Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm sợi ứng dụng trong sản xuất rượu cao độ

1
BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
–––––––––––––––––––––––––––––––






BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ


Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM NẤM SỢI ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
RƯỢU CAO ĐỘ”




Chủ nhiệm Đề tài: NGUYỄN THU VÂN

7307
23/4/2009



Hà Nội, 12-2008
2
2. kÝ hiÖu ch÷ viÕt t¾t

- CFU: §¬n vÞ h×nh thµnh khuÈn l¹c (Colony Forming Unit)
- PDA: Potato Dextrose Agar
- UI: §¬n vÞ ho¹t lùc enzim
- Mpa: §¬n vÞ ®o ¸p suÊt

3
3. Tổng quan
3.1. Cơ sỏ pháp lí/ xuất xứ của đề tài
Đề tài đợc thực hiện theo hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát
triển công nghệ với mã số 83.08.RD/HĐ-KHCN giữa Bộ Công nghiệp và
Viện Công nghiệp thực phẩm kí ngày 28 tháng 01 năm 2008.
3.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Trong sản xuất rợu cao độ của Nhật Bản (tiếng Nhật có tên là
Shochu) ở giai đoạn nuôi Koji (gạo đợc cấy bào tử mốc và nuôi để tạo hệ
enzim có tác dụng thủy phân tinh bột trong giai đoạn lên men) bào tử mốc
giống là một yếu tố quan trọng quyết định chất lợng của Koji.
Trong nghiên cứu trớc đây của chúng tôi thực hiện tại Viện Công
nghiệp Thực phẩm về sản xuất rợu cao độ theo công nghệ Nhật Bản thì
thấy rằng việc sử dụng chế phẩm mốc dạng bột nhập từ Nhật Bản có rất
nhiều u điểm nh giúp cho quá trình nuôi Koji ổn định, hoạt lực enzim
cao, chất lợng rợu cao. Điều này cho thấy rằng để duy trì chất lợng
rợu cao độ một cách ổn định bền vững thì việc tạo ra một loại chế phẩm
bào tử mốc dạng bột công nghiệp tơng tự nh sản phẩm của Nhật là rất
cần thiết cho công nghệ sản xuất rợu mới này.
Ngoài ra đối với rợu truyền thống tại các làng nghề hiện nay thì
hình thức cung cấp giống mốc chủ yếu vẫn là dạng bánh men. Tuy nhiên
công nghệ sản xuất bánh men vẫn rất thủ công dựa trên kinh nghiệm gia
truyền nên chất lợng bánh men không đồng đều giữa các mẻ, do vậy ảnh
hởng nhiều đến chất lợng rợu. Chính vì lý do này mà rợu truyền

thống chủ yếu mới đợc sản xuất ở quy mô nhỏ, không thể sản xuất đợc
ở quy mô công nghiệp, do vậy rất khó kiểm soát chất lợng và mang
nhiều nguy cơ nguy hại cho ngời tiêu dùng. Do vậy việc tạo ra dạng chế
phẩm bào tử mốc sẽ giúp cho các làng nghề rợu cổ truyền Việt Nam có
một hình thức cung cấp giống mốc ổn định, chất lợng tốt do sử dụng bào
4
tử của các chủng giống thuần chủng, đã đợc tuyển chọn phù hợp theo
các đặc tính công nghệ. Điều này sẽ giúp chất rợu của các làng nghề ổn
định hơn, hiệu suất thu hồi rợu cao hơn. Đây sẽ là một sản phẩm vi sinh
mới giúp cho công nghệ sản xuất rợu cổ truyền của Việt Nam đợc hoàn
thiện hơn và có thể là tiền đề ban đầu để đa rợu cổ truyền của Việt Nam
ra sản xuất tại quy mô công nghiệp, tạo đợc sản phẩm rợu có chất
lợng cao và ổn định.
Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi trong đề tài này là tạo đợc chế
phẩm bào tử nấm mốc có hoạt lực cao dùng làm giống cho giai đoạn ủ
mốc tạo enzim (giai đoạn đờng hoá) trong sản xuất rợu cao độ từ tinh
bột.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đợc mục tiêu nghiên cứu nhóm đề tài Nghiên cứu công
nghệ sản xuất chế phẩm nấm sợi ứng dụng trong sản xuất rợu cao
độ đã thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
1. Lựa chọn chủng nấm mốc có hoạt lực thuỷ phân tinh bột cao dùng
trong sản xuất rợu cao độ.
2. Lựa chọn nguyên liệu gạo phù hợp.
3. Nghiên cứu môi trờng và điều kiện nuôi cấy thu nhận bào tử mốc.
4. Nghiên cứu chế độ sấy và bảo quản cho hoạt lực chế phẩm ổn định.
5. Nghiên cứu phối trộn chế phẩm mốc đa chủng

5
3.4. Nấm mốc
Nấm mốc là tên chung để chỉ các nấm hiển vi có cấu tạo dạng sợi.
Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí
hậu nóng ẩm. Màu sắc của nấm mốc đợc xác định bởi màu các bào tử do
nó sinh ra nh: xanh, vàng, trắng, đen, nâu
3.4.1. Đặc điểm cấu tạo [5, 6]
Tế bào nấm mốc có các thành phần cơ bản nh tế bào nấm nói
chung cũng nh tế bào của các vi sinh vật nhân chuẩn khác bao gồm các
phần: thành tế bào, màng tế bào, nhân, không bào, ty thể, mạng lới nội
chất. Thành tế bào dày khoảng 0,2àm, có cấu tạo khá vững chắc do vừa
có cấu trúc bản mỏng vừa có cấu trúc dạng sợi. Màng tế bào thờng tách
khỏi thành tế bào ở một vài chỗ, dày khoảng 7x10
-3
àm, đợc cấu tạo chủ
yếu bởi lipit và protein.
Chất nguyên sinh là dịch keo trong suốt, không màu, luôn chuyển
động từ phần sợi nấm già sang phần sợi nấm non hoặc từ các sợi nấm sinh
dỡng đến các sợi nấm làm nhiệm vụ sinh sản.
Nhân tế bào thờng có kích thớc rất nhỏ, đờng kính 2-3 àm, hình
cầu hoặc hình trứng. Số lợng nhân trong tế bào không ổn định.
3.4.2. Đặc điểm sinh học của nấm mốc [4]
Nấm mốc có dạng hình sợi phân nhánh hoặc không phân nhánh,
cấu tạo đơn bào hoặc đa bào. Sợi nấm có kích thớc bề dày đờng kính từ
1-10 àm hoặc 20 àm, chiều dài có khi lên tới vài chục cm. Khi nấm mốc
phát triển sẽ tạo thành hệ sợi nấm hay còn gọi là khuẩn ty. Có hai loại

khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trờng và khuẩn ti
dinh dỡng ăn sâu vào môi trờng đặc (còn gọi là khuẩn ty cơ chất). Đến
giai đoạn trởng thành từ các khuẩn ty khí sinh sẽ hình thành các cơ quan
sinh sản gọi là bào tử. Một số loại nấm mốc đơn bào bậc thấp nh lớp
Phycomycetes, trong đó điển hình là Mucor, Rizopus, khuẩn ty thờng
6
không có vách ngăn, toàn bộ khuẩn ty đợc coi là một tế bào phân nhánh,
đa nhân. Các khuẩn ty có vách ngăn thì tạo nên cơ thể đa bào nh
Penicillium, Aspergillus.
Nấm mốc không có diệp lục tố, do đó không có khả năng tiến hành
quang hợp nh các loại cây xanh. Chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các
thức ăn hữu cơ có sẵn qua bề mặt của khuẩn ty, đó là các cơ thể kí sinh
hoặc hoại sinh.
3.4.3. Nấm mốc dùng trong sản xuất các loại thực phẩm cổ truyền [2]
Nấm mốc dùng để đờng hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột trong
sản xuất rợu là Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. usami, Asp. awamorii
Mốc Aspergillus đã đợc dùng phổ biến trong sản xuất tơng, nớc
chấm ở các nớc phơng Đông từ lâu đời. Giống mốc này có hệ khuẩn ty
(hệ sợi) không màu hoặc vàng nhạt. Khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách
ngăn tế bào. Tế bào có hạch nhân. Cuống đính bào tử không phân nhánh
dài và thẳng, đầu phình to thành chóp, nang hình cầu, hình bán cầu hoặc
hình chùy xung quanh đầu có nhiều cuống nhỏ. Tùy loài có cuống nhỏ
1 tầng hoặc 2 tầng. Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình
chai, khi trởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống. Các đính bào
tử xếp thành chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần. Những chuỗi đính
bào tử xếp đối xứng tỏa tròn trên chóp nang. Đính bào tử điển hình
thờng hình cầu, đơn bào, đa hạch, bề mặt xù xì. Do cuống sinh bào tử và
đính bào tử có màu sắc, nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc
mốc. Các khuẩn lạc của mốc Aspergillus thờng là: vàng, vàng lục, đen,
tro, nâu vv

Aspergillus oryzae còn gọi là mốc vàng. Đầu tiên có màu vàng lục
sau có mầu nâu thẫm. Chiều cao của cuống sinh bào tử 1-2 mm. Mốc này
sinh ra các enzim amylaza, invectaza, maltaza, proteaza và catalaza. Mốc
7
phát triển trong khoảng nhiệt độ 15-40
o
C, tối thích 30-32
o
C. Trong giống
này có nhiều chủng đợc dùng trong sản xuất rợu, sản xuất nớc chấm.
Aspergillus flavus cũng gọi là mốc vàng rất giống Aspergillus
oryzae, chỉ khác là kích thớc nhỏ hơn, các tầng cuống hình trùy mang
đính bào tử và khuẩn lạc có màu trội về xanh lục hơn. Lúc đầu khuẩn lạc
mốc có màu vàng sáng, sau chuyển thành màu nâu ôliu. Chiều cao của
cuống sinh bào tử là 0,4-1 mm. Mốc này sinh ra các hệ enzim giống
Aspergillus oryzae, đặc biệt là proteaza rất hoạt động và chế phẩm tinh
khiết của enzim này đợc dùng làm tác nhân ổn định bia. ở một số môi
trờng có chất béo (trên lạc) mốc này có thể sinh ra độc tố aflatoxin.
Aspergillus niger thờng gọi là mốc đen. Sợi mốc màu trắng nhng
đính bào tử màu đen. Từ cuống đầu tiên mọc tiếp 2-4 nhánh cuống nhỏ rồi
mới tiếp đến các đính bào tử. Mốc sinh ra enzim amylaza, invectaza,
maltaza, proteaza, pectinaza, glucozooxydaza. Mốc này đợc dùng trong
sản xuất rợu, sản xuất axit xitric, axit fumaric. Proteaza do mốc này hoạt
động ở pH 2,5-3,5, còn proteaza của Aspergillus oryzae không hoạt động
ở vùng pH này.
Aspergillus niger có hoạt tính amylaza đờng hóa khác nhau ở những
chủng khác nhau. Một số chủng đợc sử dụng để đờng hóa tinh bột
trong sản xuất rợu hoặc xiro glucoza. Mốc này có thể chịu đợc pH thấp,
nhiệt độ thích hợp là 30-35
o

