Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (larich desidue) và bèo tấm (lema sp-wolffia sp)

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP







BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ


NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP
BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRÊN TẾ BÀO
CÂY THÔNG (Larich desidue) VÀ BÈO TẤM (Lemna
sp wolffia sp)


Chủ nhiệm đề tài: LÊ HUY HÀM

7379
26/5/2009



HÀ NỘI – 2008




MỤC LỤC

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI 1
BÀI TÓM TẮT 2
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 4
LỜI MỞ ĐẦU 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 7
1.1. Tổng quan về bèo tấm 7
1.1.1. Cây phân loại bèo tấm 7
1.1.2. Phân bố của bèo tấm 7
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm 8
1.1.4. Đặc điểm sinh học 8
1.2. Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm 12
1.3. Nghiên cứu chuy
ển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp 13
1.3.1. Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật 13
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 15
1.3.3. Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 19
1.3.4. Hệ thống chuyển gen ở bèo tấm 23
1.4. Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia / Lemna 25

1.4.1. Bệnh Gumboro ở gia cầm 25
1.4.2. Chiến lược nghiên cứu và thử nghiệm ứng dụng vaccine thế hệ mới 26
1.4.3. Gen kháng nguyên VP2 trong chiến lược phát triển vaccine thế hệ mới 27
1.5. Nghiên cứ
u sản xuất vaccin qua đường miệng 29
1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước 30
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Mục tiêu của đề tài 32
2.2. Nội dung nghiên cứu cần thực hiện 32
2.3. Vật liệu 33
2.3.1. Vật liệu thực vật 33
2.3.2. Vật liệu vi khuẩn 33
2.3.3. Hoá chất 35
2. 4. Phương pháp 35
2.4.1. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ở thực vật 35
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế
bào 44
2.4.3. Phương pháp biến nạp gen 45
2.4.4. Phương pháp đánh giá cây chuyển gen 49
2.4.5. Thử nghiệm khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà 57
CHƯƠNG3:NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 58
1.
THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN Ở THỰC VẬT 58
1.1. Kết quả khuyếch đại gen mã hoá protein của virus VP2 bằng phương pháp PCR 58
1.2. Kết quả tạo dòng gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro 58
1.2.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCR
đ
2.1 58
1.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng InV
α

F
’
59
1.2.3. Kết quả tách chiết ADN plasmid 60
1.2.4. Kiểm tra vectơ tái tổ hợp bằng cách cắt với enzyme giới hạn EcoRI 60
1.3. Kết quả giải trình tự gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro 61
1.4. Thiết kế vectơ biểu hiện VP2 63
2. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ NHÂN SINH KHỐI Ở 66
BÈO TẤM WOLFFIA, LEMMA 66
2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm Wolffia australiana 66
2.1.1. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của W. australiana trong các điều
kiện nuôi khác nhau 67
2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của W. australiana 68
2.1.3. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu trong ống nghiệm W. australiana trong điều kiện nuôi
tủ ổn nhiệt 69
2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm Lemna 70
2.2.1. Tạo vật liệu vô trùng 70
2.2.2. Nghiên cứu xác định môi trường nhân cây bèo phù hợp 70
2.2.3. Tạo và nhân callus 75
2.2.4. Nhân sinh khối callus dạng I 81
2.2.5. Tái sinh cây từ callus 82
3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN ĐẠT HIỆU QUẢ CAO VÀO BÈO TẤM
WOFFIA SP, LEMMA SP. 86
3.1. Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Woffia sp 86
3.1.1. Xác định chủ
ng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W. australiana 86
3.1.2. Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không 87
3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy 88
3.1.4. Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy 89
3.1.5. Đánh giá mức độ ảnh hưởng của kháng sinh Geneticin và Paromycine đến khả năng

gây chết bèo tấm Woffia australiana 90
3.2. Xây dựng qui trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Lemna 92
3.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens 92
3.2.2. Xây d
ựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng súng bắn gen 99
4. CHUYỂN GEN VỎ VIRUS GUMBORO VÀO WOLFFIA/LEMNA 104
4.1. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Wolffia australiana 104
4.2. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Lemna 106
4.2.1. Chuyển gen nguyên cây bèo LA 106
4.2.2. Tạo callus và vật liệu chuyển gen 107
4.2.3 Chuyển gen VP2 vào callus dạng I và dạng II 108
5. PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN 109
THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM CHUYỂN GEN TRÊN GIA CẦM 109
5.1. Phân tích đánh giá cây chuyển gen 109
5.1.1. Đánh giá biểu hiện gen gus trong các dòng bèo tấm chuyển gen 110
5.1.2. Tách chiết và kiểm tra ADN tổng số của bèo tấm 111
5.1.3. Phân tích PCR các dòng bèo tấm chuyển gen VP2 111
5.1.4. Phân tích lai Southern 113
5.1.5. Xác định protein trong bèo tấm chuyển gen 113
5.2. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm 116
5.2.1. Thu mẫu huyết thanh gà 116
5.2.2. Phát hiện kháng thể kháng protein VP2 bằng ELISA 117
CHƯƠNG 4: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 121
4.1. Dạng sản phẩm kết quả tạo ra 121
4.2. Kết quả về khoa học 121
4.3. Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng 122
4.4. Trình độ công nghệ 122
4.5. Khả năng áp dụng 123
4.6. Nhu cầu kinh tế, xã hội và

địa chỉ áp dụng 123
4.7. Đào tạo 123
4.8. Sản phẩm khoa học của đề tài 124
4.9. Hợp tác quốc tế 124
4.10. Tình hình sử dụng kinh phí 124
4.11. Danh sách các công trình công bố 125
4.12. Hạn chế của đề tài 125
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 126
5.1. Kết luận 126
5.2. Đề nghị 126
TÀI LIỆU THAM KHẢO 128
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài


DANH MC HèNH

Trang
Hỡnh 1.1. Vũng sinh sn vụ tớnh ca L. aequinoctialis (Landolt, 1986)
9
Hỡnh 1.2. Hoa ca L.A
10
Hỡnh 1.3. Bốo tm W. australiana nuụi trờn a thch 12
Hỡnh 1.4. Cu trỳc pPAMksGFP 15
Hỡnh 1.5. Cu trỳc Ti plasmid dng octopine 19
Hỡnh 1.6. C ch lõy nhim ca A. tumefaciens vo t bo thc vt 21
Hỡnh 1.7. S cu trỳc h vector nh th 22
Hỡnh 1.8. S cu trỳc vector liờn hp 22
Hỡnh 2.1. Bốo tm W. australiana No. 7540 33
Hỡnh 2.2. Bốo tm Lemna aequinoctialis 33
Hỡnh 2.3: Cu trỳc ca vector nh phõn pBIN GUS-int 34

Hỡnh 2.4: Vector nh phõn pCAMBIA1301 34
Hỡnh 2.5: Cu trỳc Vector pPAM-VP2 34
Hỡnh 3.1. Kt qu
sn phm PCR 58
Hỡnh 3.2. Kt qu bin np gen mó hoỏ protein VP2 vo InV F
59
Hỡnh 3.3. Kt qu tỏch chit ADN plasmid 60
Hỡnh 3.4. Kt qu kim tra cỏc dũng ADN plasmid sau khi x lớ bng EcoRI 61
Hỡnh 3. 5. Trỡnh t nucleotit ca on ADN tỏch dũng mang gen VP2 63
Hỡnh 3.6. Phõn ct gen VP2 v vect pPAMksGFP vi enzym ct gii hn. 64
Hỡnh 3.7. Thit k plasmid pPAM- VP2 65
Hỡnh 3.8. Xỏc nh s cú mt ca gen VP2 trong chng Agrocaterium GV3101pMp90 65
Hỡnh 3.9. Mt s hỡnh nh bốo tm LA tỏi sinh sau kh trựng 70
Hỡnh 3.10. Bốo nhõn trờn mụi trng H/5 + 1,5% sucrose, pH=6,0 74
Hỡnh 3.11. Callus to c trờn nn N6/2 vi k
t hp 2,4D +BAP 75
Hỡnh 3.12. Mụ callus dng II 76
Hỡnh 3.13. To callus dng I t callus dng II 81
Hỡnh 3.14. Nhõn callus dng I trờn mụi trng cú 2,0 mg/l 2,4D + 6,0 mg/l BAP 82
Hỡnh 3.15. Tỏi sinh cõy t callus dng II 82
Hỡnh 3.16. Bốo tỏi sinh t callus dng I trờn mụi trng khụng cú cht HST 83
Hỡnh 3.17. Tỏi sinh bốo t callus dng I 85
Hỡnh 3.18. Kt qu thớ nghim th chng VK W. australiana 87
Hỡnh 3.19. Xỏc nh thi gian ly tõm chõn khụng thớch hp 87
Hỡnh 3.20: nh hng ca mt VK v thi gian ng nuụi cy 88
Hỡnh 3.21: Kt qu thi nghim thi gian ng nuụi cy v m
t VK ln 2 89
Hỡnh 3.22: ỏnh giỏ nh hng ca mụi trng ng nuụi cy 90
Hỡnh 3.23: nh hng ca geneticin n kh nng sng ca W. australiana 91
Hỡnh 3.24: nh hng ca Paramomycin n kh nng sng ca W. australiana 92

