Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp real -time PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM










KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B
BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR




Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ HẢI YẾN
MSSV: 0811110105 Lớp: 08CSH2




TP. Hồ Chí Minh, 2011

– LỜI CAM ĐOAN —


Tôi xin cam đoan bài luận văn tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu
của cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết.
Các số liệu, những kết quả thí nghiệm trong báo cáo luận văn tốt nghiệp
là trung thực. Nội dung bài báo cáo này có tham khảo và sử dụng các tài liệu,
thông tin được đăng tải trên các tạp chí và các trang web theo danh mục tài
liệu tham khảo.

Khóa luận tốt nghiệp
SVTH : Võ Thị Hải Yến i

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B 3
1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B 3
1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B 3
1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus 4
1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh 4
1.2.2. Cấu trúc bộ gen của HBV 5
1.2.3. Sự tái bản DNA 6
1.2.4. Các thành phần kháng nguyên 6
1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh 7
1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam 9
1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới 9
1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước 10
1.4. Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và
điều trị HBV 11
1.4.1. Đường lây của HBV 11
1.4.2. Triệu chứng lâm sàng 13
1.4.3. Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV 13
1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B 15
1.5.1. Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn

dịch (phát hiện kháng nguyên) 15
1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử 16
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34
2.1. Vật liệu thiết bị 34
2.1.1. Vật liệu sinh học 34
Khóa luận tốt nghiệp
SVTH : Võ Thị Hải Yến ii

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 34
2.1.3. Hóa chất 37
2.2. Phương pháp tiến hành 37
2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu 38
2.2.2. Phương pháp tách chiết 39
2.2.3. Phản ứng Real-time PCR 40
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42
KẾT LUẬN 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46


Khóa luận tốt nghiệp
SVTH : Võ Thị Hải Yến iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

bDNA branched DNA
Bp base pair
cDNA complementary DNA
Ct Threshold cycle (chu kỳ ngưỡng)
DNA Deoxyribonucle acid
dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphate

ELISA Enzyme Linked Immuno Assay
HBV Hepatitis B Virus
HBcAg Hepatitis B core Antigen
HBeAg Hepatitis B envelope Antigen
HBsAg Hepatitis B surface Antigen
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
Nu Nuleotide
PCR Polymerase chain reaction
RNA Ribonucle acid
T
m
Nhiệt độ nóng chảy của mồi








Khóa luận tốt nghiệp
SVTH : Võ Thị Hải Yến iv

DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính
hiển vi điện tử 3
Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B 4

Hình 1.3. Cấu trúc bộ gene HBV 5
Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV 8
Hình 1.5. Sự phân bố HBsAg trên thế giới 11
Hình 1.6. Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA 17
Hình 1.7. Nguyên lý PCR 19

Hình 1.8. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Real-time PCR 24
Hình 1.9. Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe đôi trong Real-time PCR 26
Hình 1.10. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real-time PCR 28
Hình 1.11. Biểu đồ biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra
từ ống phản ứng khi nhân được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt 33
Hình 2.1. Máy ly tâm thu huyết thanh 34
Hình 2.2. Máy Stratagene Mx300P 34
Hình 2.3. Máy ly tâm 35
Hình 2.4. Máy vortex 35
Hình 2.5. Máy ủ nhiệt khô 36
Hình 2.6. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml 36
Hình 2.7. Quy trình phát hiện HBV bằng phương pháp Real-time PCR 38
Hình 2.8. Chu trình nhiệt của Real-time PCR 41
Hình 3.1. Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm 43
Hình 3.2. Biểu đồ đường chuẩn 44