C và dễ phát triển trên môi trờng tinh bột.
Aspergillus awamorii và Aspergillus usami gần với Aspergillus
niger có khả năng sinh ra nhiều dextrinaza và glucoamylaza, còn amylaza
sinh ra ít hoặc trung bình. Mốc này đợc dùng nhiều trong công nghiệp
rợu để đờng hóa tinh bột.
Aspergillus kawachii l loại nấm mốc trắng đợc sử dụng rộng rãi
để nuôi Koji trong sản xuất rợu Shochu của Nhật Bản. Mốc này tạo ra
8
axit xitric và các enzim thủy phân nh -amylaza và glucoamylaza rất cần
thiết cho quá trình đờng hóa.
3.4.4. Dinh dỡng của nấm mốc [5, 6]
Nấm là những sinh vật dinh dỡng hóa năng hữu cơ, chúng chỉ có
khả năng thu nhận năng lợng từ môi trờng bên ngoài nhờ quá trình oxy
hóa hiếu khí hoặc quá trình lên men kị khí các chất hữu cơ ngoại bào.
Kiểu dinh dỡng cacbon hữu cơ này đợc gọi là kiểu dinh dỡng cacbon
dị dỡng. Nấm mốc là những loài hiếu khí hoàn toàn và có kiểu cacbon dị
dỡng thuộc loại hoại sinh, có nghĩa là có khả năng phân giải xác sinh
vật, sử dụng các chất hữu cơ để làm chất dinh dỡng.
3.4.4.1. Nguồn thức ăn cacbon
Nấm mốc có thể sử dụng nguồn thức ăn cacbon khác nhau và
không có những đòi hỏi nghiêm ngặt đối với một loại thức ăn cacbon.
Nhiều loài nấm mốc còn có khả năng đồng hoá cả các hợp chất hữu cơ rất
bền vững hoặc rất độc đối với nhiều sinh vật khác (các hợp chất n-alcal,
ancaloid, phenol, nhiều chất kháng sinh ). Đối với nguồn thức ăn hữu cơ
phức tạp nh: xilan, tinh bột, xenlulo, kitin trớc hết nấm mốc phải sinh
ra các enzim để phân huỷ các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân
tử sau đó mới đồng hoá đợc chúng.
3.4.4.2. Nguồn thức ăn Nitơ
Các loài nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với
nguồn thức ăn nitơ. Nấm mốc thờng có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ

vô cơ và hữu cơ.
Nhiều loài nấm mốc có khả năng đồng hoá cả muối amôn và
nitơrat. Nhiều loài thuộc chi Fusarium có khả năng đồng hoá nitơ trong
khí NH
3
. Nhiều loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus flavus, Trichoderma
nignorum, có khả năng đồng hoá trực tiếp nitơ phân tử.
9
Ngoài các nguồn nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng
nguồn nitơ hữu cơ (protein, pepton, peptit, axit amin vv ).
3.4.4.3. Các nguyên tố khoáng
Bằng các phơng pháp phân tích quang phổ, ngời ta đã xác định
đợc tất cả các chất khoáng có trong tế bào nấm mốc. Về các nguyên tố
đại lợng, có thể kể đến: S, P, K, Ca, Mg, Fe, chúng thờng chiếm từ vài
phần nghìn đến vài phần trăm trọng lợng khô. Các nguyên tố vi lợng có
Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, B.
Hàm lợng các nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không
những thay đổi tuỳ thuộc và điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trờng,
thời gian nuôi cấy.
3.4.5. Độc tố nấm [14]
Trong số hơn 10.000 loài nấm đợc biết đến, có khoảng 50 loài
nấm mốc gây hại cho ngời và vật nuôi vì chúng sản sinh ra độc tố, ngời
ta thờng gọi tên chúng là độc tố nấm (mycotoxin). Độc tố nấm là những
sản phẩm trao đổi thứ cấp của nấm mốc nh Aspergillus, Furasium,
Penicillium. Những loài nấm mốc này có thể phát triển trong lúc canh tác,
lúc thu hoạch, lúc dự trữ, lúc sản xuất chế biến thức ăn khi gặp điều kiện
thuận lợi. Theo số liệu của Tổ chức Nông lơng Thế giới (FAO) thì
khoảng 25% tổng số lợng ngũ cốc nhiễm mycotoxin.
Độc tố nấm mốc ở mỗi nơi là khác nhau do điều kiện khí hậu của
từng khu vực. Chẳng hạn Aflatoxin thì thờng đợc tìm thấy ở khu vực

nhiệt đới, trong khi Zearalenon thờng đợc tìm thấy ở xứ ôn đới.
Mycotoxin không những hiện diện trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt mà
còn chuyển qua thịt, sữa, trứng và các sản phẩm từ nuôi trồng thuỷ sản
nh tôm, cá. Thiệt hại kinh tế do mycotoxin gây ra có thể lên đến hàng
triệu USD mỗi năm và ảnh hởng nhiều nhất cho các nhà chăn nuôi, sản
xuất thực phẩm và thức ăn gia súc.
10
Bảng 3.1. Các dấu hiệu do nhiễm độc tố nấm
Mycotoxin Triệu chứng
- T-2 và Diacetoxycripenol - Lở loét miệng, mất tính ngon
miệng, da và ruột bị bong tróc,
sng tấy
- Zearaleuone - Rối loạn sinh sản
- Vomitoxin - Chán ăn, da bị nhiễm nấm
- Fumoni và Momlifosumin - Rối loạn thần kinh, gan bị h nát
- Aflatoxin - Gan bị nhiễm độc, suy yếu hệ
thống miễn nhiễm
- Dehratoxin và Citrinin - Thận nhiễm độc, bệnh Gout

Aflatoxin là độc tố nấm đáng sợ nhất. Có nhiều chủng nấm tiết ra
độc tố này, nhng Aspergillus flavus là loài nấm mốc sản sinh ra lợng
aflatoxin lớn nhất, nguy hiểm nhất. Hiện có 4 loại aflatoxin đã đợc xác
định là B1, B2, G1, G2 (phân biệt ký tự B và G theo màu huỳnh
quang xanh da trời và xanh lá cây khi chiếu tia cực tím lên bản tách các
vết sắc ký lớp mỏng aflatoxin). Trong đó aflatoxin B1, G1 là hai chất có
tính độc nhất và đợc nghiên cứu khá kỹ.
Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết ngời khoảng
10mg), độc tố aflatoxin còn đợc xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung
th. Ngời ta đã biết aflatoxin là một trong những chất gây ung th gan
mạnh nhất, tác động qua đờng miệng. Nếu hấp thu một tổng lợng