Hỡnh 3.25. Biu hin tm ti ca gen GUS trờn bốo tm vi cỏc chng khỏc nhau 93
Hỡnh 3.26. nh hng ca kanamycin ti bốo LA 97
Hỡnh 3.27. nh hng ca hygromycin ti bốo LA 98
Hỡnh 3.28. nh hng c
a hygromycin ti bốo LA 99
Hỡnh 3.29. Sng lc cõy bốo tm chuyn gen trờn mụi trng chn lc 106
Hỡnh 3.30: Cỏnh bốo trờn mụi trng dit khun 107
Hỡnh 3.31: Kt qu chn lc nguyờn cỏnh LA trờn mụi trng b sung hygromycin, geneticin 107
Hỡnh 3.32. Callus dng I (A); callus dng II (B) 108
Hỡnh 3.33: Mu callus dng I LA trờn mụi trng dit khun 108
Hỡnh 3.34 : Callus dng II ang tỏi sinh 109
Hỡnh 3.35: Cỏnh bốo chuyn gen callus dng II lot thớ nghim s 12 109
Hỡnh 3.36: Cỏnh bốo chuyn gen callus dng II lot thớ nghim s 25 109
Hỡnh 3.37: Biu hin gen gus cỏnh bốo tm W. australiana (1); W. globosa (2) v bốo LA (3)
chuy
n gen sau chn lc
110
Hinh 3.38. Kt qu phõn tớch PCR gen gus cỏc dũng bốo tm chuyn gen 111
Hỡnh 3.39. Kt qu phõn tớch PCR cỏc dũng Lemna aequinoctialis chuyn gen 112
Hỡnh 3.40 Kt qu phõn tớch PCR cỏc dũng Wolffia australiana chuyn gen 112
Hỡnh 3.41. Kt qu lai DNA ca cỏc dũng bốo tm chuyn gen VP2 113
Hỡnh 3.42. Kt qu phõn tớch ELISA 6 dũng bốo tm chuyn gen VP2 116
Hỡnh 3.43: Mụ t thớ nghim th kh nng gõy ỏp ng min dch ca bốo tm chuyn gen trờn g 120

Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài


DANH MC BNG
Trang
Bng 1.1.Thnh phn v hm lng cỏc hp cht hu c cú trong cỏnh bốo

8
Bng 2.1. Trỡnh t cỏc on mi s dng trong nghiờn cu
51
Bng 3.1: nh hng ca hm lng khoỏng khỏc nhau n kh nng sinh trng ca W. australiana
66
Bng 3.2: Nghiờn cu kh nng sinh trng v phỏt trin ca W. australiana trong cỏc iu kin nuụi
khỏc nhau
67
Bng 3.3: nh hng ca pH n sinh trng ca W. australiana
68
Bng 3.4: To ngun vt liu khi u in vitro
69
Bng 3.5. Hiu qu kh trựng ca cỏc loi hoỏ cht khỏc nhau 70
Bng 3.6. nh hng ca hm lng khoỏng Hutner ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 71
Bng 3.7. nh hng ca pH mụi trng nuụi ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 72
Bng 3.8. nh hng ca sucrose ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 73
Bng 3.9. nh hng ca cỏc nn khoỏng v cht i
u ho sinh trng khỏc nhau n s to callus 75
Bng 3.10. nh hng ca hm lng khoỏng trong mụi trng N6 n hiu qu to callus 76
Bng 3.11. nh hng ca 2,4D v BAP n hiu qu to callus (%) 77
Bng 3.12. nh hng ca hm lng ng (g/l) n t l to callus 78
Bng 3.13. nh hng ca hm lng CH n s hỡnh thnh callus 79
Bng 3.14. Kt qu to callus trờn cỏc mụi trng cú pH khỏc nhau 79
Bng 3.15. Kt qu
to callus dng I t dng II 80
Bng 3.16. nh hng ca cỏc cht iu ho sinh trng n cht lng callus 81
Bng 3.17. Kt qu tỏi sinh callus dng II 82
Bng 3.18. Hiu qu tỏi sinh cỏc cụng thc cú hm lng BAP khỏc nhau 83
Bng 3.19. nh hng ca IAA v kinetin ti kh nng tỏi sinh cỏnh bốo 84
Bng 3.20. nh hng ca CH ti kh nng tỏi sinh cõy bốo t callus 85

Bng 3.21: Kt qu kho sỏt chng vi khun thớch hp cho chuy
n gen vo W. australiana 86
Bng 3.22: Kt qu thớ nghim kho sỏt thi gian ly tõm hỳt chõn khụng 87
Bng 3.23. nh hng ca mt vi khun v thi gian ng nuụi cy
88
Bng 3.24. nh hng ca mt vi khun v thi gian ng nuụi cy
89
Bng 3.25. nh hng ca mụi trng ng nuụi cy
89
Bng 3.26: Kt qu thớ nghim vi geneticin 91
Bng 3.27: Kt qu thớ nghim v
i paromomycin 91
Bng 3.28. Biu hin tm thi ca gen GUS trờn mu bốo vi cỏc chng vi khun khỏc nhau 93
Bng 3.29. T l biu hin tm thi ca cỏc bin phỏp tng cng tip xỳc (%) 94
Bng 3.30. nh hng ca thi gian hỳt chõn khụng ti biu hin tm thi 94
Bng 3.31. nh hng ca mt vi khun ti biu hin tm thi 95
Bng 3.32. nh hng c
a AS ti t l biu hin tm thi ca gen GUS trờn mu bốo 96
Bng 3.33. nh hng ca kanamycin ti h s nhõn v sc sng bốo tm LA 96
Bng 3.34. nh hng ca hygromycin ti h s nhõn v sc sng bốo tm LA 97
Bng 3.35. nh hng ca geneticin ti h s nhõn v sc sng bốo tm LA 99
Bng 3.36. nh hng ca tui mu n biu hi
n tm thi ca gen gus bốo nguyờn cõy. 100
Bng 3.37. nh hng ca tui mu n biu hin tm thi ca gen gus callus bốo tm. 100
Bng 3.38. nh hng ca khong cỏch bn v ỏp lc khớ n biu hin gen tm thi ca gen gus
bốo nguyờn cõy
101
Bng 3.39. nh hng ca khong cỏch bn v ỏp lc khớ n biu hin gen tm thi ca gen gus
callus.
101

B
ng 3.40. nh hng ca x lý ỏp sut thm thu n biu hin gen gus tm thi bốo nguyờn cõy 102
Bng 3.41. nh hng ca x lý ỏp sut thm thu n biu hin gen gus tm thi callus 102
Bng 3.42. nh hng hm lng ht vng n biu hin tm thi ca gen gus bốo nguyờn cõy 103
Bng 3.43. nh hng hm lng ht vng n biu hin tm th
i ca gen gus callus 103
Bng 3.44. Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen VP2 vo bốo tm Wolffia australiana 105
Bng 3.45. Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen VP2 vo bốo tm L.aequinoctialis 106
Bng 3.46: Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen ch th vo bốo tm LA v W. australiana 110
Bng 3.47. Xỏc nh protein tng s trong dch chit bốo tm chuyn gen 114
Bng 3.48. Kt qu phõn tớch ELISA 6 dũng bốo tm chuyn gen VP2 115
Bng 3.49. Danh sỏch cỏc mu huyt thanh g thu c 116
Bng 3.50: Kt qu xột nghi
m ELISA trờn cỏc mu huyt thanh g ó c gõy ỏp ng min dch 117
Bng 3.51: Kt qu xột nghim ELISA dng tớnh ca cỏc mu huyt thanh g ó c gõy ỏp ng
min dch
118
Bng 3.52: ỏnh giỏ mc to khỏng th khỏng protein VP2 trong cỏc mu huyt thanh ca g n bốo
tm chuyn gen
119
.

