Nghiên cứu quy trình sản xuất cao đặc hai loài diệp hạ châu quy mô pilot

Bộ Y tế



Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Tên đề tài

Nghiên cứu quy trình sản xuất
cao đặc hai loài diệp hạ châu
quy mô pilot

Chủ nhiệm đề tài : DS. Nguyễn Văn Phong
Cơ quan chủ trì đề tài : Công ty cổ phần hóa dợc việt nam
M số đề tài: 01/06-10 Nghiên cứu KHCN phát triển nguồn dợc liệu và
thuốc cổ truyền





7267
30/3/2009

Hà Nội, 2008

2
Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Tên đề tài
Nghiên cứu quy trình sản xuất
cao đặc hai loài diệp hạ châu
quy mô pilot

Chủ nhiệm đề tài : DS. Nguyễn Văn Phong
Cơ quan chủ trì đề tài : Công ty cổ phần hóa dợc việt nam
Cấp quản lý: Bộ Y tế
Thời gian thực hiện: Từ 01/2007 đến 12/2008
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 1400 Triệu đồng
Trong đó kinh phí SNKH: 800 Triệu đồng




Hà Nội, 2008


3
Báo cáo kết quả đề tài nghiên cứu cấp bộ

1. Tên đề tài
Nghiên cứu quy trình sản xuất cao đặc hai loài Diệp hạ châu quy mô pilot
2. Chủ nhiệm đề tài: DS. Nguyễn Văn Phong
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Công ty cổ phần hóa dợc việt nam
4. Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế

5. Th ký đề tài: KS. DS. Nguyn Mnh Hựng
6. Phó chủ nhiệm đề tài: PGS TS. Lờ Xuõn Qu
7. Danh sách những ngời thực hiện chính
TT H v tờn
1 Hong Vn Ho, CN.
2 Nguyn Minh Lý, CN.
3 Nguyn Vn Thụng, KS.
4 inh Vn Thnh, KS.
5 ng Quc Chn, KS.
6 Phm Vn Khang, ThS.
7 V Anh Tun, Ths.

8. Các đề tài nhánh (đề mục) của đề tài (nếu có)
9. Thời gian thực hiện: Từ 1/2007 đến 12/2008








4
Những chữ viết tắt
*)

Viết tắt Nguyên bản Ghi chú
P.a Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.
P.u Phyllanthus urinaria L.
DHC

Diệp hạ châu
NCT&CB
Nghiên cứu trồng và chế biến
PTN Phòng thí nghiệm
DĐVN Dược điển Việt Nam
BVTV
Bảo vệ thực vật
TC Tiêu chuẩn
TCCS Tiêu chuẩn cơ sở
ppm
Phần triệu
ppb
Phần tỉ
CTCP
Công ty Cổ phần
CT Công ty
XN Xí nghiệp
SX Sản xuất
NC Nghiên cứu
ĐH Đại học
TCNSH
Tiêu chuẩn nước sinh hoạt
*)
Một số chữ viết tắt trong mục Tài liệu tham khảo không được liệt kê và giả thích trong mục này

5
Môc lôc
Mục
Trang
Phần A: Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài (chủ nhiệm ĐT tự đánh giá) 8
1. Kết quả nổi bật của đề tài
8
1.1. Đóng góp mới của đề tài 8
1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể) 8
1.3. Hiệu quả về kinh tế 9
1.4. Hiệu quả về xã hội 9
1.5. Hiệu quả khác 10
2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 10
3. Đánh giá thực hiện ĐT (đối chiếu với ĐCNC được phê duyệt ) 10
(a) Tiến độ 10
(b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu 10
(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương 11
(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí 11
4. Các ý kiến đề xuất 11
Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ 12
1. Đặt vấn đề 12
1.1. Tình hình chung - Tính cấp thiết 12
1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài 13
1.3. Mục tiêu nghiên cứu 13
2. Tổng quan đề tài 14
2.1. Một số kết quả nghiên cứu DHC ở nước ngoài 14
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18

3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 24
3.1. Thiết kế nghiên cứu 24
3.2. Mẫu và đối tượng nghiên cứu 24
3.3. Phương pháp nghiên cứu 24
3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu 24
3.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 25
3.3.3. Một số thiết bị hóa chất vật tư chính 30