2,5mg aflatoxin trong thời gian 89 ngày có thể dẫn đến ung gan hơn 1
năm sau. Vụ dịch năm 1960 ở miền Nam và Đông nớc Anh khi 10 vạn
gà tây từ 4-6 tuần tuổi ăn phải lạc mốc bị chết đã làm mọi ngời sửng sốt.
Các con vật bị chết sau 1 tuần khi thấy xuất hiện triệu chứng đầu tiên:
biếng ăn, sã cánh, lù dù rõ rệt. Mổ gà chết đều thấy mô gan bị phá hủy và
11
có sự tăng tế bào biểu mô của ống dẫn mật. Độc tố aflatoxin rất bền với
nhiệt, khi đem lạc mốc rang lên, mặc dù nhiệt độ rất cao, các bào tử của
nấm mốc bị tiêu diệt, nhng độc tố của chúng vẫn không bị phá huỷ hoàn
toàn.
Ngời ta đã phân lập đợc nhiều loài mốc khác nhau trên gạo,
nhng có 2 chủng hay gặp nhất là Aspergillus và Penicillium. Rất nhiều
loài mốc đợc phát hiện trên gạo có tính độc, thuộc các chủng Penicillium
khác nhau và tạo nên các màu nâu, vàng Nguy hiểm hơn cả là chủng
nấm mốc Penicillium islandicum tạo nên màu gạo vàng Thái Lan. Đây
là chủng mốc đợc xem là nguyên nhân chủ yếu gây mốc gạo trong kho.
Để phát triển, nấm mốc cần phải có môi trờng phù hợp, đó là độ
ẩm cao và nhiệt độ nóng ấm thích hợp. Aspergillus flavus chủ yếu xâm
nhập đợc khi hạt lạc chứa 15-20% hàm lợng nớc, nếu hàm lợng nớc
dới 9% thì nó không thể phát triển đợc. Vì vậy cách chống mốc tốt nhất
là phơi khô, loại hết những hạt giập vỡ, nhăn nheo hoặc nghi mốc để tránh
bào tử mốc nhanh chóng lan sang các hạt lạc bình thờng khác.
3.4.6. Một số yếu tố ảnh hởng đến quá trình nuôi mốc [4, 5, 6, 7]
3.4.6.1. ảnh hởng của nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò chủ yếu trong quá trình sinh trởng của sợi
nấm, nó cũng tác động đến việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của
chúng. Mỗi loài nấm mốc có khoảng nhiệt độ sinh trởng và phát triển
nhất định. Phần lớn nấm mốc phát triển trong khoảng 15-32
o
C và sinh

trởng tốt nhất ở khoảng 25-30
o
C. Một số ít loài nấm mốc có thể sinh
trởng ở cả các kho lạnh đến -6
o
C, thậm chí -20
o
C nh Cladosporium
herbarum, một số loài thuộc chi Penicilium. Ngợc lại, loài Asp. flavus
vẫn phát triển tốt ở 35
o
C. Một số ít loài khác có nhiệt độ tăng trởng đến
50
o
C. Căn cứ vào nhiệt độ tăng trởng, các loài nấm mốc đợc chia thành
5 nhóm: nhóm a nóng, nhóm chịu nóng, nhóm a nhiệt trung bình, nhóm
12
chịu lạnh, nhóm a lạnh. Nhiệt độ tối thích cho đa số các chủng nấm mốc
là 28-32
o
C. Nếu nhiệt độ xuống dới 24
o
C hay trên 45
o
C nấm mốc sẽ phát
triển chậm.
3.4.6.2. ảnh hởng của độ ẩm
Mọi quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật đều xảy ra trong
môi trờng nớc. Tuy nhiên nhu cầu về nớc đối với từng loài, từng chủng
và thời kỳ phát triển khác nhau có khác nhau. Trong những nhân tố tác

động vào sự phát triển của nấm mốc, độ ẩm có vai trò rất lớn. Độ ẩm của
môi trờng cũng nh độ ẩm tơng đối của không khí là yếu tố quan trọng
quyết định sự sinh trởng của hệ sợi nấm và sự sản sinh bào tử.
3.4.6.3. ảnh hởng của độ thoáng khí
Nấm mốc hoàn toàn hiếu khí và chỉ phát triển đợc trong điều kiện
thoáng khí. Các loài nh Mucor và Trichoderma là những loài cần nhiều
oxy. Một lợng nhỏ khí cacbon là cần thiết cho bào tử Aspergillus nảy
mầm nhng nếu nồng độ này quá cao lại ức chế sự phát triển của chúng.
Khi nuôi cấy nấm mốc bằng phơng pháp bề mặt cần chú ý tới độ dày
khối môi trờng để đảm bảo độ thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của
nấm mốc.
3.4.6.4. ảnh hởng của pH môi trờng
pH của môi trờng cũng ảnh hởng đến sự phát triển của nấm mốc.
Phần nhiều nấm mốc phát triển trong phạm vi pH từ 4-8 nhng một số
nấm mốc có khả năng chịu đợc những cơ chất có pH axit hơn hoặc kiềm
hơn. Tuy nhiên khi dùng phơng pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trờng ít
làm ảnh hởng đến quá trình sinh trởng và phát triển của nấm mốc vì
môi trờng rắn có tính đệm cao.