1
DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI

TT Họ và tên Cơ quan công tác
A
Chủ nhiệm đề tài
PGS.TS. Lê Huy Hàm
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông
nghiệp
B
Cán bộ tham gia nghiên cứu

1
ThS. Trần Duy Dương
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
tế bào thực vật, Viện Di truyền nông
nghiệp
2 Th.S. Vũ Văn Tiến nt
3 TS. Phạm Thị Lý Thu nt
4 TS. Nguyễn Thị Khánh Vân nt
5 PGS. TS. Lê Thanh Hoà
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam
6 PGS. TS. Đinh Duy Kháng
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam
7 PGS. TS. Đỗ Năng Vịnh
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
tế bào thực vật, Viện Di truyền nông
nghiệp
8 CN. Trịnh Thị Minh Thuỳ
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
tế bào thực vật, Viện Di truyền nông
nghiệp

2
BÀI TÓM TẮT
Hiện nay số lượng các tác nhân gây bệnh cho người và gia súc gia cầm ngày càng
tăng, hiện tượng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con người phải
ưu tiên quan tâm trước hết đến các phương pháp phòng bệnh. Việc phòng bệnh bằng
vaccine đã trở thành hoạt động quan trọng và là mục tiêu hàng đầu của ngành y tế và
thú y của các nước. Đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, do giá thành vaccine
cao, ngành chăn nuôi tại các nướ
c đang phát triển gặp nhiều rủi ro hơn nhiều so với các
nước phát triển. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới, với giá thành
hạ là một trong những tìm kiếm sôi động trên thế giới những năm gần đây.
Các nghiên cứu trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của
vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, không nh
ững
góp phần giảm giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới của việc ứng
dụng CNSH thực vật trong nông nghiệp và y học. Trong các loài thực vật được nghiên
cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đang
được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: có tốc độ nhân vô tính rất nhanh, có hàm
lượng các chất dinh dưỡng cao, rất dễ nuôi trồng, không cần các điều kiệ
n đặc biệt như:
bảo quản lạnh, chế độ vô trùng Do các đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuất
vaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa hẹn nhiều triển vọng.
Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp
bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/
Wolffia sp.)“, được thực hiện trên cơ sở hợp tác khoa họ
c với Viện Sinh lý phân tử và
Công nghệ sinh học, ĐHTH Bonn (CHLB Đức) là một trong những cố gắng góp phần
giải quyết các vấn đề trên để tiến tới ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền vào việc
sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chăn nuôi thú y và bảo vệ sức khoẻ
con người.

Mục tiêu của đề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn đề
sau: i)
Chuyển thành công gen mã hoá virus gumboro VP2 vào bèo tấm; ii) Đánh giá được
khả năng tạo miễn dịch khi cho gia cầm ăn bèo tấm có protein trên.
Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu và thu được những kết quả
chính như sau:
• Thiết kế vector mang gen vỏ protein virus gumboro biểu hiện ở thực vật
Thu thập đánh giá các nguồn gen protein vỏ virus gumboro ở Việt Nam. Thiết kế
vector pPAM-VP2 mang gen VP2 biểu hiện ở thực v
ật.

3
• Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm (Lemna sp.; Wolffia sp.)
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã được áp dụng để xây dựng và hoàn thiện phương
pháp tạo callus và tái sinh cây ở các loài bèo tấm Wolffia sp. và Lemna sp. Một số
đặc điểm sinh học cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tạo
callus và tái sinh cây đã được tối ưu.
• Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hi
ệu quả cao vào bèo tấm (Lemna/Wolffia)
Quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây Lemna sp. và Wolfia sp. bằng súng
bắn gen và thông qua Agrobacterium đã được xây dựng và cải thiện trên cơ sở tối
ưu hoá các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình biến nạp: chủng vi khuẩn, nồng độ
AS, thời gian đồng nuôi cấy
• Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia/ Lemna
Các thí nghiệm chuyển gen VP2 đã được thực hiện trên loài bèo tấm Wolffia
australina và Lemna aequinoctialis. Các dòng bèo tấm chuyển gen đ
ã được duy trì
và nhân sinh khối trên môi trường có bổ sung tác nhân chọn lọc.
• Phân tích cây chuyển gen. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm
Sự có mặt của gen chuyển trong các dòng bèo tấm chuyển gen đã được phân tích

bằng các phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southern). Đã nhận được 06 dòng
bèo tấm Wolffia australiana chuyển gen VP2. Protein VP2 đã được tách chiết từ
các dòng bèo tấm chuyển gen. Thử nghiệm bước đầu cho thấy 01 dòng bèo tấm
chuyển gen có khả n
ăng gây đáp ứng miễn dịch trên gà.
Phía đối tác (CHLB Đức) Viện Sinh lý phân tử và công nghệ sinh học thực vật (Đại
học tổng hợp Bonn) đã thực hiện các nghiên cứu trên đối tượng cây thông (Larich
desidue) và đã thu được kết quả sau: i) Đã nghiên cứu tạo huyền phù, xác định các điều
kiện tạo huyền phù và nhân nhanh tế bào thông; ii) Tối ưu hoá quy trình chuyển gen
vào Larich desidue thông qua Agrobacterium; iii) Chuyển gen kháng virus Gumboro
VP2 vào mô sẹo và đánh giá giá biể
u hiện của protein VP2 ở các dòng thông chuyển
gen.
Nói tóm lại, đề tài đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và thu được
những kết quả rất khả quan. Các kết quả nghiên cứu đạt được mang tính khoa học và
thực tiễn cao. Thành công của đề tài là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vaccine kháng
Gumboro giá rẻ dùng trong chăn nuôi gia cầm và xa hơn là sản xuất các hoạt chất sinh
học khác cho nông nghiệp và y học bằng kỹ thu
ật di truyền thực vật.

4

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid
2iP: 6-(ó,ó-Dimethylallylamino) Purin
AS: acetosyringone
BAP: 6-Benzyl Amino Purin
bp: base pair
CaMV35S- P: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter

CH: Casein Hydrolysate
cs: cộng sự
CTAB: Cetyltrimeethylammonium bromide
DNA: Deoxy ribo-Nucleic Acid
ĐC: Đối chứng
EC: Embryogenic Callus: mô sẹo phôi hoá
EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetace Acid
Et-Br: Ethidium Bromide
GMC: Cây trồng chuyển gen
GMO: Sinh vật chuyển gen
gus: β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase
IAA: Indol-3-Acetic Acid
IBA: Indol -3-Butyric Acid
Kbp: Kilobase
Km: Kanamycine
KTST: Kích thích sinh trưởng
LA: Lemna aequinoctialis
LB: Luria and Bertani
MCS: Multi-Cloning Site
MS: Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog (1962)
NAA: ỏ-Naphthalenacetic Acid
NOS: Nopaline Synthetase
NOS-P: Nopaline Synthetase Promotor
nptII: Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase
OD
600
: Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer của
hãng Beckman Coulter
PCR: Polymerase Chain Reaction
T-DNA: transferred-DNA = DNA chuyển