6
3.3.4. Xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot
31
4. Kết quả nghiên cứu 32
4.1. Nguồn dược liệu DHC 32
4.1.1. Chi DHC (Phyllanthus) 32
4.1.2. Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. 32
4.1.3. Phyllanthus urinaria Linn 33
4.1.4. Nguồn dược liệu DHC ở nước ta 34
4.2. Thu hái sơ chế và bảo quản dược liệu 38
4.2.1. Mùa thu hái 38
4.2.2. Nguồn dược liệu 38
4.2.3. Quy trình thu hái, sơ chế 38
4.2.4. Quy trình bảo quản dược liệu 39
4.3. Nhu cầu dược liệu DHC 42
4.4. Nghiên cứu cây DHC đắng 45
4.4.1. Định tính hóa học DHC đắng 45
4.4.2. Hàm lượng tro DHC đắng 50
4.4.3. Nghiên cứu chiết DHC đắng bằng nước quy mô PTN 50
4.4.4. Chiết DHC đắng bằng cồn/nước 30/70 trong PTN 53
4.4.5. Chiết DHC đắng bằng cồn/nước 50/50 trong PTN 56
4.4.6. Chiết DHC đắng bằng cồn 94

o
trong PTN [12,25] 58
4.4.7. Hàm lượng hoạt chất trong DHC đắng 59
4.5. Nghiên cứu DHC (P.u) 60
4.5.1. Định tính thành phần hóa học DHC (P.u) 60
4.5.2. Định lượng một số hoạt chất DHC (P.u) 61
4.6. Bàn luận kết quả nghiên cứu phòng thí nghiệm 61
4.6.1. So sánh định tính thành phần hóa học 61
4.6.2. So sánh định lượng thành phần hóa học hai loài P.a và P.u 62
4.6.3. So sánh hiệu quả chiết của dung môi 63
4.6.4. Bàn luận về quy trình chiết phòng thí nghiệm 64
4.6.5. Lựa chọn dung môi và quy trình chiết pilot 65
4.7. Điều chế cao đặc hai loài P.a và P.u qui mô pilot 66
4.7.1. Kết quả chiết pilot tạo cao đặc 66
4.7.2. Kết quả phân tích kiểm tra cao đặc chiết pilot 67
4.7.3. Bảo quản nghèo oxi hai loài cao đặc p.a và p.u 72
4.8. Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot 74
4.8.1. Nguyên phụ liệu dung môi hoá chất 74
4.8.2. Thiết bị, máy móc 75
4.8.3. An toàn lao động 76

7
4.8.4. Sơ đồ Quy trình sản xuất 77
4.8.5. Mô tả Quy trình sản xuất qui mô pilot cao đặc DHC 78
4.8.6. Kiểm tra chất lượng 80
4.8.7. Bã chiết – bảo vệ môi truờng 80
4.8.8. Các hồ sơ và sổ ghi chép cần thiết cho sản xuất cao 81
4.8.9. Quản lý chất lượng 82
4.9. Sản xuất 200 kg cao đặc DHC đắng 83
4.9.1. Nguyên liệu 83

4.9.2. Tiến hành 83
4.9.3. Hiệu suất chiết – tạo cao đặc 83
4.10. Đánh giá chất lượng cao đặc sản xuất được 84
4.10.1. Tính chất và thành phần hóa học 84
4.10.2. Hàm lượng kim loại nặng và thuốc BVTV 85
4.10.3. Vi khuẩn, men mốc 87
4.10.4. Độc tính cấp LD
50
87
4.10.5. Tác dụng bảo vệ gan 89
4.10.6. Phiếu kiểm nghiệm 92
4.11. Tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng cao đặc DHC 92
4.11.1. Tiêu chuẩn nguyên liệu DHC đắng P.a 93
4.11.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao đặc DHC 96
4.12. Xây dựng mẫu mã thương hiệu cao đặc DHC 100
4.12.1. Yêu cầu chung 100
4.12.2. Nội dung xây dựng mẫu mã thương hiệu 100
4.12.3. Kết quả xây dựng mẫu mã thương hiệu 101
5. Bàn luận 103
6. Kết luận và kiến nghị 105
7. Tài liệu tham khảo 108






8
Phần A
Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài

1. Kết quả nổi bật của đề tài
1.1. Đóng góp mới của đề tài
• Đã xác định được không chỉ có 1 loài Phyllanthus amarus Schum. et Thonn (P.a)
duy nhất. Nước ta có ít nhất 2 phân loài (giống) P.a
• Đã đề xuất phương pháp hong khô dược liệu thay thế cho phơi nắng
• Đã định lượng được nhóm chất có hoạt tính trong cao đặc là Alcaloid và Lignan
• Đã xây dựng được Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot
• Đã áp dụng phươ
ng pháp bảo quản chống oxy hóa, kín khí nghèo oxy, cho
bảo quản dược liệu và cao đặc DHC đắng

1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể)
* Về xác định tiêu chuẩn hóa dược liệu
Thu thập đ ược dược liệu DHC tại các địa điểm Thái Nguyên, Bắc Giang, Cát
Bà, Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Yên Bài , phân biệt được loài P.a và loài P.u.
* Về thành phần hóa học
Đã định lượng ba nhóm chất chính là Alcaloid, Flavonoid và Lignan trong
cây và trong cao đặc hai loài DHC.

