Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A.flaws và định lượng độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật ELISA trong một số thực phẩm tại hà nội

Bộ y tế
Viện dinh dỡng
^\[]






báo cáo kết quả đề tài nghiên cứu khcn


Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A. flavus
và định lợng độc tố Aflatoxin bằng kỹ
thuật ELISA trong một số thực phẩm
tại Hà Nội






Chủ nhiệm đề tài : BS. Nguyễn Lan Phơng
Đơn vị chủ trì : Khoa Thực phẩm & VSATTP
Cơ quan chủ quản : Viện Dinh Dỡng
Thời gian thực hiên : Năm 2006

6543
20/9/2007


Hà Nội 2007


2
Phiếu đăng ký và giao nộp kết quả nghiên cứu khcn

1.Tên đề tài :

Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A. flavus và định lợng độc tố Aflatoxin
bằng kỹ thuật ELISA trong một số thực phẩm tại Hà Nội

2. Mã số đề tài: Thuộc chơng trình :

3. Cấp đề tài: Đề tài cấp cơ sở
4. Cơ quan chủ trì: Labo Vi sinh Khoa Thực phẩm &VSTP
Địa chỉ : 48
B
Tăng Bạt Hổ - Hà Nội
Điện thoại: 04 8211413
5. Cơ quan cấp trên trực tiếp: Viện Dinh Dỡng Quốc gia
Địa chỉ: 48
B
Tăng Bạt Hổ - Hà Nội

Điện thoại: 049717090
6. Bộ, địa phơng chủ quản: Bộ Y Tế
Địa chỉ:138A Giảng Võ - Ba Đình - Hà Nội
Điện thoại:
7. Tổng kinh phí: 30.000.000,00đ (Ba mơi triệu đồng)
Trong đó, từ ngân sách Nhà nuwớc: 30.000.000,00đ (Ba mơi triệu đồng)

8. Thời gian thực hiện: Bắt đầu tháng 7/2006 Kết thúc tháng 12/2006
9. Chủ nhiệm đề tài : Nguyễn Lan Phơng Bác sỹ CK Vi sinh
Địa chỉ liên hệ : Labo vi sinh Khoa Thực phẩm &VSATTP
Điện thọai: 049716294

10. Danh sách cá nhân tham gia nghiên cứu

H
ọ và tên
Học hàm /học vị
Hà Thị Anh Đào PGS -TS, Dợc sỹ
Nguyễn Lan Phơng Bác sỹ
Phạm Thanh Yến Bác sỹ
Bùi Thị Mai Hơng Thạc sỹ, Bác sỹ
Nguyễn ánh Tuyết
Cử nhân


3

11. Bảo mật thông tin
A. Phổ biến rộng rãi B. Phổ biến hạn chế C. Không phổ biến

12. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Một nghiên cứu cắt ngang, khảo sát sự ô nhiễm nấm mốc A. flavus và định lợng
độc tố aflatoxin bằng kỹ thuật ELISA trong 129 mẫu (ngô, lạc, gạo mỳ) tại một số cửa
hàng bán lẻ trong địa bàn Hà Nội. Kết quả cho thấy số mẫu có nấm mốc A. flavus là 53
chiếm tỉ lệ 41%. Nhóm lạc nhiễm A. flavus cao nhất 22/ 43 mẫu chiếm tỉ lệ 51%, nhóm
ngô có 16/ 43 chiếm tỉ lệ 38% và nhóm gạo mỳ có 15/ 43 mẫu tỉ lệ 35%. Trong 53 mẫu
nhiễm nấm mốc A. flavus có 22 mẫu có độc tố Aflatoxin nồng độ từ 0.23 - 420 ppb.
Nhóm lạc 6 mẫu có Aflatoxin nồng độ từ 0.23 - 1.08 ppb; Nhóm ngô 16 mẫu có
Aflatoxin nồng độ từ 3.5 420 ppb và 10 mẫu có nồng độ vợt quá giới hạn cho phép;
Nhóm gạo, mỳ không có mẫu nào tìm thấy Aflatoxin.

13. Kiến nghị áp dụng KQNC
- Các loại sản phẩm có nguy cơ cao nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin nh các loại nông
sản, ngũ cốc đều phải bắt buộc kiểm nghiệm trớc khi đa vào dây truyền sản xuất,
chế biến kể cả thực phẩm cho ngời và thức ăn gia súc.
- Cần có biện pháp tuyên truyền giáo dục hớng dẫn về nguy hại của nấm mốc với
sức khoẻ ngời sản xuất, chế biến, kinh doanh, và ngời tiêu dùng những sản phẩm từ
các loại hạt có dầu.
- Để đảm bảo và chủ động đề phòng ô nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm rất cần
mở rộng và tăng cờng hệ thống kiểm tra, giám sát phát hiện sự ô nhiễm Aflatoxin tại
các trung tâm kiểm nghiệm thực phẩm.



14. Chủ nhiệm đề tài Hà Nội ngày 20 tháng 8 năm 2007
15. Cơ quan chủ trì đề tài

4
Bộ ytế
Viện dinh dỡng
^\[]





báo cáo

Đề tài

Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A. flavus
và định lợng độc tố Aflatoxin bằng kỹ
thuật ELISA trong một số thực phẩm
tại Hà Nội



Chủ nhiệm đề tài : BS. Nguyễn Lan Phơng
Đơn vị chủ trì : Khoa Thực phẩm & VSATTP
Cơ quan chủ quản : Viện Dinh Dỡng
Cán bộ phối hợp : Ths. Bùi Thị Mai Hơng

Bs. Phạm Thanh Yến
Cn. Nguyễn ánh Tuyết
PGS. Ts. Hà Thị Anh Đào
Kinh phí : 30 triệu đồng, nguồn NCKH








Hà Nội 2007


5
Mục lục

Trang
1. Đặt vấn đề 8
2. Tổng quan tình hình nghiên cứu
10
2.1.Vai trò của nấm mốc 10
2.2. Độc tố vi nấm 11
2.3. Nguy cơ ô nhiễm thực phẩm do độc tố vi nấm 13
2.4. Độc tính Aflatoxin 14
2.4.1. Nghiên cứu trên thế giới 14
2.4.2. Nghiên cứu trong nớc 17
3. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
20

3.1. Đối tợng nghiên cứu 20
31.1. Địa điểm nghiên cứu 20
3.1.2. Thời gian nghiên cứu 20
3.1.3. Đối tợng nghiên cứu 20
4.2. Phơng pháp nghiên cứu 20
3.2.1. Thiết kế và phơng pháp nghiên cứu 20
3.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu 20
3.2.3. Cách thu thập mẫu 20
3.2.4. Phơng pháp phân tích 21
3.2.4.1. Phơng pháp xác định A. flavus trong ngũ cốc 21
3.2.4.2. Phơng pháp định lợng aflatoxin trên ELISA bằng
kít phát hiện độc tố Veratox- HS 22
3.3. Đánh giá kết quả 24
3.4. Xử lý số liệu 24
4. Kết quả nghiên cứu 26
4.1. Kết quả khảo sát ô nhiễm nấm mốc A. f lavus 26
4.1.1. Thực trạng nhiễm nấm mốc chung ở các mẫu phân tích 26
4.1.2. Một số loại nấm mốc nhiễm của từng nhóm hạt ngũ cốc
26
4.1.3. ô nhiễm mốc trong ngô, lạc, gạo trên địa bàn các quận 26
4.2. Kết quả định lợng Aflatoxin trên máy ELISA 27
4.2.1. Xác định khoảng tuyến tính và đờng chuẩn 27
4.2.2 Giới hạn về định lợng và phạm vi định lợng 28

6
4.2.3 Độ thu hồi của kỹ thuật 29
4.2.4 Kết quả định lợng Aflatoxin của các mẫu trên ELISA 29
5. bàn luận 32
6. Kết luận 34
7. Kiến nghị 35

