[ Báo cáo khoa học ] Nghiên cứu thành phần hoá học, tác dụng dược lý và độc tính của quả nhàu việt nam

Bộ Y Tế


Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ











Nghiên cứu
thành phần hoá học, tác dụng dợc lý
và độc tính của quả nhàu Việt nam





Chủ nhiệm đề tài:
TS. Nguyễn Trọng Thông


Cơ quan chủ trì đề tài:

Trờng Đại học Y Hà Nội

6368
12/5/2007

Hà nội - 2005
Bộ Y Tế


Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ




Nghiên cứu
thành phần hoá học, tác dụng dợc lý
và độc tính của quả nhàu Việt nam





Chủ nhiệm đề tài:
TS Nguyễn Trọng Thông
Cơ quan chủ trì đề tài:
Trờng Đại học Y Hà Nội
Cấp quản lý đề tài:

Bộ Y Tế
Th ký đề tài:
TS Vũ Thị Ngọc Thanh

Danh sách những ngời thực hiện chính đề tài
1.TS . Nguyễn Trọng Thông
2.PGS . TSKH. Nguyễn Thới Nhâm
3.TS . Vũ Thị Ngọc Thanh
4.ThS . Phạm Thị Vân Anh
5.ThS . Nguyễn Hoài Trung
6. DS . Đặng Hồng Lâm



Hà Nội - 2005


Các chữ viết tắt

BCMTT : Bạch cầu múi trung tính
CQN : Cao quả nhàu
CY : Cyclophosphamid
DĐVN : Dợc điển Việt Nam
HA : Huyết áp
HCC : Hồng cầu cừu
HPLC : High performence liquid chromatography
IFN : Interferon
IL : Interleukin
IR : Infrared
KTMD : Kích thích miễn dịch

MS : Mass spectrometry
NK : Natural killer cell
NMR : Nuclear magnetic resonance
OA : Ovalbumin
SKC : Sắc ký cột
SKLM : Sắc ký lớp mỏng
TBTHHMC : Tế bào tạo hoa hồng mẫn cảm
TBTQDH : Tế bào tạo quầng dung huyết
TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam
UV : Untraviolet spectroscopy


1
A. Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài
1. Kết quả nổi bật của đề tài
1.1. Đóng góp mới của đề tài
Từ kết quả nghiên cứu thành phần hoá học và nghiên cứu độc tính, tác dụng
dợc lý cho thấy quả nhàu có tác dụng kích thích miễn dịch, chống viêm, giảm
đau, hạ huyết áp, không có độc tính cấp và bán trờng diễn. Kết quả này khẳng
định tác dụng của quả nhàu đã đợc nhân dân ta sử dụng để điều trị đau xơng
khớp, cao huyết áp, bồi dỡng sức khoẻ và cũng đã khẳng định không chỉ rễ
nhàu có tác dụng kích thích miễn dịch, chống viêm, giảm đau, hạ huyết áp mà
quả nhàu cũng có tác dụng kích thích miễn dịch, chống viêm, giảm đau và hạ
huyết áp.
Với kết quả này hy vọng quả nhàu đợc bào chế thành dạng thuốc phù hợp
để đa vào sử dụng trên lâm sàng phục vụ cho công tác chăm sóc và bảo vệ sức
khoẻ nhân dân.
1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể của đề tài)
Chiết xuất bằng các dung môi khác nhau và thông qua sắc ký lớp mỏng và
phơng pháp phổ IR, UV, MS, DEPT, COSY, HMQ cho thấy:

Trong quả nhàu có anthraglycosid, flavonoid, coumarin, triterpennoid,
saponin, polyphenol, dầu béo, alkaloid, tinh dầu, acid hữu cơ, đờng khử, acid
uronic.
Anthraquinon trong quả non 0,56%, quả già 0,55% và trong quả chín 0,39
%. Đã xác định đợc cấu trúc 3 hợp chất: soranjidiol, 1- methoxy 2-methyl 3-
hydroxyanthraquinon, scopoletin là coumarin không màu hình kim, 11 acid béo
trong đó acid béo cha no chiếm 68,85 %(acid linoleic 50,27%, acid oleic 17,79
% còn lại là acid linolenic và palmitoleic).Trong quả nhàu còn có 1 alcol acid no
11 carbon với một chức rợu bậc nhất nhng chúng tôi cha xác định chính xác
đợc cấu trúc.
Trong một gam cao quả nhàu chứa 0,0025 mmol natri; 0,00125 mmol kali;
0,00313 mmol calci; 0,00004 mmol clo; 0,081- 0,098 ppm selen; 1.07- 1,45 ppm
Co; 3,02- 4,94 ppm Cu; 35,8-154 ppm Mn; 206-283 ppm Fe.

2
Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu quả nhàu: miếng mỏng khô, hơi cứng,
màu nâu sẫm, mùi đặc biệt, vị hơi đắng, độ ẩm không quá 10%, tro toàn phần
không quá 6 %, tro không tan trong acid HCL không quá 0,5%, định tính cho
phản ứng dơng của anthranoid, trên sắc ký lớp mỏng có 2 vết màu đỏ sáng và 1
vết màu đỏ đậm anthraquinon, hàm lợng anthraquinon toàn phần không thấp
hơn 0,5%.
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao quả nhàu: thể chất mềm, đồng nhất, màu
nâu sẫm, mùi đặc biệt quả nhàu, vị hơi đắng, độ ẩm không quá 20%, cắn không
tan không quá 15 %, pH 3,5 5,5, tro toàn phần không quá 20%, tro không tan
trong acid HCL không quá 2%, định tính cho phản ứng dơng của anthranoid,
trên sắc ký lớp mỏng có 2 vết màu đỏ sáng và 1 vết màu đỏ đậm anthraquinon,
hàm lợng anthraquinon toàn phần không thấp hơn 1%.
Nghiên cứu độc tính cấp và bán trờng diễn của cao quả nhàu: kết quả cho
thấy cao quả nhàu uống với liều 300 g/kg thể trọng cao gấp 375 lần liều dùng
cho ngời không gây chết chuột trong vòng 72 giờ và không có biểu hiện độc