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

1
LỜI MỞ ĐẦU

I. Đặt vấn đề
Viêm gan siêu vi B do Hepatitis B virus (HBV) gây bệnh phổ biến trên
toàn cầu, có diễn biến phức tạp, tỷ lệ chuyển sang mãn tính cao, thường dẫn
tới xơ gan và ung thư gan. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay có
khoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan siêu vi B trên thế giới, trong đó có
khoảng 6% nhiễm viêm gan siêu vi B cấp và 5 - 10% trong số này chuyển
sang mãn tính ở người lớn, riêng với trẻ em tỉ lệ này lên đến 90%. Tỷ lệ tử
vong trong giai đoạn cấp tính là 1%, biến chứng của viêm gan B cấp là viêm
gan mãn, xơ gan, xơ gan mất bù và ung thư nguyên phát, dẫn tới tử vong 1
triệu người mỗi năm. Tại Việt Nam, hiện nay có khoảng 15 - 20% dân số
nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80 - 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan
nguyên phát có nhiễm HBV.
Một trong những kỹ thuật phổ biến dùng để chẩn đoán bệnh viêm gan
siêu vi B được sử dụng hiện nay là phương pháp Real-time PCR, cho kết quả
nhanh chóng, độ tin cậy cao, góp phần vào việc điều trị viêm gan mãn tính.

II. Mục tiêu đề tài
Do tỷ lệ nhiễm HBV khá cao nên ngoài biện pháp phòng ngừa thì vấn đề
điều trị nhiễm HBV hay tình trạng mạng virus lâu dài trong máu cũng đang
rất quan tâm. Nhưng để có thể có được những hiểu biết về các vấn đề kể trên
thì cần phải xác định được một người đang mang HBsAg trong máu có thật sự
đang nhiễm HBV hay không. Ngoài ra, để có được chỉ định điều trị đặc hiệu
cũng như theo dõi được hiệu quả điều trị thì phải phát hiện cũng như định
lượng được HBV trong máu.

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

2

Trước yêu cầu thực tế đó, khóa luận “Quy trình chẩn đoán bệnh viêm
gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR” được thực hiện với mục
đích đề xuất phương pháp định lượng HBV-DNA trong huyết thanh của
người bệnh, nhằm giải quyết các vấn đề nói trên.

III. Nhiệm vụ đề tài
Giới thiệu sơ lược về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B.
Tìm hiểu các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B.
Tìm hiểu quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương
pháp Real-time PCR.

IV. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu tài liệu, lý thuyết.














Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B
1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B [19]
Viêm gan siêu vi B là bệnh viêm gan do virus viêm gan B (Hepatitis B
Virus) gây ra, truyền nhiễm theo đường máu và sinh dục lây đến gần 1/3 dân
số trên toàn thế giới, nhiều nhất tại các nước đang phát triển.
1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B [5]
Bệnh được biết từ năm 1883 qua một vụ dịch viêm gan trên 191 người
trong số 1289 công nhân đóng tàu ở Bremen (Anh) được chủng đậu mùa. Tất
cả bệnh nhân là những người được chủng cùng một loại vaccine đậu mùa.
Năm 1965, Blumberg phát hiện kháng nguyên gây bệnh viêm gan lây
truyền qua huyết thanh, đặt tên là kháng nguyên Úc Châu (vì tìm thấy trên
một người ở Châu Úc).
HBV do Dane phát hiện năm 1970 trong huyết thanh của những bệnh
nhân viêm gan bằng kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử và được gọi là hạt
Dane.







Hình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn
dưới kính hiển vi điện tử [23]
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

4
1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus [8],[15],[18]
Tác nhân gây viêm gan siêu vi B là một loại virus thuộc họ
Hepadnaviridae, là tác nhân chủ yếu gây viêm gan và ung thư gan, được tìm
thấy trong tế bào gan và trong huyết thanh của người bị nhiễm bệnh.
1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh













Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B [24]

Virus hoàn chỉnh (virion) là một tiểu thể hình cầu có đường kính từ 42 -
47nm được gọi là hạt tử Dane, gồm:
- Một vỏ protein có bề dày khoảng 7nm chứa kháng nguyên bề mặt
HBsAg, glycoprotein và lipid.
- Lõi có đường kính khoảng 28nm chứa một phân tử DNA, 2 loại kháng
nguyên lõi là HBcAg, HBeAg và một số enzyme quan trọng như DNA

polymerase, protein kinase.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

5
1.2.2. Cấu trúc bộ gene của HBV
Phân tử DNA của virus có dạng vòng, chứa khoảng 3,2Kb gồm hai mạch
đơn có chiều dài khác nhau: một mạch dài hay mạch [-] là mạch hoàn chỉnh
và một mạch ngắn là mạch [+] liên kết với phân tử DNA polymerase.










