường độ của phản ứng ngưng kết khác nhau phụ thuộc và tỷ
trọng của hỗn dịch hoặc của huyết thanh kháng được sử dụng.
Hình 1.4. Cường độ của phản ứng ngưng kết
4+ : Tất cả các tế bào đều ngưng kết, hỗn dịch xuất hiện rõ
3+ : 75% tế bào ngưng kết, hỗn dịch vẫn đục nhẹ
2+ : 50% tế bào ngưng kết, hỗn dịch vẫn đục nhẹ
1+ : 25% tế bào ngưng kết, hỗn dịch vẫn đục nhẹ
+/- : Dưới 25% tế bào ngưng kết, chỉ dưới dạng các hạt mịn
0
: Khơng nhìn thấy ngưng kết, hỗn dịch vẫn đục và mịn.
1.2.2. Neisseria meningitidis (meningococcus) [4], [8], [29], [48].
Neisseria meningitidis là một loại vi khuẩn kí sinh tự nhiên chỉ trên
người. Đường xâm nhập của vi khuẩn thường là mũi-hầu. Tại đây vi khuẩn
không gây triệu chứng hay chỉ gây viêm họng xuất tiết, nhưng từ vị trí này vi
khuẩn có thể vào máu gây nhiễm trùng huyết hoặc VMN. Bệnh thường tiến
triển rất nhanh chóng và có thể gây tử vong trong vài giờ đối với bệnh nhân
.