tính của thuốc trong vòng 7 ngày theo dõi. Trên thỏ uống cao quả nhàu liên tục
trong 30 ngày với liều 6g/kg và 12g/kg thể trọng cao gấp 10 và 20 lần liều dùng
cho ngời không thấy có sự thay đổi tình trạng chung,
thể trọng, số lợng hồng
cầu, bạch cầu, tiểu cầu, kích thớc hồng cầu, số lợng hemoglobin, công thức
bạch cầu, hematocrit, hoạt độ ALT, AST, hàm lợng albumin, cholesterol,
bilirubin, creatinin máu cũng nh hình thái đại thể, và vi thể gan, thận.
Trên 2 mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid và tia xạ
cao quả nhàu liều 6g/kg thể trọng uống liên tục 5 ngày liền và 9 ngày liền đã làm
cải thiện rõ rệt các chỉ số đánh giá chức năng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế
bào cũng nh các chỉ số đánh giá tình trạng chung miễn dịch nh: trọng lợng
lách và tuyến ức tơng đối và số lợng bạch cầu.
Cao quả nhàu có tác dụng giảm đau ở liều 24g/Kg trên mô hình gây quặn
đau bằng acid acetic, tác dụng tơng đơng với aspirin 100 mg/Kg thể trọng.
Cao quả nhàu có tác dụng chống viêm cấp, mạn tính và chống oxyhóa: sau
khi uống cao quả nhàu làm giảm thể tích viêm chân chuột do carragenin gây

3
nên, giảm thể tích dịch và số lợng bạch cầu trong dịch rỉ viêm và giảm trọng
lợng u hạt. Tác dụng này tơng đơng với aspirin liều
150 mg/kg. Trên mô hình
gây tổn thơng tế bào làm tăng gốc tự do bằng tia xạ cao quả nhàu uống liều 5g
và 25g/kg thể trọng liên tục 9 ngày làm giảm rõ rệt hàm lợng MDA, tăng hoạt
độ các enzym chống oxyhoá SOD, GP
x,
GR và khả năng chống oxyhoá toàn phần
của cơ thể (TAS).
Cao quả nhàu có tác dụng hạ huyết áp. Với liều 1,5 g/kg thể trọng, cao quả
nhàu làm hạ huyết áp chó 20- 26 % so với huyết áp ban đầu. Tác dụng này phụ
thuộc liều lợng, liều càng cao tác dụng hạ huyết áp càng mạnh. Tác dụng hạ

huyết áp xuất hiện sau khi uống 30 phút và kéo dài hơn 5 giờ.
2. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cơng đã đợc duyệt
2.1. Tiến độ
Theo đề cơng đợc duyệt đề tài đợc thực hiện trong vòng 24 tháng kể từ
ngày24 tháng 4 năm 2002 đến ngày 24 tháng 4 năm 2004. Nhng do vì đúng vào
thời kỳ dịch viêm đờng hô hấp cấp do vius bùng nổ việc chăn nuôi súc vật gặp
khó khăn nên Bộ Y tế đã cho phép gia hạn thực hiện đề tài đến hết 2005.
2.2. Thực hiện mục tiêu nghiên cứu
Chúng tôi đã hoàn thành đầy đủ các nội dung nghiên cứu theo mục tiêu
trong đề cơng đã đợc hội đồng duyệt:
Đã nghiên cứu phơng pháp chiết xuất, thành phần hoá học trong cao quả
nhàu.
Đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu và cao quả nhàu.
Đã nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm cấp, mạn tính.
Đã nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá ở mô hình gây tổn thơng bằng tia
xạ trên thỏ.
Đã nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên hai mô hình gây suy giảm
miễn dịch bằng tia xạ và cyclophosphamid trên chuột nhắt trắng.
Đã nghiên cứu tác dụng trên tim và huyết áp ở chó, trên cơ trơn thành mạch
của tai thỏ cô lập và trên tim ếch cô lập.
Đã nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt và bán trờng diễn trên thỏ.

4
2.3. Kết quả đào tạo
Kết hợp thực hiện nội dung nghiên cứu với đào tạo đề tài đã góp phần cho
sự đào tạo thành công 02 cao học (một ngành Y, 01 ngành Dợc), 01 bác sỹ, 02
dợc sỹ đại học và 1 sinh viên Y6 chuẩn bị bảo vệ, 1 sinh viên đạt giải nhì
Vifotec.
Kết quả của đề tài đã đợc đăng tải trong 9 bài báo ở tạp chí Dợc học, tạp
chí nghiên cứu Y học Đại học Y Hà Nội và tạp chí Dợc liệu.

2.4. Đánh giá về sử dụng kinh phí
- Tổng kinh phí đợc duyệt: 150 triệu
- Kinh phí đợc cấp: 130 triệu
- Kinh phí đợc quyết toán: 130 triệu
Nhìn chung kinh phí ít so với nội dung đã thực hiên, các tác giả phải sử
dụng thêm các nguồn kinh phí từ các đề tài khác.