13
3.5. Sản xuất chế phẩm bào tử nấm mốc
3.5.1. Giới thiệu công nghệ làm bánh men cổ truyền Việt Nam [9,11]
Tại Việt Nam công nghệ sản xuất rợu cao độ cổ truyền đã có từ
lâu đời. Một hình thức chế phẩm mốc và men giống phổ biến nhất dùng
cho sản xuất rợu chính là bánh men cổ truyền, đây là một phức hệ các
loại vi sinh vật dùng để làm giống gốc trong quá trình ủ cơm và lên men.
Bánh men thờng đợc sản xuất ở quy mô nhỏ theo kinh nghiệm và các
chủng giống sử dụng làm bánh men thờng là các chủng tự nhiên hoạt lực

không cao, quy trình làm thủ công nên rất dễ nhiễm tạp các vi sinh vật
không có lợi. Do vậy chất lợng bánh men thờng không đồng đều nên
dẫn tới chất lợng rợu cổ truyền thờng không ổn định. Mặc dù đã có
nhiều nghiên cứu đợc thực hiện để nâng cao chất lợng bánh men, tuy
nhiên tính ổn định của chế phẩm vi sinh vật này cũng cha đợc thực sự
cải thiện đáng kể. Hiện nay ở Việt Nam cũng xuất hiện một số loại sản
phẩm giống dạng bột dùng cho sản xuất rợu có nguồn gốc từ Trung
Quốc, tuy nhiên đây là các sản phẩm nguồn gốc không rõ ràng và chất
lợng rợu sản xuất ra không cao thờng gây đau đầu cho ngời uống.
3.5.1.1. Hệ vi sinh vật trong bánh men
Trong bánh men chứa một phức hệ các vi sinh vật bao gồm: nấm
mốc, giả nấm men, nấm men.
Các loại nấm mốc chủ yếu trong bánh men là Aspergillus, Mucor,
Rhizopus, đó là các loại nấm mốc phổ biến có trong không khí. Các loại
nấm mốc này thờng có thành phần và tỷ lệ rất khác nhau tùy thuộc vào
từng loại bánh, từng vùng sản xuất, từng hộ. Các loại nấm mốc
Aspergillus, Mucor, Rhizopus khi phát triển trên môi trờng với cơ chất là
tinh bột có khả năng sinh tổng hợp enzim amylaza để thủy phân tinh bột
thành đờng. Trong đó đáng chú ý nhất là các chủng thuộc giống
14
Aspergillus, các chủng này có khả năng sinh tổng hợp enzim amylaza cao,
đặc biệt là glucoamylaza.
Các chủng giả nấm men thuộc loài Endomycopsis có vai trò quan
trọng trong bánh men, đặc biệt là các chủng Endomycopsis fibulliger. Khi
phát triển trên môi trờng cơ chất là tinh bột Endomycopsis fibulliger có
khả năng sinh tổng hợp enzim glucoamylaza cao để thủy phân tinh bột
thành đờng glucoza.
Các loại nấm men để giúp quá trình lên men đờng thành rợu.
Trong đó đáng chú ý nhất là các loại nấm men thuộc chủng
Saccharomyces cerevisiae, chủng này thờng có hoạt lực lên men mạnh.

3.5.1.2. Công nghệ làm bánh men
Sản xuất bánh men chính là sản xuất hỗn hợp các hệ vi sinh vật cần
thiết cho quá trình sản xuất rợu. Bản chất của bánh men là nuôi cấy và
bảo quản vi sinh vật trên môi trờng tinh bột sống ở trạng thái khô. Sau
quá trình tạo bánh, ủ và sấy tới độ ẩm bảo quản, các vi sinh vật đợc
chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái nghỉ. Chúng sẽ hoạt động
nhanh chóng trở lại trong điều kiện môi trờng thích hợp (độ ẩm, chất
dinh dỡng, nhiệt độ), sinh sản, phát triển đồng thời sinh tổng hợp phức
hệ enzim đờng hóa.
Nguyên liệu chính để sản xuất bánh men là gạo và các vị thuốc bắc,
nam hoặc các loại lá, củ, quả. Gạo để sản xuất bánh men thuốc bắc thì
đợc ngâm và nghiền ớt thành bột mịn. Đối với bánh men lá gạo đợc
nghiền khô thành bột. Gạo để sản xuất bánh men đợc lựa chọn rất kỹ,
thờng là các loại gạo cũ không bị mốc, mọt.
Thuốc bắc hoặc các loại lá, củ, quả đợc sử dụng với thành phần và
tỷ lệ khác nhau, tùy thuộc vào kinh nghiệm gia truyền của từng làng nghề.
Mỗi bài thuốc khác nhau ảnh hởng đến hơng vị của từng lọa rợu. Các
vị thuốc để sản xuất bánh men th
ờng đợc nghiền nhỏ để dùng dần.
15
Ngời ta thờng sử dụng men giống gốc làm giống để gây men.
Men giống gốc là bánh men có chất lợng tốt của mẻ trớc để lại, đợc
nghiền nhỏ trớc khi phối trộn làm men.
Để sản xuất bánh men ngời ta phối trộn tỷ lệ hỗn hợp thuốc bắc
(bánh men thuốc bắc) hoặc các loại lá, củ, quả (bánh men lá), gạo và men
giống theo kinh nghiệm. Sau đó bổ sung nớc để nhào bột tới độ ẩm
khoảng 50-55%, tạo bánh, xếp vào các khay đã đựng sẵn trấu, ủ men đến
khi các bánh men xốp phồng đều, bề mặt có hệ sợi mốc trắng, có mùi
rợu thơm. Sau đó lấy ra hong khô tự nhiên hoặc sấy khô thu đợc bánh
men cho sản xuất rợu.