* Về Quy trình sản xuất
Đã xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot, hàm luợng
Alcaloid, Flavonoid và Lignan trong cao thành phẩm đạt TCCS.
* Về bao gói bảo quản
Đã bảo quản thử nghiệm trong điều kiện nghèo oxy cho dược liệu và cao
đặc thành phẩm, đạt chất lượng và kéo dài được thời gian lưu kho.

9
* Về xây dựng thương hiệu
Đã xây dựng tiêu chuẩn dược liệu DHC đắng, tiêu chuẩn chất lượng cao

đặc thành phẩm.
Đã sản xuất hơn 200kg cao đặc DHC, và ổn định Quy trình sản xuất cao đặc
DHC qui mô pilot, bước đầu cung ứng sản phẩm cao đặc cho thị trường.
* Về đào tạo
Góp phần đào tạo 01 cao học với luận văn ‘Nghiên cứu hóa học thực vật
cây chó đẻ r
ăng cưa (Phyllanthus urinaria L.) mọc hoang tại Thái Nguyên’, kết
quả tốt.
* Về công trình công bố
- 01 bài báo trên tạp chí Hóa học : Nguyễn Văn Phong, Nguyễn Mạnh
Hùng, Nguyễn Văn Thông, Đinh Văn Thịnh, Đỗ Thị Lan Hương, Lê Xuân
Quế, Nghiên cứu chế tạo cao diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus
Schum. et Thonn. qui mô pilot, TC Hóa học, T.46, 5A, 2008, tr.454-457
- 01 tham dự Hội thảo ‘Nghiên cứu và phát triển các sản phẩm tự nhiên’
14/11/2008, ĐHBK Hà Nội.

1.3. Hi
ệu quả về kinh tế
Đã sản xuất 2000kg cao đặc thành phẩm và tính theo giá thị trường có thể
thu hồi vốn đầu tư sản xuất pilot sau 1 - 2 năm.

1.4. Hiệu quả về xã hội
• Giải quyết việc làm cho nông dân thu hái cây DHC đắng mọc tự nhiên và
gieo trồng loại cây này.

10
• Cung cấp nguyên liệu cao ổn định chất lượng cho sản xuất thuốc điều trị
bệnh gan, hạn chế thấp nhất sự phụ thuộc mùa vụ.
• Góp phần cung cấp thuốc điều trị bệnh gan hiệu quả cao, giá phù hợp, đáp
ứng yêu cầu của đông đảo nhân dân.

1.5. Hiệu quả khác
• Góp phần phát triển ngành công nghệ hóa dược
• T
ừng bước đưa công nghệ sản xuất có tính công nghiệp trong việc khai
thác nguồn thảo mộc cho đông dược.

2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội
• Đã phối hợp với công ty dược phẩm Đà Nẵng bào chế thuốc điều trị bệnh
gan từ cao đặc DHC đắng sản xuất tại CTCP Hóa Dược Việt Nam.
• Một phần nhỏ s
ản phẩm cao đặc DHC đắng đã được sử dụng trực tiếp
không cần bào chế, thay thế cho việc ‘sắc’ thuốc truyền thống hay ‘hãm’
chè từ DHC khô.

3. Đánh giá thực hiện đề tài so với đề cương đã được phê duyệt
(a) Tiến độ: Đúng theo tiến độ
(b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu
Thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu đề ra
(c) Các sản phẩ
m tạo ra so với dự kiến của bản đề cương
• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương
• Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương
• Khối lượng cao đặc sản xuất được vượt nhiều lần so với dự kiến.

11
(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí
Kinh phí đã được thực hiện theo định mức, nội dung và đối tượng
chi như đã được phê duyệt trong đề cương, đã thanh quyết toán xong.

4. Các ý kiến đề xuất
4.1. Trân trọng đề nghị Bộ xét duyệt dự án sản xuất cao Diệp hạ châu làm
thuốc điều trị bệnh gan
Nước ta có khoảng 3 - 4 triệu người bị viêm gan B mãn tính. Trong khi
thuốc tây y điều trị bệnh gan chưa nhiề
u, giá rất cao, thuốc bào chế từ DHC đắng có
tác dụng tốt, lại không có tác dụng phụ, giá thành chỉ bằng 1/20 – 1/30 giá thuốc tây.
Nhu cầu về thuốc trị bệnh gan bào chế từ DHC sẽ tăng nhanh khoảng 20% năm, số
lượng sẽ rất lớn. Đến 2015, nhu cầu cao DHC lên đến 200 - 250 tấn/năm.
4.2. Đề nghị Bộ Y tế xem xét cho phép xây dựng một dự án ‘‘Công nghệ hóa
thảo dược Việt Nam phòng chống và điều trị bệnh gan’’, cơ quan chủ trì xây
dựng Dự án sẽ là Công Ty Cổ Phần Hóa Dược Việt Nam, ngoài ra còn có các cơ
quan phối hợp các bộ các ngành.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, trên thế giới hiện có đến trên 350 triệu người
(khoảng 5% dân số thế giới) viêm gan B mãn tính. Châu Á có số người mắc bệnh
mãn tính nhiều nhất, trên 200 triệu. Hàng năm có đến 2 triệu người nhiễm virus
viêm gan B bị chết do ung thư gan, viêm xơ gan. Chưa kể đến s
ố bệnh gan do
phơi nhiễm đối với hoá chất, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, các loại ô nhiễm môi
trường khác. Vì vậy nhu cầu thực tế về thuốc trị bệnh gan sẽ rất lớn.