8. khuyến nghị 35
Tài liệu tham khảo


























7
Những chữ viết tắt

CDC Centers for disease control and prevention(Trung tâm kiểm soát và
phòng chống bệnh dịch)
FAO Food Agriculture Organization (Tổ chức thực phẩm và nông nghiệp
của Liên hợp quốc)
ASEAN
Association of Southeast Asian(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam á)
QĐ-BYT
Quết định Bộ y tế
ELISA Enzyme Linked Immuno- Sorbent - Assay
HS High Sensitivity
HPLC
High Performance Liquid Chromatography(Sắc khí lng cao áp)
TLC Thin Layer Chromatography(sắc ký lớp mỏng)
TCN Tiêu chuẩn ngành
TQTP Thờng qui thực phẩm
VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm
VSTP Vệ sinh thực phẩm
VSV Vi sinh vật
WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
TTYTDP Trung tâm Y tế dự phòng
ppb Microgam/kilogam
Afla.(TS)

Aflatoxin(tổng số)
A. flavus Aspergillus flavus
Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh
OD Optical Density(Mật độ quang)

tsbtNm
Tổng số bào tử nấm mốc
ADN Acid desoxyribonucleic.
Afla.
aflatoxin
Afla.b
1
AflatoxinB
1
Afla.M
1
AflatoxinM
1



8
1. Đặt vấn Đề
Khí hậu nóng ẩm, thời gian ma kéo dài và bão lụt thờng xảy ra, là điều kiện tốt
cho nấm mốc phát triển nhanh gây ô nhiễm tới lơng thực, thực phẩm. Các loại nông
sản thực phẩm thờng thu hoạch trong thời vụ dễ gặp ma dài ngày, đó là mối nguy
cơ lớn cho vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm.
Trong quá trình thu hoạch, bảo quản, dự trữ lơng thực và thực phẩm nấm mốc có
thể xâm nhập, phát triển, gây độc vào bất kỳ giai đoạn nào. Nhiều loài nấm mốc có ý
nghĩa công nghiệp, đợc dùng trong sản xuất chất kháng sinh, vitamin, một số dạng
tơng Ngợc lại có rất nhiều chủng nấm mốc gây h hại và làm độc thực phẩm,
gây bệnh cho ngời, động vật và thực vật. Nấm mốc gây ô nhiễm ở khắp mọi nơi và
độc tố thờng đợc phát hiện ở các thực phẩm bị ô nhiễm do sản xuất, bảo quản
trong kho khi hàm lợng nớc trong chúng ở mức cao. Nấm mốc Aspergillus flavus
là loại a phát triển trên những loại hạt có dầu nh ngô, lạc, đậu, cà phê, lúa

mạch và sinh ra độc tố. Có nhiều loại độc tố vi nấm nhng Aflatoxin là một độc tố
đáng sợ nhất và nấm Aspergillus flavus là loài cung cấp lợng Aflatoxin chủ yếu.
Aflatoxin nhiễm vào trong các nông sản, thức ăn gia súc, ngời và gia súc ăn
phải thức ăn nhiễm Aflatoxin, độc tố này sẽ tích lũy ở một số cơ quan trong cơ thể
gây nhiễm độc gan, thận, xuất huyết đờng tiêu hoá, ung th gan. Các điều tra cho
thấy có sự tơng quan giữa hàm lợng Aflatoxin trong thực phẩm và số bệnh nhân
ung th gan ở nhiều nứơc nh
Thái Lan, Uganda, Kenya, malaysia, Nhật Bản,
Philippin[1]. Tại ấn Độ và nhiều nớc Châu Phi ngời ta còn nhận thấy những trẻ em
đợc nuôi dỡng kém thờng đễ bị nhiễm và tích luỹ Aflatoxin cao trong gan do ăn
nhiều bột lạc, ngô, đậu, hạt có dầu, thực phẩm lên men bị nhiễm nấm mốc[2].
ở Việt nam trong khi các bệnh truyền nhiễm đang từng bớc đợc đẩy lùi thì các
bệnh do ăn phải các loại thực phẩm có độc nói chung và độc vi nấm nói riêng lại có
chiều gia tăng. Hiện nay cha có thống kê nào nói lên số ngời bị ngộ độc vi nấm
nhng những liên quan của Aflatoxin với đời sống sức khoẻ cộng đồng đã đợc đề
cập đến. Các nhà khoa học cũng đã khuyến cáo phải đặc biệt chú ý đến tới lạc, ngô,
gạo và các sản phẩm chế biến từ chúng bởi rất dễ bị ô nhiễm nấm mốc và độc tố
Aflatoxin.
Nông sản, thực phẩm không chỉ sử dụng cho tiêu dùng nội địa mà còn cho xuất
khẩu. Một số thị trờng nớc ngoài thờng xuyên giám định lô hàng và loại bỏ các
chuyến hàng có hàm lợng độc tố vi nấm cao hơn 2-10ppb. Vì vậy nên nhu cầu kiểm
tra lợng Aflatoxin trong các sản phẩm ngày càng cao.
Để xác định hàm lợng độc tố Aflatoxin trong thực phẩm rất cần thiết phải lựa
chọn một phơng pháp phù hợp trong điều kiện kiểm tra nhanh, chính xác đối với
từng cơ sở, labo. Khá nhiều nớc đã chọn phơng pháp Sắc ký lỏng cao áp (HPLC),

9
là phơng pháp chính thức đợc chấp nhận trên toàn cầu[3]. Ngoài ra phơng pháp
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
cũng đợc lựa chọn khi phòng thí nghiệm không đợc trang

bị HPLC, đây là phơng pháp thờng đợc dùng ở phần lớn các phòng phân tích tại
các nớc đang phát triển[3]. Hiện nay những phơng pháp này có độ phát hiện rộng,
chính xác, và đang đợc a dùng. Tuy nhiên quy trình phân tích Aflatoxin bằng
phơng pháp HPLC hay TLC trong các mẫu thực phẩm phải qua nhiều công đoạn từ
khâu chiết tách, làm sạch mẫu sử dụng dung môi siêu tinh khiết nên rất tốn kém, mất
nhiều thời gian. Quá trình tách triết sử dụng nhiều dung môi rất độc nên có n
g
u
y
cơ
gây ô nhiễm môi trờng và độc hại cho kiểm nghiệm viên.
Sử dụng phơng pháp định lợng độc tố Aflatoxin trên máy ELISA bằng bộ kít
phát hiện độc tố Veratox - HS phần nào có thể khắc phục đợc những nhợc điểm
trên. Veratox - HS định lợng Aflatoxin là một thử nghiệm ELISA, cho phép thu
đợc chất kết tủa chính xác đến phần tỷ (ppb). Phơng pháp này đơn giản, dễ làm,
đáp ứng đợc nhu cầu muốn kiểm tra lợng độc tố Aflatoxin thấp. Vì trong những
năm gần đây xu hớng giảm mức giới hạn độc tố vi nấm trong thực phẩm ở một số
nớc trên thế giới ngày càng gia tăng (trứơc đây giới hạn của AflatoxinB
1
trong thức
ăn đa số các nuớc lấy mức dới 10 mcg/kg, nhng gần đây có tới 29 quốc gia đã để ở
mức 4 mcg/kg). Hơn nữa kỹ thuật này lại phù hợp cho nhiều Trung tâm y tế dự phòng
và một số cơ sở kiểm nghiệm cha có điều kiện trang bị HPLC, TLC.
Hà Nội không phải là nơi sản xuất chính ra các loại nông sản nh ngô, lạc, gạo,
mỳ mà lợng thực phẩm này nguồn chính vẫn là chuyển đến từ các vùng giáp gianh.
Tuy nhiên trong tất cả các chợ và một số tuyến phố đều thấy mặt của các loại nông
sản thực phẩm này. Tình trạng ô nhiễm nấm mốc A. flavus và độc tố Aflatoxin trong
ngũ cốc tại Hà Nội ra sao hiện nay cũng còn ít đề tài đề cập đến. Vì vậy chúng tôi đã
chọn đề tài: Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A. flavus và định lợng độc tố Aflatoxin
bằng kỹ thuật ELISA trong một số thực phẩm tại Hà Nội.