TDZ: Thidiazuron
Ti- Plasmid: Tumor inducing plasmid= plasmid gây khối u thực vật
X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid



5
LỜI MỞ ĐẦU
Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong
lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống
cây trồng chuyển gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chống chịu sâu, bệnh,
kháng thuốc diệt cỏ Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đã đạt 125
triệu ha. Một loạt các giống cây tr
ồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn,
mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng
cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học đã
được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (Jame, 2008).
Sự phát triển hứa hẹn sáng s
ủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây
chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa
bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng
thể, interferon, vaccine (Mason et al, 1998).
Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau
của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động v
ật bậc cao, vi khuẩn, nấm men
Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược
điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm
men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất
protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ s
ử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh

có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật
có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Vaccine do thực vật sản xuất ra
thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật"
(Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết
hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể
được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa
vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dịch
toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003). Ý tưởng sử dụng thực vật làm
hệ thống sản xu
ất vaccine uống (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của
nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết
quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003).
Bệnh Gumboro là bệnh viêm túi bạch huyết nhiễm trùng (Infectiuous Bursal
Disease -IBD) cấp tính do virus gây ra ở gà, chủ yếu là ở gà 2-6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết
và khả năng lây lan cao ở gà con. Tỷ lệ chết cao còn là hậu quả của suy giảm miễn dịch
do virus gây ra và sự liên - tạp nhi
ễm các bệnh khác. Cũng do bị suy giảm miễn dịch,
mọi chương trình vaccine phòng chống một số bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm cũng bị

6
ảnh hưởng, gây thiệt hại kinh tế lớn đối với gà nuôi công nghiệp (Lê Thanh Hoà, 1992;
Nguyễn Tiến Dũng, 1996; Lê Thanh Hoà, 2003).
Cấu trúc kháng nguyên của IBDV tập trung ở phần vỏ capsit. Chúng có cấu trúc
protein là VP1, VP2, VP3 và VP4. Sự khác nhau về tính kháng nguyên của các typ
virus là do cấu trúc protein của vỏ capsit quyết định. Kibenge F.S và cộng sự (1988) đã
thông báo rằng VP2 và VP3 là hai thành phần chủ yếu của virus Gumboro, chiếm 57%
và 34%. Trong khi VP1 và VP4 chỉ là protein phụ. VP1 chỉ chiếm 3% còn VP4 chỉ
chiếm 6%. VP2 là protein vỏ của virus IBD, được mã hoá bởi đ
oạn gen có độ dài
khoảng 1.300 nucleotide. VP2 có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’

và 3’ và thành phần amino acid, nhưng lại có một vùng khoảng gần 500 nucleotide ở
chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác nhau, nên được gọi là vùng “siêu
biến đổi”. Vùng này quyết định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy,
được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc
Gumboro (Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Jackwood và cs, 2008).
Xuấ
t phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền
Nông nghiệp đã được Bộ Khoa học Công nghệ cho phép thực hiện đề tài “Nghiên cứu
sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền
trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)”. Đây là một
trong những đề tài thuộc chương trình hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và
CHLB Đức, đề tài vừ
a có định hướng ứng dụng lại vừa có ý nghĩa tiếp thu công nghệ,
xây dựng tiềm lực tiến tới làm chủ lĩnh vực công nghệ ADN tái tổ hợp.

7
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1. Tổng quan về bèo tấm
1.1.1. Cây phân loại bèo tấm
Theo Landolt (1986), bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp
Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae, chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Wolffiella với
trên 40 loài khác nhau.
Les và cộng sự, 2002 đã dựa trên đặc điểm về hình thái, nhiễm sắc thể và vi
phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm gồm có
5 chi t
ức là thêm một chi mới là Landoltia (Les và cs, 2002).
Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, 2004 dựa trên sự so sánh
trình tự đoạn intron nằm giữa locus trnL và trnF của bộ gen lục lạp đã xác định rằng họ
Lemnaceae và Pistia cùng thuộc họ ráy Araceae (Rothwell và cs, 2004).

1.1.2. Phân bố của bèo tấm
Bèo tấm phân bố khắp thế giới trừ vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá
lạnh. Vùng sa mạc và vùng đất r
ất ẩm ướt thì khá hiếm. Trong 4 chi bèo tấm thì 3 chi
(Spirodela, Lemna, Wolffia) được phân bố khắp thế giới, Wolffiella ít có ở châu Mĩ và
châu Phi. Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ. Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở
Bắc Mĩ và Đông Nam Á. Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng ven nhiệt đới của châu Mĩ
và châu Phi. Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mĩ, Đông Nam Á và châu Úc.
L. aequinoctialis được phân bố r
ộng rãi ở các vùng ấm áp trên thế giới. Cùng
với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như Nam Âu,
vùng trung tâm Bắc Mĩ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…(Landolt, 1986).
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm
Hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao. Bèo tấm có chứa các
vitamin A, B1, B2 và các axit amin không thay thế, trừ methionin. Bèo tấm nuôi ở
điều kiện tối ưu là một trong số các loài thực vật có hàm lượ
ng protein tổng số đạt cao
nhất. Hầu hết các loài bèo có hàm lượng protein đạt từ 6,8-45% phụ thuộc chủ yếu vào
điều kiện nuôi cấy (Landolt và Kandeler, 1987).
Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh sáng,
nhiệt độ, thành phần và hàm lượng khoáng chất trong môi trường nuôi (đặc biệt là
nitơ). Hàm lượng protein và các thành phần hữu cơ khác có trong cánh bèo được liệt kê
ở bảng 2.5 (Landolt và Kandeler, 1987).


8
Bảng 1.1.Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo
Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng khô)
Proteins 6,8 – 45
Lipids 1,8 - 9,2

Sợi thô 5,7 - 16,2
Đường 14,1 - 43,6
Tro 12,0 - 27,6

Bèo sinh trưởng trong điều kiện tối ưu về dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy
thì hàm lượng protein có thể đạt tới 45% trọng lượng chất khô (Leng và cs, 1994).
Hàm lượng protein này rất cao so với các loài thực vật khác và tương đương với hàm
lượng protein có trong đậu tương
1.1.4. Đặc điểm sinh học
1.1.4.1. Khái niệm cơ bản về cánh bèo
Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là “frond” (cánh bèo), là
một tậ
p hợp của các mô có sự biệt hoá hạn chế. Mức độ tổ chức của mô cánh bèo trong
họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella và Wolffia (Landolt, 1986).
1.1.4.2. Hình dạng và kích thước cánh bèo
Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số loài có cánh không dẹt do có
xoang khí lớn. Cánh bèo có hình ovan (hay tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm (S.
polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối ưu.
Ở điều ki
ện thường có thể nhỏ hơn 1 mm.
Kích thước và hình dạng của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên
ngoài và kiểu gen của chúng. Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng
đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ (Landolt, 1986).
1.1.4.3.Hình thức sinh sản của bèo tấm
Bèo tấm có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính. Hình thức sinh sản hữu tính của
bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất thuận để bảo tồn nòi giống (Landolt,
1986; Landolt và Kandeler, 1987).
*Sinh sản vô tính