12
Phần B

Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ

1. Đặt vấn đề

1.1. Tình hình chung – tính cấp thiết
Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, có hệ thực vật rất
phong phú, đa dạng, với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài đã được
nhân dân ta dùng làm thuốc [3, 4], là nguồn tài nguyên thiên nhiên quí báu,
nguồn gen vô giá không phải quốc gia nào cũng có.
Hệ thực vật phong phú là tiền đề cho sự phát triển ngành hoá học các hợp
chất thiên nhiên ở nước ta, là nguồn nguyên liệu có giá trị cho ngành hóa dược
đang trên đà phát triển.
Các phương thuốc y học cổ truyền, các nguồn đông dược có những ưu thế
nhất định, đối với nhiều lĩnh vực y tế có tính vượt trội cao, nhất là độc tính thấp,
hiếm khi có tác dụng không mong muốn, và dễ sử dụng. Nguồn tài nguyên sinh
học này có thể tái tạo tự nhiên hay nhân giống và sinh khối nhân tạo, không gây
ô nhiễm môi trường, không làm tổn hại đến môi sinh. Hiện có tới 60%-70% các
loại thuốc chữ
a bệnh đang lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm
sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [3].
DHC là một cây thuốc quí, được nhiều nước trên thế giới sử dụng, ngày
càng đuợc quan tâm nghiên cứu. DHC có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan,
làm phục hồi chức năng gan và ức chế virus viêm gan B phát triển. Nhiều chế
phẩm bào chế từ DHC đã được lưu hành ở
nước ta, thay thế một phần thuốc nhập
đắt tiền, mang lại lợi ích hết sức thiết thực về y tế, xã hội, và đặc biệt về kinh tế
cho bệnh nhân bị bệnh gan ở nông thôn.
Tuy nhiên việc sản xuất thuốc còn phụ thuộc thời vụ thu hái, việc chế biến
nguyên liệu, bào chế bán thành phẩm còn thủ công, nhỏ lẻ, chất lượng sản phẩm
chưa ổn
định.

13
Để sản xuất qui mô lớn, có tính công nghiệp, cần có nguồn nguyên liệu ổn

định, cả về chất lượng và số lượng, không bị ảnh hưởng bởi thời vụ thu hái. Vì
vậy việc chiết hoạt chất tạo cao đặc qui mô đủ lớn, làm nguồn nguyên liệu ổn
định đảm bảo chất lượng cao cung ứng cho bào chế thuốc là hết sức cần thiết.

1.2. Giả thiết nghiên cứu c
ủa đề tài
Từ nhu cầu cấp thiết trên đây và thực tế sử dụng đông dược nói chung và
DHC nói riêng, có thể giả thiết xây dựng được Quy trình sản xuất qui mô pilot
cao đặc DHC, tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng, và đảm bảo tính ổn định lâu
dài của sản phẩm.

1.3. Mục tiêu của đề tài là
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, giả thiết trên đây, đề tài đề ra mụ
c tiêu sau:
• Xây dựng quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot.
Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. ) và Diệp
hạ châu (Phyllanthus urinaria L.).
• Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng hai loại cao này.
• Theo dõi độ ổn định của cao.

14
2. Tæng quan ®Ò tµi
2.1. Một số kết quả nghiên cứu DHC ở nước ngoài
2.1.1. Nghiên cứu về DHC
DHC là cây thuốc tự nhiên, nên chỉ quốc gia nào có nguồn tài nguyên này
mới có quá trình sử dụng lâu đời. Các nước nghiên cứu về DHC đều có nguồn
nguyên liệu DHC tự nhiên, điển hình nhất là Ấn Độ, một số nước Nam Mỹ,
Trung Quốc … Trong số đó, Ấn Độ là nước có nhiều kết quả ứng dụng Diệp hạ
châu, và có những nghiên cứu cơ bản có hệ thống. Ngoài ra một số nước phát
triển như Mỹ, Nhật, Pháp mới đây đều có những công trình nghiên cứu về Diệp
hạ châu theo phương pháp của y học hiện đại.