Mục tiêu nghiên cứu
1. Xác định mức nhiễm nấm mốc A. flavus trong một số mẫu thực phẩm tại Hà
Nội
2. Định lợng độc tố Aflatoxin(tổng số) trong mẫu nhiễm nấm mốc A. flavus
bằng kỹ thuật ELISA






10
2. Tổng quan tình hình nghiên cứu
2.1.Vai trò của nấm mốc
Trong thế giới của nấm có nhiều loài nấm lớn và nấm nhỏ(vi nấm). Những nấm
ăn đợc là nguồn dinh dỡng quý và hơng vị đặc trng chỉ có nấm mới có. Chúng
có nhiều ý nghĩa trong nền kinh tế cùng nh trong lĩnh vực làm thức ăn. Nấm mọc
hoang dã hoặc nuôi trồng đều có hàm lợng protein, vitamin và chất khoáng cao.
Nhng cũng có loài sinh ra độc tố gây ra nỗi kinh hoàng cho ngời.
Nấm mốc thuộc vi nấm là loài thực vật không có chất diệp lục, nên chúng chỉ
sống đợc nhờ có hệ sợi bám vào các chất hữu cơ. Hệ sợi của nấm mốc có một số ăn
sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ti dinh dỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi
là khuẩn ti khí sinh. Một số sợi của khuẩn ti khí sinh dần dần sẽ phát triển thành cơ
quan sinh sản đặc biệt mang bào tử. Màu sắc của bào tử sẽ đặc trng cho màu của
nấm mốc khi già.
Nấm mốc phổ biến rộng trong tự nhiên, là một nhóm rất lớn, ngời ta thờng xếp
vào loại vi sinh vật. Chúng mọc trên cơ chất dinh dỡng và tạo thàng lớp lông mợt
có màu sắc khác nhau. Nhiều loài nấm mốc có ý nghĩa công nghiệp, ngợc lại nhiều
nấm mốc làm hỏng thực phẩm và hàng công nghiệp, làm thay đổi rất nhiều thành
phần hoá học của cơ chất và thải ra sản phẩm trao đổi chất. Sản phẩm trao đổi chất

của mốc là những chất độc (Mycotoxin) đối với ngời cũng nh động vật. Một trong
những họ nấm mốc thờng gặp là họ nấm Aspergillus, chúng có tới 200 loài.
Trong khoảng mấy chục năm gần đây, ngời ta chú ý nhiều đến nấm mốc
Aspergillus flavus mọc trên cơ chất là bột có chất béo nh bột lạc, bột ngô, bột đậu
tơng, lúa mỳ, mạch, cà phê, ca cao, cùi dừa Mốc này rất giống mốc Apergillus
oryzae - một nấm mốc có màu vàng hoa cau sử dụng trong nghề làm tơng, nó sinh
ra một loại độc tố gọi là Aflatoxin.
Hai loại nấm mốc là nơi sản xuất chính ra độc tố
Aflatoxin đó là nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Những loại nấm
này hầu nh đợc tìm thấy ở khắp mọi nơi trên thế giới. Chúng đợc sinh ra từ đất
trồng nhng lại a phát triển ở những loại hạt giàu dinh dỡng, độc tố của chúng
đợc sản sinh trớc khi thu hoạch trên cánh đồng và sau khi thu hoạch ở nơi bảo
quản. Trong cả hai trờng hợp thì những h hại do côn trùng gây ra, do vận chuyển
bảo quản sai quy cách, do tác động của môi trờng đều cho phép nấm mốc xâm nhập
vào hạt.

11
Một số chủng nấm mốc thờng gặp trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật :
Chủng
Thực phẩm bị ô
nhiễm
Độc tố
Triệu chứng chính
và cơ quan bị độc
Aspergillus
flavus
Lạc, đậu tơng, hạt
ngũ cốc và sản
phẩm chế biến
Aflatoxin,Aflatoxin

trong sữa
U gan

Aspergillus
ochraceus
Hạt ngũ cốc,cà
phê, thịt hun khói
Ochratoxin

Fusarium
graminearum
Hạt ngũ cóc và sản
phẩm chế biến
Độc tố ở dạng thiên
nhiên
Buồn nôn, gây nôn
trên lợn
Fuarium
sporotrichoides
Hạt ngũ cóc và sản
phẩm chế biến
Fusariogenin
Gây bệnh giảm
bạch cầu
Penicilium
citrovirid
Gạo
Citreoviridin,
citrinin
Kích ứng da, độc

gan và thận
Penicilium
expansum
Táo, rợu táo
Patunin
Gây ung th và đột
biến
2.2 Độc tố vi nấm (Mycotoxin)
Nấm mốc nhiễm vào lơng thực, thực phẩm gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát
triển và có thể sinh độc tố. Độc tố vi nấm là độc tố sinh ra từ các chủng nấm độc,
thuộc một trong những loại độc nhất. Về độc tính của nấm mốc ngời ta lờ mờ biết
đến từ lâu nhng đến cuối thế kỷ XIX mới khẳng định. Ngời ta đã xác định đợc
mối tơn
g

q
uan
g
iữa bệnh chón
g
mặt, mạch
y
ếu, khát nớc, mắt lon
g
lanh sợ hãi của
ngời ăn phải bánh mì mốc, bánh mạch mốc, lạc mốc.
Ngộ độc do nấm phải kể đến ngộ độc do nấm mốc. Mycotoxin do nấm mốc sinh
ra rất đa dạng và phức tạp về cấu trúc cũng nh về cơ chế bệnh lý, các độc tố của
nấm đợc chia làm 3 nhóm: Gây độc theo đờng tiêu hoá, nhóm gây độc hệ thần
kinh, nhóm phá huỷ tế bào và mô[4]. Trong lịch sử đã từng xảy ra nhiều vụ ngộ độc

thức ăn do độc tố của một số chủng vi nấm, gây tử vong cho hàng loạt ngời và gia
súc. Thời kỳ đầu của thế kỷ XX tại ấn Độ đã xảy ra nhiều vụ ngộ độc do nguyên
nhân nhiễm mốc. Có bệnh sơ gan trẻ em, một bệnh đã lan rộng trên lục địa ấn Độ và
đợc xác định có liên quan tới độc tố vi nấm. ở miền Tây nớc này có một vụ dịch
viêm gan ở cả ngời và chó nguyên nhân đợc xác định là do ăn ngô mốc[2]. Có
những gia đình bị mắc bệnh sau 2-3 tuần ăn ngô mốc và chết cả nhà. ở Triều Tiên
một số tù binh bị viêm gan do ăn phải thực phẩm bị nhiễm mốc, nhiều trờng hợp gia
súc bị ngộ độc do ăn cỏ khô bị mốc, Ngựa bị thần kinh, choáng váng, khó thở, viêm
não chảy máu, gan thận bị h do ăn phải ngũ cốc bị mốc và đợc ghi nhận là độc tố
vi nấm[1,2].
Các tác hại của độc tố nấm có thể là gây ngộ độc cấp tính, mạn tính ngăn cản hệ

12
thống miễn dịch, gây suy giảm các chức năng của cơ thể và gây nên bệnh ung th.
Aflatoxin là nguyên nhân gây ung th nguyên phát ở ngời, gây nên một số bệnh
mạn tính nh xơ gan, viêm dạ dày mạn tính, gây nhiễm độc gen Ngời ta cũng phát
hiện về mối liên quan sau: Những vùng ăn nhiều gạo mốc có tỷ lệ ngời mắc và có
tổn thơng gan cấp và mạn tính, đặc biệt là các chứng xơ gan và ung th gan xơ
nhiễm nhiều hơn so với các vùng khác. Theo thống kê của một số tác giả những nớc
có đời sống cao nh Châu u, với điều kiện khí hậu lạnh khô thì tỉ lệ ung th gan do
Aflatoxin thấp hơn nhiều so với các nớc có đời sống thấp v khí hậu nóng ẩm.
Tác động của độc tố vi nấm đến ngời sản xuất, chế biến là phải gánh chịu sản
lợng thấp, sản phẩm không tiêu thụ đợc, mất thị trờng, mất phí giám sát và xét
nghiệm, phí kiện tụng - Ngời tiêu dùng thì phải chịu thực phẩm kém dinh dỡng,
ngộ độc thực phẩm cấp hoặc mạn, giảm thu nhập do nghỉ việc vì ốm bệnh. Hậu quả
gây hại của Mycotoxin trên động vật là sự chuyển hoá thức ăn kém, tốc độ tăng
trởng thấp. Đối với gia cầm giảm chất lợng thịt, giảm 50% tỷ lệ phát triển, đẻ ít
trứng và trứng bé hơn, giảm khả năng chống đỡ bệnh tật, từ đó làm giảm tính cạnh
tranh của ngành chăn nuôi trên thị trờng quốc tế.
Nhiễm Mycotoxin sẽ gây tổn thơng gan, thận, túi mật, tác động lên tim, tuần