5
B. Nội dung báo cáo kết quả đề tài
1. Đặt vấn đề
Cây nhàu (Morinda citrifolia L. Rubiaceae), một trong những dợc liệu
đợc nhân dân sử dụng lâu đời với mục đích nâng cao sức đề kháng của cơ thể,
rễ nhàu chữa bệnh tăng huyết áp, chống viêm [4, 37]. Năm 1981, dịch chiết
toàn phần rễ cây nhàu dạng sao và cha sao đã đợc Đào Văn Phan và Nguyễn
Trọng Thông nghiên cứu thấy có tác dụng giảm đau, chống viêm và hạ huyết áp
trên súc vật thực nghiệm [49]. Năm 1996, Phan Thị Phi Phi và cộng sự nghiên
cứu trên invitro, invivo chứng minh là có tác dụng kích thích miễn dịch thông
qua tác dụng kích thích hồi phục các chỉ số miễn dịch ở súc vật thực nghiệm, các
tế bào ngời nuôi cấy in vitro bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia gamma và tiêm
cyclophosphamid. Trần Ngọc Dung và cộng sự (2000) dùng viên M, chế phẩm từ
dịch chiết rễ nhàu có tác dụng tốt cho bệnh nhân ung th vòm họng sau xạ trị.
Cây nhàu là cây lu niên, thời gian trồng để cho thu hoạch rễ là sau 6-8
năm. Nh vậy muốn phát triển và nhân rộng nguồn dợc liệu từ rễ nhàu làm
thuốc sẽ gặp nhiều khó khăn về nguyên liệu vì trồng cây nhàu để khai thác rễ đòi
hỏi phải cần nhiều năm.Trong khi đó kinh nghiệm dân gian không chỉ dùng rễ
nhàu làm thuốc mà còn dùng quả nhàu làm thuốc bổ nâng cao sức đề kháng của
cơ thể. Đặc biệt gần đây nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu về quả
nhàu trồng ở Hawaii và đa ra nhiều nhận xét khả quan về tác dụng chống khối u
và tác dụng kích thích miễn dịch [61, 62, 70, 71, 72, 81, 82, 83, 84, 97, 105,
107]. Tuy vậy, ở Việt Nam nghiên cứu khoa học chủ yếu tập trung vào rễ nhàu

nh về tác dụng dợc lý, thành phần hoá học, độc tính của rễ nhàu [18, 25, 27,
35, 43, 45, 46, 49, 56, 57, 58]. Trong khi đó nhân dân dùng rất nhiều các sản
phẩm từ quả nhàu và thậm chí có xí nghiệp đã sản xuất thuốc từ quả nhàu nhng
cha có tác giả nào nghiên cứu một cách tơng đối toàn diện về quả nhàu. Xuất
phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với mong muốn xác
định tính khoa học các tác dụng và độc tính của quả nhàu Việt Nam đã đợc dân
gian sử dụng với các mục tiêu nghiên cứu sau:
1. Nghiên cứu thành phần hoá học của quả nhàu.
2. Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của cao quả nhàu.
3. Nghiên cứu một số tác dụng dợc lý của cao quả nhàu trên thực nghiệm.

6
Chơng 1
Tổng quan tài liệu
1.1. Tổng quan về cây Nhàu
1.1.1. Đặc điểm nhận dạng
Cây nhàu còn gọi là cây ngao núi, nhầu núi, cây giầu, tên khoa học là
Morinda citrifolia L., họ cà phê Rubiaceae [4, 37, 51]. Đây là cây lu niên, mọc
tự nhiên ở những nơi ẩm thấp dọc bờ sông bờ suối. ở Việt Nam cây mọc chủ yếu
ở miền Nam từ Quảng Bình trở vào, không thấy mọc tự nhiên ở miền Bắc. Trên
thế giới cây nhàu thấy có ở nhiều nớc nh Thái Lan, ấn Độ, Malaixia đặc biệt
đợc trồng rất nhiều ở quần đảo Tahiti thuộc các nớc vùng Trung Mỹ [61, 62,
105].
Cây nhàu là cây thân mộc, cao từ 6-8 m, có nhiều cành to, lá mọc đối
xứng nhau hình bầu dục, đỉnh lá nhọn, mép lá có răng ca, phiến lá mỏng và dai,
có 6-7 gân lá, cuống dài 10-12mm. Hoa nhàu hình ống loa kèn, màu trắng mọc
thành chùm ở nách lá, nở vào tháng 12. Quả hình trứng, dài 4-5cm, mọc thành
chùm, lúc còn non có mầu xanh, sau chín có mầu trắng hồng hoặc vàng, quả
chín vào tháng 7-8.

ảnh 1.1. Cành, lá, hoa và quả nhàu

7

ảnh 2: Quả nhàu

1.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
* Nghiên cứu về rễ: cây nhàu đợc quan tâm nghiên cứu từ rất sớm.
Youngken (1957) đã xác định thành phần hoá học chính trong rễ nhàu là
anthraglycosid, ngoài ra còn có alcaloid, flavonoid và một số thành phần khác
[120].
Younos và cộng sự (1990) nghiên cứu chứng minh dịch chiết rễ cây nhàu
có tác dụng giảm đau, thông qua hệ thống thần kinh trung ơng [121].
* Nghiên cứu về trái: bắt đầu từ những năm 1990, ở Mỹ nhiều công trình
nghiên cứu về cây nhàu đã đợc công bố, đặc biệt các công trình này tập trung
nhiều về thành phần hoá học và tác dụng của trái cây nhàu trồng ở Hawaii.
Theo Hirazumi và cộng sự (1994 - 1999) cho thấy dịch chiết quả nhàu có
tác dụng chống ung th trên thực nghiệm [80, 81, 82, 83, 84].
Mới đây, dịch chiết quả nhàu đã đợc nghiên cứu ở Mỹ tại Trờng Đại
học Stanford, California, Los Angeles và Trờng Đại học Hawaii; ở Anh tại
Trờng Y Lon don; ở Pháp tại Trờng Đại học Meets. Nói chung, các kết quả
thu đợc là phù hợp với nhau và đều kết luận là dịch chiết quả nhàu có tác dụng
làm hạ huyết áp. Các nhà nghiên cứu ở Hawaii lần đầu tiên đã chiết ra trong dịch