9

Hình 1.1. Vòng sinh sản vô tính của L. aequinoctialis (Landolt, 1986)
Fo cánh mẹ a cánh con đầu tiên
F1 cánh con thế hệ thứ nhất b cánh con thứ hai
F2 cánh con thế hệ thứ 2 + cạnh dương của
cánh
F
2+a (1-a)
cánh con đầu tiên của cạnh dương của thế hệ thứ hai
phát sinh từ cánh đầu tiên ở cạnh âm của thế hệ đầu tiên
- cạnh âm của cánh
Các loài bèo sinh trưởng bằng phương thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinh
nằm trong xoang ở vùng gốc cánh. Ở điều kiện tối ưu tốc độ sinh sản vô tính của bèo
tấm gần đạt mức tăng theo hàm số mũ. Lượng cánh có thể tăng lên gấp đôi chỉ sau 24
giờ nuôi cấy ở các loài sinh trưởng nhanh như L. aequinoctialis, W. microscopica (xem
hình 1.1).
+ Vòng đời của cánh bèo
Với hình thức sinh sản vô tính, thời gian m
ột vòng đời của cánh bèo chỉ vài
tuần. Theo nhiều tác giả cho biết vòng đời của một cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt độ
nuôi, ở 30
o
C, vòng đời giảm còn một nửa so với ở 20
o
C. Trong giai đoạn ngủ nghỉ và ở
nhiệt độ thấp, cánh bèo có thể tồn tại trong vài tháng. Điều kiện dinh dưỡng cũng có
thể ảnh hưởng tới vòng đời. Lượng dinh dưỡng không đủ có thể làm cánh bèo già hoá
nhanh và chết chỉ sau 1 đến 2 tuần. Nói chung, vòng đời của một cánh bèo sẽ dài hơn
nếu tốc độ nhân cánh thấp hơn. Khi nồng độ dinh dưỡng giảm dưới ngưỡng tối thiểu

thì cánh bèo b
ị tổn thương và chết nhanh hơn bình thường (Landolt, 1986).
*Sinh sản hữu tính



10
+Ra hoa








+ Quả và hạt
Khoảng 2 - 5 tuần sau khi thụ tinh thì quả chín. Mỗi quả có lá bao khô và
thường có 1 hạt. Ở hầu hết các loài quả gần như đối xứng ngoại trừ L. valdiviana và L.
perpusilla. Quả dài từ 0,35 mm – 2,75 mm. Hạt bèo tấm có dạng hình trứng với 1 vảy
đen ở đỉnh. Khi quả có nhiều hơn 1 hạt thì quả có dạng hình trứng hoặc tam giác. Kích
thước hạt bi
ến đổi trong cùng 1 loài và giữa các loài từ 0,3 - 2 mm về chiều dài và 0,2 -
0,8 mm về đường kính. Hạt có vỏ hạt ngoài và vỏ trong, nội nhũ và phôi. Vỏ ngoài
gồm 2 - 11 lớp tế bào của biểu bì ngoài, ở đỉnh có nhiều lớp tế bào hơn ở giữa và cuối
hạt (Landolt, 1986).
1.1.4.4. Đặc điểm sinh học của Wolffia australiana
W. australiana là loài thực vật hạt kín có hoa nhỏ bé nhất. Chúng không có rễ,
cây dạng hình trứng hoặc hình elip, có chiều dài từ 0,4 mm đến 0,9 mm. Chúng s
ống

trôi nổi trên mặt nước, rất khó để quan sát được hoa của chúng. Hoa của W. australiana
được bao bọc trong một cái bao, phát triển bên trên thân của cây chứa một nhị hoa và
một nhụy đơn không có đài hoa và những cánh hoa. Hạt phấn có gai, những phần nhô
lên mặt nước được bao trùm lại. Ở giữa những tế bào được bao bọc bởi một lớp lục lạp,
nhờ đó chúng nổi lên mặt nước.
Ưu đ
iểm của W. australiana so với các loài thực vật khác
- W. australiana có thể sản xuất từ 6,8% đến 45% protein tính trên trọng lượng
khô. Protein của bèo tấm có hầu hết các amino acid không thay thế. Ngoài ra W.
australiana có các loại vitamine: A, B1, B2, B6, E
- Thời gian nhân đôi 24-48h tuỳ theo điều kiện nuôi trồng. Có thể sản xuất sinh
khối lớn trong thời gian rất ngắn.
- Dễ nuôi trồng, chỉ cần nước, ánh sáng, CO và muối khoáng.
- Cây tự thụ, không tạo phấn đảm b
ảo tốt các điều kiện về an toàn sinh học cho
Các cơ quan ra hoa ở bèo tấm LA gồm các
thành phần: 1 lá bắc, 2 nhị, 1 nhuỵ, hiếm khi có 3
nhị (hình 1.2). Ở Spirodela và Lemna, các cơ quan
của hoa phát sinh trong xoang phát sinh cánh con. Ở
Wolffiella và Wolffia, hoa phát sinh trong 1 xoang ở
bề mặt trên của cánh và không ở cùng xoang phát
sinh cánh con. Hoa của Wolffia nằm dọc theo đường
trung tâm cánh. Hoa của Wolffia nằm ở cạnh đường
trung tâm của cánh (Landolt, 1986).
Hình 1.2. Hoa của L.A
St: nhị; Pi: Nhuỵ; Pe: lá bắc
(Landolt, 1986)

11
cây biến đổi gen.

- Cải tạo môi trường nước, đặc biệt nó còn làm giảm sự phát triển của muỗi
Anopheles.
- W. australiana là hệ thống mới cho sản xuất các loại vacxin và những kháng
thể đơn.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng phát triển W. australiana
Cũng giống như các loài cây khác,nhiệt độ, môi trường, ánh sáng, chất dinh
dưỡng, độ pH là các yếu tố tác động lên sinh trưởng và phát triển của W. australiana.
W australiana có th
ể sinh trưởng trong các ao hồ, các môi trường nước nhân
tạo, các bình nuôi. Việc thay nước thường xuyên là rất quan trọng, tránh được sự mất
nước do bay hơi. W. australiana cần được nuôi trong môi trường sạch. Khi lấy bèo từ
các ao hồ sẽ bị lẫn nhiều các sinh vật khác: vi khuẩn, nấm, tảo, vi sinh vật, thậm chí các
tế bào động vật rất nhỏ, những ấu trùng. Do đó phải làm sạch bèo trước khi nuôi bằng
cách chuyển các cá thể riêng l
ẻ vào môi trường nước sạch, việc này được làm hết sức
cẩn thận bởi các tế bào bèo rất dễ bị tổn thương.
Môi trường nuôi
Cây sinh trưởng và phát triển tốt hay không phụ thuộc rất nhiều vào môi trường
nuôi. Nhu cầu dinh dưỡng tối ưu cho các loài cây là không giống nhau, tuỳ thuộc vào
loài, giống, thậm chí các mô được lấy từ các cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể
sinh vật.
Cho đến nay người ta đã tìm ra nhiều lo
ại môi trường dinh dưỡng cơ bản như:
môi trường MS, môi trường Knop, môi trường B5. Trong đó, môi trường MS được sử
dụng cho nhiều loại cây trồng. Môi trường MS rất giàu thành phần khoáng đa lượng,
đặc biệt là nitrat và amonium. Tuy nhiên đối với một số loài thì hàm lượng khoáng MS
tỏ ra quá cao và có trường hợp gây độc cho mô nuôi cấy.
Vì thế, với mỗi đối tượng, ta cần tìm ra môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng
và phát triển của chúng. Riêng đối vớ
i W. australiana môi trường nuôi nhân tạo thường

dùng là H (Hutner)
Nguồn cacbon
Trong quá trình nuôi cấy cây chủ yếu hút chất dinh dưỡng từ môi trường. Nguồn
cacbon được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy thực vật là sucrose với nồng độ 1-8%,
glucose và fructose thường được sử dụng thay cho sucrose, còn các loại đường khác
như mantose, manose, lactose ít được dùng. Đối với W. globosa đường tốt nhất để
dùng cho nuôi cấy là sucrose với nồng độ 1%
Các muối khoáng
W. australiana sinh trưởng tốt
ở những nơi mà trong nước giàu chất khoáng, đặc

12
biệt là photpho và nitơ. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nitơ được sử dụng dưới
dạng muối: CaNO
3
; KNO
3
; NaNO
3
; NH
4
NO
3
. Photpho thường được dùng dưới dạng
Kaliphotphat (KH
2
PO
4
)
Nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu cho bèo sinh trưởng khoảng từ 20
0
- 30
0
C, ở nhiệt độ 35-40
0
C
ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng của bèo. Dưới nhiệt độ lạnh bèo hình thành
các chồi ngủ, vì thế bèo có thể sống qua mùa đông ở ao hồ dưới dạng những chồi ngủ.
Ánh sáng
Ánh sáng trực tiếp là điều kiện tự nhiên cho bèo, tuy nhiên, ánh sáng trự tiếp có
thể là một vấn đề nếu ta nuôi bèo trong một vật đựng nhỏ, ánh sáng sẽ làm nước tăng
nhiệt độ và bốc hơi làm cho cây chế
t. Chính vì vậy thay nước thường xuyên và tránh
mất nước là điều rất quan trọng.
Ánh sáng đèn huỳnh quang là loại ánh sáng dùng phổ biến nhất vì nó phát ra tia
hồng ngoại cung cấp đầy đủ ánh sáng cho quang hợp và cây sẽ không bị nóng lên.
Độ pH
Độ pH ảnh hưởng đến quá trình hút chất dinh dưỡng trong cây tương đối phức
tạp, ở các nồng độ pH khác nhau thì quá trình hút chất dinh dưỡng cũng khác nhau. W.
globosa có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH rộng, nhưng sống tố
t trong khoảng
pH=4,5 đến pH=7,5.