Hình 1.3. Cấu tạo bộ gene HBV [18]

Mạch [-] có 4 vùng mã hóa đã được xác định: gene S, gene C, gene P và
gene X.
v Gene S (surface)
Mã hóa kháng nguyên bề mặt HBsAg, gồm ba vùng (pre S1, pre S2, S)
mã hóa ba loại protein của HBsAg.
- Vùng S mã hóa protein nhỏ (là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số) chứa
226 acid amin, có vị trí gắn glucose.
- Vùng S và pre S2 mã hóa loại protein trung bình chứa 281 acid amin,

có vị trí gắn glucose.
- Vùng S, pre S1, pre S2 mã hóa protein lớn chứa 389 - 400 acid amin,
không có vị trí gắn glucose.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

6
v Gene C (core)
Mã hóa các polypeptide ở phần lõi của virus, gồm kháng nguyên lõi là
HBcAg. Gene C có một trình tự ngắn là pre C (precore) mã hóa HBeAg. Nếu
có một đột biến tại mã ngừng (stop codon) sẽ làm cho virus không sản xuất
được HBeAg trong khi HBsAg vẫn được tổng hợp. Dòng đột biến này cũng
có vai trò trong viêm gan siêu vi mãn và viêm gan siêu vi tối cấp.
v Gene P (pol hay polymerase)
Gene P chiếm 3/4 bộ gene của virus. Gene này gối lên phần cuối gene C,
phần đầu gene X và toàn bộ gene S. Gene P mã hóa một polypeptide cơ bản,
có hoạt tính DNA polymerase và ribonuclease H.
v Gene X
Đây là gene có kích thước nhỏ nhất, mã hóa một polypeptide gồm 154
acid amin, có chức năng điều hòa sự phiên mã của virus.
1.2.3. Sự tái bản DNA
Trong sự tái bản DNA, mạch DNA [-] làm khuôn mẫu phiên mã ra mạch
RNA [+] gọi là mRNA. Các bản sao mRNA này sẽ được đưa vào lõi của virus
ở giai đoạn cuối của quá trình tái bản, mRNA sẽ làm khuôn mẫu cho giai
đoạn phiên mã ngược để tổng hợp mạch cDNA [-] nhờ enzyme reverse
transcriptase cũng là enzyme DNA polymerase. Sau đó, mRNA bị phân hủy
bởi hoạt tính ribonuclease. Mạch cDNA [-] lại làm khuôn mẫu tổng hợp mạch
[+] nhưng sự tổng hợp không được hoàn tất trước khi virus trưởng thành và
được giải phóng. Vì thế, các virus hoàn chỉnh thường có sự khác nhau về

chiều dài hai mạch DNA và mạch [+] luôn ngắn hơn mạch [-].
1.2.4. Các thành phần kháng nguyên
v Kháng nguyên bề mặt (HBsAg)
HBsAg được tìm thấy trong huyết thanh người dưới dạng một thành
phần của virus hoàn chỉnh hay dạng không hoàn chỉnh.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

7
Năm 1968, Bayer và cộng sự đã quan sát được hai dạng HBsAg dưới
kính hiển vi điện tử.
- Dạng hình cầu có đường kính 17 - 25nm.
- Dạng hình ống có đường kính khoảng 20nm, chiều dài thay đổi có thể
lên đến vài trăm nm.
Cấu tạo hóa học của cả hai dạng này gồm: protein, carbohydrate, lipid,
không có nucleic acid nên được xem là dạng không hoàn chỉnh của HBV.
HBsAg là chỉ điểm huyết thanh học thường được dùng để xác định
nhiễm HBV. Đồng thời các mẫu huyết thanh có HBsAg sẽ là nguồn cung cấp
kháng nguyên rất tốt, có thể làm vật liệu cho các phản ứng huyết thanh học áp
dụng trong chẩn đoán.
v Kháng nguyên lõi
Gồm hai loại: HBcAg và HBeAg
- HBcAg được tìm thấy trong nhân tế bào gan bị nhiễm HBV, trong
huyết thanh người bị nhiễm. HBcAg hiện diện như là một thành phần
của một virus hoàn chỉnh, chứ không có ở dạng tự do.
- HBeAg là loại kháng nguyên hòa tan trong huyết thanh. Ở tế bào gan
HBeAg hiện diện trong tế bào chất, sẽ được giải phóng khỏi phần lõi
của virus khi xử lý với các chất mạnh.
1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh

Các HBV gắn vào các receptor của nó trên màng tế bào gan. Sau đó,
chúng bị tế bào nuốt vào trong theo kiểu ẩm bào. Vỏ capsid của nó (khi đã lọt
vào tế bào) sẽ được một enzyme thích hợp của tế bào phân hủy và acid
nucleic của HBV được giải phóng. Acid nucleic này đi vào nhân tế bào gan,
tại đây sẽ tái tổng hợp tiến hành phiên mã, dịch mã và cuối cùng tạo sợi DNA
mới. Các sợi này được lắp ráp qua lưới nội chất tạo ra các virion, và cuối cùng
các virion được xuất bào ra ngoài.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

8
Virus gắn vào bề mặt tế bào gan: HBV gắn vào bề mặt tế bào gan cảm
thụ nhờ sự phù hợp giữa thụ thể của tế bào với protein trên màng của virus.
Virus xâm nhập tế bào: Sau khi bám vào thụ thể của tế bào chủ, có sự
hòa nhập vỏ virus với màng tế bào, sau đó capsid được phóng thích vào trong
tế bào.
Virus nhân lên trong tế bào: Đầu tiên, các thông tin di truyền của virus
được mã hóa trong các phân tử DNA sẽ được phiên mã sang các RNA thông
tin của virus. Quá trình này cần đến sự tham gia của các enzyme RNA
polymerase. Các tRNA của virus sẽ đóng vai trò truyền tin để tạo ra các DNA
của virus và các protein của vỏ capsid của virus, các virus mới sẽ được lắp ráp
từ DNA và protein.

Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV [27]
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

9
1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam [2],[4]
1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay trên thế giới có khoảng 2 tỉ
người bị nhiễm HBV và 350 triệu người mang mầm bệnh mãn tính.
Viêm gan siêu vi B thường là nguyên nhân dẫn đến viêm gan mãn tính,
xơ gan và ung thư gan nguyên phát với tỷ lệ tử vong là 1 - 2 triệu người.
Các genotype HBV khác nhau phân bố ở vùng địa lý đặc trưng khác
nhau:
- Genotype A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi và Ấn Độ.
- Genotype B và C thì phổ biến ở Châu Á.
- Genotype D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông,
Ấn Độ và Nam Phi.
- Genotype E phổ biến ở Tây Phi.
- Genotype F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska.
- Genotype G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ.
- Genotype H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ, Nhật Bản.

Tình hình HBV thay đổi theo từng khu vực địa lý. Tùy theo tỷ lệ người
mang HBsAg [+] mà người ta chia làm 3 khu vực chính:
1.3.1.1. Khu vực lưu hành thấp
Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 0,1 - 0,5% dân số như ở Bắc Mỹ, Tây Âu và
Úc. Tỷ lệ người mang HBsAg cao nhất ở khoảng tuổi từ 20 - 40, trẻ em hiếm
khi bị nhiễm HBV.
1.3.1.2. Khu vực lưu hành trung bình
Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 2 - 7% ở một số quốc gia miền Nam Châu Âu
và Đông Âu, Nga, Nam Mỹ. Kiểu lây truyền thường là phối hợp nhưng lây
nhiễm qua đường tình dục thường là quan trọng hơn. Tuổi bị lây nhiễm cao
nhất là từ 25 tuổi (khoảng 50% dân số).
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