8
chiết chất scopoletin. Chất này làm giãn những mạch máu bị co thắt, làm cho tim
không phải làm việc quá tải khi bơm máu vào hệ tuần hoàn, nh vậy làm cho
huyết áp trở về bình thờng [105, 115].
Dịch chiết quả nhàu đợc nghiên cứu làm thuốc chống ung th, nhiều
công trình nghiên cứu quan trọng về tác dụng này của quả nhàu đã đợc trình

bày tại các Hội nghị thờng niên của Hội Ung th Mỹ lần thứ 83, 84, 85. Theo
các nhà nghiên cứu ở khoa Y John Burns Trờng Đại học Hawaii cho thấy tác
dụng chống ung th trên chuột nhắt cấy truyền ung th ổ bụng thể hiện là thời
gian sống sót tăng 105 - 123% so với lô chuột chứng không ăn quả nhàu.
Một hợp
chất mới đợc chiết trong dịch quả nhàu đã đợc công bố gọi là damnacanthal. Chất
này có tác dụng chuyển hoá các tế bào tiền ung th nuôi cấy invitro thành tế bào
bình thờng [89, 106, 113]. Sau đó Tomouri Hiramatsu và cộng sự đã công bố
trên tạp chí Cancer Letters một công trình khẳng định là damnacanthal trong quả
nhàu có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào tiền ung th [79].
Theo Yudah Folkman ở Trờng đại học Harvard thì dịch chiết quả nhàu
có tác dụng làm giảm lợng máu tới khối u giống nh chất squalamin trong dầu
gan cá mập thông qua ức chế sự tạo tân mạch làm ngăn cản sự phát triển khối u
[105, 114, 115].
Dịch chiết quả nhàu còn đợc dùng trong các bệnh khác nh làm giảm sự
tiết dịch của niêm mạc: viêm xoang, viêm phế quản, hen, hạ thấp sự tiết acid ở
dạ dày: loét dạ dày, tá tràng, trào ngợc dịch dạ dày, các bệnh tự miễn: viêm
khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến, bệnh tiểu đờng týp 2, viêm tuyến giáp, bệnh
Crohn, bệnh luput ban đỏ, bệnh nhiễm khuẩn, nấm: Ecpet typ 1 và 2, viêm gan
mạn tính. Sở dĩ dịch chiết quả nhàu có nhiều tác dụng nh vậy vì trong dịch trái
có chất xeronin, một chất đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và hoạt động
của tất cả các tế bào trong cơ thể [105, 115].
Theo một số tác giả trên thế giới, trong quả nhàu có soran
j
idiol,
1- methoxy- 2 methyl- 3 anthraquinon; 1-oxy-2,3- dimethoxy anthraquinon;
2,6- dioxy-octanoyl (-- d- glucopyranosyl); rutin, acid asperulosid; 7- sterol
(sitosterol; ergosterol, squalen, lanosterol và lupeol). Ngoài ra, trong quả nhàu

9

còn có 32 yếu tố vi lợng trong đó có selen trong cùi quả và hạt <0,00014% [91,
92, 97, 100, 107, 112, 113].
*Nghiên cứu về lá: gần đây có một số công trình nghiên cứu về thành
phần hoá học và tác dụng dợc lý của lá cây. Theo Sang S. và cộng sự (2001)
trong lá nhàu có nhiều iridoid glycosid, chất này có tác dụng ức chế AP-1- một
protein có hoạt tính quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh ung th [101,
102, 103].
1.1.3. Tình hình nghiên cứu trong nớc
Cây nhàu đợc quan tâm nghiên cứu từ những năm cuối thập niên 60. Các
công trình nghiên cứu tập trung vào rễ cây.
- Tác dụng trên huyết áp:
Đặng Vân Hồ ở Viện Bài Lao - Ngô Quyền (Sài Gòn cũ) là ngời đầu tiên
quan tâm nghiên cứu rễ nhàu điều trị bệnh cao huyết áp. Sau này Đặng Hồng
Vân, Nguyễn Tờng Vân, Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1981) đã chứng
minh dịch chiết rễ nhàu có tác dụng an thần, hạ huyết áp, giảm đau. Cơ chế hạ
huyết áp mạnh và kéo dài của cao rợu rễ nhàu đợc chứng minh là do hủy
adrenalin, phong toả thần kinh thực vật và giãn mạch ngoại vi [49].
Dùng dịch chiết rễ nhàu cho các bệnh nhân cao huyết áp, Phạm Khuê và
cộng sự đã chứng minh tác dụng hạ huyết áp rõ rệt ở ngời cao tuổi, hạ nhiều
nhất từ 30-50 mmHg [35].
- Tác dụng trên miễn dịch:
Phan Thị Phi Phi, Phạm Huy Quyến và cộng sự (1996) đã xác định tác
dụng KTMD của dịch chiết rễ cây nhàu toàn phần trên chuột nhắt và trên invitro.
Trần Ngọc Dung và cộng sự (2000) đã nghiên cứu ứng dụng về tác dụng KTMD
của viên M chế từ dịch chiết cây nhàu để điều trị hỗ trợ cho bệnh nhân ung th
vòm họng sau xạ trị.
Kết quả cho thấy viên M có tác dụng phục hồi số lợng các
tế bào miễn dịch và kéo dài đời sống của các bệnh nhân này so với đối chứng
[18, 45, 46].
Đỗ Quốc Việt (2000) chứng minh damnacanthal có trong dịch chiết rễ

nhàu có tác dụng chống ung th trên thực nghiệm [57].