2.1.1.1. Về thực vật học
DHC từ lâu được sử dụng làm thuốc ở nhiều nước : Trung Quốc, Ấn độ, các
nước Nam Mỹ (Peru, Achentina, ). Trên thế giới đã phát hiện trên 700 loài Diệp hạ
châu, với tên gọi dân gian rất khác nhau, nhưng trong số được nghiên cứu nhiều nhất
vẫn là hai loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn. và Phyllanthus urinaria L.
Có thể liệt kê một số tài liệu khoa học nghiên cứu về hai loài DHC này:
1. Nghiên cứu về loài Phyllanthus urinaria L. [28, 34, 37, 38, 50]
2. Nghiên cứu về loài Phyllanthus amarus
Schum. et Thonn. [25, 29, 33, 36, 41, 42,
49, 59, 62].
Ngoài ra còn có một số loài khác được nghiên cứu:
3. Nghiên cứu về loài Phyllanthus niruri [46, 48, 50, 67]
4. Nghiên cứu về loài khác (Phyllanthus acidus [55], (Phyllanthus emblica-) [52])
5. Nghiên cứu về Phyllanthus, không phân biệt loài nào [63, 69, 70] cho thấy

15
khả năng sử dụng hỗn hợp các loài Diệp hạ châu.
2.1.1.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học

Các nhóm chất chính có giá trị về tác động sinh học [27, 35, 44, 64]
- Lignan (có nhiều trong lá, thân), gồm các hợp chất chính sau:
+ Phyllanthin và Hypophyllanthin, có tới > 0,3% khối lượng (w)
+ Lintetralin, Lintetralin ( 4-hydroxy: Seco:, iso:) : > 0,02% w
+ Niranthin, Niranthin (demethylenedioxy, hydroxy): > 0,04% w
+ Nirphyllin, Nirtetralin > 0,09% w
- Flavonoid (trong lá, thân):
+ Catechin,(+):, Catechin, epi: (-):;Catechin-3-o-gallate,epi: (-):
+ Gallocatechin, (+):;Gallocatechin, epi: (-): ; Gallocatechin-3-o-gallate, epi: (-):
+ Phyllanthus Flavonoid FG-1 ; Phyllanthus Flavonoid FG-2
- Alcaloid :
+ Nirurine
+ Octa-trans-2-trans-4-dienamide, Alcaloid-mis, Octa-trans-2-trans-4-dienamide
+ Indolizidine Alcaloid
+ Securinine (nor:, nor: (-), nor: 4-methoxy) (Pyrrolizidine Alcaloid)
+ Ecurinine, nor: Ent (Pyrrolizidine Alcaloid)
- Steroid (đến 0,07%):
+ Cholesterol, 24-iso-propyl: ; Estradiol ; Fraternusterol ;
+ Phyllanthosecosteryl Ester ; Phyllanthosterol ; Phyllanthostigmasterol ; β- Sitosterol
Ngoài ra còn có tannin, lipid, coumarin.
Còn có nhiều nghiên cứu mới về hoá học của DHC [35, 44, 45, 64].



16
2.1.1.3. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học
Nghiên cứu khả năng chữa bệnh của DHC có các nội dung sau:
a/ Tác dụng hồi phục gan, điều trị viêm gan B, các bệnh khác về gan [28, 33,
34, 36-40, 42, 46, 49, 50, 59, 62, 63, 67-70]
b/ Tác dụng chống virus viêm gan B [28, 31, 33, 34, 36, 37, 40, 42, 46, 49, 57-

59, 62, 66, 67]
c/ Điều hòa đường huyết, lợi tiểu, hạ huyết áp [43, 51, 53, 56]
d/ Tác dụng bảo vệ hệ tim mạch [38, 50, 52]
đ/ Tác dụng chống ung thư (anticancer-cytotoxicity), chống HIV, [30, 45, 54]

2.1.1.4. Kết quả nghiên cứu về độc tính
Trong suốt thời gian hơn 30 năm nghiên cứu và sử dụng DHC để điều rị
bệnh, trên thế giới chưa ghi nhận trường hợp ngộ độc nào.

2.1.2. Một số chế phẩm từ DHC của nước ngoài
1. Sản phẩm từ DHC: bột lá, hạt (seeds), dịch cồn (tinture). Bột lá khô 5g
pha nước nóng uống (như pha chè) />
2. CT ChromaDex (www.chromadex.com
) sản phẩm Phyllanthin và
hypophyllantin, Quercetin (5mg, 10mg)
3. CT Pharmasave: Bột DHC 200mg/lần, 3 lần/ngày, điều trị bệnh gan, kể cả
u gan (
4. Live 52 của Ấn Độ,