10

1.3.1.3. Khu vực lưu hành cao
Tỷ lệ HBsAg [+] vào khoảng 8 - 15%. Đặc điểm dịch tễ học quan trọng
của vùng này là nhiễm HBV thường gặp ở trẻ em và lây nhiễm qua đường chu
sinh (đường lây từ mẹ sang con). Trung Quốc, Phi Châu, Đông Nam Á được
xếp vào khu vực này. Ngoài ra người ta cũng ghi nhận sự lây nhiễm còn xảy
ra ở tuổi thiếu niên do các trẻ bị lây lẫn nhau trong gia đình, hoặc trong bạn
bè, thường gặp ở trẻ em châu Phi. Vì vậy, hầu hết dân số bị nhiễm có huyết
thanh chẩn đoán HBV dương tính rất sớm, thường là sau 10 tuổi. Tuy nhiên,
bệnh lại thường được phát hiện ở tuổi trưởng thành, lúc mà các biến chứng
mãn tính của nhiễm HBV có thể đã xuất hiện như viêm gan mãn, xơ gan và
ung thư gan nguyên phát. Do nhiễm ở tuổi còn nhỏ nên nguy cơ mang siêu vi
mãn tính rất cao, những phát hiện này chứng tỏ rằng người trẻ mang HBV là
người có khả năng lây nhiễm nhất. Việt Nam cũng được xếp vào khu vực lưu

hành cao, nghĩa là nhiễm HBV khá phổ biến, tuy chưa có những nghiên cứu
dịch tễ học thống nhất.
1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước
Ở Việt Nam, cứ 5 - 7 người dân thì có một người nhiễm, chủ yếu là kiểu
gene B và C. Virus B xâm nhập tế bào gan, biến chúng thành nơi sản xuất
virus mới. Khi phát hiện ra sự bất thường này, hệ miễn dịch sẽ tấn công kẻ
xâm lược. Nếu “cuộc chiến“ thắng lợi, tế bào gan tổn thương sẽ được thay thế
bằng những tế bào khỏe mạnh và bệnh nhân sẽ được phục hồi. Nhưng ở một
số người, hệ miễn dịch không loại trừ được virus và họ trở thành người mang
virus viêm gan B mãn tính. Khoảng 10% số người nhiễm virus B rơi vào
trường hợp này. Trong các trường hợp xấu nhất, các tế bào gan bị virus phá
hoại bị thay thế bằng các mô sợi bất thường, dẫn đến xơ gan và ung thư gan.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

11

Trên bản đồ dịch tễ của thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng
nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia
có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Nhận định này cũng được một số công
trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận. Không phải tất
cả các trường hợp nhiễm HBV đều cần phải được đặt ra vấn đề phải điều trị vì
đa số bệnh nhân đều có thể tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch
bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virus.
Tuy nhiên vẫn có một tỷ lệ người nhiễm HBV cần phải được điều trị đặc hiệu
bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu viêm gan mãn tính và lượng virus
tăng cao.

Hình 1.5. Sự phân bố HBsAg trên thế giới [25]

1.4. Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và
điều trị HBV [4],[8],[19]
1.4.1. Đường lây của HBV
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

12

Phương thức lây nhiễm chủ yếu trong viêm gan siêu vi B là lây qua
đường tiêu hóa. Sự lây nhiễm sẽ dễ dàng xảy ra khi trong máu hoặc trong dịch
tiết của người bệnh đã nhiễm có nồng độ siêu vi B rất cao và khi người bệnh
tiếp xúc thường xuyên với các yếu tố nguy cơ trong một thời gian dài. Mặt
khác, đa số những người mang siêu vi B mãn tính thường không có triệu
chứng và họ không hề hay biết để dự phòng nguy cơ lây nhiễm cho những
người xung quanh.
Về phương diện dịch tễ học, người ta ghi nhận có ba phương cách lây
nhiễm chính:

v Lây truyền qua đường ngoài tiêu hóa do tiếp xúc với máu, các vật
phẩm của máu
Cách lây nhiễm này thường gặp ở các nhân viên y tế, người được truyền
máu nhiều lần, người mắc bệnh máu khó đông và được lọc máu ngoài thận,…
Ngoài ra, bệnh còn có thể lây qua đường tiêm chích hoặc khi sử dụng các
dụng cụ không đảm bảo vô khuẩn như phẫu thuật, nội soi đường tiêu hóa,
châm cứu, xỏ lỗ tai, xăm mình, chữa răng và nhất là những người nghiện ma
túy sử dụng chung ống tiêm.
HBV có tính đề kháng tương đối và bền vững khi được bảo quản ở nhiệt
độ -20
o
C trong nhiều năm, có thể tồn tại ở 60
o
C trong bốn giờ.
v Lây truyền qua đường tình dục
Máu và các chất dịch của cơ thể như nước bọt, tinh dịch hoặc dịch âm
đạo đều chứa virus.
v Lây truyền từ mẹ sang con
HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sanh hơn là lúc lây qua nhau
thai. Mức độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tùy thuộc vào
hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở
mẹ.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

13

1.4.2. Triệu chứng lâm sàng
- Viêm gan cấp tính

Thời gian ủ bệnh từ 1 - 6 tháng. Một số bệnh nhân có cảm giác như bị
cảm nhẹ, đôi khi không biết mình bị HBV. Một số khác bị vàng da, mệt mỏi,
đau nhức, buồn ói, chán ăn, sốt nhẹ, biến đổi cảm giác (hiện tượng đặc biệt là
người ghiền thuốc lá tự nhiên không thích mùi thuốc lá), đau bụng (dưới sườn
bên phải). Những trường hợp bị viêm nặng sẽ đưa đến gan to, ngầy ngật, khó
ngủ, mê muội, lãng trí hoặc bất tỉnh.
Biểu hiện lâm sàng: tăng nhiệt độ, vàng da (một tuần sau khi bị nhiễm và
có thể kéo dài đến 1 - 3 tháng), gan to, lách to. Hiếm khi thấy bàn tay ửng đỏ
hoặc “spider nevi” (mạch máu li ti kết tỏa thành hình nhện như hoa thị trên
da).
- Viêm gan mãn tính
Phần lớn khi bị viêm mãn tính bệnh nhân hoàn toàn bình thường. Một số
bị viêm mãn tính nặng thì tiếp tục bị các triệu chứng viêm cấp như mệt mỏi,
chán ăn, đau bụng và suy gan.
Biểu hiện lâm sàng: gan to, bàn tay ửng đỏ. Khi bị biến chứng sơ gan có
thể bị ứ nước trong bụng, vàng da, loãng máu, chảy máu trong dạ dày, tĩnh
mạch tỏa lớn từ rốn (do tăng áp làm giãn tĩnh mạch cửa gan), nam vú lớn như
vú nữ, tinh hoàn teo nhỏ (vì gan yếu làm thay đổi cân bằng của các hormone
giới tính).
1.4.3. Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV
v Phòng bệnh
Tiêm chủng vaccine: Sau khi tiêm vaccine, để đánh giá được hiệu quả
bảo vệ của chúng cần làm xét nghiệm anti-HBsAg để phát hiện kháng thể
chống virus đã được hình thành. Khi người bệnh xét nghiệm HBsAg [+] thì
không được tiêm vaccine nữa. Hiện Việt Nam đã có vaccine viêm gan thế hệ
III mới nhất Sci-B-Vac có độ an toàn và tính hiệu quả cao hơn trước rất nhiều.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