10
- Tác dụng giảm đau, chống viêm:
Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1981) đã chứng minh cao lỏng rễ
nhàu có tác dụng giảm đau trên thực nghiệm [49]. Trần Ngọc Ân và cộng sự đã
ứng dụng điều trị cho những bệnh nhân mới bị viêm khớp thấy có tác dụng tốt,
tuy nhiên đối với bệnh nhân ở giai đoạn II của bệnh, tác dụng của thuốc còn
cha mạnh.
- Tác dụng hạ đờng huyết:
Đào Văn Phan, Nguyễn Khánh Hoà và CS (2002) thử tác dụng trên đờng
huyết của rễ nhàu liều 200mg, 300mg đờng tiêm màng bụng và liều 1g, 1,5g
đờng uống không làm hạ đờng huyết trên chuột nhắt trắng bình thờng. Tuy
nhiên, trên chuột gây tăng đờng huyết thấy thuốc có tác dụng làm hạ mức
đờng huyết.
- Nghiên cứu về thành phần hoá học
Theo Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thu Hằng [25], trong rễ nhàu chứa:
anthraglycosid 0,35%-1,54%; ngoài ra trong thành phần của rễ nhàu còn chứa
flavonoid, tanin. Theo Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông và cộng sự, trong rễ
nhàu có chứa selen [49].
Đỗ Thị Nguyệt Quế (1997) đã nghiên cứu thành phần hoá học trong thân
cây nhàu, ứng dụng qui hoạch thực nghiệm chiết xuất tối u hoạt chất trong thân
và rễ để bào chế viên M chứa dịch chiết toàn phần thân và rễ cây nhàu [43].
Đỗ Quốc Việt và cộng sự (2000) đã phân lập và xác định cấu trúc hai
anthraglycosid là damnacanthal và nordamnacanthal từ thân cây nhàu [57].
-Nghiên cứu về độc tính:
Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1981) nghiên cứu độc tính cấp và
bán cấp của cao rợu rễ nhàu cho thấy với liều 0,2-8 g dợc liệu khô/kg cân
nặng cha thấy có biểu hiện độc tính trên chuột và thỏ [49].
Theo nghiên cứu của Viện Dợc liệu cho thấy với liều 300g/ ngày cao gấp

1000 lần liều dùng cho ngời dịch chiết rễ nhàu không gây độc tính cấp trên
chuột. Theo Đàm Trung Bảo, Phó Đức Thuần, LD
50
trên chuột nhắt trắng theo

11
đờng uống của dịch chiết rễ nhàu là 181,47g/kg cân nặng và với liều 0,5 ml
dịch chiết 5%/kg dùng liên tục 30 ngày không có dấu hiệu độc [trích từ 45].
Về độc tính trên bộ máy di truyền, theo Trần Thanh Hơng và cộng sự
(1995) thấy dịch chiết rễ nhàu không thấy làm rối loạn số lợng, cấu trúc nhiễm
sắc thể ở liều điều trị và liều gấp 20 lần liều điều trị [27].
- Nghiên cứu về sản xuất:
Sau khi các công trình nghiên cứu khoa học về thành phần hoá học và tác
dụng dợc lý của rễ nhàu đợc công bố, các xí nghiệp dợc phẩm trong nớc đã
sản xuất các chế phẩm chứa dịch chiết rễ nhàu toàn phần dùng trong các bệnh
tăng huyết áp, suy giảm miễn dịch sau xạ trị, bồi bổ sức khoẻ Trờng Đại học
Dợc Hà Nội bào chế thuốc dạng viên nang 0,25g và viên bọc đờng 0,15g đặt
tên là M (viết tắt của chữ Morinda). Dự án KC 04. DA 04 giữa trờng Đại học Y
Hà Nội và xí nghiệp Dợc phẩm Trung ơng 25 sản xuất viên nang 0,5g chứa
dịch chiết cây nhàu toàn phần đặt tên là Uphamorin, đặc biệt xí nghiệp Dợc
phẩm Trung ơng 25 sản xuất sản phẩm quả nhàu ngâm rợu đóng chai 750ml,
trà quả nhàu hoà tan gói 5g và 10g.

12
Chơng 2
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1. Đối tợng
- Cao quả nhàu dùng trong nghiên cứu là dạng cao mềm, đợc sản xuất
theo qui trình sau:

Quả nhàu già thu hoạch vào tháng 6, sấy khô, tán thành bột, chiết xuất
trong hỗn hợp dung môi cồn ethylic và nớc bằng phơng pháp ngấm kiệt thu
đợc dịch chiết cồn (dung dịch A). Phần bã còn lại đem chiết xuất tiếp với một
dung môi phân cực, thu đợc dịch chiết B. Trộn đều và cô đặc hỗn hợp hai dịch
chiết A và B, cho bay hơi hết cồn đợc cao quả nhàu toàn phần. Qui trình trên
đợc tiến hành tại Công ty Nacatifoods. Cao quả nhàu toàn phần tỷ lệ 1:5, khi sử
dụng đợc pha loãng bằng nớc đến tỷ lệ thích hợp cho từng nghiên cứu.
Trong nghiên cứu xác định thành phần tinh dầu chúng tôi dùng quả nhàu
chín để chiết xuất.
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng, cả hai giống, tuổi 6 tuần,
nặng 20 2 gam do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ơng cung cấp.
- Chuột cống trắng cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lợng 150-180g
- Thỏ chủng Orytolagus Cuniculus, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lợng
2 -2,5 kg do Trung tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây cung cấp.
- ếch cả hai giống khoẻ mạnh, cân nặng 100-120g.
- Chó, cả 2 giống khoẻ mạnh, cân nặng 8-12kg.
Súc vật đợc nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nớc uống tại phòng
thí nghiệm Bộ môn Dợc lý, Trờng đại học Y Hà Nội từ 3- 7 ngày trớc khi
nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu.
2.2. Dụng cụ, hoá chất nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu hoá học
- Dung môi, hoá chất cần thiết cho nghiên cứu: ethanol dùng để chiết xuất,
đạt tiêu chuẩn DĐVN III; methanol, Singapore, loại công nghiệp; methanol,