hoàn, thần kinh, có thể ung th gan.
Độc tố vi nấm gây tổn thơng ở gan và thận: Những bệnh độc tố nấm thờng đặc
trng bởi gan và thận h
. Một số lớn các chất khi vào cơ thể, qua gan sau những biến
đổi hoá học hoặc là đợc chuyển vào máu, hoặc là bị loại khỏi vòng tuần hoàn. Các
chất bã và những chất đa vào cơ thể nhng không đợc sử dụng chúng đợc thận bài
tiết loại bỏ. Vì vậy các trờng hợp nhiễm độc thức ăn , những cơ quan bị tổn thơng
đầu tiên là gan và thận.
Độc tố vi nấm tác động vào tim: Một số độc tố nấm có độc tính đối với tim đó là
trờng hợp một loại axit tetronic đợc tìm thấy từ nhiều loài Penicilium và các giống
nuôi cấy Aspergillus ochraceus.
Độc tố vi nấm tác động vào máu và hệ tuần hoàn : Một khi đã vào máu, dù là
bằng đờng nào thì độc chất cũng đợc truyền đi khắp cơ thể trong 23 giây . Nhiều
tổn thơng liên quan đến độc tố nấm kèm chứng chảy máu. Hội chứng chảy máu
hay gặp nhất cả ở động vật lẫn ngời, liên quan đến các bệnh độc tố nấm do
Stachybotrys atra, Fusarium tricinctum, Penicilium citreoviride. Các chứng chảy
máu gây dễ vỡ mao quản, xuất huyết da hoặc ở các cơ quan khác(Dạ dày, ruột, gan,
thận, tuyến thợng thận, phổi , não ). Các chứng chảy máu thờng do nhiễm độc cấp
tính, các dạng nhiễm độc mạn tính thì thấy tuỷ xơng mất dần chức năng tạo máu và
thấy chứng giảm bạch cầu, tan tế bào bạch huyết. Một số bệnh độc nấm còn gây
ngng kết hồng cầu.

13
Độc tố vi nấm tác động vào hệ thần kinh: Ngời ta thấy có sự suy nhợc thần
kinh, choáng váng nhức đầu, một số trờng hợp vật vã kèm thở hổn hển, dễ kích
động, nôn mửa, co giật, mệt mỏi, kiệt lả, tê liệt cơ, động tác không phối hợp.
Một số loại độc tố nấm đang đợc quan tâm là aflatoxin, OchratoxinA,
Fumonisin, Trichothecenes, Zearalenone và Patulin. John I.Pitt(2004) đã tiến hành
phân tích 1700 mẫu thực phẩm trong vài năm gần đây tại Indonesia, Thái Lan và
Philipin, hơn 35.000 loại nấm đã dợc xác định và từ đó có có thể suy ra khả năng

sinh độc tố vi nấm rất phổ biến và nguy hiểm. Loại độc tố vi nấm chiếm vị trí quan
trọng nhất trong khu vực ASEAN là Aflatoxin, đợc xem nh là một chất gây ung th
nguyên phát và đợc nhiều ngời biết đến, nó liên quan tới sức khoẻ ở cả con ngời
và động vật[5].
Một số bệnh ngộ độc do nấm mốc
Hội chứng
chủ yếu
Nấm gây
bệnh
Cơ chất Độc tố Động vật cảm
thụ
Bệnh độc tố
gan
Aspergillus
flavus
Hạt, bột hạt có
dầu,khô dầu
Các Aflatoxin
Ngời, lợn, trâu,
bò, gà tây, vịt,
ngỗng, trĩ, chó,
Bệnh độc tố
thận
Penicilium
citrium
Lạc, gạo, ngô,
mạch, lúa mỳ
Xitrinin
Lợn, ngời
Xuất huyết

Furarium
sporotri
Nớc quả,rơm
rạ, ngũ cốc, kê
Furariogenin
Ngời
Bệnh độc tố
thần kinh
Aspergillus
clavatus
A.oryzae
Hạt đang ủ
mầm, mạch nha,
ngũ cốc
Clavaxin
Trâu, bò, ngời,
vật nuôi
2.3 Nguy cơ ô nhiễm thực phẩm do độc tố vi nấm
Nấm mốc Aspergillus flavus đợc tìm thấy khắp mọi nơi ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới, phát triển tốt với khí hậu nóng ẩm. Aflatoxin đợc tạo ra trên đồng ruộng
suốt thời gian phát triển của cây hoặc trong thời gian sản phẩm lu kho. Bất kỳ việc
xử lý không đúng cách trong giai đoạn nào của chuỗi thực phẩm cũng dẫn đến ô
nhiễm Aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Aflatoxin M
1
và M
2
là chất
chuyển hoá hydroxyl của Aflatoxin B
1
và B

2
, có thể tìm thấy trong sữa và các sản
phẩm sữa từ những con vật nuôi ăn phải thức ăn bị nhiễm Aflatoxin. Ngộ độc thực
phẩm do độc tố nấm xảy ra trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp để nấm mốc
phất triển.
Độc tố vi nấm trong nông sản dù có nhiễm từ trớc thu hoạch nhng vẫn tiếp

14
tục phát triển mạnh trong giai đoạn sau thu hoạch, các nghiên cứu cho thấy tỉ lệ ô
nhiễm này tăng nhanh hơn ở giai đoạn bóc vỏ, và sấy khô. Giới hạn 20 mcg/kg là dễ
đạt đợc ở ngày thứ hai sau thu hoạch khi mà hàm lợng độ ẩm của ngũ cốc ở vào
khoảng 26 -53%[7]. Sự gia tăng độc tố vi nấm vẫn tiếp tục, thậm chí cả sau khi đã
sấy khô tuỳ thuộc vào độ ẩm khác nhau ở từng loại ngũ cốc. Ngời nông dân thờng
phơi hoa màu dới ánh nắng mặt trời, thời gian phơi khô phải 48 giờ, nếu trời ma,
đặc biệt là ma phùn, độ ẩm cao, thiếu ánh nắng mặt trời, rất dễ tạo điều kiện phát
triển nấm mốc.
Trong kinh doanh thờng có một khối lợng lớn thóc, gạo, ngô, lạc, cà phê
đợc chất đống cha kịp làm khô để bao gói, đó là cơ hội để tạo ra nấm mốc.Trong
bảo quản ngũ cốc khi để độ ẩm 15 -18% trở lên là điều kiện thích hợp để hình thành
Aflatoxin. Bảo quản ngũ cốc ẩm trong túi nhựa hoặc để trên sàn kho hơn 10 ngày
cũng là điều kiện để nấm mốc phát triển.
2.4. Độc tính của Aflatoxin
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới:
Độc tố Aflatoxin, nó là nguyên nhân gây ra 10.000 trờng hợp tử vong hàng năm ở
các nớc có hệ thống kiểm soát nghèo nàn(J.I.Pitt,2004). Hoa kỳ đã đóng góp nhiều
bài nghiên cứu chung về nấm mốc độc nhng vẫn dành phần chủ yếu cho các đề tài
nhiễm độc do A. flavus và Aflatoxin gây ra.
Từ năm 1960 khi xảy ra hàng loạt gà tây ở Anh chết do ăn lạc mốc nhập từ
Brazin, các nhà khoa học lúc đó không xác định đựơc nguyên nhân và phát hiện
trong gan của gà tây bị nhiễm độc tố và đợc đặt tên là Aflatoxin. Năm 1961 ngời