2.1.3. Chiết Diệp hạ châu
Chiết DHC được thực hiện chủ yếu với dung môi nước, tiếp theo là

17
dung mụi cn/nc. Quy trỡnh chit DHC c gii thiu trong hỡnh 1.3:
* Thu hỏi: cú th chit ngay tt c cỏc b phn ca cõy thu hoch c, hoc
chit tng b phn riờng bit, c bit l lỏ, thõn cõy.
* X lý s ch: Cú th x lý sn phm thu hỏi trc khi chit, vớ d phi sy
khụ, ct hoc xay nghin nh. Vớ d chit 10kg nguyờn liu / 100 lớt nc.
* Chit: chit truy
n thng s dng dung mụi nc. Cú th s dng rung siờu õm

chit. Thit b chit thng lm bng thộp khụng g.
* Quỏ trỡnh lc: chit theo phng phỏp thụng dng vi ngun nguyờn liu xỏc
nh, nh thu hỏi t nhiờn hoc canh tỏc cú giỏm sỏt, lc ch loi b phn x bó.
* Cụ c cú th lm tiờu hao mt phn hot cht do bay hi, phõn hu, v c bit l
oxi hoỏ. Thụng dng nht l cụ
c ỏp sut thp.
* Cụng on bao gúi bo qun rt quan trng i vi sn phm lu kho lõu di.


Hỡnh 1.3. Cỏc cụng on ch yu trong Quy trỡnh chit xut Dip h chõu

2.2. Tỡnh hỡnh nghiờn cu trong nc
2.2.1. Cõy DHC
DHC (ngc di lỏ) l tờn chung ca chi DHC (chi Phyllanthus). DHC
1. Thu hái 2. Xử lý, sơ chế
5. Cô đặc 4. Lọc
3. Chiết
6. Sấy
7. Kiển tra
8. Bao gói
9. Bảo quản

18
còn là tên lưu hành thông dụng ở nước ta chỉ chung các loài cây thuốc cổ truyền
thuộc chi DHC (Phyllanthus), rất có giá trị và đã được sử dụng trong dân gian
hàng nghìn năm nay, không chỉ ở nước ta mà còn ở nhiều nước khác trên khắp
thế giới, điển hình là Ấn Độ, Nam Mỹ
Chi DHC (chi Phyllanthus) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae),
Chi Phyllanthus là một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu, với
kho

ảng hơn 700 loài, phân bố khắp nơi đặc biệt tập trung ở vùng Đông Nam Á
và vùng nhiệt đới của Nam Mỹ. Hai loài DHC được quan tâm nghiên cứu nhiều
nhất là [6-10, 13-18, 20. 24. 26]:
1. Cây Diệp hạ châu (cây chó đẻ răng cưa) không có vị đắng, có tên khoa
học là Phyllanthus urinaria L., được dân gian sử dụng làm thuốc chữa nhiều
loại bệnh và được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây [8, 20, 60, 61].
2. Cây DHC đắng có tên khoa học là Phyllanthus amarus Schum. et
Thonn. mọc hoang phổ biến ở n
ước ta và nhiều nước khác trên thế giới, được sử
dụng để chữa đinh râu, mụn nhọt, lở loét, rắn cắn…, và đặc biệt là thuốc chữa
viêm gan có hiệu quả, được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [8, 9, 10, 13, 15,
18, 24, 26, 60, 61].
Hai cây thuốc quí này là đối tượng nghiên cứu chế tạo cao đặc qui mô pilot.



2.2.1.1. Về thực vật học
Những nghiên cứu mới đây về mặt thực vật học hai loài cây trên được tóm tắt
trong bảng 1.1 [5, 6, 7, 17, 47, 61]. Ngoài ra các đặc điểm khác nhau về thân, lá, hoa
và quả [8, 14, 16, 61], có mô tả chi tiết kèm theo ảnh minh hoạ (hình 1.1) [61].

19

a/ DHC Phyllanthus urinaria L

b/ DHC đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.
Hình 1.1. Ảnh hai loài Diệp hạ châu

Bảng 1.1. Một số đặc điểm của hai loại cây DHC [61].
Bộ phận DHC đắng Phyllanthus amarus

Schum. et Thonn.
Diệp hạ châu
Phyllanthus urinaria L.

