Nghiên cứu xây dựng panel hồng cầu tại viện huyết học truyền máu trung ương nhằm nâng cao chất lượng an toàn truyền máu về mặt miễn dịch

Bộ y tế




Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ




ứng dụng kỹ thuật PCR và fish
nghiên cứu biến đổi adn ở một số
thể bệnh lơ xê mi và hemophilia A


Chủ nhiệm đề tài :
PGS. TS. Phạm Quang vinh
Cơ quan chủ trì đề tài :
viện huyết học - truyền máu TW




6872
22/5/2008


hà nội - 2007
Bộ y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ



ứng dụng kỹ thuật PCR và fish
nghiên cứu biến đổi adn ở một số
thể bệnh lơ xê mi và hemophilia A




Chủ nhiệm đề tài :
PGS. TS. Phạm Quang vinh
Cơ quan chủ trì đề tài :
viện huyết học - truyền máu TW
Cơ quan quản lý : Bộ Y tế




Thời gian thực hiện : Từ tháng 10 năm 2003 đến tháng 6 năm 2007
Tổng kinh phí thực hiện đề tài : 260 triệu đồng
Trong đó : Kinh phí SNKH : 260 triệu đồng



hà nội - 2007
Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

1. Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật PCR và FISH nghiên cứu biến đổi ADN
ở một số thể bệnh Lơ xê mi và Hemophilia A.
2. Chủ nhiệm đề tài :
PGS. TS. Phạm Quang vinh
3. Cơ quan chủ trì đề tài :
viện huyết học - truyền máu TW
4. Cơ quan quản lý đề tài : Bộ Y tế
5. Th ký đề tài : ThS. Võ Thanh Bình
6. Phó chủ nhiệm đề tài
7. Những ngời thực hiện :
Đơn vị :
- Khoa Miễn dịch Di truyền - Viện Huyết học - Truyền máu TW
- Khoa Tế bào - Viện Huyết học - Truyền máu TW
- Khoa lâm sàng các bệnh máu viện huyết học - truyền máu TW
- Khoa điều trị hemophilia viện huyết học - truyền máu TW
- Phòng Sinh hoá, Khoa Di truyền - Sinh học phân tử
Viện Vệ sinh Dịch tễ TW
Cá nhân :
1. PGS. TS. Phạm Quang Vinh - Viện HH-TM TW
2. PGS. TS. Bạch Khánh Hoà - Viện HH-TM TW
3. CN. Nguyễn Quốc Cờng - Viện HH-TM TW
4. CN. Trần Công Hoàng - Viện HH-TM TW
5. ThS. Nguyễn Thị Mai - Viện HH-TM TW
6. ThS. Võ Thanh Bình - Viện HH-TM TW
7. ThS. Nguyễn Quang Tùng - Viện HH-TM TW
8. ThS. Vũ Minh Phơng - Viện HH-TM TW
9. CN. Nguyễn Minh Phơng - Viện HH-TM TW
10. BSNT. Nguyễn Thiên Lữ - Viện HH-TM TW
11. TS. Nguyễn Hạnh Phúc - Viện VSDT TW
12. TS. Nguyễn Hoài Giang - Viện VSDT TW

8. Các đề tài nhánh
9. Thời gian thực hiện đề tài : Từ tháng 10/2003 đến tháng 6/2007.

chữ viết tắt


AML ( Acute Myeloid leukemia)
: Lơ xê mi cấp dòng tuỷ
ALL ( Acute Lymphocytic leukemia)
: Lơ xê mi cấp dòng lympho
APL ( Acute promyelocytic leukemia)
: Lơ xê mi cấp thể tiền tuỷ bào
FISH ( Fluorescense In situ Hybridization) : Kỹ thuật lai huỳnh quang
MDS ( Myelodysplastic syndrome)
: Hội chứng rối loạn sinh tuỷ
MLL ( Mixed Lineage leukemia)
: Lơ xê mi cấp lai tuỷ - lympho
PCR (polymerase chain reaction)
: Phản ứng khuếch đại gen
RT - PCR (Reverse Trans-criptase
Polymerase chain reaction)
: Phản ứng khuếch đại gen đảo ngợc
RFLPs ( Restriction Fragment Length
Polymorphism)
: Kỹ thuật cắt ADN bằng enzym hạn
chế

Mục lục
Trang
Phần A. Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài
1
Mở đầu
3
Chơng 1. Tổng quan tài liệu 5
1.1. Bất thờng vật chất di truyền và bệnh máu 5
1.1.1. Bất thờng di truyền bẩm sinh 5
1.1.2. Bất thờng di truyền mắc phải 6
1.2. Bất thờng di truyền và Hemophilia 6
1.2.1. Giới thiệu bệnh Hemophilia 6
1.2.2. Di truyền phân tử yếu tố VIII 8
1.2.3. Di truyền bệnh Hemophilia 9
1.2.4. Các tổn thơng di truyền ở bệnh nhân Hemophilia A 10
1.2.5. Các phơng pháp phát hiện ngời mang gen bệnh
Hemophilia
11

1.3. Bất thờng di truyền và lơ xê mi 17
1.3.1. Cơ chế sinh lơ xê mi 17
1.3.2. Hệ thống gen trong tế bào liên quan đến ung th 17
1.3.3. Hoạt hoá các oncogene ở bệnh máu ác tính 25
1.3.4. Bất hoạt gen ức chế u 32
1.3.5. Vai trò phát hiện bất thờng di truyền trong nghiên cứu
bệnh lơ xê mi
33
Chơng 2.
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
36
2.1. Xác định ngời mang gen Hemophilia 36
2.1.1. Đối tợng 36
2.1.2. Phơng pháp nghiên cứu 36
2.2. Nghiên cứu bất thờng gen ở bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh 40
2.2.1. Đối tợng 40
2.2.2. Phơng pháp nghiên cứu 40
2.3. Xác định gen hỗn hợp AML/ETO ở lơ xê mi cấp M2 và gen
PML/RAR ở M3
48
2.3.1. Đối tợng 48
2.3.2. Phơng pháp 49
Chơng 3.
Kết quả
54
3.1. Hemophilia 54
3.1.1. Tỉ lệ dị hợp tử với dạng đa hình ADN có điểm cắt với
enzym BclI trên intron 18 và HindIII trên intron 19 của
gen yếu tố VIII
54