3.5.2. Giới thiệu công nghệ sản xuất Tane Koji Nhật Bản [1, 12, 16]
Tane Koji theo tiếng Nhật có nghĩa là hạt mốc giống. Nuôi cấy mốc
để sản xuất tơng hoặc xì dầu ở các nớc phơng Đông có từ thời cổ xa.
Trớc đây bào tử nấm mốc có từ thiên nhiên rơi vào trong xôi gạo và mọc
lên mốc làm tơng hay làm rợu. Theo phơng pháp truyền thống có từ
thời Muromachi (XIII-XV) thì mốc đợc sản xuất trên gạo hấp chín theo
tỷ lệ 96% gạo, 4% tro của một số lá cây nh camellia, zelkova nuôi cấy
ở nhiệt độ 34-36
o
C trong 7 ngày. Loại sản phẩm này đợc gọi là Tane
Koji.
Năm 1884 J. Takamine (Nhật Bản) đã nuôi cấy Asp. oryzae trên
gạo, sau đó thay gạo bằng cám mì và thu đợc chế phẩm enzim bằng cách
chiết qua nớc rồi kết tủa bằng cồn. Năm 1914 mốc này đợc dùng rộng
rãi trong sản xuất rợu ở Mỹ theo qui trình công nghệ của Takamine và
đợc dùng phổ biến trên thế giới để đờng hóa các nguồn nguyên liệu
tinh bột trớc khi lên men rợu cho đến nay.
Hiện nay tại Nhật có khoảng 6 nhà máy chuyên sản xuất chế phẩm
bào tử mốc giống (Tane Koji) và cung cấp cho toàn bộ các nhà máy rợu
trên toàn nớc Nhật. Không chỉ rợu mà nhiều sản phẩm khác nh nớc
16
chấm, tơng là những sản phẩm mà có trải qua giai đoạn nuôi Koji
cũng sử dụng các chế phẩm bào tử dạng bột nh vậy (mỗi một sản phẩm
khác nhau sử dụng một loại bào tử của chủng giống riêng biệt). Tại các
công ty sản xuất mốc giống các chủng nấm mốc thuần chủng nh
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus kawachii đợc nuôi
trên những môi trờng đặc hiệu để thu nhận lợng bào tử lớn và sau đó
đợc hoàn thiện thành dạng sản phẩm bào tử dạng bột và nhà sản xuất
rợu mua dạng chế phẩm này dùng trực tiếp cho quá trình nuôi Koji trong

sản xuất rợu. Điều này giúp chất lợng rợu sản xuất ra luôn ổn định do
sử dụng các chủng giống công nghiệp, thuần chủng, hoạt lực cao và giúp
cho quy trình công nghệ làm Koji tại các cơ sở sản xuất rợu trở nên đơn
giản, dễ thao tác hơn.
3.5.2.1. Các sản phẩm Tane Koji đợc sử dụng trong sản xuất rợu
Shochu
Hiện nay ở Nhật có 3 loại Tane Koji đợc sử dụng rộng rãi trong
công nghiệp sản xuất rợu cao độ Shochu đó là: Tane Koji đen, Tane Koji
trắng và Tane Koji vàng. Các tên gọi này xuất phát từ màu của các bào tử
nấm mốc.
Tane Koji đen đợc sản xuất từ chủng Aspergillus awamorii, chủng
mốc đen thờng đợc dùng chủ yếu trong sản xuất Shochu truyền thống ở
Nhật Bản do tạo nhiều axit xitric. Tane Koji trắng đợc sản xuất từ chủng
Aspergillus kawachii, chủng đột biến từ Aspergillus awamorii. Hiện nay
loại mốc trắng này đang rất đợc a chuộng ở Nhật bởi vì chủng này tạo
hơng thơm rất đặc trng. Tane Koji vàng đợc sản xuất từ chủng
Aspergillus oryzae. Chủng này không sản sinh nhiều axit xitric trong quá
trình nuôi Koji nên thờng chỉ dùng khi phối trộn với chủng mốc đen.


17
3.5.2.2. Công nghệ sản xuất Tane Koji
Qui trình công nghệ
Gạo

Vo sạch

Nớc Ngâm

Để ráo nớc

Hấp chín

Làm nguội

Bào tử giống gốc Trộn đều

Đa vào khay

Vào phòng nuôi

Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp

Chế phẩm Tane Koji
Thuyết minh qui trình công nghệ
A. Xử lý nguyên liệu gạo
Vo gạo: với số lợng gạo nhiều thì sử dụng thiết bị chuyên dụng. Sau khi
vo lợng nớc hấp thụ vào gạo khoảng 10%.
Ngâm gạo: mục đích của quá trình ngâm là cho gạo hấp thụ nớc để dễ
chín khi hấp. Gạo đợc ngâm trong nớc có nhiệt độ 15-16
o
C, thời gian từ
12-15 giờ. Sau khi ngâm gạo lợng nớc hấp thụ vào gạo khoảng 30%.
18
Đồ gạo: gạo sau khi ngâm nớc đợc làm ráo rồi đa vào thiết bị hấp,
thờng thời gian đồ gạo kéo dài từ 30 đến 50 phút tùy từng loại gạo.
Trong quá trình đồ gạo, gạo hấp thụ thêm 10% nớc. Sau khi đồ gạo, tiến
hành cân xác định lại khối lợng gạo đồ. Nếu tỉ lệ khối lợng gạo đồ/khối
lợng gạo ban đầu đạt khoảng 140 -150% là đạt yêu cầu.
Làm nguội: sau khi đồ gạo đợc tãi ra làm nguội đến nhiệt độ 37

o
C rồi
trộn bào tử mốc giống có tên gọi Tsubujyo
B. Quá trình nuôi Tane Koji
Sau khi đợc cấy giống mốc, gạo đồ đợc chuyển vào các khay
nuôi bằng gỗ, rồi đa vào phòng nuôi, nhiệt độ phòng giữ khoảng 32
o
C,
độ ẩm không khí trong phòng là 80-90%, thời gian nuôi khoảng 5-6 ngày.
Các khay nuôi đợc xếp chồng lên nhau cứ 5 khay một và đợc đặt trên
các giá đỡ. Hàng ngày tiến hành đảo trộn khối ủ và đảo vị trí các khay
nuôi sao cho nhiệt độ giữa các khay đồng đều và đạt nhiệt độ yêu cầu
trong quá trình nuôi.
Điều kiện phòng nuôi: diện tích phòng khoảng 15m
2
/100 kg gạo.
Trong phòng nuôi có hệ thống điều khiển nhiệt độ, độ ẩm và thiết bị
thông khí. Tờng bao quanh, trần và mái của phòng nuôi đợc làm bằng
vật liệu giữ ấm.

