Thu nhận và tinh sạch papain trong đu đủ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TIỂU LUẬN
Thu nhận và tinh sạch
Enzyme papain từ quả đu đủ

Giáo Viên Hướng dẫn: Th.S Lê Thanh Hải
Sinh viên thực hiện: Huỳnh Lượm
Phạm Thị Minh
Quách Lê Minh
Ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Chung Thuận Nguyên
TP. HCM, Tháng 10 Năm 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TIỂU LUẬN
Thu nhận và tinh sạch
Enzyme papain từ quả đu đủ
Giáo Viên Hướng dẫn: Th.S Lê Thanh Hải
Lớp: C
6
SH
1
Sinh viên thực hiện: Huỳnh Lượm
Phạm Thị Minh
Quách Lê Minh
Ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Chung Thuận Nguyên
Page 2
TP. HCM, Tháng 10 Năm 2012
LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Cao
Đẳng Kinh tế - Công nghệ TP.Hồ Chí Minh và các thầy cô đã tận tình chỉ dạy và
truyền đạt những kiến thức bổ ích để chúng tôi có được đầy đủ kiến thức để hoàn
thành tốt bài tiểu luận này.
Và cũng xin chân thành cảm ơn cô Lê Thanh Hải giáo viên giảng dạy bộ
môn công nghệ protein- enzyme đã truyền đạt kiến thức và giúp chúng em hoàn
thành bài tiểu luận này.
Vô cùng biết ơn người thân và bạn bè đã hỗ trợ giúp chúng tôi hoàn thành tốt
bài tiểu luận này.
Trong quá trình thực hiện làm bài tiểu luận sẽ không tránh khỏi thiếu sót.
Kính xin quý thầy cô và bạn bè đóng góp ý kiến để bài tiểu luận được hoàn chỉnh
hơn.
Page 3
MỤC LỤC
PHẦN I : LỜI MỞ ĐẦU 3
PHẦN II : GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 4
2.1. Giới thiệu về cây đu đủ 4
2.1.1. Giới thiệu 4
2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ 5
2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 5
2.2. Giới thiệu về enzyme papain 5
2.2.1. Cysteine protease 5
2.2.2. Nguồn gốc 5
2.2.3. Tính chất của papain 5
2.2.3.1. Tính chất vật lý 6
2.2.3.2. Tính chất hóa học 7
2.2.3.2.1. Cấu tạo hóa học 7
2.2.3.2.2. Cấu trúc không gian 8
2.2.3.2.3. Cấu trúc tâm hoạt động của papain 9
2.2.3.2.4. Phản ứng của papain 11

2.2.3.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 13
PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 14
3.1. Phương pháp thu nhận papain 14
3.1.1. Thu nhận nhựa đu đủ 14
3.1.2. Thu nhận papain 14
3.2. Phương pháp tinh sạch papain 15
3.2.1. Điện di 15
3.2.2. Lọc qua Sephadex G-75 15
PHẦN IV : ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU
PHỘNG 17
4.1. Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng 17
4.1.1. Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân 17
4.1.1.1. Nguyên lý chung: 17
4.1.1.2. Thuyết minh quy trình chung: 18
4.1.2. Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân 18
4.1.3. Tính chất của sản phẩm sau thủy phân 19
4.1.4. Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành 19
Page 4
4.1.5. Phương pháp xác định hoạt tính 20
4.1.5.1. Cơ chất: 20
4.1.5.2. Điều kiện: 20
4.1.5.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: 20
4.1.5.3.1. Khái quát 20
4.1.5.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính của papain 21
4.2. Một số ứng dụng của enzyme papain 25
4.2.1. Trong y học 25
4.2.2. Trong công nghiệp thực phẩm: 25
4.2.3. Trong các ngành công nghiệp khác: 26
PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28
5.1. Kết luận

5.2. Kiến nghị
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN I : LỜI MỞ ĐẦU
Page 5
Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và
peptidase. Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh. Ngoài
ra, papain còn là một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzym papain
rất tốt cho hệ tiêu hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng
hơn. Nó có thể giúp phân giải và loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể.
Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi các chất có albumin thành pepton, có
tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi trường hơi kiềm hay trung tính.
Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng thì lòng trắng
trứng bị mất tính sánh sền sệt. Trung bình một trái đu đủ cho được 12g mủ, từ 4kg
mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả
trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các
chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong
các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng
75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự
nhiên. Với những lợi ích và giá trị mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng
rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh vực chế biến mỹ phẩm. Ngoài ra, Papain
rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt
may, thuộc da, thực phẩm
Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm
chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu
phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi.
PHẦN II : GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN
2.1. Giới thiệu về cây đu đủ

2.1.1. Giới thiệu
Page 6
Hình: Các loại hoa và trái đu đủ
Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac
Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua
thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là
cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây
đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói
trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà
lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần
lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ.
2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ.
Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao
(1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là
giống lai tự nhiên của loài C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người
Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á.
Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại
Dương và châu Phi.
2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ
1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da.
2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip
(Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến
chứng áp- xe gan.
3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức
răng.
4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein
(proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi
dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung
Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không
hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó.

5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền
(mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu.
6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để
dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa
đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh
(antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive
Page 7
bacteria). Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch
hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp,
papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia
trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm
papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D
hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain.
2.2. Giới thiệu về enzyme papain
2.2.1. Cysteine protease
- Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử
trong khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại
liên kết: peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong
tâm hoạt động.
- Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều
enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng
rộng rãi trong công nghiệp.
- Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase
B) và endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân
liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các
liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide.
2.2.2. Nguồn gốc
Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được
phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng
là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis

et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác
như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines
and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất
tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm.
2.2.3. Tính chất của papain
2.2.3.1. Tính chất vật lý
Bảng 2.1: Tính chất vật lý của papain
Tính chất vật lý Giá trị
Page 8
Điểm đẳng điện pI = 8.75
Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04
Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13
Phân tử lượng 20,700
Độ triền quang [α]D -66.7
0
Độ xoắn 17%
Vòng hiệu ứng cotton 290nm
Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724
Trị số ma sát f/fo 1.16
Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu
hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt.
2.2.3.2. Tính chất hóa học
2.2.3.2.1. Cấu tạo hóa học:
Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là 1 protease thiol,
theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm
185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton.
Bảng 2.2: Thành phần hóa học:
Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng
Alanine 13 Lyeine 9
Arginine 10 Proline 4

Aspartic acid 17 Serine 9
Half – Cysteine 6 Threonie 11
Glutamid acid 17 Tryptophan 7
Glycine 23 Tyrosine 5
Histidine 2 Valine 17
Isoleucine 10 Methionine 15
Page 9
Leucine 10 0
Tổng cộng: 185
Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid
amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân
tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc
cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức
năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở
vị trí 25.
2.2.3.2.2. Cấu trúc không gian
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị
gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt
của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm
histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có
trong phân tử.
Hình: Cấu trúc bậc 3 của Papain
Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159.
Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi
cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt
độ thích hợp là 50 – 57
0
C.
2.2.3.2.3. Cấu trúc tâm hoạt động của papain
Page

10
- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc
3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với
Asp 175 bởi liên kết hydrogen.
- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid
là:
Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.
- Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động
của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác
nhau.
Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys.
Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser.
 Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng:
- Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các
amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.
- Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:
(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH  (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N-
CH(R)-CO-)k
i+k=n
- Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid
(H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH  (H2N-CH(R)-COOH)n
`
+ (H2N-
CH(R)-CO-)k
Page
11
n
`
+k = n
- So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có

khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có
khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các
glutamic acid có nhóm carboxy tự do. Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7
amino aicd trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1
chuỗi có phenylamine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các
gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng
X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân
bởi papain.
- Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase.
 Hoạt hóa papain:
Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự
do. Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động
sang trạng thái hoạt động. do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các
chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic…
trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. hki có mặt các chất này thì nhóm –SH của
papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất
thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là
chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim
loại nặng có trong nhựa đu đủ.
 Bất hoạt:
- Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2,
O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản
ứng với nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt
động của nó.
- Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp.
papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt
tính. Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ
( độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-
8m).
2.2.3.2.4. Phản ứng của papain

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó
đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.
Page
12
2.2.3.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain
Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng
nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100
0
C. Còn ở dạng dung dịch
papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.5
0
C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn
(>100
0
C) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt
hóa vào dung dịch.
Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 100
0
C
thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn. Điều đáng lưu ý là sau
khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn
papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ
papain.
Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4
0
C bền trong nhiều tháng. Trong
dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng.
Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy
hoặc oxy Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt
Page

13
độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì
nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 37
0
C. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể
chịu nhiệt độ sấy ở 115
0
C trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.
pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng
lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm
mạnh có pH > 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất
mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là
7-7.5. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được
ổn định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút.
Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là
methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50%. Trong
dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm
giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính
mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch
về độ quay quang học và hoạt tính của papain.
PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN
3.1 Phương pháp thu nhận papain
Sơ đồ quy trình công nghệ:
200-300m dd
cysteine 0.04M
pH: 5.7
Page
14
Nguyên liệu
180g nhựa đu đủ

Nghiền
Trích ly
Lọc
Celite(100g)
Cát sạch(150g)
Bã
Bã
Thời gian: 1-2 giờ
400-500ml
(NH4)2SO4

pH : 7-7.5
thời gian: 1 giờ
pH: 6.5
Thời gian: 30phút
t: 37
0
C
t: 40
0
C
3.1.1. Thu nhận nhựa đu đủ:
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây,
ngoại trừ rễ. nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain
A( gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B(gốc amino aicd là
tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới
95%.
3.1.2. Thu nhận papain:
 Chuẩn bị:
Do trong nhựa đu đủ ngoài papain, chymopapain còn có 1 số enzyme,

protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác để có được quy trình
tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì có quy trình hòa tan nhựa
đu đủ nhằm loại bỏ tạp chất. cách làm như sau:
Page
15
Chỉnh pH
Lọc
Kết tủa phân đoạn 1
Ly tâm 1
Kết tủa phân đoạn 2
Ly tâm 2
Kết tinh
Tái kết tinh
Sấy chân không
Papain.
110mlNaOH
1M
Tủa xám
(NH4)2SO4
Dịch lỏng
Dịch lỏng
60g NaCl rắn
dd NaCl bão
hòa
Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong
cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g
cysteine hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử
dụng để đư pH dịch chiết tới 5.7)
Khi nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình
nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine. Rửa cối với dung dịch

cysteine để điều chỉnh thể tích chiết lên 11.
Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc
Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng
xanh, pH gần 5.7.
Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong
điều kiện lạnh.
 Loại bỏ các chất không tan pH9:
Thêm từ từ và khuấy đều 1 lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để
điều chỉnh pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600
vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu
dịch trích trong.
 Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4:
Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly
tâm ở 2500 vòng/ phút. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại lấy
chymopapain. Tủa được rửa lại 1 lần nữa với 400-500ml dung dịch (NH4)2SO4
40% độ bão hòa.
 Quá trình phân đoạn bằng NaCl:
Hòa tan trong 600mL dung dịch cysteine 0.02M, dung dịch thu được có
pH 7- 7.5 sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau 1 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút
trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dich lỏng.
 Kết tinh
Hòa tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0.002M ở nhiệt độ phòng
được 1 dung dịch huyền phù có pH = 6.5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để
tinh thể tạo thành, duy trì ở 4
0
C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/ phút
trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể.
 Tái kết tinh:
Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất nhiệt độ phòng tạo dung
dịch có nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ ( đồng thời khuấy đều)

dung dich NaCl bão hào ( 10mL/ 300mL dung dịch protein). Khi 75% thể tích
dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch huyền
phù được giữ ở 4
0
C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ thu
Page
16
nhận tinh thể. Hoạt động riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết
tinh thêm 1 lần nữa như trên.
Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain
trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng
lọc 4000A
0
và đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc.
 Sấy chân không
Sấy chân không ở nhiệt độ 40
0
C thu nhận papain tinh chế.
3.2. Phương pháp tinh sạch papain
3.2.1. Điện di:
Sử dụng gel polyacrylamide 12%, dung dịch đệm là beta-alanine 34mM,
pH = 4.3 và cường độ dòng điện không đổi là 4mM. mẫu sẽ được chuẩn bị trong
Tris-glycerol-beta-mercatoethanol cho vào nước sôi trong 40 giây. Gel sẽ được
hiện màu bằng thuốc thử Coomassie-Blue R-250 và Brilliant Blue G-colloidal.
3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75:
Để xác định phân tử lượng của papain, ta dùng cột Sephadex G-75 có
kích thước cột là 1.1x100 cm. cột được cân bằng trước dung dịch đệm gồm
sodium phosphate 0.1M và dung dịch EDTA ( ethylenediamine-tetraacetic aicd)
pH=7.
PHẦN IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU

PHỘNG
4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng
4.1.1. Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân
Page
17
Bánh dầu đậu
phộng xay nhuyễn
Enzyme papain
(khô)
dd đệm phosphate 0.1M
Thủy giải
Lọc hoặc ly tâm
Bã sau lọc
Dịch lọc
t: 150
0
C
pH : 8-8.5
thời gian: 2 giờ

Sơ đồ thủy phân.
4.1.1.1.Nguyên lý chung:
Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá
trình khá phức tạp. Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ
tham gia phản ứng theo sơ đồ sau:
E + S  ESS + P
- Người ta cho rằng ban đầu enzyme sẽ liên kết với cơ chất (bánh dầu đậu
phộng), sau đó mới diễn ra sự thủy giải và tạo ra các sản phẩm là các acid amin và
các đoạn peptid ngắn.
- Ở đây E là enzyme papain và S là protein đậu phộng, ES là phức hợp trung

gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm (chủ yếu là các acid amin và các
peptid cấp thấp).
Sự tạo thành và chuyển biến của hợp chất trung gian ES xảy ra qua 3 bước:
Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức enzyme – protein (ES).
Bước 2: Có sự thay đổi mật độ điện tử và sự biến dạng hình học của các mối liên
kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất S cũng như trung tâm hoạt động của E.
Bước 3: Giai đoạn tạo thành acid amin hay peptid cấp thấp và giải phóng enzyme.
4.1.1.2. Thuyết minh quy trình chung:
Bánh dầu đậu phộng sau khi được xay nhuyễn ta bổ sung enzyme khô
papain và dd đệm phosphate 0.1M để quá trình phân giải bánh dầu nhanh hơn, quá
trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 150
0
C với pH = 8-8.5, thời gian thủy
phân là 1- 2 giờ.
Sau quá trình thủy giải ta đem đi ly tâm nhằm thu dịch lỏng ( loại bỏ bã )
đồng thời ta bổ sung các chất như O2,O3,H2O2, iodur acetate …. Làm cho
enzyme không hoạt động nữa để thu được sản phẩm loãng. Nhưng nhà sản xuất
muốn sản phẩm đạt được chất lượng cao và bảo quản dễ dàng hơn người ta thường
cô đặc sản phẩm tao ra sản phẩm khô ở đây ta kết thúc quá trình thủy phân của
enzyme papain.
Page
18
Bất hoạt enzym
Sản phẩm thu được dạng
dung dịch loãng
Cô đặc
Sản phẩm đậm đặc
hoặc khô
O2, O3, H2O2,
iodur acetate

Mục đích người ta dùng enzyme papain dể thủy phân bánh dầu đậu phộng
là nhằm cung cấp them các acid amin có trong enzyme vào trong bánh dầu, để bổ
sung vào thức ăn cho gia súc và cho người.
4.1.2. Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân:
- Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần lớn
các enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngoài của protein đậu phộng theo một tiến
trình tương đối nhanh, sau đó sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong
những thành phần này xảy ra chậm hơn. Sự thủy phân những nối peptid của
protein đậu phộng có thể chia làm hai pha:
+ Pha nhanh (pha động): xảy ra ở giai đoạn đầu. Trong suốt pha này, một
số lớp peptid bị phá hủy trong một đơn vị thời gian và một phần chất hòa tan được
phóng thích vào trong dung dịch.
+ Pha chậm (pha tĩnh): tốc độ thủy phân càng về sau càng giảm, tiến trình
hầu như ít có sự thay đổi cho đến khi phản ứng thủy phân kết thúc.
4.1.3. Tính chất của sản phẩm sau thủy phân
- Tính chất quan trọng nhất của sản phẩm là tính dinh dưỡng. Chiều dài chuỗi
peptid của sản phẩm thủy phân có tầm quan trọng đặc biệt. Khả năng hòa tan, khả
năng nhũ tương, vị đắng …đều phụ thuộc ít nhiều vào kích thước và trọng lượng
phân tử của các loại proteint có trong sản phẩm. Tất cả các sản phẩm thủy phân
đều có vị đắng ở những mức độ khác nhau làm hạn chế rất nhiều tính cảm quan
của sản phẩm. Vị đắng là nhược điểm chung của các sản phẩm thủy phân với xúc
tác enzyme và được cho là có liên quan đến những peptid có trọng lượng phân tử
thấp (khoảng 6,000 Da). Ta không thể khử được vị đắng nhưng có thể giảm bớt
được bằng cách kiểm soát mức độ thủy phân để cho những peptid có phân tử
lượng lớn chiếm ưu thế.
- Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân không triệt để,
sau thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn không tan, do đó người ta thường
phối hợp thủy phân bằng hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân.
4.1.4. Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành.
Điều chế enzyme papain để thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng với các

nội dung sau:
1. Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ
- Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain
Page
19
- Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế.
- Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain.
2. Khảo sát phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng
- Xác định hàm lượng đạm formol và đạm amoniac theo thời gian phản ứng
- Khảo sát sự thay đổi hàm lượng xúc tác, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến
hiệu suất phản ứng thủy phân.
4.1.5. Phương pháp xác định hoạt tính
4.5.1. Cơ chất:
- Protease trong nhựa đu đủ
- Cơ chất là casein từ sừa
4.5.2. Điều kiện:
- Papain dùng để thủy phân casein thì nhiệt độ tối ưu của nó là 50 đến 57
0
C.
- Ngoài ra để cho papain hoạt động tốt còn phải tạo ra môi trường pH tối ưu là 7.0
đến 7.5 và hợp chất dung môi phù hợp cho quá trình phản ứng.
4.5.3.Phương pháp xác định hoạt độ enzyme:
4.5.3.1. Khái quát:
- Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta
thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học. Các phương pháp, so màu, đo
khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ được dùng phổ biến trong nghiên cứu
định lượng các phản ứng enzyme.
- Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:
1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành

trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ
chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.
3. Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu
được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
- Đơn vị đo hoạt độ của enzyme:
Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc tế
(hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961. Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là
lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1mmol) cơ chất
sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 U = 1mmol cơ chất (10-6 mol)/ phút.
Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat):
Page
20
- Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ
chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn
1 Kat = 6.107 U Và 1 U 60= 1 microkatal.
Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động cần phải đánh
giá độ sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme là hoạt
độ riêng.
- Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/ 1mg protein
(U/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme.
- Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry.
Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử.
- Hoạt độ phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử
enzyme trong một đơn vị thời gian.
4.5.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính của papain:
Để xác định hoạt tính của protease nhóm chúng em đã sử dụng phương
pháp Anson cải tiến. Phương pháp này được thực hiện như sau:
1. Nguyên lý của phương pháp

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo
sản phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác
định lượng tyrosine và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin.
2. Đối tượng áp dụng của phương pháp
Phương pháp này áp dụng để xác định hoạt độ enzyme trong thực phẩm, thức ăn
chăn nuôi, chế phẩm sinh học.
3. Dụng cụ và hoá chất
 Dụng cụ, thiết bị
- Máy lắc
- Máy đo mật độ quang
- Bếp ổn nhiệt
- Bình tam giác 250 ml.
- Bình định mức 10 ml, 100 ml, 500ml
Page
21
- Ống nghiệm
- Pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml
 Hoá chất
- Dung dịch Na
2
HPO
4
1/15M: hòa tan 5,9690g Na
2
HPO
4
.12H
2
O trong
nước vừa đủ 250 ml.

- Dung dịch KH
2
PO
4
1/15M : hòa tan 0,9072 g KH
2
PO
4
trong nước vừa
đủ 100 ml
- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 ml dung dịch
Na
2
HPO
4
1/15M với 11,5 ml dung dịch KH
2
PO
4
1/15M đến khi pH đạt 7,6.
- Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein trong 100 ml dung dịch đệm
Sorensen
- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml
- Dung dich NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml.
- Thuốc thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4).
- Dung dich HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250
ml
- Dung dịch Tyrosine 20 µM/l : khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin trong
dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500 ml
- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha loãng

5 ml dung dịch Tyrosine 20 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100 ml
 Chuẩn bị đường chuẩn
 Chuẩn bị dung dịch tyrosin chuẩn
Page
22
- Từ dung dịch tyrosin chuẩn 1 µM/l , xây dựng đường chuẩn với dung dịch
tyrosin có nồng độ từ 0,2 - 1,0 µM/l .
Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ
đường chuẩn tyrosine tương quan tương quan giữa lượng tyrosine (µM) và ΔOD
(ΔOD = OD
TN
- OD
KC
).
4. Phương pháp tiến hành
 Chiết mẫu
Mẫu cân chính xác 10g ( đối với mẫu rắn) hoặc 10 ml (đối với mẫu lỏng)
cho vào becher, định mức vừa đủ 100ml bằng nước cất đem lắc trên máy lắc trong
vòng 15 phút. Đem ly tâm lạnh với 4000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch, bỏ bã
(đối với mẫu lỏng không cần ly tâm, chỉ lắc để đồng nhất mẫu).
 Tiến hành
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không
Dung dịch
ống nghiệm
Thử thật Thử không
Dung dịch casein 1%(ml) 5 5
Dung dịch hóa chất
Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0

Lượng tyrosine tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 5,0
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 5,0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm
Page
23
Dung dịch TCA 5%(ml) 0 0
Dung dịch enzyme mẫu
(ml)
1 1
Lắc đều và giữ ở 35,5
0
C trong 20 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Lấy 2 ống nghiệm mới khác,cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử
thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không.
Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc
mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. ΔOD = OD
TT
– OD
TK
, sau đó dựa
vào đồ thị chuẩn suy ra được µM tyrosine.
 Tính kết quả:
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu
trong điều kiện thí nghiệm ( 35,5
o

C: pH 7,6 … ) thủy phân casein trong 1 phút tạo
thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp
thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1 µM tyrosine trong đường
chuẩn.
Hđ Protease (UI/g)= Hđ Protease (UI/g)/ t * m * v
Với: Hđ Protease : hoạt độ enzyme protease ( UI/g)
V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)
v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)
4.2 Một số ứng dụng của enzyme papain
4.2.1 Trong y học:
• Chữa bệnh giun kim, gium đũa.
• Dùng tiêu diệt các dị vật thừa, các protein chết trong cơ thể. Hỗn hợp
papain-bromelin-celluloza được sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận.
Page
24
• Làm thành phần chính của các loại thuốc trị bệnh biếng ăn, ăn không tiêu.
• Làm 1 sổ vi trùng gram (+) và gram (-) ngưng phát triển, vi trùng thương
hàn, Staphylococus rất nhạy cảm với papain.
• Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin:
• Dung dịch papain cysteine salicilate có công dụng chữa bỏng.
• Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng…
4.2.2 Trong công nghiệp thực phẩm:
- Protease, trong đó có papain được sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thịt, cá
và đã mang lại hiệu quả kinh tế cao. Với phương pháp này, người ta có thể biến
đổi những loại thịt cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế
phẩm có tính chất tốt hơn.
- Papain còn được dùng để thủy phân protein và ngăn ngừa vi khuẩn gây thối,
do nhiệt độ tối ưu của nó là 70
0
C.

- Papain được dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc bổ.
Papain còn được dùng trong sản xuất bia vì nó giúp tiêu hóa các protein còn hòa
tan trong bia.
4.2.3. Trong các ngành công nghiệp khác:
- Papain được dùng làm mềm da trong ngành công nghiệp thuộc da, dùng tẩy
các vết máu trên quần áo.
- Trong công nghiệp mỹ phẩm, papain được dùng để tẩy các vết nám, tàn
nhang trên da, làm cho da mềm mại hơn.
Page
25