Anh đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống: Cho ăn thức ăn có nhiễm mốc trong
đó 20% l bột lạc thối, sau 6 tháng thy xuất hiện ung th gan.
Từ sau vụ này hội
đồng nghiên cứu y học Anh hớng hoạt động chủ yếu vào việc nghiên cứu các độc tố
của Aspergillus flavus. Tuy những nghiên cứu về nấm mốc mới chỉ phát triển trong
mấy chục năm gần đây, nhng nhờ đó đã làm cho sự hiểu biết về độc tố của chúng
ngày càng sáng tỏ. Tại Pháp từ những năm 1965 khảo sát khi sản xuất bia từ lúa mỳ
và kiểm tra cẩn thận tại các xí nghiệp các quy trình lên men và nguyên liệu đầu vào,
thờng không phát hiện bị nhiễm độc tố Aflatoxin nhng nếu sản xuất với quy mô
nhỏ do không kiểm tra chặt chẽ dễ bị nhiễm Aflatoxin. Cũng trong thời kỳ này các
nhà khoa học đã xác định đợc hội chứng Reyes Syndrome gây bệnh não, hoại tử
ruột non làm chết nhiều trẻ em từ 1- 9 tuổi mà nguyên nhân là trong thức ăn bị nhiễm
độc tố Aflatoxin[3]. Ngoài ra Aflatoxin còn góp phần làm cho một số bệnh trầm trọng
thêm nh viêm gan hay rối loạn về dinh dỡng đặc biệt ở trẻ em. Theo dõi các trẻ em
đợc nuôi dỡng kém, thờng dễ bị nhiễm nấm mốc. Các nhà y học lâm sàng cho
biết các vùng tổn thơng ở gan của những trẻ này giống nh trong nớc tiểu của trẻ

15
em bị sơ gan đều có vết độc tố Aflatoxin.
Ngời ta đã biết aflatoxin l một trong những chất gây ung th gan mạnh tác
động qua đờng miệng nếu hấp thu một tổng lợng 2,5mg aflatoxin trong thời gian
89 ngy có thể dẫn đến ung th gan hơn 1 năm sau. ở khắp các vùng Nam Phi, nơi
ngời ta ăn nhiều lạc có mốc A. flavus, thì tỷ lệ bệnh nhân bị ung th gan rất cao.
Độc tố aflatoxin rất bền với nhiệt, khi đem lạc mốc rang lên, mặc dù nhiệt độ
rất cao, các bo tử của mốc bị tiêu diệt, nhng độc tố của chúng vẫn không bị phá
hủy hon ton. Ngời ta đã nghiên cứu thấy rang lạc ở 150
0
C trong 30 phút thì tỷ suất
Aflatoxin B
1

giảm trung bình 80% v aflatoxin B
2
giảm 60%. Nh vậy lạc mốc dù
đợc rang ở nhiệt độ cao, ăn vo vẫn nguy hiểm.
Aflatoxin tác động có thể gây đột biến gen tế bào động vật, ngoài ra còn gây rối
loại tổng hợp ADN. Xảy ra quá trình đột biến phần lớn là tế bào gan, sau đến tế bào
thận. Tại một nghiên cứu ở Trung Quốc lấy mẫu nớc tiểu kiểm tra tình trạng tích luỹ
trong cơ thể đã xác định Aflatoxin có thể xem là chỉ số đánh dấu sinh học trong nớc
tiểu xác định nguy cơ gây ung th nguyên phát [8]. Theo cơ quan bảo vệ môi trờng
toàn cầu tại 16 nớc: úc, áo, Brazin, Canada, Guatemala, Đức, ý, Nhật, Kenia,
Mexico, Hà Lan, Thuỵ Điển, Thuỵ Sỹ, Anh, Mỹ, Liên Xô cũ đã thông báo sự nhiễm
Aflatoxin trong thực phẩm là nghiêm trọng và thờng tập trung vào một số sản phẩm
ngũ cốc và hạt có dầu nh: ngô, lạc, đậu đỗ, cà phê v.v[1].
ở Liên xô cũ đã thành lập một tổ chức chuyên nghiên cứu về độc tố vi nấm, Nhật
bản lại chủ yếu quan tâm đến nấm mốc gây độc trên gạo, ở châu Âu ngời ta quan
tâm đến các bệnh độc tố nấm nói chung. Báo cáo của Stoloff năm 1985 cho biết mức
nhiễm Aflatoxin trong lạc khi nhập vào Mỹ thờng có d lợng trên 25ppb[8].
Hiện nay đã xác nhận có 6 loại dẫn xuất của Aflatoxin(B
1
, B
2
, G
1
, G
2
, M
1
, M
2
), có

hoạt tính mạnh và độc nhất là Aflatoxin B
1
đã đợc thử nghiệm và xác định gây ung
th trên nhiều động vật thuộc loại gặm nhấm, trong đó chuột là loài dễ bị mắc ung
th nhất với liều TD
50
là 1,3 mcg/g trọng lợng cơ thể. AflatoxinB
1
đã đợc trung tâm
nghiên cứu quốc tế xếp vào nhóm 1 các chất gây ung th cho ngời, thờng gặp ở
các nớc nhiệt đới, đặc biệt là Châu á và Châu Phi. Chỉ cần hàng ngày thờng xuyên
bị nhiễm một vài mcg Aflatoxin B
1
trong khẩu phần ăn đã có thể gây ung th gan trên
ngời. Các dẫn xuất Aflatoxin khác ít độc hơn, Aflatoxin B
2
và Aflatoxin G
1
cũng có
khả năng gây khối u nhng không mạnh bằng Aflatoxin B
1
, nhng Aflatoxin M
1
là
dẫn xuất hydroxy của Aflatoxin B
1
có trong sữa, tuy trong thử nghiệm cha gây ung
th tế bào gan trên chuột nhng vẫn có thể gây nguy hiểm cho trẻ em khi sử dụng
sữa bò hoặc sữa mẹ bị nhiễm Aflatoxin M
1

. Mối nối đôi của cấu trúc AflatoxinB
1
rất

16
khôn
g
bền vữn
g
, sẵn sàn
g
nối với các chất khác sinh ra độc tố.
Trong 6 loại Aflatoxin thờng gặp nhất là nhóm Aflatoxin(B
1
,B
2
) và nhóm
Aflatoxin(G
1
, G
2
), đợc phân biệt trên cơ sở nhóm Aflatoxin (B
1
, B
2
) phát màu huỳnh
quang xanh lơ thẫm (Blue) còn nhóm Aflatoxin (G
1
, G
2

) có màu xanh lá cây
vàng(Green). Về cấu trúc hoá học có sự khác nhau giữa nhóm B và G ở chỗ có thêm
vòng Cyclopentanon ở nhóm G, còn Aflatoxin B
2
, G
2
là hai dẫn xuất khử Hydrro
tơng ứng của Aflatoxin B
1
, G
1
. Aflatoxin M
1
và Aflatoxin M
2
là sản phẩm chuyển hoá
từ hai Aflatoxin B
1
, B
2
trong sữa của động vật cho sữa, khi nhiễm Aflatoxin trong thức
ăn tạo thành, kí hiệu M là sữa (Milk)
Công thức cấu tạo của một số Aflatoxin

o
o
o o
o

OCH
3

OH

A
flatoxin M
1

o o
o o
o

OCH
3

OH
Aflatoxin M
2
o o
o o
o

OCH
3


A
flatoxin B
1
o
o
o o
o

OCH
3

A
flatoxin B
2
o o
o o
o

OCH
3


A
flatoxin G
1
o
o
o o
o

OCH
3


A
flatoxin G
2

17

Xác định đợc lợng nhiễm Aflatoxin cho phép trong lơng thực, thực phẩm là rất

cần thiết, để tránh ảnh hởng lâu dài đến sức khoẻ, phòng bệnh ung th gan, phòng
những khuyết tật cho thai nhi. Nhiều nớc đã qui định giới hạn cho phép Aflatoxin có
trong lơng thực, thực phẩm ở mức 5 - 20 ppb. Tại hội nghị Quốc tế lần 2, 1997 về
độc tố vi nấm ở Bangkok, Tổ chức nông nghiệp về thực phẩm và y tế thế giới đã
thành lập nhóm chuyên viên về độc tố vi nấm trong Codex. Xây dựng và thống nhất
phơng pháp phân tích, lấy mẫu và qui định kỹ thuật phân tích định lợng phát hiện
chính xác hàm lợng Aflatoxin dới 10ppb trong các sản phẩm thực phẩm. Tại Pháp
qui định mức nhiễm Aflatoxin trong sữa nớc dùng cho trẻ em dới 3 tuổi là 0.03
ppb và sữa nớc thông dụng là 0.05 ppb[9].
Một số qui đinh giới hạn độc tố vi nấm ở một số nớc trên thế giới:
(1995) (Đơn vị : mcg/kg)