14

Tuyệt đối không dùng chung các dụng cụ có thể gây xây xát da, niêm
mạc (dao cạo, bàn chải răng, dụng cụ y tế … hoặc truyền máu) để tránh lây
lan từ người bệnh.
Quan hệ tình dục có bảo vệ, có thể ngăn chặn sự lây nhiễm HBV.
v Điều trị
Khi mắc bệnh viêm gan B, thường sẽ xét nghiệm một mẫu máu của bệnh
nhân để tìm các dấu hiệu của bệnh gan. Hai yếu tố sẽ xem xét kĩ lưỡng là
lượng siêu vi (lượng HBV-DNA) lưu thông trong máu, và các enzyme của
gan có thể cho biết tình trạng tổn thương gan. Kiểm soát lượng siêu vi trong
máu, duy trì lượng enzyme ở mức bình thường, và tăng cường hệ miễn dịch
của bệnh nhân để ngừa bệnh hiệu quả. Hiện nay, có các loại thuốc giúp có tác
dụng chữa bệnh viêm gan B, nhưng không thể chữa khỏi được. Các loại thuốc
này được gọi là interferon và thuốc kháng siêu vi.
- Interferon
Interferon, một chất đạm tự nhiên trong cơ thể, có tác dụng tăng cường
hệ miễn dịch để ngừa bệnh. Các nhà nghiên cứu đã bào chế các loại interferon
tổng hợp có tác dụng giúp hệ miễn dịch chống viêm nhiễm trong gan và tăng
lượng kháng thể chống loại siêu vi này. Interferon có thể giúp cải thiện tình
trạng sức khỏe lá gan và giảm bớt lượng siêu vi trong gan. Việc điều trị bằng
interferon thường diễn ra trong một thời gian nhất định, thường là vài tháng,
và có thể giúp cải thiện vĩnh viễn tình trạng sức khỏe của gan mà không gây
ra triệu chứng kháng siêu vi. Chính vì vậy, interferon là biện pháp điều trị tốt
nhất được nhiều người lựa chọn đầu tiên, do nó có hoạt tính chống virus và
kích thích hệ miễn dịch.
- Thuốc kháng siêu vi
Thuốc kháng siêu vi (dạng thuốc viên hoặc thuốc nước) can thiệp vào
quá trình tái tạo HBV để ngăn chặn tình trạng tái tạo siêu vi HBV mới.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

15

Có bốn loại thuốc kháng siêu vi đã được Cơ quan Quản lý Dược phẩm và
Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận. Các loại thuốc kháng siêu vi khác
nhau ở chỗ, chúng chú trọng tới một bộ phận khác nhau trên bộ gene của siêu
vi. Tuy nhiên, dần dần HBV có thể phát sinh các đột biến giúp siêu vi này tiếp
tục sinh sôi bất kể điều trị bằng thuốc viên kháng siêu vi. Hiện tượng này gọi
là “kháng” siêu vi, vì siêu vi có thể “kháng lại” thuốc kháng siêu vi. Các loại
thuốc kháng siêu vi có thể có tác dụng trong một thời gian để giảm bớt lượng
siêu vi và mức enzyme, tuy nhiên khi hiện tượng kháng thuốc xảy ra thì các
mức này lại bắt đầu tăng cao.
Các nhà nghiên cứu vẫn chưa bào chế được loại thuốc kháng siêu vi hoặc
biện pháp điều trị kết hợp hoàn hảo có tác dụng xóa bỏ hoàn toàn HBV. Các
loại thuốc kháng siêu vi hiếm khi tạo ra các triệu chứng là phản ứng phụ.
Hiện nay FDA chấp nhận 5 thuốc để điều trị viêm gan mãn virus B:
interferon alpha-2b (1992), lamivudine (1998), adefovir dipivoxil (2002) và
entecavir (2005) và peginterferon alpha-2a (tháng 5-2005).
1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B
1.5.1. Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa
miễn dịch (phát hiện kháng nguyên) [5]
HBV cũng tạo ra kháng nguyên “e” hay HBeAg, được phóng thích vào
máu và phát hiện bằng thử nghiệm huyết thanh học. Sự hiện diện HBeAg và
DNA virus lưu hành trong máu là một dấu hiệu chỉ điểm virus đang tăng sinh
và có độ gây nhiễm rất cao. Khi tình trạng nhiễm trùng phục hồi, HBeAg và
HBsAg không còn trong máu, và có dấu hiệu chuyển đổi huyết thanh: xuất
hiện các kháng thể anti-HBe và anti-HBs. Vì vậy, dựa vào nguyên lý tính đặc
hiệu kháng nguyên – kháng thể có thể chẩn đoán HBV bằng kỹ thuật ELISA.