3.1.2. Xác định ngời phụ nữ mang gen bệnh dựa vào phân
tích kết quả PCR-RFLPs với BclI
58
3.2. Phát hiện gen hỗn hợp BCR/ABL ở lơ xê mi hạt kinh 60
3.2.1. Phát hiện bằng kỹ thuật PCR 60
3.2.2. Phát hiện gen hỗn hợp BCR/ABL bằng kỹ thuật FISH 64
3.3. Phát hiện gen hỗn hợp ETO/AML ở M2 và PML/RAR ở
bệnh nhân M3
66
Chơng 4.
Bàn luận
68
4.1. Tính đa hình gen Hemophilia và xác định ngời mang gen
bệnh
68
4.1.1. Tỉ lệ dị hợp tử của PCR-RFPs với vị trí cắt đặc hiệu của
BclI và HindIII
68
4.1.2. áp dụng PCR-RFLPs với BclI vào chẩn đoán ngời
mang gen Hemophilia A
70
4.2. Gen hỗn hợp BCR/ABL và lơ xê mi hạt kinh 72
4.3. Kết quả phân tích gen ETO/AML và RAR/PML 75
Kết luận
77
Tài liệu tham khảo
79

1
Phần A
Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài

Hoàn cảnh ra đời và mục tiêu của đề tài :
Các bất thờng ADN là nguyên nhân của nhiều bệnh bẩm sinh, có tính
di truyền mà hai bệnh thờng gặp trong chuyên khoa Huyết học - Truyền
máu là Thalassemia và Hemophilia. Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong
nớc và trên thế giới về gen bệnh gây Thalassemia. Một số kết quả đã đợc
ứng dụng trong chẩn đoán sớm và chẩn đoán trớc sinh.
Trong khi đó bất thờng ADN trong Hemophilia rất phức tạp và đa
dạng, những hậu quả của bệnh rất nặng nề. Trên thế giới đã có nhiều nghiên
cứu về gen bệnh, về phát hiện ngời lành mang gen bệnh để có biện pháp đề
phòng. ở Việt Nam công tác quản lý, chăm sóc ngời bệnh Hemophilia cha
thật tốt. Tính chất di truyền, đặc điểm gen di truyền cha đợc nghiên cứu;
cha có biện pháp hiệu quả xác định ngời lành mang gen bệnh.
Bên cạnh đó một số biến đổi ADN trong tế bào gốc tạo máu có thể đa
đến hậu quả rối loạn phát triển và gây ra bệnh máu ác tính. Mỗi loại bất
thờng gen có những bệnh cảnh khác nhau. Vì vậy năm 2001 Tổ chức Y tế
Thế giới đã đa ra cách xếp loại bệnh máu và cơ quan lympho. Theo cách
xếp loại này với lơ xê mi cấp cần xem xét trớc hết là sự có mặt hay không
của các biến đổi gen đặc trng. Để xác dịnh gen này cần thực hiện kỹ thuật
xét nghiệm sinh học phân tử.
Viện Huyết học - Truyền máu trong nhiều năm đã xây dựng Trung tâm
Hemophilia và tổ chức các hoạt động tuyên truyền về phát hiện, chăm sóc,
điều trị bệnh. Hàng năm số bệnh nhân do Viện quản lý càng tăng lên.
Trong những năm qua Viện đã triển khai các kỹ thuật chẩn đoán hiện
đại nh xác định CD màng tế bào, phân tích bất thờng nhiễm sắc thể trong

lơ xê mi. Viện là cơ sở đầu ngành của chuyên khoa Huyết học - Truyền máu
cần triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng trong chẩn đoán ngời

2
mang gen hemophilia, chẩn đoán trớc sinh với bệnh này. Đồng thời Viện
phải tổ chức sớm việc ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán và phân loại mới theo
quốc tế. Vì vậy đơn vị nghiên cứu đã đề xuất đề tài nhằm mục đích :
1. Sử dụng kỹ thuật PCR xác định các bất thờng ADN ở bệnh nhân
hemophilia tiến tới tìm ngời lành mang gen bệnh.
2. Triển khai kỹ thuật PCR và FISH trong việc phát hiện một số gen
đặc trng ở bệnh lơ xê mi cấp, lơ xê mi hạt kinh.
Kết quả nổi bật của đề tài:
1. Triển khai đợc kỹ thuật PCR và FISH ở Viện Huyết học -
Truyền máu Trung ơng.
- Đa kỹ thuật hiện đại vào áp dụng và đào tạo đợc đội ngũ cán bộ
kỹ thuật thực hiện đợc qui trình kỹ thuật xét nghiệm PCR, FISH làm cơ sở
cho việc ứng dụng phơng pháp sinh học phân tử chẩn đoán bệnh.
- ứng dụng dụng kỹ thuật PCR - RFLPs xác định ADN đa hình gen
yếu tố VIII. Bớc đầu xác định tỷ lệ dị hợp tử của dạng đa hình ADN cắt
bằng enzym BclI là 48% ở phụ nữ bình thờng. Đây là tỷ lệ có ý nghĩa để
giúp phát hiện ngời mang gen Hemophilia A.
- ứng dụng đợc kỹ thuật PCR và kỹ thuật FISH để xác định gen hỗn
hợp ABL/BCR ở lơ xê mi kinh dòng tủy . ứng dụng kỹ thuật RT PCR phát
hiện gen AML/ETO và RAR/PML ở lơ xê mi cấp dòng tủy, tiến tới góp phần
phân loại lơ xê mi.
2. Xây dựng đợc qui trình sử dụng kỹ thuật PCR xác định ngời
lành mang gen trong gia đình bệnh nhân Hemophilia A và đã áp dụng để
phát hiện đợc 2 ngời lành mang gen bệnh, xác định 7 ngời không mang
gen bệnh.
3. Đào tạo:

- Một luận văn nội trú (đã bảo vệ)
- Làm cơ sở một luận án Nghiên cứu sinh

3

Mở đầu
Bệnh máu là các bệnh liên quan đến tế bào máu, cơ quan tạo máu và
hệ thống cầm, đông máu.
Tế bào máu và cơ quan tạo máu hoạt động, sinh sản, bệnh hoá thực
chất là quá trình hoạt động của hệ thống gen - protein. Các yếu tố tham gia
vào cầm, đông máu cũng là protein - đó là sản phẩm của tế bào thông qua
hoạt động gen - protein.
Nh vậy, dù thuộc loại bệnh nào đều có liên quan đến hoạt động của
gen - protein.
Các kỹ thuật sinh học đặc biệt là kỹ thuật sinh học phân tử phát triển
đã có đóng góp trong việc chẩn đoán nhiều bệnh và phát hiện nhiều tác nhân
gây bệnh.
Những bệnh máu liên quan đến vật chất di truyền có thể là do bẩm
sinh: hệ thống gen đã bị tổn thơng ngay khi cơ thể đợc hình thành, các tế
bào của cơ thể đều mang gen bất thờng. Thuộc nhóm này có rất nhiều bệnh
nhng 2 loại bệnh hay gặp là thalassemia và hemophilia. Cũng có thể bất
thờng vật chất di truyền xảy ra ở 1 tế bào gốc tạo máu và tạo ra các tế bào
con cháu mang bất thờng này. Có nhiều bất thờng gây rối loạn phát triển tế
bào mà điển hình là bệnh ác tính cơ quan tạo máu.
Trên thế giới các nghiên cứu phát hiện bất thờng vật chất di truyền
(ADN) trong các bệnh thalassemia, hemophilia và bệnh ác tính hệ tạo máu đã
đợc thực hiện ở các trung tâm và các nớc phát triển, đang phát triển. Kết
quả nghiên cứu đợc ứng dụng trong chẩn đoán và phòng ngừa bệnh
Hemophilia, Thalassemia. Riêng đối với bệnh máu, Tổ chức Y tế Thế giới đã
đề nghị xếp loại trớc hết căn cứ vào bất thờng di truyền [21].

4
ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu vật chất di truyền trong bệnh
Thalassemia. Tuy nhiên cha có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân
tử trong việc xác định đột biến (bất thờng ADN) ở bệnh nhân Hemophilia
và lơ xê mi.
Nhằm dần dần triển khai áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong
nghiên cứu bệnh máu, chúng tôi thực hiện đề tài này với mục tiêu:
1. ứng dụng kỹ thuật PCR xác định bất thờng ADN ở bệnh nhân
hemophilia A góp phần phát hiện ngời mang gen bệnh.
2. ứng dụng kỹ thuật PCR và và FISH phát hiện bất thờng ADN ở
một số thể bệnh lơ xê mi cấp và lơ xê mi hạt kinh.

5
Chơng 1
Tổng quan tài liệu

1.1. Bất thờng vật chất di truyền và bệnh máu
Bệnh máu có thể là bệnh của tế bào máu, cơ quan tạo máu hay bệnh
liên quan đến hệ thống cầm và đông máu.
Tế bào máu đợc sinh ra ở tủy sinh máu. Quá trình sinh máu ở cơ qnan
tạo máu là quá trình sinh sản tế bào kèm hiện tợng biệt hoá và trởng thành.
Qua quá trình này thì từ một tế bào gốc ban đầu có thể hình thành nhiều loại
tế bào có hoạt động chức năng khác nhau. Tế bào sinh sản, biệt hoá, trởng
thành bình thờng là nhờ hệ thống gen hoạt động bình thờng. Gen bị bất
thờng có thể dẫn đến rối loạn và sinh ra bệnh.
Quá trình đông - cầm máu là quá trình chuyển máu từ trạng thái lỏng
thành trạng thái rắn để không chảy ra ngoài thành mạch mỗi khi thành mạch
bị tổn thơng. Để thực hiện quá trình này cần sự nguyên vẹn của tiểu cầu và
có mặt đầy đủ các yếu tố đông máu. Các yếu tố đông máu là các protein - đó
là sản phẩm của các gen và hoạt động sinh protein. Gen bất thờng dẫn đến
các yếu tố bất thờng đó là bệnh lý, các bất thờng di truyền có thể là bất
thờng bẩm sinh hay mắc phải.
1.1.1. Bất thờng di truyền bẩm sinh
Cơ sở vật chất di truyền đợc hình thành khi hình thành hợp tử. Hợp tử
là tế bào đầu tiên của cơ thể. Các bất thờng bẩm sinh thờng do bố mẹ
truyền cho hay do tổn thơng ADN trong quá trình hình thành giao tử. Nh
vậy, nếu hợp tử đã mang bất thờng nào thì mọi tế bào đều mang bất thờng
đó. Tuy nhiên một loại bất thờng chỉ thể hiện ở một loại hoạt động.
Điển hình trong bất thờng này là các bệnh thalassemia, hemophilia,
rối loạn chức năng tiểu cầu, hồng cầu và những bệnh liên quan đến sinh tế
bào máu nh hội chứng Fanconi [1].

6
1.1.2. Bất thờng di truyền mắc phải
Bên cạnh các bất thờng vật chất di truyền bẩm sinh có mặt trong tất
cả các tế bào thân của cơ thể thì có những bất thờng di truyền mắc phải.
Mỗi một cơ quan của cơ thể có các tế bào hoạt động chức năng. Đó là
các tế bào đã đợc biệt hoá cao độ. Quá trình hình thành các tế bào này là
quá trình sinh sản tế bào thông qua gián phân từ tế bào gốc của cơ quan, kèm
theo tổng hợp nhiều protein đặc trng. Bất thờng di truyền có thể hình thành
trong các tế bào gốc đầu dòng. Những bất thờng này có thể là nguyên nhân
của một bệnh trong cả quần thể tế bào con cháu. Tế bào máu cũng không
ngoài qui luật trên. Các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu đợc sinh ra từ tế
bào gốc tạo máu. Tế bào đầu tiên sinh ra tất cả các dòng gọi là tế bào gốc vạn
năng. Từ tế bào gốc vạn năng này thông qua sinh sản và biệt hoá tạo nên tế
bào gốc định hớng cho các dòng, rồi trởng thành tạo nên tế bào hoạt động
chức năng.
Bất thờng di truyền xảy ra ở tế bào gốc tạo máu có thể gây ra bệnh
máu. Bất thờng di truyền phát sinh ở tế bào gốc định hớng hồng cầu có thể
tạo ra những hồng cầu có màng kém bền vững trong một số điều kiện nh
bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm. Có những bất thờng liên quan tới
các protein tham gia vào điều hoà sinh sản tế bào gây ra giảm sinh hay tăng
sinh ác tính các tế bào máu. Hậu quả là các bệnh ác tính của tế bào máu và
cơ quan tạo máu.
Ngày nay ứng dụng những hiểu biết này, Tổ chức Y tế Thế giới đã
thống nhất phân loại bệnh ác tính hệ tạo máu dựa trên các bất thờng vật chất
di truyền [21].
1.2. Bất thờng di truyền và hemophilia
1.2.1. Giới thiệu bệnh Hemophilia
Hemophilia là một rối loạn chảy máu di truyền hay gặp nhất do giảm
hoặc bất thờng yếu tố viii (đối với Hemophilia A) hoặc yếu tố ix (đối với

7
Hemophilia B). Bệnh gặp ở khắp nơi trên thế giới với tỉ lệ khoảng 1: 10.000
trẻ em trai mới sinh. Tỷ lệ này không khác nhau giữa các chủng tộc cũng nh
giữa các vùng địa lí [22]. Tại Việt Nam ớc tính có khoảng 5.000 ngời bị
bệnh tuy nhiên mới chỉ có khoảng 20% đợc chẩn đoán và quản lí [4] .
Bệnh đợc mô tả đầu tiên từ thế kỉ thứ 2 trớc công nguyên khi các
giáo sĩ Do Thái cắt bao qui đầu cho trẻ em nam và thấy ở một số trẻ có chảy
máu lâu cầm sau cắt [22]. Trải qua thời gian dài, bệnh dần dần đợc làm sáng
tỏ về biểu hiện cũng nh cơ chế sinh bệnh. Đặc biệt vào thế kỉ thứ 19, khi
nhiều thành viên nam trong gia đình của Nữ hoàng Anh Victoria (1819 -
1901) có biểu hiện chảy máu lâu cầm và chết sớm thì việc tìm hiểu đặc điểm
lâm sàng, xét nghiệm, cơ chế sinh bệnh cũng nh điều trị trở thành một cuộc
cách mạng:
- Năm 1820, schửlein đặt tên bệnh là Hemophilia, có nghĩa là bệnh a
chảy máu
- Năm 1822, Nasse phát hiện đợc đặc điểm di truyền của bệnh.
- năm 1840, lane ghi nhận sự truyền máu thành công ở bệnh nhân
hemophilia.
- Năm 1911, addis mô tả thrombin đợc tạo ra muộn hơn so với ngời
bình thờng và hiện tợng này có thể điều chỉnh bởi một lợng nhỏ huyết
tơng bình thờng.
- Năm 1939, brinkhous xác nhận bệnh nhân hemophilia có thành phần
prothrombin bình thờng và sự khiếm khuyết của hệ thống đông máu là do
chậm chuyển prothrombin thành thrombin và nguyên nhân là do thiếu một
yếu tố gọi là yếu tố chống hemophilia, sau này đựơc Wright đề nghị đặt tên
là yếu tố viii.
- Năm 1952, aggeler mô tả bệnh nhân bị a chảy máu do thiếu yếu tố
tạo thành thromboplastin khác với yếu tố viii và sau này đợc gọi là yếu tố
ix.

8
- Đến năm 1984, ngời ta giải mã đợc trình tự gen yếu tố viii. Đây là
phát minh có ý nghĩa rất lớn, là nền tảng để sản xuất yếu tố viii/ix tái tổ hợp
cũng nh phục vụ cho việc chẩn đoán di truyền học, chẩn đoán ngời mang
gen, chẩn đoán trớc sinh [22]
1.2.2. Di truyền phân tử yếu tố VIII
Gen sản xuất yếu tố VIII có độ dài 186kb nằm trên nhánh dài của
nhiễm sắc thể X, tại vị trí Xq28. Vùng mã hóa ARN thông tin có độ dài
khoảng 9 kb đợc chia thành 26 exon, có kích thớc từ 69 đến 3106 đôi bazơ
(bp). ARN thông tin mã hóa một protein gồm 2351 acid amin. Yếu tố VIII
đợc sản xuất nh một protein chuỗi đơn với cấu trúc 6 domain (a1-A2-B-
A3-C1-C2) và ở dạng bất hoạt. Protein yếu tố VIII sẽ thay đổi khi có sự phân
hủy protein. Dới tác dụng của thrombin và yếu tố Xa, yếu tố VIII bị cắt ở vị
trí 372 (chỗ nối A1 - A2), 740 (chỗ nối A2-B) và 1689 (chỗ nối B-A3). Khi
domain A2 tơng tác với phức hợp A1/A3-C1-C2 thì protein yếu tố VIII đợc
hoạt hoá.



Hình 1.1: Cấu trúc phân tử gen và protein yếu tố viii
(Theo Tuddenham Egd 1994)

9
Trên intron 22 có 2 gen khác là F8a và F8b. F8a đợc sao chép theo
hớng ngợc với gen yếu tố VIII bao gồm 1 exon duy nhất. Hai bản copy thêm
của F8a nằm tại vị trí tơng đơng với gen kết thúc 400kb của gen yếu tố VIII
trên nhiễm sắc thể X. Gen F8b đợc sao chép cùng hớng với gen yếu tố viii.
Chức năng và sản phẩm của các gen này hiện còn cha đợc biết [14], [22].
1.2.3. Di truyền bệnh Hemophilia:
Do gen sản xuất yếu tố viii nằm trên nhiễm sắc thể x, di truyền lặn vì

vậy đa số ngời bị bệnh là nam giới, còn phụ nữ là ngời mang gen bệnh.
Ngời ta thống kê có khoảng 30% các trờng hợp bị bệnh không có tiền sử
gia đình, nghĩa là trong gia đình chỉ có một cá thể duy nhất bị hemophilia và
trờng hợp này đợc gọi là đơn phát. Một trờng hợp đơn phát có thể là kết
quả của sự truyền gen hemophilia từ các phụ nữ không có triệu chứng qua
các đời mà cha đợc phát hiện; hoặc từ một đột biến mới ở ngời mẹ và
ngời mẹ là ngời mang gen; hoặc là một đột biến mới từ chính bệnh nhân
hemophilia (novo mutation) [14], [48], [63].
Nếu bố bị bệnh lấy mẹ bình thờng thì tất cả con trai của họ là ngời
bình thờng, còn tất cả con gái sẽ là ngời mang gen bệnh.
X: nhiễm sắc thể X bình thờng
X
h
: nhiễm sắc thể X mang gen bệnh
Mẹ bình thờng Bố bị bệnh

XX



X
h
Y

XX
h
Con gái
mang gen
XX
h

Con gái
mang gen
XY
Con trai
bình thờng
XY
Con trai
bình thờng


- Tất cả con trai không bị bệnh

- Tất cả con gái đều mang gen
bệnh



Nếu mẹ mang gen bệnh lấy bố bình thờng thì có 50% khả năng con
gái của họ là ngời mang gen bệnh, 50% khả năng con gái bình thờng, 50%
con trai bị bệnh và 50% con trai bình thờng về Hemophilia.

10

Mẹ mang gen bệnh Bố bình thờng
XX
h


XY
XX

Con gái
bình thờng
XX
h
Con gái
mang gen
XY
Con trai
bình thờng
X
h
Y
Con trai
bị bệnh


- Có 50% khả năng con trai bị
Hemophilia
- Có 50% khả năng con gái trở thành
ngời mang gen bệnh


Nếu bố bị bệnh lấy mẹ mang gen bệnh (trờng hợp này rất hiếm gặp
và thờng do kết hôn gần) thì 50% con trai của họ là ngời bị bệnh, 50% con
trai bình thờng, 50% con gái bị bệnh, 50% con gái là ngời mang gen bệnh.
Mẹ mang gen bệnh Bố b bnh
XX
h

X
h
Y
X
h
X
Con gái
mang gen
X
h
X
h
Con gái
b bnh
XY
Con trai
bình thờng
X
h
Y
Con trai
bị bệnh


- Có 50% khả năng con trai bị Hemophilia.
- Có 50% khả năng con trai bình thờng
- Có 50% khả năng con gái trở thành ngời mang
gen bệnh
- Có 50% khả năng con gái trở thành ngời bị
bệnh

1.2.4. Các tổn thơng di truyền ở bệnh nhân Hemophilia A:
Gen mã hoá yếu tố viii có kích thớc lớn gồm 26 exon và 25 intron.
Hemophilia có thể là hậu quả của các đột biến điểm, mất một phần hoặc tất
cả gen, chuyển đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hoặc đột biến ở bộ ba khởi đầu
hay bộ ba kết thúc. Các nghiên cứu cho thấy tổn thơng di truyền đóng vai
trò quan trọng trong việc hình thành kháng thể kháng viii cũng nh mức độ
nặng của bệnh. những bệnh nhân bị mất đoạn lớn nhiễm sắc thể, đột biến bộ
ba khởi đầu hoặc kết thúc và tái tổ hợp giữa các nhiễm sắc thể, đảo đoạn
intron 22 thờng hay xuất hiện kháng viii hơn những bệnh nhân mất đoạn
nhỏ nhiễm sắc thể và đột biến hỗn hợp [14],[22],[42],[48]. Sự đảo đoạn là
hậu quả của sự tái tổ hợp gen F8a ở intron 22 và 1 trong 2 bản sao của vùng
tơng ứng trên gen kết thúc của nhiễm sắc thể X với kích thớc khoảng 500

11
kb đợc tìm thấy ở 28 53% bệnh nhân hemophilia thể nặng ở nhiều nớc
[14]Độ lớn của gen cũng nh tỉ lệ đột biến mới cao dẫn tới khó khăn trong
việc xác định trực tiếp tổn thơng gen yếu tố VIII [14],[42].
Ngoài các đột biến làm giảm hoặc bất thờng tổng hợp yếu tố viii, gen
mã hóa yếu tố VIII còn có một số biến đổi không gây bệnh gọi là đa hình
(polymorphism). các đa hình có thể xảy ra ở bệnh nhân hemophilia và ở cả
những ngời bình thờng. chúng có thể nằm trên vùng mã hóa (exon) hoặc
không mã hóa (intron) và di truyền liên kết với gen yếu tố viii. phân tích các đa
hình này có thể giúp phát hiện ngời mang gen bệnh hemophilia. các nghiên
cứu cho thấy: bằng kĩ thuật sinh học phân tử, với các phơng pháp pcr,
rflpngời ta có thể xác định đợc 88% ngời mang gen bệnh [14], [38],
[48]. các dạng đa hình gen yếu tố viii thờng đợc sử dụng trên thế giới là:
biến đổi ở intron 18 với vị trí cắt đặc hiệu của enzym Bcli, ở intron 19 với vị trí
cắt đặc hiệu của enzym Hindiii, đoạn lặp 2 nucleotid (CA)n ở intron 13
1.2.5. Các phơng pháp phát hiện ngời mang gen bệnh Hemophilia:

Ngời phụ nữ mang gen tuy không biểu hiện bệnh nhng có khả năng
truyền gen bệnh cho thế hệ sau. Trong điều kiện của nớc ta hiện nay, việc
điều trị bệnh nhân hemophilia còn gặp nhiều khó khăn do chi phí điều trị lớn,
vì vậy, đa số bệnh nhân hemophilia không đ
ợc điều trị đầy đủ dẫn tới tỉ lệ
tàn tật cao. Chính vì vậy việc phát hiện ngời mang gen bệnh để t vấn cho
họ về sinh sản, để có thể sinh ra thế hệ sau khoẻ mạnh là một nhu cầu bức
bách và có ý nghĩa nhân văn cao cả.
Có nhiều phơng pháp phát hiện ngời mang gen bệnh: dựa vào phân
tích phả hệ, dựa vào kiểu hình (tỉ lệ fviii:c/vwf:ag), dựa vào kiểu gen
trong đó phơng pháp phát hiện ngời mang gen bệnh dựa trên phân tích kiểu
gen có u thế là phân tích trực tiếp tổn thơng adn vì vậy có thể xác định

12
chính xác nhiễm sắc thể mang gen bệnh do đó cho phép khẳng định đợc
ngời mang gen bệnh hay không và có thể sử dụng để chẩn đoán trớc sinh
cho thai nhi.
1.2.5.1 Xác định ngời mang gen dựa vào phân tích phả hệ và dựa vào
kiểu hình (yếu tố đông máu):
Phân tích phả hệ có thể xác định đợc ngời phụ nữ chắc chắn mang
gen và ngời phụ nữ có khả năng mang gen.
Ngời phụ nữ chắc chắn mang gen khi:
- có ít nhất hai con trai bị bệnh.
- là con của bệnh nhân hemophilia.
- có 1 con trai bị bệnh và có ít nhất 1 ngời đàn ông trong họ mẹ bị bệnh.
Ngời phụ nữ có khả năng mang gen khi:
- có 1 con trai bị bệnh.
- có ít nhất 1 ngời đàn ông trong họ mẹ bị bệnh và không có con trai bị
bệnh.
khả năng mang gen của một ngời phụ nữ dựa vào phân tích phả hệ có

thể thay đổi nếu kết hợp với việc phân tích kết quả yếu tố đông máu
(viii:c/ix:c). Có khoảng 50% ngời mang gen có nồng độ yếu tố
viii:c/ix:c bình thờng và khoảng 50% ngời mang gen có nồng độ yếu tố
viii:c/ix:c thấp. Hiện nay để xác định ngời mang gen Hemophilia A,
ngời ta dựa vào tỉ lệ viii:c/vwf:ag của ngời phụ nữ bình thờng và ngời
phụ nữ chắc chắn mang gen, kết hợp tuổi và nhóm máu hệ abo để xác định
khoảng giá trị của ngời mang gen (ngỡng xác định). Hạn chế của phơng
pháp này là độ dao động của nồng độ yếu tố đông máu của các cá thể khác
nhau là rất lớn vì vậy sẽ có một khoảng giá trị lẫn lộn giữa nhóm mang gen
và không mang gen và do đó sẽ có những trờng hợp không thể kết luận khả
năng mang gen đợc. hơn nữa không có chỉ số chung giữa các labo mà tỉ lệ

13
này cần đợc xác định ở từng labo đông máu một. ví dụ ngỡng xác định
ngời mang gen ở ấn Độ là 0.7 [14] thì ở Philippin là 0.6 [44], thái lan là
0.82 [59]. Mặc dù sự kết hợp phân tích phả hệ và kết quả xét nghiệm yếu tố
đông máu là các yếu tố có ý nghĩa quan trọng, tuy nhiên chúng chỉ cung cấp
cho chúng ta biết đợc khả năng mà không cho phép khẳng định ngời phụ
nữ đó có hay không mang gen.
1.2.5.2 Xác định ngời phụ nữ mang gen dựa vào phân tích tổn thơng di
truyền:
Sau khi gen yếu tố viii và yếu tố ix đợc nhân lên nhiều lần thì ngời
ta có thể xác định chính xác tình trạng mang gen cũng nh chẩn đoán trớc
sinh thai nhi hemophilia A và B bằng cách phân tích adn. việc phân tích
trực tiếp đột biến nh trong thalassemia hoặc bệnh thiếu máu hồng cầu hình
liềm có thể coi là một biện pháp lí tởng, có thể áp dụng trong đa số các
trờng hợp, ngay cả khi cá thể bị bệnh trong gia đình không có mặt để phân
tích, hoặc trong gia đình đơn phát. Một điều quan trọng cần lu ý là: ngay cả
với phơng pháp này, trong trờng hợp đơn phát, với một ngời phụ nữ nghi
mang gen có thể không thể loại trừ khả năng mang gen khi không xác định

đợc đột biến ở ngời phụ nữ đó vì rất dễ có khả năng thể khảm trong tế bào
phôi hoặc tế bào thân của ngời đó. Một ngời phụ nữ chỉ mang đột biến
trong một phần của tế bào phôi sẽ không thể đợc chẩn đoán bằng phân tích
tế bào máu. t
rong trờng hợp đột biến tìm thấy ở ngời phụ nữ này thì ngời
đó chính là ngời mang gen.
phân tích gen của bệnh nhân Hemophia A cho thấy có tới hơn 900 đột
biến điểm và trên 70 mất đoạn và đảo đoạn trên gen yếu tố viii đã đợc xác
định [9]. chính vì độ lớn của gen cũng nh sự đa dạng về đột biến nên trên
thực tế phơng pháp xác định trực tiếp đột biến rất khó áp dụng.

14
tuy nhiên, đối với các trờng hợp Hemophilia A thể nặng thì đột biến
nên đợc sàng lọc đầu tiên là đảo đoạn intron 22 sau đó đến đảo đoạn intron
1; lí do bởi các đột biến này đợc tìm thấy ở 45-50% bệnh nhân Hemophilia
A thể nặng. Để phát hiện các đột biến này có thể sử dụng phơng pháp
khuyếch đại chuỗi dài (long pcr) hoặc Southern blot. các phơng pháp này
tơng đối phức tạp và để tiến hành cho kết quả tốt thì cần có một labo và
nhân lực chuyên nghiệp.
bên cạnh đó, ngời ta có thể giải mã trực tiếp trình tự adn. Đây là
một phơng pháp lí tởng tuy nhiên yêu cầu thiết bị máy móc cao cấp và giá
thành của phơng pháp này rất đắt.
Phân tích gián tiếp gen, ở đây đợc hiểu là đa hình độ dài đoạn cắt giới
hạn (restriction fragment length polymorphism - rflps) có thể đợc dùng
để xác định nhiễm sắc thể (alen) mang gen đột biến. rflps là những thay
đổi xảy ra trên trình tự nucleotid của gen mà không ảnh hởng đến chức năng
của gen đó nhng có thể sử dụng để chẩn đoán. Enzym giới hạn cắt chuỗi
ADN tại một vị trí đặc hiệu cho từng enzym. Nếu có các đa hình tự nhiên xảy
ra, vị trí cắt đặc hiệu sẽ thay đổi do vậy độ dài của đoạn cắt cũng sẽ thay đổi
theo giữa các cá thể khác nhau cũng nh giữa 2 nhiễm sắc thể x của ngời

phụ nữ đợc phân tích. Đây chính là căn cứ để xác định alen bị đột biến ở
ngời phụ nữ mang gen.
có 7 loại đột biến tạo 2 dạng là các đa hình trong gen (intragenic) yếu
tố viii đã đợc mô tả và sử dụng để xác định ng
ời mang gen cũng nh chẩn
đoán trớc sinh Hemophilia A: Bcli, Hindiii, Xbai, Bgli, Mspi (1), Mspi (2),
và Taqi trong đó Bcli đợc sử dụng nhiều nhất trên thế giới. Hai đa hình
trong gen đa dạng là đoạn lặp 2 nucleotid CA ở intron 13 và 22 cũng đợc sử
dụng có hiệu quả ở nhiều tộc ngời. Bên cạnh đó, có 2 rflps ngoài gen nằm
trên locus hemophilia cũng đợc sử dụng, đó là Bg1ii/dx và Taqi/st14. tuy

15
nhiên, do nguy cơ tái tổ hợp trong quá trình giảm nhiễm mà ngời ta ít sử
dụng các mồi ngoài gen. sử dụng phơng pháp khuyếch đại chuỗi (pcr)
ngời ta có thể phát hiện đợc các rflps trong vòng 1-2 ngày thay vì 10 -
14 ngày so với kĩ thuật rflp qui ớc [48].
ngời dị hợp tử về marker nào là ngời có 2 alen khác nhau về marker
đó trên 2 nhiễm sắc thể x của mình, và đợc gọi là có thông tin. tỉ lệ dị hợp
tử của các marker đa hình rflps này rất thay đổi ở các tộc ngời khác nhau
vì vậy để đảm bảo hiệu quả cho việc chẩn đoán, việc chọn lựa sử dụng đa
hình nào cần căn cứ vào tỉ lệ dị hợp tử của quần thể ngời đó. bên cạnh đó,
có một số rflps liên kết tơng quan với nhau; nói cách khác là có 1 alen
của rflps này liên kết với một alen của rflps khác vì vậy khi phối hợp 2
marker này với nhau sẽ ít làm tăng tỉ lệ có thông tin. ví dụ ở quần thể ngời
Caucasia, nếu sử dụng cả 4 rflps Taqi, Xmni, Mspi và Mnli (là các alen
liên kết tơng quan) thì chỉ có thể làm tăng tỉ lệ phụ nữ có thông tin là 55%
trong khi nếu sử dụng riêng Taqi thì tỉ lệ này là 45%. Tuy nhiên nếu kết hợp
Ddei và HhaI với Taqi thì tỉ lệ có thông tin tăng lên đến 76% [48].
để phân tích rflps xác định ng
ời mang gen và chẩn đoán trớc sinh

cần có mẫu máu của cả ngời bệnh lẫn một số thành viên khác trong gia
đình, điều này đôi khi gặp khó khăn. Hơn nữa, đối với các trờng hợp đơn
phát thì phơng pháp này không thực hiện đợc.
nh vậy, để sử dụng phơng pháp phân tích gián tiếp gen xác định
ngời mang gen cần lu ý các điểm sau:
1. ngời mẹ mang gen phải dị hợp tử với marker đa hình đợc sử dụng.
2. nếu phối hợp các marker đa hình cần biết sự tơng quan liên kết giữa
chúng.

16
3. khoảng cách giữa marker đa hình và gen cần đợc biết vì nguy cơ tái
tổ hợp liên quan trực tiếp đến khoảng cách giữa marker và đột biến.
4. tỉ lệ có thông tin phụ thuộc vào tỉ lệ dị hợp tử về marker đa hình của từng
quần thể và cần xác định tỉ lệ này trớc khi tiến hành phân tích adn.
ví dụ:
trong một gia đình Hemophilia A, phân tích pcr-rflps với Bcli cho
kết quả:
- ngời mẹ là ngời chắc chắn mang gen dị hợp tử (+/-).
- ngời bố dơng tính (+)
- con trai bị bệnh âm tính (-)
- con gái dị hợp tử (+/-)
phân tích kết quả:
- vì con trai bị bệnh nên alen (-) là alen mang gen bệnh. Do con trai
nhận nhiễm sắc thể X từ mẹ nên alen (-) của mẹ là alen mang gen bệnh, alen
(+) là alen bình thờng.
- vì con gái nhận 1 alen từ bố và 1 alen từ mẹ vì vậy alen (+) có nguồn
gốc từ bố, alen (-) có nguồn gốc từ mẹ.
kết luận: con gái là ngời mang gen bệnh.
Mẹ mang gen bệnh Bố bình thờng
X