Hình 1.3. Bèo tấm W. australiana nuôi trên đĩa thạch
1.2.
Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm
Có rất ít các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh trên bèo tấm được công bố từ
trước tới nay. Theo các tài liệu mà chúng tôi có được từ năm 1978 Chang và Hsing đã
tạo được callus thành công trên L. aequinoctialis khi nuôi cấy các cánh trưởng thành

của L. aequinoctialis trong môi trường lỏng có chứa 10 mg/l 2,4 D. Callus được tạo ra
từ vùng mô phân sinh xung quanh điểm node phát sinh cánh sau 13 tuần nuôi cấy.
Trong thời gian nuôi cấy tiếp theo, hai ông chỉ tạo được dạng cấu trúc giống cánh có
màu xanh mà không có tiến triển nào tốt hơn sau đ
ó hai tháng (Chang và Hsing, 1978).

13
Trước đó, vào những năm 1976-1978 Chang và Chiu đã tạo thành công callus và tái
sinh cánh ở dòng bèo L.gibba G3 (Chang và Chiu, 1978). Mãi cho đến những năm
1997, 1998, một số nhà nghiên cứu thuộc đại học phía Bắc Bang Carolina phát triển
một hệ thống tái sinh thông qua callus ở L. gibba G3. Tuy nhiên kết quả cuối cùng mới
chỉ là dạng cấu trúc giống cánh màu xanh hoặc là dạng nốt sần màu xanh (Moon và
Stomp, 1997).
Một quy trình tái sinh được xây dựng trên L.minor L đã được công bố năm 2002,
trong đó callus đượ
c tạo ra với tỷ lệ 89.11% khi cấy từ mẫu cánh bèo L. minor (4 loại
mẫu: toàn cánh trưởng thành; cánh bị tổn thương do cắt; nửa cánh; mẫu rễ xấp xỉ 1cm)
trên môi trường có bổ sung 45 mM 2,4 D. Cánh tái sinh từ callus thu được trên môi
trường tái sinh có 22mM IAA và 4,0 mM Kinetin. Tỷ lệ tái sinh đạt 100%, cánh tái
sinh thu được khi chuyển lên môi trường nhân cánh đã nhanh chóng tạo ra cánh bình
thường (Stefaniak và cs, 2002).
Li và cộng sự, 2004 đã xây dựng hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và chi tiết trên các
loài bèo Spirodela oligorrhiza, Spirodela punctata, Lemna gibba var Hurfeish. Báo cáo
này đ
ã phân tích ảnh hưởng của các loại đường và các chất KTST tới giai đoạn tạo
callus (Li và cs, 2004). Các auxin sử dụng gồm có dicamba, PCA, NAA, 2,4 D. Các
cytokinin gồm có TDZ, BA, 2iP, zeatin. Các loại đường gồm có galactose, sorbitol,
maltose, sucrose, mannitol. Các chất KTST, đường và hàm lượng của chúng được sử
dụng khác nhau ở các giai đoạn khác nhau trong hệ thống tái sinh và ở mỗi loài bèo (Li
và cs, 2004).

1.3. Nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp.
1.3.1. Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật
1.3.1.1. Vectơ tách dòng

Để tách dòng một đoạn ADN, đoạn đó cần phải được đính vào vectơ tách dòng.
Có nhiều loại vectơ: plasmid, phage, cosmid, YAC… Người ta chọn sử dụng vectơ dựa
vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đích tạo dòng. Một vectơ được sử
dụng cho mục đích tách dòng cần có những đặc điểm sau đây:
• Vectơ phải có khả năng sao chép tích cự
c trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào
sự sao chép hệ gen tế bào chủ.
• Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng ADN
tối đa. Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ dàng xâm nhập vào tế
bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và đạt hiệu quả.
• Vectơ phải có các đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa
vectơ, các đặc tính này được mã hoá bởi các gen ch
ọn lọc. Thông thường đó là

14
các đặc tính kháng kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vectơ sống được trên môi
trường có chất kháng sinh chọn lọc, hoặc có khả năng sản sinh một enzyme
chuyển hoá một cơ chất tạo mầu, dễ dàng phát hiện trên môi trường thạch.
• Vectơ phải tồn tại được trong vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn
nhất cho tế bào chủ.
• Vectơ phải mang những vị trí nhận biết duy nhất củ
a một số lượng tối đa
enzyme giới hạn. Điều này mở rộng khả năng xây dựng các vectơ tái tổ hợp.
Hơn nữa các vị trí nhận biết này thường đặt vào giữa các gen chọn lọc. Nhờ vậy
mà khi trình tự ADN gắn xen vào một vị trí cũng sẽ gắn xen vào chính giữa gen
và làm bất hoạt gen đấy. Cho đến nay đã có nhiều thế hệ plasmid khác nhau ra

đời, thế hệ sau là c
ải tiến của thế hệ trước và ngày càng mang nhiều đặc tính quý
báu cho việc tạo dòng.
Trong số các loại vectơ hiện nay thì plasmid được sử dụng rộng rãi nhất. Về chức
năng, người ta chia vectơ thành hai loại lớn là vectơ nhân dòng (cloning vector) và
vectơ biểu hiện (expression vector).
Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vectơ pCR
đ
2.1 để tách dòng và
vectơ
pPAMksGFP để biểu hiện đoạn gen VP2 của virus gumboro
Vectơ pCR
đ
2.1
Để tách dòng và xác định trình tự gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro
chúng tôi sử dụng vectơ pCR
đ
2.1 của hãng Introgen làm vectơ tách dòng. Đây là một
trong các vectơ có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật
là có thể gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu
dính, mỗi đầu có một base Thymine. Vectơ pCR
đ
2.1 có kích thước 3,9 kb, được thiết
kế có gắn một operon chuyển hoá đường lactose là operon-lac. Tại vùng ranh giới giữa
promoter của operon này là gen cấu trúc mã hoá cho
β
- galactosidase có vùng cắt đa vị
(
multiple cloning site (MCS) – vùng nhân dòng đa điểm cắt) với 17 vị trí cắt cho các
enzyme giới hạn: EcoR I, Hind III, Nsi I, Kpn I, Sac I, BamH I, Spe I, BstX I, EcoR V,

Not I, Ava I, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I. Trong đó EcoR I, BstX I có hai vị trí cắt, các
enzyme còn lại chỉ có một vị trí cắt. Với vị trí của vùng MCS như vậy, sản phẩm
β
-
galactosidase có thể được tạo ra (nếu vectơ không được đính đoạn ngoại lai) hoặc
không được tạo ra (nếu vectơ được đính đoạn ngoại lai). Dựa vào dấu chuẩn đó, người
ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vectơ tái tổ hợp với tần suất cao. Ngoài ra,
vectơ pCR
đ
2.1 có chứa gen kháng kháng sinh là Ampicillin và Kanamycin, nhờ đó có
thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa Ampicillin và Kanamycin với

15
nồng độ ức chế tối thiểu. Phần trình tự trên biểu thị vectơ pCR
đ
2.1 được đính kèm sản
phẩm PCR bởi liên kết TA.
1.1.3.2. Vectơ biểu hiện
Để có thể thu nhận protein tái tổ hợp thì gen mã hoá cho protein phải được gắn
vào vectơ biểu hiện. Có rất nhiều vectơ biểu hiện tương ứng với nhiều loại tế bào biểu
hiện khác nhau. Ở đây để biểu hiện gen VP2 mã hoá một phần kháng nguyên vỏ của
virus gumboro, chúng tôi chọn vectơ pPAMksGFP (6496 bp) để thiết kế pPAM-VP2.
Các vect
ơ này được điều khiển bởi promotor 35S promoter và gen chỉ thị nptII kháng
với geneticin (Hình 1.4). Vùng nhận biết gắn gen kháng kháng sinh giúp cho việc chọn
lọc chính xác dòng plasmid tái tổ hợp. Những plasmid này được TS. J.Schillberg
(Fraunhofer, Viện sinh học phân tử và kinh tế ứng dụng, Aachen, CHLB Đức cung
cấp).