Tên nớc
Tổng
Afla
trong
thức ăn
Afla.B
1
trong
thức ăn
Afla.M
1
trong sữa
Tổng Afla
trong thức
ăn gia súc
Afla.B
1
trong thức

ăn gia súc
Ochrato
xinA trong
ngũ cốc
Autralia - 0,5 - - -
Canada - - 20 - 20
Codex - 0,5 - - -
EU 4 2 0,05 - 5 -
Hàn Quốc - 10 0,5 - 10 -
Philippin 20 20 - - - -
Indonesia 20 - - - - -
Thailand 20 - - - - -
Malaysia 35 - - - - -
Singapo 5 - 0,5 - - 2,5
Nhật - 10 - - 10 -
Mỹ 20 - 0,5 20 100 -300 -
Trung Quốc
-
20 ngô,
10 gạo
0,5 - - -
ở Mỹ không ăn nội tạng nên qui định để liều cao và để bảo vệ ngời tiêu dùng.
2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nớc:
Phần lớn các mẫu ngô, lạc, đậu tơng, thức ăn chăn nuôi đem phân tích đều

18
nhiễm nấm mốc với nhiều mức độ khác nhau, tron
g
đó đa số nấm mốc có khả năn
g

sản sinh ra Mycotoxin nh A. flavus, A. ochraceus, vì thế nên nồng độ độc tố
Mycotoxin trong các mặt hàng nông sản luôn ở mức cao. Việt Nam là nớc xuất
khẩu nhiều lạc và Tổ chức thị trờng Châu âu đã tìm thấy nhiều độc tố nấm trong
lạc xuất khẩu. Một thống kê của Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch cho biết 216
mẫu phân tích trong 2 năm 1999-2000 là :
Số liệu phân tích Aflatoxin 1999-2000 (Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch)
Mức độ Aflatoxin
TT Mặt hàng Số
mẫu
Số mẫu
dơng tính
<10ppb 10-50ppb >50ppb
1 Thức ăn gia súc 83 68 58 10 0
2 Bắp 89 75 40 26 9
3 Đậu phộng 11 10 7 1 2
4 Lúa mạch xay 67 58 54 4 0
5 Gạo 11 1 1 0 0
Tổng số 261 212 160 41 11
Nhiễm độc Mycotoxin nói chung và Aflatoxin nói riêng trong thực phẩm không
chỉ gây thiệt hại đơn thuần về mặt kinh tế mà tác hại lớn nhất cho con ngời là về
mặt sức khoẻ. Bệnh nhiễm độc tố vi nấm là do tiêu thụ những thực phẩm bị nhiễm
Aflatoxin dẫn đến ung th và tác động đến con ngời không kém các chất độc hại có
nguồn gốc hoá học khác. Tháng 2/2002 tại Hà Giang xảy ra vụ ngộ độc do ăn bánh
làm từ bột ngô đã bảo quản lâu dẫn tới hậu quả là 11 ngời tử vong. Một điều tra độc
tố vi nấm trong ngô tại Hà Giang các tác giả đã cho biết vùng ăn nhiều ngô bị mốc
có tỉ lệ bệnh nhân ung th gan, thận cao hơn vùng khác[11]. Điều này cho thấy có
mối liên quan chặt chẽ giữa Aflatoxin và ung th gan nguyên phát ở ngời qua đờng
ăn uống. Tìm hiểu một số yếu tố nguy cơ ở bệnh nhân ung th gan nguyên phát Bùi
Thanh Hà cho biết: Tỉ lệ phát hiện Aflatoxin trong tổ chức gan ở nhóm ung th gan là

25/30(83,3%), ở nhóm chứng là 2/20(10%)[12].
Độ ẩm lớn, thời gian ma kéo dài, đã tạo điều kiện cho nấm mốc độc phát triển
nhanh, bên cạnh đó việc bảo quản lơng thực thực phẩm của ngời dân nớc ta cũng
cha đợc chú trọng, càng làm tăng thêm sự ô nhiễm độc tố vi nấm. Điều tra của
Viện Dinh Dỡng (1992) nhận thấy tỉ lệ nhiễm Aflatoxin trên ngô bị mốc ở 2 miền
Nam Bắc khá cao từ 73,3% - 95.5%, với hàm lợng từ 16 -100ppb. Năm 1990 - 1995
Viện đã kiểm tra 387 mẫu lơng thực thực phẩm nhận thấy có 73 mẫu (19%) bị
nhiễm Aflatoxin và có 19 mẫu có hàm lợng vợt quá giới hạn cho phép[13]. Một
khảo sát của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm trong vùng ngô, lạc tại Nghệ An cũng

19
cho thấy 243 mẫu sản phẩm có tới 90% mẫu có nhiễm Aflatoxin và 56/243 mẫu có
hàm lợng vợt quá giới hạn cho phép[14].
Hiện nay một số loại thực phẩm nhiễm độc tố vi nấm Aflatoxin vẫn đợc bán
cho ngời sử dụng, đó là do nhà sản xuất không loại bỏ đợc loại nguyên liệu đã
nhiễm Aflatoxin. Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Mai, Từ Thị Hơng Viện Vệ sinh Y
tế Công cộng Tp. HCM về hệ nấm mốc và lợng Aflatoxin có trong bánh dầu đậu
phộng tại một số cơ sở sản xuất nớc chấm ở Tp. HCM cho thấy: Trong 10 mẫu dầu
đậu phộng và nớc tơng kiểm tra nồng độ Aflatoxin có từ 1-7.5 ppb[15]. Hàm lợng
này vẫn nằm trong giới hạn cho phép nhng điều quan trọng là quá trình tích tụ của
độc tố này trong gan khi hàm lợng độc tố vợt quá ngỡng cho phép sẽ gây ung th
gan. Nghiên cứu của Bùi Thanh Hà - Đỗ Thị Tính trong bệnh phẩm gan và dịch cổ
trớng ở những bệnh nhân ung th gan nguyên phát cho thấy 100% mẫu bệnh phẩm
gan có Aflatoxin nồng độ từ 1,1-3,1ppb và 100% mẫu dịch cổ trớng có Aflatoxin
nồng độ từ 0,7-1,7 ppb [16,17].
Trong quá trình sản xuất chế biến long thực, thực phẩm một số lợng ngũ cốc
đã bị loại ra do nhiễm Aflatoxin thì lại đợc dùng lại làm thức ăn cho gia súc, gia
cầm. Tại Viện Vệ sinh Y tế Công cộng 1998 - 2000 kiểm nghiệm 115 mẫu thực
phẩm có nguồn gốc ngũ cốc và các loại hạt có dầu thì tỉ lệ nhiễm độc tố vi nấm
Aflatoxin cao từ 30% - 67% đặc biệt ở thức ăn gia súc 94%[18].