13
Trung Quốc, loại PA; methanol, Prolabo, loại dùng cho HPLC; chloroform,
Singapore, loại công nghiệp; chloroform, Trung Quốc; aceton, Singapore, loại
công nghiệp; ethylacetat, Trung Quốc, loại PA; benzen, Trung Quốc, natri
hydroxid, Trung Quốc.
Các dung môi loại công nghiệp đều đợc chng cất lại ở nhiệt độ thích hợp

trớc khi dùng.
- Dụng cụ, thiết bị:
. Kính hiển vi Olympus; tủ sấy Gallen Kamp; máy cô chân không
(Rotavapor R - 3000 - Bchi); tủ sấy chân không SHELLAB (Mỹ); cân
phân tích: Libror AEL - 40SM (Shimadzu, Japan); bản nhôm tráng sẵn
Kieselgel 60F 254 (20 x 20cm), (Merck, Art 5554).
. Máy siêu âm Sonorex (Brandson) của Pháp.
. Máy cô quay Biichi chân không, đèn tử ngoại Camag ở bớc sóng 254
nm và 365 nm; cột sắc ký các loại.
. Máy đo phổ cộng hởng từ hạt nhân Brucker Avance 500, 500 MHz
của Viện Hoá học thuộc Viện Khoa học Việt Nam, Hà Nội.
. Máy đo phổ khối Hewlette Packard PH 5989B của Viện Hoá học
thuộc Viện Khoa học Việt Nam, Hà Nội.
. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC- LC- 10AD) của hãng
Shimadzu, Nhật Bản.
. Các dụng cụ thí nghiệm thông thờng khác.
2.2.2 Nghiên cứu về độc tính và tác dụng dợc lý
- Hoá chất và máy huyết học tự động ABC (Animal Blood Counter) của
hãng Ugo- Basile, Italy.
- Hoá chất và máy xét nghiệm sinh hoá máu tự động Screenmaster của
hãng Hospitex Diagnostic, Italy.
* Nghiên cứu tác dụng chống viêm, giảm đau
- Aspegic gói 500mg (hãng Laboratoires Synthelabo).
- Hoá chất đủ tiêu chuẩn thí nghiệm: carrageenin, amiant, formaldehyd,
natri clorid, acid acetic

14
- Phù kế Plethysmometer No 7280, Mâm nóng (hot plate) của hãng Ugo -
Basile (Italy).
* Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá:

- Belaf: dạng viên nang mềm của Hàn Quốc, mỗi viên chứa selen 50mg,
vitamin A 5000UI, vitamin C 500 mg, vitamin E 400 UI.
- Hoá chất: acid thiobarbituric, KCl, heparin của Hãng Merck- Đức.
Các kít định lợng SOD (superoxid dismutase), GPx (glutathion
peroxidase), GR (glutathion reductase), TAS (total antioxidant status) của hãng
Randox.
* Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch:
- Nhũ dịch OA (Ovalbumin + Al(OH)
3
): dùng làm kháng nguyên gây mẫn
cảm cho chuột.
- Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin): nồng độ 1%, dùng làm kháng
nguyên đối chứng để kiểm tra mức độ của phản ứng quá mẫn chậm của chuột với
kháng nguyên OA đã mẫn cảm.
- Hồng cầu cừu (HCC): máu tĩnh mạch cừu đợc lấy trong điều kiện vô
trùng, bảo quản trong dung dịch Alsever (glucose 24,6g, natricitrat 9,6g,
natriclorid 5,05g, nớc cất vừa đủ 1200 ml, pH 6,1), ở nhiệt độ 4
0
C, sử dụng
trong thời hạn 2 tuần.
- Cyclophosphamid: dạng thuốc bột, biệt dợc Endoxan lọ 200 mg, lô sản
xuất 2A510 của hãng ASTA Medica, Đức.
- Levamisol dạng bột trắng, hàm lợng 98,6% do phòng Hoá lý I, Viện
Kiểm nghiệm Trung ơng, Bộ Y tế cung cấp.
- Kính hiển vi quang học Olympus CH 20, Nhật.
- Máy chiếu tia gamma: máy Chicobalt - Picker của Tiệp khắc, sử dụng
nguồn cobalt 60.
* Nghiên cứu tác dụng trên huyết áp, tim mạch:
- Các hoá chất: adrenalin, nicotin, acetylcholin của xí nghiệp Dợc phẩm
Trung ơng I.

15
- HA kế thuỷ ngân Ludwig.
- Buồng nuôi cơ quan cô lập của hãng Ugo- Basile, Italy.
2.3. Phơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu thành phần hoá học
2.3.1.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ: Bột quả nhàu đợc chiết xuất theo
quy trình sau thu đợc các dịch chiết cho phản ứng với các thuốc thử đặc hiệu
theo phơng pháp của trờng Đại học Dợc khoa Rumani để tìm các nhóm hoạt
chất.
Bột dợc liệu
Ether
Lọc
KOH10%

Bã Dịch A
Cồn 90
Lọc HCl H
2
O
Lọc H
2
SO
4

Dịch B Cặn A1 Dịch A
2

Bã B1 B2 B3 B4 B5
Nớc
HCL 10%
Đun nóng, lọc
Bã + Dịch C Thử với thuốc thử đặc hiệu

Bỏ đi

16
2.3.1.2. Khảo sát hợp chất Antharaquinon
a/ Định tính: trên bột dợc liệu
* Soi kính hiển vi bột dợc liệu : lấy một ít bột quả nhàu đã nghiền mịn
cho lên một lam kính. Nhỏ một vài giọt NaOH 5%. Soi kính hiển vi để quan sát.
* Vi thăng hoa: lấy 2g bột dợc liệu đã nghiền mịn cho vào chén sứ, nhỏ
một giọt H
2
SO
4
, trộn đều. Đun cất cho bay hết hơi acid và nớc. Dùng một lam
kính đậy lên chén sứ, mặt trên có bông gòn thấm nớc và quan sát màu sắc của
khói bám trên lam kính.
Sau đó soi kính hiển vi những tinh thể và nhỏ một giọt NaOH 5% để quan
sát sự thay đổi của các vi tinh thể.
* Phản ứng với các thuốc thử hoá học
- Phản ứng Borntrager:
+ Bột dợc liệu: Lấy khoảng 10g bột dợc liệu cho vào bình nón, thêm
benzen cho thấm đều và ngập mặt dợc liệu khoảng 1cm, lắc kỹ và gạn benzen
vào bình gạn. Cho vào bình gạn 5ml NaOH 10%, lắc kỹ. Để yên 5 phút, quan sát
mầu sắc lớp kiềm phía dới.