Hình 1.4. Cấu trúc pPAMksGFP
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật, chúng được chia
thành 2 loại chính: gián tiếp và trực tiếp. Phương pháp chuyển gen gián tiếp là phương
pháp dựa trên việc đưa 1 cấu trúc gen mang bởi 1 plasmid vào tế bào đích bằng các vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens hay Agrobacterium rhizogenes. Phương pháp trực
tiếp là phương pháp không sử dụng tế bào vi khuẩn làm đối tượng trung gian
(Trojanowska, 2002).
1.3.2.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens
Số lượng các loài cây trồng được chuyển gen thông qua A. tumefaciens tăng mạnh
trong vài n
ăm gần đây. Nhiều loài cây trồng khác nhau đã được chuyển gen bằng việc
áp dụng hai hệ thống chuyển gen:

16
a) Hệ thống chuyển gen in vitro (sử dụng hệ thống tế bào nuôi cấy in vitro)
b) Hệ thống chuyển gen in vivo (không sử dụng hệ thống tế bào nuôi cấy in vitro)
(Sharma và cs, 2005).
Hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium in vitro
Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải có
được sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của Agrobacterium và khả năng tái sinh của các tế
bào sau khi lây nhiễm với Agrobacterium (Birch, 1997).
M
ột số kỹ thuật hỗ trợ trong quá trình biến nạp đã cải thiện hiệu quả của hệ thống
chuyển gen thông qua Agrobacterium bao gồm:
* Xử lý sóng siêu âm
Xử lý mô thực vật với Agrobacterium trong điều kiện sóng siêu âm tạo ra các
tổn thương nhỏ, đồng nhất ở mô thực vật, cho phép Agrobacterium dễ dàng xâm nhập
vào tế bào thực vật. Bằng phương pháp này đã cải thiện rõ r
ệt hiệu quả chuyển gen,

biểu hiện gus tạm thời đã tăng từ 100-1400 lần ở các tế bào đậu tương, đậu đũa, cây
vân sam trắng, lúa mỳ và ngô sau khi biến nạp với Agrobacterium theo phương pháp
SAAT (Trick và Finer, 1997).
* Ly tâm tế bào
Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium kết hợp với ly tâm đã được
áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hoá nhận được từ hoa
chuối đực nuôi cấy in vitro của hai gi
ống chuối thương mại Cavendish và Lady Finger.
Tần số chuyển gen đã được cải thiện đáng kể bằng cách áp dụng chế độ ly tâm tế bào
thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn (Khanna và cs, 2004).
Hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium in vivo
Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in planta)
và rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một trong những loài cây mô hình đối với các
nghiên cứu về hệ gen h
ọc. Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công
đoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số
lượng cây chuyển gen thu được lớn hơn. Kỹ thuật này đã được mô tả ở các cây trồng
khác nhau như: đậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương, hoa rum và cây lạc (Rohini
và Rao, 2000).
* Phương pháp chuyển gen vào hạt
Hạt Arabidopsis được lây nhiễm với Agrobacterium sau đó đem tr
ồng và thu
được cây trưởng thành với tần số biến nạp 1%. Hạt Arabidopsis chuyển gen đã được
tạo thành từ các cụm hoa mới xuất hiện sau khi lây nhiễm Agrobacterium tại những
vùng bị tổn thương khi cắt bỏ cụm hoa (Katavic và cs, 1994).
* Phương pháp ngâm cụm hoa

17
Một số nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở cây Arabidopsis bằng cách
ngâm các thể giao tử cái của hoa non, cụm hoa trong dịch vi khuẩn Agrobacterium

(Desfeux và cs, 2000). Phương pháp này cũng được áp dụng với các cây 1 lá mầm.
* Phương pháp thấm lọc chân không
Phương pháp chuyển gen thấm lọc chân không cũng tương tự như phương pháp
ngâm cụm hoa. Phương pháp này đã được áp dụng ở một số cây trồng, đặc biệt là cây
một lá m
ầm. Trong môi trường chân không, tế bào thực vật tiếp xúc với Agrobacterium
tốt hơn. Người ta đã nhận được các cây Medicago truncatula (cây mô hình thuộc họ
đậu) chuyển gen bền vững bằng phương pháp chuyển gen này (Trieu và cs, 2000).
1.3.2.2 .Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
Chuyển gen bằng súng bắn gen
Bắn gen là một kĩ thuật sử dụng các mảnh kim loại kích thước ỡm được bọc các
DNA và được tăng tốc bắn vào các tế
bào đích ở tốc độ đủ để xuyên qua thành tế bào
mà không gây tổn hại nghiêm trọng tới tế bào (Taylor và Fauquet, 2002). Theo cách
đó, gen quan tâm được chuyển vào bên trong của tế bào nơi nó được tách khỏi vỏ hạt vi
đạn và được tổ hợp vào nhân hay bộ gen. Phương pháp bắn gen được phát triển vào
những năm 1980 nhằm cạnh tranh với phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium.
Phương pháp được áp dụng cho hầu hết các loài cây không thuộc họ cà, cây ngũ c
ốc,
cây họ đậu.
Chuyển gen nhờ Silicon Carbide
Nguyên lý: Các sợi Silicon Carbide được đưa vào huyền phù chứa mô thực vật
(màng tế bào, phôi non, callus) và DNA plasmid. Tất cả được trộn bằng máy votex,
máy lắc hoặc máy đảo. Sợi Silicon Carbide bọc DNA sẽ xuyên qua thành tế bào do có
các lỗ nhỏ tạo ra trên thành tế bào khi sợi Silicon Carbide va đập với tế bào. Sợi Silicon
Carbide hay được sử dụng là các tinh thể đơn lẻ của các khoáng chất hữu cơ như thạch
anh (silica). Silicon Carbide có hình d
ạng ống dài từ 10 - 80 mm, đường kính 0,6 mm
và ít bị co giãn.
Ưu điểm chính của phương pháp này là giá rẻ và có thể sử dụng cho các loại vật

liệu thực vật khác nhau. Nhược điểm chính là tỉ lệ chuyển gen không cao, gây tổn
thương tế bào dẫn đến khả năng tái sinh kém và cần phải tuân thủ qui trình cảnh báo
nghiêm ngặt khi làm trong phòng thí nghiệm, nếu hít phải sợi Silicon Carbide, đặc biệt
là sợi amiăng có thể bị bệ
nh nghiêm trọng.
Có một số kết quả đã đạt được của phương pháp này như thu được dạng chuyển
gen-dòng tế bào hay cây ở ngô, lúa mì, thuốc lá…
Chuyển gen bằng xung điện

18
Xung điện vào tế bào và mô thực vật rất giống về nguyên lí với xung điện tế bào
trần. Sự khác biệt ở chỗ vật liệu thực vật sử dụng là bao phấn, hạt phấn, mảnh lá, phôi,
callus, hạt hay chồi. Để chuyển gen cả DNA plasmid và vi khuẩn Agrobacterium đều
có thể được sử dụng.
Kĩ thuật này đã được sử dụng trên nhiều loài: thuốc lá, lúa gạo và lúa mì. Các thí
nghiệm để thu cây chuyển gen (bền vững) cũng bắt đầu từ đầu những năm 90. Kết quả
tốt nhất đạt được ở ngô: 6,25 % cây chuyển gen thu được thông qua chuyển vào phôi
và 54,6% với callus ( D’Halluin và cs, 1992). Các tác giả tính toán rằng cứ 10000 tế
bào thì có 1 nhận được gen chuyển. Ở lúa mì, tỉ lệ thu được cây chuyển gen chỉ đạt
0,28%. Mặc dù phương pháp này rất đơn giản và hiệu quả trên một số loài, nó vẫn ít
đượ
c sử dụng để chuyển gen thực vật.
Kỹ thuật vi tiêm
Biến nạp thông qua vi tiêm dựa trên việc chuyển DNA vào nhân hoặc bào tương
bằng các dụng cụ của một pipet có đầu vi mao dẫn thuỷ tinh (Morikawa và Yamada,
1985). Các bước vi tiêm cần được thực hiện trên một thiết bị vi thao tác. Trong quá
trình đưa DNA vào nhân, tế bào được cố định với một pipet giữ và hút cẩn thận. Cả hai
pipet đều chứa dầu khoáng hoạt động gi
ống như xilanh. Vi tiêm chủ yếu được sử dụng
cho chuyển gen vào các tế bào động vật lớn.