+
X
-
X
+
Y
X
+
X
-


Con gái mang gen
X
-
Y
Con trai bị bệnh


17
1.3. Bất thờng di truyền và lơ xê mi
1.3.1. Cơ chế sinh lơ xê mi
Các nghiên cứu về sinh tế bào máu cho thấy quá trình tạo máu là quá
trình vừa sinh sản tế bào vừa biệt hoá và trởng thành để từ một tế bào gốc
ban đầu hình thành nên các tế bào hoạt động chức năng khác nhau. Quá trình
này trải qua nhiều giai đoạn, đầu tiên là tế bào gốc vạn năng sinh sản và biệt
hoá thành tế bào gốc định hớng tủy hay lympho, rồi từ đó tiếp tục biệt hoá
thành tế bào đầu dòng. Từ tế bào đầu dòng quá trình sinh sản kèm trởng
thành để tạo nên nhiều tế bào hoạt động chức năng.
Quá trình sinh sản, biệt hoá và trởng thành này thực chất là quá trình

hoạt động của các gen. Có một số gen chỉ đạo việc nhân lên của tế bào, có
những gen khác lại là khuôn mẫu để tổng hợp nên các protein đặc trng cho
sự biệt hoá, trởng thành của tế bào. Khi hoạt động của các gen này bị rối
loạn làm tế bào không biệt hoá hay trởng thành đợc nhng hiện tợng phân
bào vẫn xảy ra dẫn đến hậu quả là tích tụ nhiều tế bào non cha trởng thành
và thiếu các tế bào trởng thành hoạt động chức năng đó là lơ xê mi.
Nếu quá trình biệt hoá, trởng thành bị ức chế hoàn toàn là bệnh lơ xê
mi cấp. Trờng hợp các tế bào tạo máu dòng bạch cầu phân chia quá mạnh
vẫn biệt hoá trởng thành đợc là bệnh lơ xê mi kinh.
1.3.2. Hệ thống gen trong tế bào liên quan đến ung th
Từ đầu thế kỷ XX, Boveri đã giả thiết là trong tế bào có 2 hệ thống gen
hoạt động bình thờng. Đó là hệ thống gen kích thích phân chia tế bào và hệ
thống gen kìm chế phân chia tế bào để duy trì sự sinh trởng bình thờng.
Khi một trong hai hệ thống này bị bất thờng (hoạt hoá quá mức gen kích thích
gây phân bào hoặc mất chức năng gen ức chế phân bào) đều có thể dẫn đến ung
th. Sau này nhiều bằng chứng đã cho thấy giả thiết này chính xác [13],
Bên cạnh đó còn có hệ thống các gen sửa chữa ADN : Tế bào phân
chia liên tục để đảm bảo và duy trì sự sống. Mỗi lần phân chia tế bào có
khoảng 6 tỉ cặp bazơ đợc tổng hợp, nên sai sót rất lớn. Song cơ thể có hệ

18
thống sửa chữa những sai sót đó. Hoạt động này giảm hoặc mất do di truyền
hay mắc phải sẽ làm các sai sót không đợc sửa chữa trong đó có các sai sót
gây hoạt hóa gen ung th hay bất hoạt gen ức chế ung th và kết cục là ung
th [13], [30], [45], [52].
1.3.2.1. Gen ung th (oncogene):
Với các phơng pháp nghiên cứu hiện đại, ngời ta thấy trong tế bào
có những gen bình thờng không hoạt động hay có các chức năng nhất định,
vì một lý do nào đó những gen này trở nên hoạt động hay bị thay đổi cấu trúc
làm thay đổi chức năng và hậu quả là tế bào tăng sinh quá nhanh gây ra ung

th, đó là các oncogene (gen gây ung th).
Nghiên cứu thực nghiệm virus gây bệnh ở động vật, ngời ta thấy bộ
gen của virus không gắn một cách ngẫu nhiên vào ADN tế bào vật chủ mà
gắn có chọn lựa. Nghiên cứu những điểm gắn này ngời ta biết các gen gây
ung th trong tế bào.
Các gen gây ung th của virus gọi là oncogene virus (V-ONC), các gen
tế bào có thể gây ra quá trình tăng sinh ác tính gọi là oncogene tế bào
(C-ONC).
1.3.2.2. Cơ chế sinh bệnh và phân loại oncogene :
Nhiều tác giả (Hirai, Lichtman, Hoffbrand, Naeim, Palumbo) đều cho
rằng các C-ONC phân bố rộng trong bộ NST và bình thờng mã hoá những
protein tham gia biệt hoá, điều hoà tăng sinh, hay protein cấu tạo vị trí tiếp
nhận yếu kích thích trên màng tế bào. Khi những gen này hoặc là thay đổi,
mã hoá các protein có hoạt tính mạnh hơn, hoặc thể hiện ở những giai đoạn
không phù hợp cho sự phát triển của tế bào sẽ gây bệnh ác tính [24], [25],
[35], [43], [45].
Theo Hampson, quá trình sinh máu đợc điều hoà bằng các chất kích
thích tăng sinh, những chất này tác động lên vị trí tiếp nhận trên màng tế bào
và qua đó truyền qua màng, hoạt hóa các protein trong bào tơng. Một dây
chuyền phản ứng xảy ra từ màng tế bào, qua bào tơng, vào nhân tế bào và

19
cuối cùng tác động lên yếu tố phiên mã, phát động tổng hợp protein, sinh sản
tế bào [20], (hình 2).
Nh vậy quá trình hoạt động của gen, quá trình tiếp nhận và truyền các
thông tin từ yếu tố kích thích xảy ra qua nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn do
một loại protein đảm nhận. Mà protein lại là sản phẩm của gen, điều đó cho
thấy các oncogene tác động thông qua sản phẩm. Hoffbrand đã phân loại các
oncogene theo cách thức tác động của các protein sản phẩm nh sau [25]:

Hình 1.2 : Sự truyền tin từ vị trí tiếp nhận
STAT : Signal
GAP : GTP - ase activating protein : Protein hoạt hoá phân giải GTP
MAP : Mitogen activated proteinase : enzym hoạt hoá gây phân bào
PKC : Protein Kinase C
- Sản phẩm của oncogene là yếu tố kích thích tăng sinh bên ngoài.
Điển hình của loại này là gen C-SIS, gen này mã hoá chuỗi của yếu tố kích
thích phân chia tiểu cầu P - DGF (Platelet - Derived Growth Factory) vì một
lý do nào đó gen hoạt động quá mức làm mẫu tiểu cầu tiết quá mức yếu tố
này gây hiện tợng kích thích phân bào các tế bào có nguồn gốc tổ chức liên
kết, nhất là nguyên bào xơ [25].