Độc tố Aflatoxin
chịu nhiệt, rất bền vững và chỉ bị phá huỷ ở nhiệt độ cao trên
120
0
C trong môi trờng kiềm. Vì thế cho nên khi vào cơ thể gia cầm, gia súc chúng
không bị phân huỷ hoàn toàn mà vẫn còn tích luỹ trong mô (chủ yếu là mô gan) và
gây ô nhiễm cho ngời ăn thịt gia cầm, gia súc này, tạo nên một dây truyền sinh học
mầm bệnh. Để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, bảo vệ sức khoẻ ngời tiêu dùng
trớc nguy cơ bệnh tật, ngăn ngừa và hạn chế sự nhiễm Aflatoxin cho ngời bằng
đờng ăn uống thì việc xác định lợng Aflatoxin cho phép theo qui định với lơng
thực, thực phẩm là điều rất cần thiết. Tại Việt Nam Bộ Y tế đã xây dựng giới hạn d
lợng Aflatoxin trong thực phẩm và sữa trớc năm 1998 là 0,5 - 20ppb và sau năm
1998 có giảm mức d lợng xuống thấp hơn để phù hợp với mức chỉ tiêu của các
nớc đang phát triển. Qui định gần đây nhất là theo quyết định số
867/QĐ/BYT/1998 - Mức giới hạn cho phép với độc tố Aflatoxin trong thức ăn là
dới 10ppb và trong sữa là nhỏ hơn 0,5 ppb, các độc tố vi nấm khác trong thức ăn là
35 ppb[19]. Xác định lợng ăn vào trung bình ngời lớn ở nớc ta là
60ng/ngời/ngày và tính theo trọng lợng cơ thể 0,3 -1,2 ng/ngời/ngày. Lợng
Aflatoxin M
1
ăn vào trẻ em tính theo trọng lợng cơ thể 1ng/em/ngày thấp hơn so với
một số nớc châu á, châu Phi [20].


20
3. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
3.1 Đối tợng nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm nghiên cứu :
Tại một số chợ và khu phố bán ngô, lạc, mỳ gạo trên địa bàn Hà Nội
3.1.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian tiến hành đề tài từ 7/2006 đến 12/2006
3.1.3 Đối tợng nghiên cứu: 3 nhóm ngũ cốc
Bột gạo và bột mỳ, ngô và bột ngô, lạc và bột lạc
3.2. Phơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả dựa trên một điều tra cắt ngang thực trạng
ô nhiễm nấm mốc và lợng độc tố Aflatoxin trong lạc, ngô, gạo mỳ từ tháng 7/2006
đến 12/2006
Phơng pháp nghiên cứu: Mẫu gạo mỳ, ngô, lạc đợc mua ngẫu nhiên trong một số
chợ của Hà Nội. Tại Labo Vi sinh Khoa Vệ sinh thực phẩm của Viện Dinh Dỡng, xác
định sự ô nhiễm nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus của gạo mỳ, ngô, lạc theo TCVN
số 5166 - 1990 và số 52 TCN- TQTP 0001:2003, nuôi cấy phân lập tìm ra những mẫu
nhiễm nấm mốc A. flavus, sau đó định lợng độc tố Aflatoxin(tổng số) từ những mẫu
có nấm mốc a. flavus, A. parasiticus trên máy ELI SA bằng bộ kít thử Veratox-HS
aflatoxin của hãng NEOGEN (Mỹ).
3.2.2. Cỡ mẫu: Chọn mẫu ngẫu nhiên theo công thức:
n = z
2
p(1-p)/e
2

n: Là số mẫu phân tích, với độ

tin cậy là 90% -> z =1,64
p: Là tỉ lệ mẫu có a. flavus theo các nghiên cứu trớc khoảng 80%[14,15]
e: sai số 10% = 0,1
Mẫu tính toán: Theo công thức tính đợc 43 mẫu cho một nhóm thực phẩm
Tổng số mẫu: 43 mẫu/nhóm x 3 nhóm = 129 mẫu sẽ đợc phân tích tìm nấm A.flavus.
Sau khi xác định số mẫu có nấm A. flavus sẽ đợc lu giữ lại để định lợng độc tố
Aflatoxin(tổng số) bằng ELISA.

3.2.3. Cách thu thập mẫu:
Mẫu đợc mua ở các quầy bán lẻ của một số chợ và khu phố trong quận Cầu Giấy,
Đống Đa, Ba Đình, Hoàn Kiếm, Hai Bà Trng, tập trung ở 3 nhóm sản phẩm là ngô,
lạc và gạo mỳ.
Lấy mẫu theo nguyên tắc lấy mẫu để kiểm tra vi sinh vật ở phòng thí nghiệm, mỗi

21
mẫu lấy 3 đơn vị mỗi đơn vị ít nhất 250g, cho vào túi vô trùng đã chuẩn bị sẵn, bảo
quản lạnh và đa về phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ.
Ba đơn vị mẫu sẽ đợc trộn đều lấy một đơn vị thống nhất làm đại diện cho mẫu,
số còn lại làm mẫu lu.
3.2.4. Phơng pháp phân tích
3.2.4.1 Phơng pháp xác định nấm mốc A. flavus có trong thực phẩm :
áp dụng theo số 785/2003/QĐ-BYT, 52 TCN- TQTP 0001:2003. Sử dụng kỹ thuật
đổ đĩa, đếm khóm nấm trên môi trờng thạch Sabouraud sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ
28
0
C trong thời gian 5 ngày. Số lợng bào tử nấm mốc có trong mẫu kiểm tra sẽ đợc
tính từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng. Định danh nấm mốc A. flavus
đợc tiến hành qua nhận xét đại thể về đặc điểm khóm nấm và nhận xét vi thể về hình
thái học của khóm nấm.
Dùng dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểm nghiệm vi sinh.
Môi trờng: Dùng thạch Sabouraud, thạch Czapeck(Merk-2005) nớc thạch
1
0
/
00
, dung dịch Lactofenol Amann. Môi trờng nuôi cấy, nớc pha loãng đợc
điều chế theo công thức và hấp tiệt trùng ở 110
0

C/30 phút.
Mẫu đợc xay nhỏ, cân 25g cho vào 225 ml nớc thạch1
0
/
00
để pha loãng đồng
nhất đợc nồng độ1/10. Tuỳ mẫu có thể pha loẫng 1/100, 1/1000
Dùng pipet vô trùng hút chính xác 1ml mẫu thử cho vào hộp lồng vô trùng. Đun
chảy thạch Sabouraud, để nguội đến 45
0
C chỉnh pH của thạch đến 4,5 - 5,5 bằng
dung dịch axit lactic 20%. Rót vào hộp lồng12-15ml thạch, xoay đều trộn rồi để
các đĩa thạch đông tự nhiên sau đó đặt vào tủ ấm 28
0
C trong 5 ngày.
Đếm và ghi lại những đĩa có khuẩn lạc nghi ngờ là có nấm A.flavus, sau đó
dùng que cấy nhọn đầu lấy một ít bào tử cấy mấy điểm cách đều nhau trên đĩa
thạch Czapeck, ủ ấm 28
0
C trong 5 ngày, không lật ngợc đĩa.
Định danh nấm mốc A.flavus trên đĩa thạch Czapeck và lấy khóm nấm làm tiêu
bản và quan sát vi thể ở vật kính 10, 40: Khóm nấm mốc có đờng kính 3-5cm
trên thạch Czapeck sau 5 ngày, khóm nấm lúc đầu hơi vàng, sau trở nên xanh
lục hoặc vàng lục, đôi khi hoá nâu khi già. Nấm mốc A. flavus có vách cuống
conidi xù xì, có gai, bông lớn hình cầu, hình phóng xạ hoặc hình cột lỏng lẻo,
hình tia, bọng hình cầu đến gần cầu. Thể bình một hoặc hai tầng chủ yếu hai
tầng.

22
Sơ đồ xác định nấm mốc A. flavus
1. Lấy mẫu, pha loãng

1ml 1ml





25g mẫu 225ml nớcthạch 9ml nớc thạch 9ml nớcthạch




10
-1
10
-2
10
-3
2. Nuôi cấy mẫu

Nhận xét đại thể
Thạch Czapek / ủ
28 1
0
C/ 5 ngày





Soi tiêu bản kính

Nhận xét vi thể

3.2.4.2. Phơng pháp định lợng aflatoxin(tổng số) trên ELISA bằng kít phát hiện
độc tố Veratox HS của hãng NEOGEN (Mỹ)
Kít phát hiện độc tố Aflatoxin Veratox - HS là một thử nghiệm miễn dịch trực tiếp
(ELISA), xác định lợng độc tố Aflatoxin(tổng số) trong các loại thức ăn và thực phẩm
có khả năng nhiễm Aflatoxin nh ngũ cốc, bột ngũ cốc, hạt có dầu, lạc tơi, lạc chiên,
bột lạc, ngô, bỏng ngô, lúa mì, bột mì, cà phê, milo
Thạch Sabouraud/ ủ
28 1
0
C/ 5 ngày

1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml

23



Nguyên lý phản ứng dựa trên nguyên tắc phản ứng ELISA





Conjugate Samples Antibody Substrate Red sto
p

(C.H men) (KN) (KT) (cơ chất ) (chất dừng)
- Mẫu đợc trộn với chất cộng hợp men ở trong những giéng trộn màu đỏ, độc tố
Aflatoxin(tổng số) tự do có trong mẫu sẽ đảm bảo đợc gắn enzym tạo ra phức men.
- Phức hợp gắn men đợc chuyển sang giếng gắn kháng thể đặc hiệu. Tại đây phản ứng
kháng nguyên, kháng thể xảy ra, sau bớc rửa cơ chất đi thì phản ứng có màu xanh da
trời. Màu xanh càng đậm có nghĩa là càng ít độc tố Aflatoxin.
- Kết quả định lợng đợc đọc bằng máy đọc ELISA: Mật độ quang của những nồng
độ chuẩn sẽ hình thành đờng cong chuẩn. Từ mật độ quang các mẫu sẽ tính chính xác
lợng độc tố Aflaioxin(tổng số) của từng mẫu.

Thành phần bộ kít
Phần hoá chất
1. 48 giếng nhỏ có gắn kháng thể.
2. 48 giếng trộn đợc đánh dấu màu đỏ.
3. 5 lọ loại 1,5ml dán nhãn màu vàng từ 0, 1, 2, 4 và 8 ppb Aflatoxin.
4. 1 lọ loại 7ml dung dịch cộng hợp men Aflatoxin-HRP nhãn xanh da trời.
5. 1 lọ loại 24ml dung dịch cơ chất K-Blue nhãn xanh lá cây
6. 1 lọ, 32ml dung dịch dừng phản ứng nhãn đỏ.
7. Methanol Grade ACS.
8. Nớc cất hoặc nớc không bị ion hoá.
Phần dụng cụ
1. Xy lanh chia độ 250 m.
2. Bình đựng dung tích 125ml.
3. Giấy lọc Whatman # 1, ống tiêm lọc, phễu lọc, các ống tuýp để chứa mẫu.
4. Máy trộn tốc độ cao Waring kèm một bình loại 1lít.
5. Máy nghiền.
6. Cân với trọng lợng cân từ 5 -25gram.
7. Thiết bị đọc, kèm bộ đọc 650nm.
+

24
8. Pipet man 12kênh, Pipet man 100 àl và đầu côn.
9. Khăn giấy và giấy thấm.
10. Thiết bị hẹn giờ, bút kính, chai rửa dạng bóp bằng nhựa loại 250ml.
11. Đĩa hình thuyền để đựng thuốc thử phản ứng.
Chuẩn bị mẫu và các chiết xuất
Mẫu kiểm tra lấy theo kỹ thuật lấy mẫu đã đợc chấp nhận. Mẫu đợc tán nhỏ và
trộn đều trớc khi tiến hành. Giữ mẫu ở nhiệt độ từ 2- 8
0
C cho đến khi phân tích.

1. Chuẩn bị một lợng dung dịch Methanol 70% bằng việc trộn 7 phần methanol
Grrade ACS với 3 phần nớc cất.
2. Lấy mẫu đại diện, nghiền toàn bộ mẫu cho đến khi ít nhất 75% của nguyên liệu đã
đợc tán nhỏ lọt qua đợc lới lọc 20, cỡ khoảng bằng bột cà phê tan.
3. Trộn 25g mẫu đã nghiền với 125 ml methanol 70%/ dung dịch trong khoảng 2 phút
bằng thiết bị trộn tốc độ cao.
4. Lọc triết xuất bằng cách đổ 5 ml qua lọc Whatman # 1(hoặc ống tiêm lọc) và thu
phần nớc lọc ra làm mẫu
Các bớc tiến hành
Để tất cả thuốc thử phản ứng ở nhiệt độ phòng từ 18-30
0
C trớc khi sử dụng
1. Lắc đều các chai thuốc thử trứơc khi dùng
2. Cho 100 àl chất cộng hợp men vào từng giếng đã đánh dấu màu đỏ
3. Cho100àl chất đối chứng và mẫu vào các giếng đánh dấu màu đỏ theo tuần tự sau
0 1 2 4 8 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Dải1
S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 Dải2

4. Chuyển 100 àl sang các giếng đă gắn kháng thể, ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
5. Rửa các giếng (5 lần) bằng nớc cất rồi úp ngợc các giếng xuống trên các khăn
giấy thấm cho đến khi hết nớc đọng.
6. Cho 100àl cơ chất vào các giếng, lắc đều trong 10-20 giây, ủ 10 phút.
7. Cho100àl dung dịch dừng phản ứng vào các giếng và lắc đều
8. Lau sạch phía ngoài của các giếng bằng vải khô và đọc bằng máy đọc ELISA ở
bớc sóng 650nm.
9. Sử dụng phần mềm Log/Logit của Neogen để tính kết quả
Cách tính kết quả
Các kết quả phải đợc đọc trong vòng 20 phút sau khi kết thúc việc kiểm tra.
phản ứng tại các giếng trộn tạo ra màu xanh da trời. Màu xanh càng đậm có nghĩa là
càng ít độc tố Aflatoxin. Mật độ quang học của mẫu chứng sẽ hình thành đờng cong

chuẩn. Từ mật độ quang của các mẫu sẽ tính chính xác lợng độc tố Aflatoxin(tổng số)
Một số đặc điểm về chất lợng kỹ thuật của bộ kít

25
- Giới hạn
p
hát hiện: 0.5
pp
b (đợc xác định bằn
g
bình
q
uân của 10 mẫu khôn
g
chứa
độc tố Aflatoxin, cộng với 2 độ lệch chuẩn)
- Giới hạn về định lợng: 1ppb là điểm thấp nhất trên đờng cong biểu đồ.
- Phạm vi định lợng: 1- 8 ppb(với các mẫu định lợng trên 8ppb sẽ phải pha loãng ra
truớc khi kiểm tra)
- Phạm vi áp dụng: Ngũ cốc, sản phẩm ngũ cốc, milo, lạc tơi, lạc chiên bơ, bột lạc,
bỏng ngô, gạo các loại hạt của cây lúa mì.
3.3. Đánh giá kết quả
Đánh giá kết quả mẫu kiểm tra có đạt tiêu chuẩn vệ sinh hay không căn cứ vào
các chỉ tiêu trong danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lơng thực, thực phẩm theo QĐ
số 867 của Bộ Y tế ban hành ngày 4/4/1998[19]
Giới hạn cho phép theo QĐ 867 của nhóm ngũ cốc, đậu đỗ[19]:
TT
Thực phẩm Chỉ tiêu
Số khẩn lạc cho phép
trong1g hay 1ml

1 Lạc
TSBTNM-M
10
3

2 Gạo, mỳ
TSBTNM-M
10
3

3 Ngô
TSBTNM-M
10
3

Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm[19]:
TT
Tên độc tố vi nấm Sản phẩm
Giới hạn nhiễm tối đa cho
phép mcg/kg(ppb)
1
Aflatoxin tổng số
hoặc B
1

Thức ăn 10
2
Aflatoxin M1
Sữa

0,5
3
Các độc tố vi nấmkhác Thức ăn 35
Khi kết quả vợt quá giới hạn cho phép theo bảng trên thì thực phẩm đợc xác định
là không đạt tiêu chuẩn vệ sinh (bị ô nhiễm)
3.4. Xử lý số liệu
Lu giữ và xử lý số liệu theo phơng pháp thống kê y sinh học thông thờng, sử dụng
phần mềm EXCEL, phần mềm Microplate Manager 5.1.