+ Bã dợc liệu sau khi chiết hết dẫn chất quinon tự do bằng benzen, thêm
10 ml H
2
SO
4
10% tiếp tục chiết với benzen bằng cách đun hồi lu. Dịch benzen
thêm 5 ml NaOH 10% lắc đều. Để yên 5 phút, quan sát lớp kiềm ở phía dới .
- Phản ứng với Magnesi acetate

Lấy khoảng 10g bột dợc liệu chiết với 50 ml cồn, dịch chiết cồn cô còn
khoảng 5-6 ml. Lấy khoảng 0,5 ml dịch lọc + 1 giọt magnesi acetate 1%, quan
sát màu của dung dịch.
Sắc ký lớp mỏng
Dịch chấm sắc ký: anthraquinon hoà tan trong methanol
Bản mỏng: silicagel GF 254 tráng sẵn của Merck
Hệ dung môi: benzen- chloroform - acid acetic (9:1,5:0,5)

17
Phát hiện vết: soi đèn UV365nm và thuốc thử dung dịch NaOH 5% trong
methanol.
b/ Định lợng
:
- Định lợng bằng phơng pháp cân của có cải tiến:
Cân chính xác khoảng 10 g dợc liệu. Đun cách thuỷ trong bình nón 250
ml trong 1 giờ với 100 ml benzen và 15 ml H
2
SO
4
20%, lọc qua bông vào bình
gạn, rữa bông với 5 ml benzen. Thêm vào bã 50 ml benzen nữa và đem cách thuỷ

sôi 30 phút, lọc chiết qua bông vào bình gạn nói trên. Thêm vào bã 50 ml benzen
và tiếp tục nh trên. Thêm vào bình nón có bã dợc liệu, hai lần, mỗi lần 20 ml
benzen và lọc qua bông trên. Sau đó, lắc dịch chiết benzene với 50 ml dung dịch
amoniac trong 5 phút. Sau khi để yên, tách lớp kiềm ở dới, chiết lớp benzen còn
lại bằng amoniac mỗi lần 30 ml đến khi lớp kiềm không mầu, tập trung các dịch
nớc kiềm và acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 10 % đến PH = 3. Dịch
acid đợc lắc lại với benzen đến khi dịch benzen không mầu. Dịch benzen đợc
làm khan bằng Na
2
SO
4
khan và bốc hơi hết benzen. Sấy lúc đầu 60
0
C sau 80
0
C đến
khi khối lợng không đổi.
Hàm lợng anthraquinon có trong dợc liệu: X (%) =
hmm
m
.
11
2

x100
Trong đó:
m
1
: khối lợng dợc liệu ban đầu (g)
m

2
: khối lợng cắn sau khi sấy đến khối lợng không đổi (g)
h: độ ẩm của dợc liệu (%)
Sau đó kiểm tra cắn định lợng bằng SKLM với
+ Điều kiện sắc ký nh sau:
. Chất hấp phụ: silicagel F245 sắc ký lớp mỏng tráng sẵn trên bảng
nhôm (Merck).
. Dịch chấm sắc ký: cắn định lợng dợc liệu quả nhàu bằng phơng
pháp cân hoà trong benzen.
. Hệ dung môi: benzene- ethylacetat - acid formic (75: 25: 1).
. Thuốc thử phát hiện: KOH 1% trong cồn và soi UV
365
nm .



18
Chiết xuất và phân lập các hợp chất:
+ Phơng pháp 1:

100 g cao quả nhàu
n-Hexan 4 lần
n- Butanol 4 lần

Dịch chiết (vàng, rất sạch)
Cô

Cắn khô (2,2%)
SKC
DM: benzen: chloroform: acid acetic(9:1:0,5)

Hex1- Hex5


Hex2 (100 mg)
SKC
DM: benzene: chloroform : acid acetic(9:1:0,5)
C1 tinh khiết








19
+ Phơng pháp 2:
Cao quả nhàu 100g
Na
2
CO
3
5%
Acid hoá = HCl 10%, pH3-4
Lọc chân không lấy tủa

SKC
DM: Toluen-dichloromethan tỷ lệ khác nhau

Bốc hơi
dung môi


SKC SKC
DM: toluen DM:toluen:
-ethylacetat dichloromethane
(9,5: 0,5) (9:1)


Hợp chất C
2

12 mg
Hợp chất C
3

25 mg
Hợp chất C
4

10 mg
Hợp chất C
5

30 mg

Tủa T (13,1 g, nâu sẫm)
Thu 6 phân đoạn từ T1-T6
Cắn T
3
(rắn mầu
vàng, 150 mg)
Cắn T
4
(rắn mầu
vàng, 250 mg)