20
Thân cành tròn, hình trụ dẹt, có hai mấu cạnh
Lá nhỏ, mỏng, gân mờ to dày hơn, gân mập nổi rõ
Cụm hoa hoa đực và hoa cái mọc trên
cùng đốt
hoa cái ở dưới, hoa đực ở trên
cành
Lá đài 5 lá đài 6 lá đài
Bề mặt quả trơn nhẵn nhăn hoặc gai
Bề mặt hạt sọc dọc, vằn ngang nhỏ có rãnh ngang lớn

Nếu đã có hai loài DHC (P.a và P.u), cần nhận dạng phân biệt giữa chúng với
nhau, có thể sử dụng hai đặc điểm chính: màu sắc và vị:
1. DHC (P. u) có thân màu tía, vị không đắng (hình 1a)
2. DHC đắng (P. a) thân xanh, có vị đắng (hình 1b)

2.2.1.2. Về thành phần hoá học
Đã phân lập được Hypophyllanthin và Phyllanthin (Lignan) có khả năng
bảo vệ gan, và β-Sitosterol, và một số hợp chất khác [13, 14, 16, 24, 61].
Trần Đình Thắng và đồng tác giả [16] đã nghiên cứu phân lập và xác định
một số chất phenolic từ cây DHC Phyllanthus urinaria L.
Nhiều tác giả đã nghiên cứu so sánh hai loài DHC trên [61].
- Chiết được Alcaloid bằng hỗn hợp dung môi CHCl
3
-MeOH (9:1)
- Chiết được polyphenol bằng hỗn hợp dung môi CHCl

3
-EtOAc-HCOOH
(7:3:1)
Các chất Alcaloid của DHC đắng (P. a) được nghiên cứu và giới thiệu
trong [24]. Viện Dược liệu chế tạo Phyllantin từ bột cao khô DHC [9]. Các hợp
chất Lignan được chiết xuất và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan [60].


21


Hình 1.2. Hypophyllanthin và Phyllanthin

2.2.1.3. Tác dụng sinh học
[9, 10, 13, 14, 15, 18, 21, 24, 26, 61]
DHC có tác dụng sinh học rất đa dạng.
Hoạt tính sinh học của các chất chiết xuất từ DHC đã chứng minh [14]
+ Chống oxi hoá (phương pháp DPPH) (Hypophyllantin và Phyllantin)
+ Hoạt tính kháng vi sinh vật (8 chủng điển hình, trong đó có Escherichia
coli) tác động của Hypophyllantin, Phyllantin được so sánh với penicilin.
+ Sử dụng 3 chủng vi sinh để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
hai chất trên, Hypophyllantin và Phyllanthin đều có khả năng chống oxi
hoá, kháng khuẩn 3 chủng E. coli, B. subtilis
và S. cerevisiae
- Thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity), đối với tế bào Caco2 (human
colonic carcinoma cell line- Abcam) cho thấy Alcaloid chiết từ DHC có
tác dụng dương tính trên tế bào Caco2 [24, 61]
- Một số nghiên cứu khả năng bảo vệ khôi phục chức năng gan [9, 15, 26]:

22

+ Đối với chuột, sử dụng dịch chiết DHC qua đường uống 15 ngày trước khi
tác động CCl
4
, CCl
4
+ dầu oliu (qua đường uống), 24h sau tác động, máu
chuột được kiểm tra ALT và AST. Kết quả cho thấy cả hai loài DHC đều có
tác dụng bảo vệ gan rất rõ nét
+ Rễ, thân, lá đều có tác dụng bảo vệ gan, thân lá có hiệu quả cao hơn [26].
- Bột cao DHC đắng (bột Phyllanthin), 1g tương đương 11g dược liệu khô,
được thử nghiệm trên động vật (chuột và thỏ) [9]. Kết quả: bột phyllantin
có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm và xơ gan, lợ
i tiểu, lợi mật [9], nhất là
tác dụng bảo vệ chống viêm xơ gan rất rõ rệt.
- Chế phẩm Hepamarin có tác dụng của chế phẩm chống viêm gan [10, 18].
Về hiệu quả kinh tế, điều trị bằng Hepamarin chỉ hết hơn 1200000đ/3
tháng, khoảng 1/10 so với điều trị bằng Intron A (11 880000đ/3 tháng)

2.2.1.4. Về độc tính [ 9, 10, 13, 14, 15, 18, 21, 24, 26, 61]
Độc tính của DHC được quan tâm nghiên cứu bằng nhiều phương pháp
- Bột DHC đắng (Phyllan amarus Schum. et Thonn.) đã loại tạp chất gọi là
Phyllatin, được thử độc tính cấp và độc tính bán trường diễn [9]:
+ 500g dược liệu khô cho 1kg chuột trong một tuần, cả lô 10 con chuột đều
khỏe mạnh [9]. Không tìm được LD
50
. Như vậy DHC có độc tố rất thấp, có
độ an toàn cao trong việc dùng làm thuốc điều trị bệnh.
+ Độc tính bán trường diễn được thử nghiệm trên thỏ với liều 10g
khô/kg/ngày trong vòng 30 ngày liền, không biểu hiện nhiễm độc về mặt
sinh hoá, huyết học và tổ chức học [9].

Kết qủa nghiên cứu này phù hợp với kết quả công bố trên thế giới.