3.5.3. Nguyên liệu sử dụng cho sản xuất chế phẩm bào tử mốc
Gạo là nguyên liệu chính để sản xuất chế phẩm bào tử mốc và có
ảnh hởng lớn đến sinh trởng của sợi nấm cũng nh việc sản sinh bào tử.
Gạo là loại nông sản sẵn có ở Việt Nam. Các số liệu thống kê về sản
lợng lúa trong cả nớc đợc trình bày ở bảng 3.2



19
Bảng 3.2. Sản lợng lúa cả nớc (nghìn tấn) [8]

Sản lợng

Năm
Lúa đông
xuân
Lúa hè thu Lúa mùa Tổng số
2000 15571,2 8625,4 8333,3 32529,5
2001 15474,4 8328,4 8305,6 32108,4
2002 16719,6 9199,7 8538,9 34447,2
2003 16822,7 9400,8 8345,3 34568,8
2004 17078,0 10430,9 8640,0 36148,9
2005 17331,7 10415,1 8044,0 35790,8

3.5.3.1. Thành phần của gạo
Thành phần chính của gạo gồm: tinh bột, protein, chất béo, các
vitamin, các chất khoáng Tỷ lệ các thành phần đó phụ thuộc vào rất
nhiều yếu tố nh: thổ nhỡng, khí hậu, giống lúa, kỹ thuật canh tác, mùa
vụ, ngoài ra còn phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và bảo quản.

Tinh bột
Đánh giá chất lợng gạo ngời ta chú trọng đến tỷ lệ giữa amyloza
và amylopectin có trong tinh bột, tỷ lệ này ở mỗi loại gạo rất khác nhau.
Trong tinh bột gạo tẻ hàm lợng amyloza vào khoảng 18-26%, trong tinh
bột gạo nếp hầu nh chỉ có amylopectin

20
Bảng 3.3. Hàm lợng amyloza của một số loại gạo [13]
Hàm lợng amyloza
TT Loại gạo Protein
(% chất
khô)
(% chất
khô)
Phân loại
Mức độ
gelatin
hóa
1 Nếp cái hoa
vàng
9,03 3,55 Thấp Trung
bình
2 Nàng Hơng 8,12 20,82 Trung bình Trung
bình
3 CR-203 8,34 26,15 Cao Trung
bình
4 C-70 7,62 27,38 Cao Trung
bình
5 C-71 7,68 25,41 Hơi cao Thấp
6 X-21 7,62 20,62 Trung bình Thấp
7 Bao Thai Hồng 8,19 24,36 Trung bình Thấp
8 Mộc Tuyền 8,37 28,26 Cao Thấp
9 DT-10 10,12 25,74 Hơi cao Thấp
10 Q-5 7,5 26,96 Cao Thấp
11 Khang Dân 6,93 26,66 Cao Thấp
12 Tạp Giao 1 8,92 19,9 Thấp Trung

bình
13 Tạp Giao 4 10,23 18,9 Thấp Trung
bình
14 IR-64 11,17 21,57 Trung bình Cao
15 IR-62030 8,04 24,15 Trung bình Thấp
16 OM-269 8,7 24,9 Trung bình Thấp


21
Protein
Mỗi một loại gạo, hay cùng một loại gạo ở các vùng khí hậu, thổ
nhỡng khác nhau, có tỷ lệ và thành phần protein khác nhau. Nhng chủ
yếu là orezinin thuộc nhóm glutelin, ngoài ra còn có globulin, locozin và
prolamin. So với một số loại ngũ cốc khác nh lúa mỳ, lúa mạch thì
thành phần protein trong gạo thấp, nhng trong cấu trúc protein lại chứa
đủ các loại axit amin không thay thế.
Bảng 3.4. Hàm lợng các axit amin không thay thế của gạo [13]
TT Axít amin Gạo nếp
(g/100g)
Gạo tẻ (g/100g)
1 Treonin 0,22 0,27
2 Arginin 0,57 0,55
3 Lyzin 0,34 0,29
4 Metionin 0,15 0,11
5 Tryptophan 0,08 0,08
6 Phenylalanin 0,51 0,39
7 Lơxin 0,53 0,62
8 Valin 0,44 0,47
9 Izolơxin 0,34 0,38
10 Histidin 0,19 0,11

Chất béo
Các chất béo trong hạt gạo chỉ tập trung ở lớp ngoài (vỏ cám) và
phôi hạt. Chủ yếu là các axit béo cha no nh: axit oleic chiếm tới 42,4%,
axit linoleic chiếm tới 30%, axit panmatic chiếm tới 15,5% thành phần
chất béo của hạt gạo.
Vitamin
Gạo chứa nhiều loại vitamin: B1, B2, PP, E, D trong đó vitamin
B1 chiếm một hàm lợng lớn. Gạo lật B1 chiếm 0,5 mg%, gạo xát B1
22
chiếm 0,2 mg%. Các vitamin chủ yếu tập trung ở lớp vỏ alơron và ở phôi
của hạt.
Các chất khoáng
Gạo chứa một hàm lợng đáng kể các chất khoáng: Ca, Mg, Fe,
Zn Tùy từng loại gạo, thời vụ, vùng địa lý mà tỷ lệ, thành phần các chất
khoáng trong gạo khác nhau.
3.5.3.2. Sự thay đổi thành phần hóa học của hạt gạo trong quá trình
chế biến
Sau quá trình làm sạch, hàm lợng chất béo và protein của hạt lúa
thực tế không có gì thay đổi. Riêng hàm lợng tro giảm, hàm lợng
xelluloza giảm chủ yếu do râu thóc đã đợc tách bỏ đi.
Bảng 3.5. Sự thay đổi thành phần hóa học của thóc trong quá trình
làm sạch [3]
Hàm lợng % theo chất khô
Tên sản phẩm
Protein Chất béo Tro Xenluloza
Thóc trớc khi làm
sạch
7,28 2,33 5,24 9,64
Thóc sau khi làm sạch 7,25 2,33 5,06 9,43
Sau khi xay, trấu đợc tách ra và ngời ta thu lấy gạo xay. Thành

phần hóa học của gạo xay và trấu đợc ghi lại ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Thành phần hóa học của các sản phẩm sau khi xay [3]
Hàm lợng % theo chất khô
Tên sản phẩm
Protein Chất béo Tro Xenluloza
Gạo xay nguyên 8,76 1,86 1,42 0,84
Tấm xay 8,56 1,88 1,63 1,221
Cám xay 11,48 9,40 11,85 19,09
Trấu 3,09 0,69 20,32 49,15