Phương pháp này không được phát triển do qui trình thực hiện mất nhiều thời
gian và thiết bị vi thao tác rất đắt. Tuy nhiên phương pháp này có ưu điểm là nó cho
phép chuyển không chỉ DNA plasmid mà còn toàn bộ gen vào tế bào thực vật
(Griesbach, 1987). Cây chuyển gen chỉ được tạo ra trong vài nghiên cứu bao gồm các
loài như: thuốc lá petunia, cải dầu và lúa mạch và thường ở tỉ
lệ rất thấp (Trojanowska,
2002).
Phương pháp chuyển gen qua ống phấn
Nguyên lý: DNA ngoại lai được đưa vào vòi nhuỵ bị cắt một thời gian ngắn sau
khi thụ phấn. DNA ngoại lai chuyển tới tế bào trứng bằng cách chảy xuống theo ống
phấn. Quy trình được áp dụng lần đầu tiên cho chuyển gen vào lúa gạo. Sau đó nó được
sử dụng cho các loài khác như lúa mì, đậu tương, Pentunia hybrida và dưa hấu
(Trojanowska, 2002). Vi khuẩn hay DNA plasmid có thể
được tiêm vào cụm hoa với
các tế bào mẹ hạt phấn ở giai đoạn tiền giảm phân mà không cần loại bỏ nhị. Trong
trường hợp đó người ta hy vọng DNA ngoại lai sẽ hợp với bộ gen thể giao tử.
Phương pháp chuyển gen bằng Liposome
Ý tưởng về một phương pháp chuyển gen trực tiếp hình thành vào giữa những
năm 80 nhằm để chuyển DNA vào tế bào bằng công cụ củ
a liposone. Liposome là các
túi vi thể hình cầu được tạo ra khi các phospho lipid bị hydrat hoá. Chúng có thể được

19
mang cùng với rất nhiều loại phân tử, gồm có DNA. Đối với tế bào trần, quá trình
chuyển gen diễn ra sự dung hợp thành tế bào và nội thực bào. Chuyển gen thông qua
liposome ít được sử dụng dù nó rẻ và không yêu cầu thiết bị. Nguyên nhân chính là do
thực hiện nó quá tốn nhân công và hiệu quả thu được lại thấp. Chỉ có vài báo cáo về
chuyển gen bằng liposome vào bộ gen cây chủ và tạo được cây tái sinh ở thuốc lá và
lúa mì (Zhu và cs, 1993; Trojanowska, 2002).
1.3.3. Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens

Cấu trúc và chứ
c năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid được tìm thấy ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây bệnh và tồn tại
bền vững ở nhiệt độ dưới 30
o
C. Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng
lượng phân tử bằng 3 - 5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Với
kích thước khoảng 200 kb, trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập.
Có 2 dạng Ti-plasmid phổ biến. Octopine Ti là plasmid mang các gen cần để tạo
ra các khối u sần sùi sản sinh ra octopine trong khi nopaline Ti- plasmid mang các gen
gây khối u nhẵn sản sinh ra nopaline (Hooykaas và cs, 1979). Octopine Ti plasmid và
Nopaline Ti plasmid có các vùng cơ bản như sau: (i) Vùng T-DNA, (ii) vùng vir
-là
vùng điều khiển hoạt động cắt và chuyển T-DNA vào tế bào sinh vật chủ, (iii) vùng
rep-vùng cần thiết cho sự tái bản Ti-plasmid, (iv) các operon tra và trb-đóng vai trò
điều khiển sự chuyển liên hợp của Ti-plasmid và (v) các gen điều khiển sự hấp thu và
sử dụng các opine (hình 1.5) (Zhu và cs, 2000).

Hình 1.5. Cấu trúc Ti plasmid dạng octopine
Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA
Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho
thấy, T-DNA được giới hạn bởi hai đoạn trình tự lặp lại ở hai biên có kích thước 25bp
(Negrotto và cs, 2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003).
Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genom thực vật là một đoạn
liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một đoạn gen liên
tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (l) Các gen mã hoá những enzym cần

20
thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u như tms1, tms2, tmr mã
hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin (Hooykaas

và Schilperoort, 1992).
Cơ chế phân tử của quá trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất phenol và đường có tác dụng
dẫn dụ A. tumefaciens đến bám vào thành tế bào cây chủ. Các hợp chất này đồng thời
cũng làm cảm ứng hoạt động của các gen vùng vir. Trước tiên protein virA nằm trên
thành tế bào vi khuẩn nhậ
n biết sự có mặt và tương tác với các hợp chất phenol thực
vật. Nhờ đó protein virA được phosphoryl hoá, tiếp đó nó chuyển tiếp phosphoryl hoá
phân tử protein virG tạo ra dạng protein virG hoạt hoá. Protein virG đã hoạt hoá kết
hợp với vùng điều khiển của vir-box giúp kích hoạt và tăng cường mức độ phiên mã
các gen gây độc khác như virB, virC, virD và virE (Mclean và cs, 1994; Gelvin, 2003).
Sợi dưới của T-DNA bị cắt ở v
ị trí cách 4 nucleotid từ đầu bờ phải bởi hoạt
động của protein virD2. Protein này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của mỗi đoạn bị
cắt. Đồng thời với quá trình cắt là quá trình tổng hợp mới sợi thay thế cho sợi bị cắt.
Đoạn bị cắt ra là sợi đơn đại diện cho vùng T-DNA và được gọi là sợi T (Wie và cs,
2000; Valentine, 2003).
Trong quá trình di chuyển, protein virE2 gắn với sợi T tạo thành phứ
c hợp T
dạng ống sợi nucleo-protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tác động của
các enzym thuỷ phân và các enzym endonuclease có trong dịch bào của tế bào cây chủ.
Protein virB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khẩn và tế bào cây chủ giúp cho sợi T có thể
được vận chuyển sang tế bào cây chủ (Citovsky và cs, 1989; Durenberger và cs, 1989;
Zupan và cs, 2000). Protein virD2 gắn ở đầu 5’ của sợi T đóng vai trò là tín hiệu nhận
biết trong hệ thống vận chuyển (Hooykaas và Schilperoot, 1992). Quá trình chuyển T-
DNA này gần giố
ng với quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn, trong đó protein virB tương
đương với yếu tố F.
Ở bên trong nhân, T-complex chuyển tới điểm tổ hợp và các protein bảo vệ sợi
T được tách ra trước khi T-DNA được tổ hợp vào những vị trí ngẫu nhiên trên bộ gen

cây chủ. Quá trình tổ hợp T-DNA vào bộ gen cây chủ là quá trình phụ thuộc nhiều nhất
vào cây tế bào chủ (hình 1.6) (Bako và cs, 2003).
Sau khi kết hợp vào bộ gen cây chủ, các gen trên T-DNA, nhờ sự đi
ều khiển của
gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát
triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u (Wie và cs,
2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003).