Các bước cơ bản:
- Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết, được gắn trên một bề mặt.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

16

- Kháng thể - antibody (KT) biết trước. Kháng thể này được gắn kết với
enzyme.
- Thêm vào một cơ chất (subtance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và
tạo tín hiệu có thể xác định được.
- Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa
KN - KT. Sự hiện diện của phức hợp KN - KT sẽ quyết định cường độ
sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt
cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh
hưởng đến kết quả xét nghiệm.
1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử
1.5.2.1. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng DNA nhánh (bDNA)
[8]
Là phương pháp phát hiện và định lượng DNA (hoặc RNA) bằng kỹ
thuật lai và khuếch đại tín hiệu trên pha rắn là các giếng thử nghiệm. Phương
pháp được thực hiện theo các bước sau: (1) HBV-DNA nếu có trong mẫu thử
sẽ lai với các đoạn dò đích (target probes), có hai loại: một loại có đầu đặc
hiệu với đoạn dò tóm bắt, một loại có đầu đặc hiệu với DNA nhánh (bDNA).
(2) Trên bề mặt của các giếng thử nghiệm có gắn các đoạn dò tóm bắt
(capture probes). Các đoạn dò này sẽ tóm bắt các đoạn dò đích, đã được lai
với HBV-DNA, nhờ đó đã tóm bắt HBV-DNA lên giếng thử nghiệm. (3) Các

đoạn dò đích, đã lai với HBV-DNA, có đầu đặc hiệu bDNA vẫn được tự do sẽ
được lai với bDNA. (4) Các nhánh của bDNA sẽ được lai với các đoạn dò
phát hiện đã đánh dấu enzyme Alkaline phosphatase, nhờ đó phát hiện được
sự hiện diện của HBV-DNA đã bị tóm bắt trên giếng. Phương pháp này có thể
phát hiện một lượng tối thiểu là 7.10
5
phân tử DNA trong một ml máu.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

17



Hình 1.6. Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA [14]


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

18

1.5.2.2. Phương pháp PCR [1],[3],[22]
v Nguyên tắc
Đây là một kỹ thuật tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào,
cho phép khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vùng trình tự
oligonucleotide đã biết trước. Hai trình tự oligonucleotide này được gọi là
mồi xuôi - bắt cặp với mạch [+] DNA và mồi ngược bắt cặp với mạch [-]

DNA. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu
kỳ gồm ba giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính
Nhiệt độ phản ứng là 94
o
C trong 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử
DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các enzyme
đều dừng lại, phân tử DNA duỗi thẳng ra hoàn toàn, từ đó dễ dàng cho việc
bắt cặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung.
- Giai đoạn bắt cặp
Các primer (đoạn mồi) là các đoạn Nu ngắn (khoảng 20 - 25 Nu) sẽ bắt
cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo nguyên tắc bổ sung. Sự bắt
cặp này sẽ có hai ý nghĩa đặc hiệu: đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn
gene mà ta cần khuếch đại và đặc hiệu theo chiều dài của đoạn gene khuếch
đại.
- Giai đoạn kéo dài
Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờ tác dụng
của enzyme Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu vào các
primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn mồi dài ra và hình thành
nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và một bản sao DNA mới
đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai phân tử DNA
có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu.
Chu kỳ này được lặp lại nhiều lần (30-40 lần), kết quả từ một số lượng
DNA đích ban đầu (N), sau n chu kỳ sẽ tạo thành N x 2
n
bản sao.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

19




Hình 1.7. Nguyên lý PCR [9]

v Các thành phần trong phản ứng PCR
Một phản ứng PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản sau:
- DNA mạch khuôn
DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn vật chất ban đầu cho
phản ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn
hoặc virus. Ngoài ra, RNA cũng là một nguồn vật liệu cho phản ứng khuếch
đại nếu nó được phiên mã ngược thành cDNA. Nồng độ DNA ban đầu trong
phản ứng không cần quá cao, có thể chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho