LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG THỰC PHẨM

MỤC LỤC
Danh mục hình ảnh 5
Lời mở đầu 6
CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM
SOÁT TRONG THỰC PHẨM
1.1. Samonella 7
1.2. Campylobacter 7
1.3. Clostridium perfringens 8
1.4. Clostridium botulinum 9
1.5. Staphylococcus aureus 10
1.6. Vibrio spp 11
1.7. Escherichia coli 12
1.8. Shigella spp 13
1.9. Coliforms 14
1.10. Listeria monocytogenes 15
1.11. Bacillus cereus 16
1.12. Aspergillus 17
1.13. Virus 18
CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
TRUYỀN THỐNG
2.1. Samonella 20
2.1.1. Tổng quan 20
2.1.2. Nguyên tắc 20
2.1.3. Môi trường và hóa chất 21
2.1.4. Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm 22
1
2.2. Vibrio 27
2.2.1. Tổng quan 27
2.2.2. Nguyên tắc 28
2.2.3. Môi trường và hóa chất 28
2.2.4. Quy trình phân tích 29

2.3. Listeria monocytogenes 31
2.3.1. Tổng quan 31
2.3.2. Nguyên tắc 32
2.3.3. Môi trường và hóa chất 32
2.3.4. Quy trình phân tích 33
2.4. Staphylococcus aureus 35
2.4.1. Tổng quan 35
2.4.2. Nguyên tắc 35
2.4.3. Môi trường và hóa chất 36
2.4.4. Phân tích định tính Staphylococus aureus 36
2.4.5. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 37
2.4.6. Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN 39
2.5. Bacillus Cereus 39
2.5.1. Tổng quan 39
2.5.2. Nguyên tắc 40
2.5.3. Môi trường và hóa chất 40
2.5.4. Quy trình phân tích 41
2.6. Clostridium 46
2.6.1. Tổng quan 46
2.6.2. Nguyên tắc 47
2
2.6.3. Môi trường và hóa chất 48
2.6.4. Quy trình phân tích 48
2.6.5. Báo cáo kết quả 49
2.7. Coliform và E.Coli 49
2.7.1. Tổng quan 49
2.7.2. Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E.coli
bằng phương pháp MPN 49
2.7.3. Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng phương pháp đếm khuẩn
lạc 52

2.7.4. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 55
2.8. Tổng nấm men nấm mốc 57
2.8.1. Tổng quan 57
2.8.2. Nguyên tắc 58
2.8.3. Môi trường và hóa chất 58
2.8.4. Quy trình phân tích định tính 59
2.8.5. Quy trình phân tích định lượng 59
CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
KHÔNG TRUYỀN THỐNG
3.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 61
3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 63
3.3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization) 65
3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 66
3.5. Một số phương pháp thử nhanh khác 70
3.5.1. Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ 70
3
3.5.2. Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent
Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid
Membrane) 71
3.5.3. Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) 71
3.5.4. Kỹ thuật Redigel 72
3.5.5. Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance) 72
3.5.6. Kỹ thuật đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) 73
3.5.7. Kỹ thuật đo mức phóng xạ (Radiometry) 73
KẾT LUẬN 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO 76
4
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Samonella.
Hình 1.2 Campylobacter.

Hình 1.3 Clostridium perfringens.
Hình 1.4 Clostridium botulinum.
Hình 1.5 Staphylococcus aureus.
Hình 1.6 Vibrio cholerae.
Hình 1.7 V.vulnificus.
Hình 1.8 V.parahaemolyticus.
Hình 1.9 Escherichia coli.
Hình 1.10 Shigella.
Hình 1.11 Coliforms.
Hình 1.12 Listeria monocytogenes.
Hình 1.13 Bacillus cereus.
Hình 1.14 Aspergillus flavus.
Hình 1.15 A.parasiticus.
Hình 1.16 Virus.
5
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay người tiêu dùng lựa chọn thực phẩm thì ngoài những yêu cầu về sự
bỗ dưỡng, hợp khẩu vị, giá cả phải chăng còn có an toàn thực phẩm cũng là một
trong những yêu cầu hàng đầu. Số vụ ngộ độc thực phẩm cùng tỷ lệ bệnh ung thư
được cho là do ăn phải các chất gây ô nhiễm ngày càng gia tăng. Trong số đó,
nhiễm khuẩn chiếm tỉ lệ khá cao đang là mối lo của nhiều nước trên thế giới.
Việt Nam là nước đang phát triển thuộc vùng nhiệt đới. Trình độ sản xuất còn
thấp cộng với điều kiện khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện cho nhiều loài vi sinh
vật gây hại thực phẩm phát triển. Tình hình ngộ độc thực phẩm liên tục xảy ra.
Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có
trong thực phẩm là rất cần thiết nhằm phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, kém
chất lượng, bảo vệ sức khỏe của người tiêu dùng và cho cộng đồng. Xuất phát từ
yêu cầu trên sinh viên tiến hành đề tài: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG THỰC PHẨM.

2. Mục đích nghiên cứu
Nội dung báo cáo là giới thiệu về đặc trưng và phương pháp xác định một số
vi sinh vật gây ngộ độc thường xuất hiện trong thực phẩm. Qua đó giúp cho mọi
người biết được có những mối nguy nào trong việc sử dụng thực phẩm và
phương pháp để kiểm nghiệm những thực phẩm nghi ngờ có nhiễm vi sinh vật.
3. Kết cấu của khóa luận tốt nghiệp
Khóa luận gồm 3 chương:
Chương 1: Các chỉ tiêu vi sinh vật thường được kiểm soát trong thực phẩm.
Chương 2: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật truyền thống.
Chương 3: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật không truyền thống.
6
CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM
SOÁT TRONG THỰC PHẨM
1.1. Salmonella
Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu
tế bào trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường
là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị
nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ. Triệu chứng
ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7 ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ
thực phẩm bị nhiễm Samonella đều bị ngộ độc. Các loại thực phẩm có nguy cơ
bị nhiễm Samonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ
trứng, thủy sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người
và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Đặc biệt nguy hiểm cho người là
các loài Samonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn.
7
8
Hình 1.1 Samonella
1.2. Campylobacter
9
Campylobacter gây bệnh viêm nhiễm đường ruột, hiện diện khắp nơi, đặc

biệt trong hệ vi sinh vật của nhiều loại động vật và chim. Tuy nhiên các dòng
Campylobacter gây ngộ độc thực phẩm thuộc loại ưa nhiệt bắt buộc, không thể
phát triển ở nhiệt độ thấp hơn 30
o
C. Các triệu chứng ngộ độc do vi sinh vật này
gây ra là đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng, mê
sảng, thỉnh thoảng có những biểu hiện bệnh giống như cảm cúm. Thời gian ủ
bệnh từ 2 – 11 ngày. Các sản phẩm sữa, thịt gia cầm, nước là nguồn có thể gây
nên ngộ độc do Campylobacter. Campylobacter có thể hiện diện trong các loại
thực phẩm hút chân không. Các loài này rất nhạy cảm với nhiệt độ và acid nên
có thể bi tiệt trùng hoàn toàn bằng phương pháp thanh trùng Pastuer và không
tăng trưởng được trong thực phẩm có tính
acid.
Hình 1.2 Campylobacter
1.3. Clostridium perfringens
C.perfringens được tìm thấy trong đất, trong phân người. Trước đây người
ta cho rằng chỉ các dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan
máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm. Ngày nay đã có những ghi nhận các vụ
10
ngộ độc thực phẩm gây ra bởi các dòng C.perfringens nhạy cảm với nhiệt, không
làm tan máu. Các triệu chứng ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra là đau
thắt vùng bụng, tiêu chảy. Thời gian ủ bệnh từ 12 – 24 giờ. Nguồn thực phẩm có
thể chứa các vi sinh vật này thường là thịt gia cầm, nhất là gia cầm đông lạnh
sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác. Bào tử của
C.perfringens có tính bền đối với nhiệt nên chúng có thể sống sót qua quá trình
nấu chín, đặc biệt là khi đun nấu thực ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn. Các
bào tử sống sót này khi gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm, tăng trưởng.
Hình 1.3 Clostridium perfringens
1.4. Clostridium botulinum
Loài vi sinh vật này phân bố khắp nơi trong đất, nước, trong đường ruột

các gia súc và các loài thủy sản. Vi sinh vật này sinh độc tố botulin gây ngộ độc
thịt làm thực phẩm cho người. Triệu chứng lâm sàng khi ngộ độc là ói mửa,
buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh như choáng váng, rối
loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở vùng ngực, khó thở và tê liệt,
có thể dẫn đến tử vong. Các triệu chứng trên biểu hiện 12 – 36 giờ sau khi tiêu
thụ thực phẩm nhiễm độc tố và kéo dài 2 – 6 ngày tùy theo mức độ nhiễm độc và
11
tình trạng sức khỏe của từng bệnh nhân. Các loại thực phẩm như thịt, rau quả
không được bảo quản đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được
chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng
quy cách có nguy cơ gây ngộ độc bởi vi sinh vật này rất cao. Điều kiện thích hợp
cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật này là điều kiện kỵ khí, pH trung
tính, không có các vi sinh khác cạnh tranh. Độc tố botulin do C.botulinum dòng
E thường có nguồn gốc từ cá và các sản phẩm thủy sản. Dòng vi sinh vật này
thường phân lập được từ các mẫu bùn đáy tại các cửa sông.
Hình 1.4 Clostridium botulinum
1.5. Staphylococcus aureus
Trong tự nhiên Staphylococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi,
tóc hay long của các loài động vật máu nóng. Staphylococcus aureus sản sinh
một số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy ở 100
o
C
trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 – 6 giờ
người bị ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ. Các
loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi
được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 40
o
C) và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp
12
thường hay nhiễm các loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông

qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến.
Hình 1.5 Staphylococcus aureus
1.6. Vibrio spp
Các loài Vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion Na
+
để
phát triển, một số loài có khả năng gây bệnh cho người là Vibrio cholera,
V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.hollisae, V.furnsii, V.mimicus, V.fluvialis,
V.alginolyticus, V.cholerae là tác nhân gây nên các vụ dịch tả trên toàn thế giới.
Loài vi sinh vật này được chia thành hai kiểu huyết thanh chính là O
1
và không
O
1
(non-O
1
). Kiểu huyết thanh O
1
lại gồm ba kiểu huyết thanh phụ là Ogawa,
Inaba và Eltor (còn được gọi là kiểu O139). Hai kiểu huyết thanh Inaba và
Ogawa ngày nay chỉ còn được tìm thấy tại các nước thuộc khu vực châu Á.
Trong khi đó, các vụ dịch tả trên thế giới lại gây ra bởi kiểu Eltor. Dịch tả gây ra
bởi V.cholerae thường được lan truyền rất nhanh qua đường nước, gây nhiễm
thực phẩm và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ sinh kém. V.cholerae
tạo ra độc tố tả cholera-toxin, có độc tính mạnh: chỉ cần 5μg gây nhiễm qua
đường miệng có thể gây ra tiêu chảy cho người trưởng thành. Ngoài độc tố tả,
13
loài này cũng tiết ra một số độc tố tương tự shiga-toxin. Nguồn thực phẩm có
nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây, rau quả, sữa và
các sản phẩm sữa, các loại thủy sản tươi sống (không qua gia nhiệt hay gia nhiệt

nhẹ).
Một loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng khác là V.parahaemolyticus
tạo độc tố hemolysin bền nhiệt có phản ứng kháng nguyên Kanagawa. Tuy
nhiên, những năm gần đây người ta phát hiện ra rằng nhiều dòng
V.parahaemolyticus có phản ứng Kanagawa âm tính cũng có thể gây bệnh. Triệu
chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy nhẹ
xuất hiện 2 – 96 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm. Thời gian ủ bệnh phụ
thuộc vào mật độ tế bào vi khuẩn đã xâm nhiễm và thể trạng của từng bệnh nhân.
Loài vi khuẩn này hiện diện và tăng trưởng trong môi trường có hàm lượng muối
cao, thường phân lập được từ các sản phẩm thủy sản, trong các vùng nước ấm
ven biển.
Các loài Vibrio khác khi xâm nhiễm vào trong thực phẩm cũng có thể gây
nên các bệnh đường ruột và có biểu hiện bệnh lý tương tự như hai loài trên.
Riêng loài V.vulnificus không gây các triệu chứng bệnh đường ruột mà gây
nhiễm trùng máu cho người.