23
Xát gạo nhằm mục đích tách đến mức tối đa các lớp vỏ quả, vỏ hạt
và alơron. Tùy theo cờng độ xát (mức bóc cám) cao hay thấp mà thành
phần hóa học của gạo thành phẩm khác nhau khá nhiều.
Bảng 3.7. Sự thay đổi thành phần hóa học của gạo theo mức độ xát[3]
Hàm lợng, % theo chất khô
Tên sản
phẩm
Protein Chất béo Tinh bột Tro Xelluloza
Gạo lật (xay) 8,6-10,1 1,5-2,0 76,8-82,5 1,32-1,70 0,86-1,60
Gạo xát 1 lần 8,1-9,9 1,4-1,9 78,4-85,8 1,20-1,40 0,6-1,2
Gạo xát 2 lần 7,9-9,6 1,3-1,6 80,0-87,1 1,10-1,26 0,5-1,1
Gạo xát 3 lần 7,8-9,4 1,0-1,1 83,0-88,0 0,98-1,14 0,4-0,8
Gạo xát 4 lần 7,7-9,3 0,7-0,9 84,5-89,0 0,70-0,98 0,2-0,5
Gạo xát 5 lần 7,6-9,2 0,5-0,6 09,8 0,48-0,72 0,1-0,4

Gạo càng xát kỹ thì hàm lợng xelluloza càng thấp và nh vậy độ
tiêu hoá của gạo sẽ tăng. Nhng do quá trình xát đã loại đi các lớp vỏ và
một phần lớp alơron nên hàm lợng protein và chất béo trong gạo cũng
giảm đi. Đặc biệt hàm lợng các vitamin giảm đi rất rõ rệt. Trong quá

trình xát gạo lợng vitamin có thể mất đi đến 56-81% tuỳ theo từng loại
gạo.
Trong quá trình xát gạo, hàm lợng amyloza của tinh bột gạo tăng
lên, nh vậy có nghĩa là tinh bột ở lớp ngoài của hạt gạo có chứa ít
amyloza hơn các lớp trong.
Bảng 3.8. Sự thay đổi hàm lợng amyloza trong quá trình xát gạo [3]
Hàm lợng amyloza (% theo tinh bột của thóc)
Loại gạo
Tám Thơm Chiêm Chanh Mộc Tuyền Nếp Cái
Gạo xay (lật) 17,8 25,2 19,2 rất ít
Gạo xát 18,3 26,3 21,0 rất ít

24
4. Thực nghiệm
4.1. Phơng pháp tiến hành nghiên cứu:
4.1.1. Phơng pháp phân tích hóa lý và hóa sinh
- Xác định độ ẩm theo phơng pháp sấy đến 105
o
C trong 3 giờ đến trọng
lợng không đổi.
- Xác định hàm lợng protein bằng phơng pháp Kieldan
- Xác định hàm lợng axit bằng phơng pháp trung hòa
- Xác định hoạt độ enzim -amylaza theo phơng pháp của Nhật
Nguyên tắc: đo cờng độ màu tạo thành giữa phản ứng của tinh bột và
enzim -amylaza có trong mẫu cần phân tích với Iod là chất hiện màu.
Hoạt độ enzim -amylaza là số gam tinh bột tan đợc chuyển hóa
thành các dextrin có phân tử lợng khác nhau khi sử dụng 1g chế phẩm
enzim ở 40
o
C trong thời gian 30 phút.

Công thức tính:
HA =
10
100
x75,12x
t
TT
ot

(UI/g Koji)

t
T : mật độ đo quang của mẫu thí nghiệm
o
T : mật độ đo quang của mẫu đối chứng

t: thời gian phản ứng (phút)
12,75: hệ số thực nghiệm

10
100
hệ số pha loãng (tỷ lệ trích ly enzim)

4.1.2. Phơng pháp vi sinh
- Xác định khả năng thủy phân tinh bột bằng cách đo vòng thủy phân tinh
bột
- Xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu
- Xác định số lợng bào tử sống trên môi trờng PDA
- Xác định số lợng bào tử nảy chồi trên môi trờng thạch có 1% tinh bột
25

4.1.3. Phơng pháp đánh giá cảm quan theo TCVN 3217-79
Cách lấy mẫu:
- Tiến hành lấy mẫu theo TCVN 378-70 và TCVN 1275-72
- Lợng mẫu lấy theo yêu cầu của hội đồng cảm quan nhng không
quá 4 lít
- Mẫu đợc bảo quản cho tới khi thử nghiệm ở nơi không có ánh
nắng mặt trời chiếu thẳng vào và ở nhiệt độ không quá 25
o
C.
Tiến hành thử mẫu:
Cho rợu mẫu vào đầy chai thủy tinh, chai đó đã đợc tráng bằng
nớc cất và rợu mẫu thử nghiệm, ngay sau đó tiến hành kiểm tra độ
trong và màu sắc dới ánh sáng tự nhiên hay nhân tạo.
Rót rợu mẫu vào khoảng một phần ba thể tích cốc thủy tinh, cốc
đó đã đợc tráng bằng nớc cất và rợu mẫu thử nghiệm, ngay sau đó tiến
hành kiểm tra mùi, vị.
Sau khi cảm quan xong một mẫu phải nghỉ từ 5-10 phút. Trong thời
gian nghỉ, súc miệng bằng nớc đun sôi để nguội không có mùi, vị lạ.
Bảng 4.1. Hớng dẫn đánh giá cảm quan rợu TCVN 3217-79 [10]
Tên
chỉ
tiêu
Hệ số
quan
trọng
Điểm cha
có trọng
lợng
Yêu cầu
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật

thể lạ nhỏ, màu hoàn toàn đặc trng cho sản
phẩm
4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật
thể lạ nhỏ, màu đặc trng cho sản phẩm





Độ
trong
và






0,8
3 Chất lỏng trong, có tơng đối nhiều vật thể lạ
nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc
trng của sản phẩm