20
* Nhận dạng các chất phân lập đợc:
Xác định cấu trúc và định danh các chất phân lập đợc từ quy trình chiết
xuất, phân lập ở mục trên thông qua :
HPLC, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ cộng hởng từ hạt nhân, phổ
khối.
2.3.1.3. Nghiên cứu về tinh dầu
* Chiết xuất tinh dầu nhàu từ quả chín bằng phơng pháp lôi cuốn từ hơi
nớc
* Xác định tính chất và một số hằng số vật lý của tinh dầu nhàu
- Nhận xét cảm quan:
Tinh dầu ở dạng lỏng, sánh, trong, màu vàng nâu, mùi hôi khó chịu, vị cay
nóng, có cảm giác bỏng.
- Xác định các hằng số vật lý:
+ Tỷ trọng:

Xác định tỷ trọng bằng phơng pháp cân với dụng cụ là lọ Picnomet 10ml,
nhiệt độ phòng 26
o
C, cân bằng cân SARTORIUS.
+ Năng xuất quay cực
Đo bằng triền quang kế mODDp.20 Bellingham- Stanley L.t.d
+ Độ tan trong cồn 70
o
C
Cho 1 ml tinh dầu vào erlen 50 ml có nút mài, cho cồn từ buret xuống
mỗi lần, 2ml, lắc đều cho đến khi nào tan hết (dịch trong suốt) đo thể tích cồn
sau mỗi lần cho cồn xuống, ngâm erlen vào nớc 25
o
C. Nếu nhiệt độ phòng
cao hơn 25
o
C thì có thể hoà tan ở ngoài không cần ngâm trong nớc. Chỉ sau
khi dung dịch trở nên trong suốt mới ngâm erlen vào nớc có nhiệt độ thích
hợp để đa nhiệt độ hoà tan của dung dịch về 25
o
C. Nếu không có hiện tợng
đục trở lại thì xem là đợc và ghi lợng cồn đã dùng.
+ Chỉ số khúc xạ
Đo bằng khúc xạ kế OPL No 119


21
* Định lợng tinh dầu:
Định lợng theo phơng pháp ghi trong Dợc điển Việt Nam III tập 3
trang 494.

* Xác định thành phần hoá học trong tinh dầu:
Sử dụng sắc ký khí (skk) kết hợp với khối phổ để xác định thành phần hoá
học của tinh dầu.
+ Điều kiện sắc ký
Mẫu pha loãng trong dung môi CH
2
Cl
2
tỷ lệ 1/100 Mẫu/CH
2
Cl
2
phân
tích trên máy Fisons Instruments.
Cột mao quản BP
5
dài 50 mm, đờng kính 0,32 mm, dày 0,25àm.
Khí đốt: He.
áp suất hơi Psi.
Thể tích mẫu: 1 àl.
Nhiệt độ buồng tiêm: 250
o
C.
+ Khối phổ
Máy CTC/MIS GC 8000 series MD 800 Mode Fullscan FC43.
Thời gian quét một scan 0,9 sec.
Mass : 29 550 (đ.v.c)
2.3.1.4. Nghiên cứu chất béo
Xác định acid béo trong quả nhàu bằng phơng pháp UV, HPLC, IR, NMR.
2.3.1.5 Xác định một số nguyên tố vô cơ trong quả nhàu:

- Dùng phơng pháp quang kế ngọn lửa để xác định ion Na, K, Ca , Clo
- Dùng phơng pháp kích hoạt notron để xác định selen, Mn, Co, Fe
2.3.2. Nghiên cứu độc tính của cao quả nhàu
2.3.2.1. Nghiên cứu độc tính cấp [119]
Thử độc tính và xác định LD
50
của cao quả nhàu trên chuột nhắt trắng
bằng phơng pháp Litchfield - Wilcoxon. Chuột nhắt trắng, nhịn đói 12 giờ,

22
đợc chia thành các lô khác nhau, mỗi lô 10 con, uống cao quả nhàu với liều
tăng dần để xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều cao nhất gây
chết 0%. Chuột đợc theo dõi tình trạng chung trong suốt 7 ngày và tỷ lệ chết
trong 72 giờ của từng lô sau khi uống thuốc.
2.3.2.2. Nghiên cứu độc tính bán trờng diễn [119]
Thỏ thí nghiệm đợc chia thành 3 lô
- Lô chứng (n=10): uống dung môi là nớc cất.
- Lô trị 1 (n=10): uống cao quả nhàu liều 6g/kg trọng lợng thỏ, gấp 10
liều dùng trên ngời.
- Lô trị 2 (n=10): uống cao quả nhàu liều 12g/kg trọng lợng thỏ, gấp 20
lần liều dùng trên ngời.
Tất cả các thỏ đợc uống dung môi hoặc thuốc mỗi ngày một lần vào buổi
sáng, với thể tích 3 ml/kg trọng lợng thỏ, liên tục trong 30 ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi trớc và trong quá trình nghiên cứu:
* Tình trạng chung, thể trọng của thỏ.
* Đánh giá chức phận tạo máu thông qua các chỉ số: số lợng hồng cầu, số
lợng huyết sắc tố, thể tích trung bình hồng cầu, số lợng bạch cầu, công thức
bạch cầu, số lợng tiểu cầu và hematocrit [32, 54, 55].
* Đánh giá chức năng gan mật thông qua định lợng một số enzym và một
số chất: AST (aspartat amino transferase), ALT (alanin amino transferase);

bilirubin toàn phần, bilirubin trực tiếp, cholesterol và albumin [32, 59].
* Đánh giá chức năng thận bằng định lợng creatinin huyết thanh [32, 59].
* Cấu trúc đại thể và vi thể của gan và thận.
Tất cả các xét nghiệm trên đợc đánh giá tại 3 thời điểm: trớc uống
thuốc, sau uống thuốc 15 ngày và 30 ngày. Riêng về hình thái đại thể và các xét
nghiệm về cấu trúc vi thể gan, thận đợc đánh giá tại 2 thời điểm: sau uống
thuốc liên tục 30 ngày và sau khi ngừng uống thuốc hoàn toàn 30 ngày (đánh giá
khả năng phục hồi).