Hình 1.6 Vibrio cholerae Hình 1.7 V.vulnificus Hình 1.8 V.parahaemolyticus
14
1.7. Escherichia coli
E.coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện trong đường ruột của người và
các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai
trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có 4 dòng có thể
gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enteropathogenic E.coli (EPEC),
Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) và
Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/Verocytoxin E.coli (VTEC) hay E.coli
O157: H7. Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân
hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây
người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện ở những vùng nước
ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên
E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn các

triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa. Biểu hiện lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất
nặng, có thể gây chết người phụ thuộc và mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khả
năng đáp ứng của từng người.
Hình 1.9 Escherichia coli
1.8. Shigella spp
15
Giống Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) gồm 4
loài khác nhau là S.dysenteriae, S.sonnei, S.plexneri và S.boydii. Các loài
Shigella có tính chuyên biệt ký chủ cao, chỉ xâm nhiễm và tăng trưởng trong
người và các loài linh trưởng. Trong môi trường nước các loài này có thể tồn tại
hơn 6 tháng. Các vụ ngộ độc thực phẩm do Shigella gây ra chủ yếu tập trung ở
các nước kém phát triển, nơi việc sản xuất chế biến thực phẩm được thực hiện
trong điều kiện vệ sinh không đảm bảo. Shigella cũng có thể lây nhiễm trực tiếp
từ người qua người. Shigella chủ yếu gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực
trùng) trong khoảng 1 – 7 ngày sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm. Biểu hiện
bệnh lý có thể thay đổi từ dạng nhẹ như tiêu chảy nhẹ đến mức nghiêm trọng
(đặc biệt là ở trẻ em và người già) như đi tiêu ra máu, có những mảnh niêm mạc
ruột, mất nước, sốt cao và bị co rút thành bụng. Các triệu chứng trên có thể kéo
dài từ 12 – 14 ngày thậm chí lâu hơn. Hàng năm có khoảng nửa triệu người tử
vong do vi sinh vật gây bệnh này. Vi khuẩn Shigella lây nhiễm chủ yếu qua nước
và thực phẩm. Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp
xúc bề mặt trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm.
Hình 1.10 Shigella
1.9. Coliforms
16
Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng
để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
Nhóm Coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm ,
không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường
nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành hai

nhóm nhỏ là Coliform và Coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động
vật. Trên thực tế kiểm nghiệm Coliform phân được quan tâm nhiều hơn
Coliform. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng
bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Khi Coliform phân
hiện diện ở số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng bị nhiễm nước nhiễm
phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân. Trong
các thành viên của nhóm Coliform phân thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều
nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm.
Hình 1.11 Coliforms
1.10. Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở trẻ em,
phụ nữ mang thai hay người già trong những năm gần đây. Mặc dù
L.monocytogenes chỉ hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, nhưng khi
17
được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại, khi có điều kiện thuận lợi sẽ tăng trưởng
nhanh xâm nhiễm vào các mô sâu hơn và gây bệnh. Triệu chứng bệnh thường
bắt đầu là tiêu chảy, sốt nhẹ, sau đó là nhiễm trùng máu, tổn thương hệ thần kinh
trung ương, tim, mắt, gây nên sẩy thai, đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi ở phụ nữ
mang thai. L.monocytogenes ưa lạnh, tăng trưởng ở nhiệt độ từ 2 – 44
o
C, thường
được phân lập từ phô mai, sữa, thịt cá, rau quả và trong nước. Loài này có thể
nhiễm vào thực phẩm ở mọi công đoạn trong quy trình chế biến thực phẩm, sữa
hay rau quả. Đặc biệt, trong thời gian bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thấp, loài
này có cơ hội tăng trưởng thành số lượng lớn. Các sản phẩm được thanh trùng
bằng phương pháp Pastuer và được bảo quản
trong các tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh vật
này rất cao.
Hình 1.12 Listeria monocytogenes
1.11. Bacillus cereus

B.cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng
được trong khoảng nhiệt độ từ 5 – 50
o
C, tối ưu ở 35 – 40
o
C, pH dao động từ 4,5 -
9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn này hiện diện trong
đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…).
Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và
18
emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus khi thực
phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước
khi sử dụng. Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ trên 10
6
tế bào/g đủ gây ngộ
độc. Triệu chứng ngộ độc phổ biến gây ra bởi B.cereus là đau bụng, tiêu chảy,
không sốt, bắt đầu 4 – 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12
– 24 giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1 – 2 giờ ăn
phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ.
Hình 1.13 Bacillus cereus
1.12. Aspergillus
Aspergillus flavus và A.parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong
các loài nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm.
Độc tố mycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai loài này được gọi
chung là aflatoxin có khả năng gây ung thư. Các nấm mốc này có thể phát triển ở
nhiệt độ từ 7 – 40
o
C và tối ưu ở 24 - 28
o
C, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt

trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa, miến, đậu phộng, bắp, lúa mì…) không
được phơi sấy tốt, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới với điều kiện độ ẩm và nhiệt
độ không khí cao. Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có thể nhiễm vào
thực phẩm gây độc cho người. Ở các chủng có khả năng sinh độc tố, sau khi tăng
trưởng 1 – 3 ngày độc tố được tạo ra và tiết vào cơ chất. Bốn loại aflatoxin được
19
tạo ra bởi A.flavus và A.parasiticus là aflatoxin B
1
, B
2
phát huỳnh quang màu
xanh (blue) và G
1
, G
2
phát huỳnh quang màu lục (green). Khi ăn cỏ hoặc thức ăn
chứa aflatoxin B
1
hoặc B
2
, bò sữa có thể chuyển hóa chúng thành các độc tố
aflatoxin M
1
, M
2
hiện diện trong sữa bò. Do aflatoxin là chất gây ung thư mạnh
nên được kiểm tra nghiêm ngặt. Hầu hết các nước đều có tiêu chuẩn quốc gia về
hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của độc tố này trong nông sản, thực
phẩm, thường là 10ppb (một phần tỷ).
Hình 1.14 Aspergillus flavus Hình 1.15 A.parasiticus

1.13. Virus
Các vụ dịch bệnh gây ra do tác nhân virus từ thực phẩm cho đến nay vẫn
là vấn đề bí ẩn. Các nghiên cứu về virus thực phẩm. Đặc điểm sinh lý của virus
đường ruột, phương pháp nuôi cấy, phát hiện virus trong thực phẩm cho đến nay
vẫn còn nhiều hạn chế. Tuy nhiên, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như lai
phân tử, kỹ thuật PCR… người ta có thể phát hiện virus có hại cho con người
trong thực phẩm. Sự lan truyền virus qua người thông qua đường miệng đã được
biết đến từ năm 1950. Các virus gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu có
nguồn gốc từ các sản phẩm thủy sản. Trong khoảng hơn 100 loại virus đường
ruột được biết hiện nay chỉ một vài loại có khả năng gây bệnh cho người
20
(Hepatitis type A virus, HAV, Norwalk virus, Calicivirus, Astrovirus, Virus Non
A, Virus Non B). Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào,
không thể tự nhân lên trong nước hay trong thực phẩm. Chúng xâm nhiễm vào
thực phẩm hoàn toàn do quá trình chế biến, từ nước bị ô nhiễm. Các loài nhuyễn
thể ăn lọc như nghêu, sò… có khả năng tích lũy nhiều virus trong nước làm mật
độ virus trong nhuyễn thể cao hơn rất nhiều so với môi trường nước xung quanh.
Liều lượng gây nhiễm của virus từ thực phẩm có thể thấp hơn rất nhiều so với vi
khuẩn. Virus hiện diện trong cơ thể người và các loài động vật và được tìm thấy
với số lượng lớn trong phân của những người bị nhiễm, tồn tại từ nhiều ngày đến
nhiều tuần. Nước bị nhiễm phân là con đường lây nhiễm gián tiếp hay trực tiếp
của virus vào thực phẩm. Khả năng sống sót của virus trong môi trường hay
trong thực phẩm phụ thuộc vào các yếu tố: nhiệt độ, nồng độ muối, cường độ
bức xạ mặt trời hay sự hiện diện của các thành phần hữu cơ khác. Tất cả virus
đường ruột đều có tính kháng với acid, các enzyme thủy phân, muối mật có trong
đường tiêu hóa. Một số virus có thể kháng nhiệt như virus viêm gan siêu vi A
(HAV), hoặc kháng phenol, ethanol… Ô zôn và chlorine là những tác nhân có
thể làm bất hoạt một vài loại virus đường ruột. Để ngăn ngừa các bệnh do virus
từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được nấu chín để khử virus trước khi dùng,
các loại nhuyễn thể ăn lọc phải được khai thác từ, những vùng nước không

nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng nước sạch trước khi tiêu thụ.
21
Hình 1.16 Virus
CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
TRUYỀN THỐNG
2.1. Samonella
2.1.1. Tổng quan
Là trực khuẩn Gram âm,hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, có
tiên mao, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men
saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả
năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H
2
S.Cho đến
nay đã xác định được 2339 serotype (kiểu huyết thanh) thuộc giống Salmonella.
Các serotype này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa trên công
thức kháng nguyên O (kháng nguyên somatic) và kháng nguyên tiên mao H
(flagella).
2.1.2. Nguyên tắc
Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình
gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella
thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện
chung với một số lượng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae
có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
- Bước tăng sinh: tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn
quy trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tăng
sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi.
22
- Bước tăng sinh chọn lọc: các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng
để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis
(RV), Selenite Cystein Broth, Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT). Các

nghiên cứu gần đây của AOAC cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các
môi trường khác để phân tích nhiều loại mẫu khác nhau. Tuy vậy, môi trường TT
thường được dùng để phân tích các loại mẫu chứa thịt tươi sống, các mẫu có mật
độ nhiễm cao, các loại thức ăn gia súc… Hiện nay người ta khuyến khích việc sử
dụng ít nhất 2 loại môi trường tăng sinh chọn lọc để tăng cường khả năng phát
hiện được tất cả các serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu.
- Bước phân lập: nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi
sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để
phân lập Salmonella, mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này
dựa trên một vài đặc tính. Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm
khuyến khích việc sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân lập khác nhau để
tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt môi trường
XLD được khuyến khích sử dụng.
- Bước khẳng định: nhằm xác nhận lại các khuẩn lạc đặc trưng cho
Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này dựa trên việc sử dụng
các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella.
Các thử nghiệm được khuyến khích sử dụng là thử nghiệm KIA/TSI, indol, LDC
(lysine decarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase), urea, lên men mannitol,
sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O và H đa giá. Thông thường các phòng
phân tích vi sinh thực phẩm không có khả năng xác định đến loại phụ hay
serotype mà chỉ xác nhận đến Salmonella spp. Việc phân tích chính xác serotype
23
nhiễm vào thực phẩm thường được thực hiện tại các trung tâm vệ sinh phòng
dịch hay các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.
2.1.3. Môi trường và hóa chất
- Nước pepton đệm (Buffered Peptone Water, BPW).
- Canh Rappaport – Vasiliadis Soya Pepton (RV).
- Canh Malachite Green Magnesium Chloride (canh RV cải tiến).
- Tetrethionate Muller – Kauffmann (TT).
- Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD).

- Thạch Hektoen Entric Agar (HE).
- Thạch Bismuth Sulphite Agar (BS).
- Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS).
- Thạch Triple Sugar Iron (TSI).
- Canh Ure.
- Canh Lysine Decarboxylase.
- Canh Ornithine Decarboxylase.
- Canh Mannitol (Phenol Red Broth Base).
- Canh Sucrose (Phenol Red Broth Base).
- Canh Sorbitol (Phenol Red Broth Base).
- Canh Tryptone.
- Thuốc thử Kovac’s.
- Kháng huyết thanh Salmonella đa giá.
2.1.4. Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm
2.1.4.1. Tăng sinh
Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô
trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong
24
15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37 1
o
C trong 18 – 24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm
có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần
thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt như sau:
- Đối với mẫu gia cầm tươi sống: đặt gia cầm vào một bao nhựa lớn, thêm
1 lít môi trường tăng sinh BPW. Lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để môi trường
thấm được vào trong toàn bộ mẫu.
- Đối với sữa khô: cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml
môi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó lắc cho đến khi sữa
tan hoàn toàn.
- Đối với các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng nhất

mẫu ở độ pha loãng 1/100 trong BPW (thay vì 1/10 như bình thường) trước khi
nuôi tăng sinh. Biện pháp này nhằm làm giảm nồng độ các hợp chất ức chế sự
tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh.
- Đối với các loại mẫu như casein, pho mát, bơ và các sản phẩm tương tự
khác: thực hiện đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến
40
o
C.
- Đối với sản phẩm chứa cocoa: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim
Milk Broth được làm ấm ở 40
o
C.
- Đối với dừa, các sản phẩm của dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo
cao đồng nhất mẫu với BPW, sau đó thêm vào 2 – 3 giọt Triton X-100 trước khi
ủ tăng sinh.
2.1.4.2. Tăng sinh chọn lọc
25