23
2.2.2. Chế phẩm từ DHC
1. Hemaparin (XN dược COPHAVINA sản xuất [10, 18]
2. Phyllanthin (Viện dược liệu) [9, 21]
3. Viên bao phim VG-5 (CTCP Dược DANAPHA), Sylgan-S
4. Viên BOBINA, Viên nang Hamega (CT Dược thảo Phúc Vinh)
5. Liver 94 (Viện 103 và Bệnh viện Thanh Nhàn, Hà Nội)
6. Bột DHC đắng- hepaphyl, [Bệnh viện Quân khu IV và XN Dược phẩm
Trung ương),
7. Trà DHC (Viện dược liệu,), DHC (CTCP Dược phẩm 2/9)
8. Viên bao phim LIVSIN-94 (Nhà sản xuất HATAPHAR)
9. Sirô ORALLIVER (CTCP Dược phẩm Hà Tây),

3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1. Thiết kế nghiên cứu
Đề tài được thiết kế nghiên cứu xây dựng và triển khai Quy trình sản xuất
cao đặc DHC ở mức pilot.

3.2. Mẫu và đối tượng nghiên cứu
Cây DHC đắng (P.a) và DHC (P.u) là đối tượng nghiên cứu của đề tài. Cả
hai loài DHC này đều được lựa chọn theo kết quả đánh giá về thực vật học.
Mẫu cây DHC được khảo sát tại nhiều vùng (Bắc Giang, Hải Dương, Thái
Nguyên, Thái Bình, Hà Nội, Yên Bái, Hải Phòng, Cát Bà …), được thu hái tự
nhiên. Phần lớn DHC khô làm nguyên liệu sản xuất được thu mua trong dân. Các

24
mẫu thí nghiệm được thu hái và phân loại, nghiên cứu thực vật học, định tính,

định lượng và chiết xuất tạo cao đặc.

3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu
• Chỉ tiêu: Nguồn nguyên liệu
• Chỉ tiêu phân loại nhận dạng về thực vật học
• Chỉ tiêu thành phần hóa học của DHC
• Chỉ tiêu Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot
• Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm cao đặc (tính chất, độc tính, bảo vệ gan)
• Chỉ tiêu độ ổn định của cao
• Chỉ tiêu tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và sả
n phẩm

3.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
3.3.2.1. Phương pháp đánh giá nguồn nguyên liệu
- Khảo sát tại các địa phương, cả hai nguồn : nguồn DHC mọc tự nhiên và nguồn
DHC gieo trồng theo thời vụ hàng năm [17].
- Khảo sát khả năng sơ chế
- Khảo sát tài liệu, số liệu lưu trữ, thông tin về việc sử dụng DHC

3.3.2.2. Phương pháp phân loại nhận dạng về thực vật họ
c
- Nghiên cứu tổng quan tài liệu thực vật học các loài DHC [6, 7, 17, 47]
- Ý kiến chuyên gia (Viện Sinh Thái Tài Nguyên, Đại học sư phạm Hà Nội II)
- Quan sát mô tả hình thái học (cây, cành, lá, hoa quả, màu sắc, vị)
- Định tính thành phần hóa học

25

3.3.2.3. Phương pháp định tính và định lượng thành phần hóa học của DHC

Cả hai phương pháp định tính và định lượng thành phần hóa học chủ yếu
đều dựa theo tài liệu [12, 22].
*) Định tính: Phương pháp định tính theo tài liệu [12, 22], các chất :
Alcaloid,
Coumarin, Dầu béo, Đường khử, Flavonoid, Protit, Saponin, Tanin, Xianua.
Một số ví dụ định tính nhóm hoạt chất
+ Định tính Alcaloid
a) Lấy 50 ml dịch chiết DHC, kiềm hóa bằng 10ml dung dịch NH
3
(20-
25%). Tiếp tục rót vào khoảng 50 ml CHCl
3
lắc mạnh và để cho phân lớp, dịch
chiết được lọc và chuyển vào phễu chiết, thêm vào phễu chiết 10 ml dd HCl
10%. Hỗn hợp được lắc đều cẩn thận rồi để yên trong vài phút. Lớp cloroform
tách ra còn lại lớp axit. Lấy phần axit để thử định tính bằng các thuốc thử sau:
b) Thuốc thử Dragendorff. Cho vài giọt thuốc thử trên vào dịch cần
nghiên cứu thấy có kết tủa vàng cam.
c) Thuốc thử Wagner. Cho vài giọt thu
ốc thử trên vào dịch cần nghiên
cứu thấy có kết tủa mầu nâu.
d) Cho vài giọt axit picric trong cồn vào dịch, thấy cho kết tủa màu vàng.

+ Định tính Flavonoid
a) Phản ứng với amoniac.
Nhỏ 2 giọt dịch thử lên miếng giấy lọc sau đó hơ trên miệng ống nghiệm
đựng dung dịch amoniac thấy xuất hiện màu vàng và đậm dần.
b) FeCl
3
1% trong nước :