Fish word 1 Vi sinh vật môi trường

MỤC LỤC
Trang
A.
B.

Giới thiệu về kĩ thuật Fish....................................................................................2
Phương pháp thực hiện Fish................................................................................3
IQuy trình thực hiện.......................................................................................3
1.1 Tóm tắt quy trình thực hiện.................................................................3
1.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang............................................4
..............................................................................................................
1.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ..............................................................8
..............................................................................................................
1.4. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu............................................9
1.5. Quan sát và xử lý tín hiệu.................................................................10
IINhững trở ngại đối với kĩ thuật Fish...........................................................12
2.1. Kết quả khơng chính xác..................................................................12
2.1.1. các chất tự phát huỳnh quang…………………………………...12

2.1.2 Đầu dị thiếu tính đặc hiệu………………………………………..13
2.2 Kết quả âm tính.................................................................................13
2.2.2. Do những cấu trúc phức tạp của đầu dị hay trình tự đích……....13
2.2.3. Hàm lượng ARN thấp..…………………………………………..14
2.3.4. Ảnh chụp bị mất màu…………………………………………….14
III- Biện pháp khắc phục…………………………………………………….....15
C.
Ứng dụng của kĩ thuật Fish……………………………………..………………16
I.
Hệ vi sinh vật trong nước thải…………………………………………...…16
II.
Vi khuẩn cộng sinh…………………………………………………………17

III. Trong Y học……………………………………………………………..…18
III.1. Các quần thể vi khuẩn phức tạp……………………………………..18
III.2. Phát hiện mầm bệnh trong các mô cấy và dụng cụ vô trùng………..22
III.3. Nấm………………...………………………………………………..23
III.4. Thuốc thú Y…………………...…………………………………….24
III.5. Các mầm bệnh ở thực vật……………………………………………24
D.Triển vọng và phát triển của Fish……………..……………………………….25
I.
Trên thế giới………………………………………………………………..25
II.

Tại Việt Nam……………………………………………………………….29
1


E.

Tài liệu tham khảo..............................................................................................31

2


A. GIỚI THIỆU VỀ KĨ THUẬT FISH.
FISH là một kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi
khuẩn. FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết mơi trường
ni cấy đặc hiệu mà cịn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ về điều kiện và
mơi trường ni cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệ thống phức tạp của
các quần thể vi sinh vật. FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và
sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình dung và nhận biết các tế bào vi
khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh. Độ nhạy và tốc độ thực hiện là

những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụng hiến cứu hữu hiệu nhất.
Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong môi
trường tự nhiên, nổi bật là hệ vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden, tại vịnh hẹp ở Na-uy,
sinh vật phù du ở sông hoặc biển, tuyết hồ trên núi cao, trong đất và trên bề mặt rễ thực
vật. FISH đặc biệt phổ biến trong y học, ngoài mục đích xác định các mầm bệnh có
nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh về đường hơ hấp, tiêu hóa, các bệnh lây qua đường máu,
ung thư…) FISH còn được sử dụng để chẩn đoán thường qui sự bất thường về cấu trúc và
số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của thai nhi.
Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong
chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta
trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh
vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển.

3


B. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH
I. QUY TRÌNH THỰC HIỆN.
1.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH
FISH dị tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các lồi vi sinh vật mong
muốn bằng cách dùng đầu dị được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình tự
đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào).
Quy trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản sau:
- Chuẩn bị mẫu và đầu dò.
- Cố định mẫu.
- Lai giữa đầu dị và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào.
- Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dị khơng được lai.
- Dị tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang
trực tiếp).
- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.

Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH
4


1.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang
Lựa chọn đầu dò: Như đã được đề cập từ trước, các trình tự đích được sử dụng
phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng
bản sao nhiều và cấu trúc được bán bảo tồn. Các đầu dò oligonucleotide ứng với
mỗi cấp độ phân loại, giữa các loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, cho đến các
chi và loài cụ thể đều có thể thiết kế được dựa theo kích thước của rRNA đích
Với sự tăng lên nhanh chóng của các đoạn thông tin di truyền trong các cơ
sở dữ liệu chung và thương mại, đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận
biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác. Điều này đặc
biệt có ý nghĩa khi tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay các sinh vật chưa
từng nuôi cấy đặc hiệu. Số lượng lớn các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần sao
chép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào luôn cung cấp đủ số
lượng các trình tự đích để hiển thị được các dòng tế bào cụ thể, ngay cả các
oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH. Việc lựa
chọn vị trí trình tự đích và q trình thiết kế đầu dò phải được tiến hành với sự thận
trọng cao nhất. Gần đây, các trình tự đích khác như rRNA 23S, rRNA 18S mà gần
đây là mRNA cũng đã được xác định thành cơng bởi thí nghiệm FISH.
Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ
nhạy và khả năng xâm nhập vào tế bào. Một đầu dị oligonucleotide điển hình
thì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tự
động. Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiếp cận được với trình tự đích, nhưng chúng lại
mang được ít các trình tự đánh dấu. Trong FISH, các trình tự đích thơng dụng nhất
là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và
số lượng các bản sao nhiều. Do đó, các đầu dị được lựa chọn thường là các
5

oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất
trong quá trình lai. Các đầu dị oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đã có một số
sản phẩm được thương mại hóa. Chúng có thể lưu trữ được ở-20OC trong tối
khoảng vài tháng.
Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang
lên đầu dị là cách thơng dụng nhất, nhanh nhất, rẻ nhất và dễ dàng thực hiện nhất
bởi vì chúng khơng địi hỏi phải tiến hành các bước dị tìm sau quá trình lai. Một
hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với
oligonucleotide trong suốt q trình tổng hợp thơng qua liên kết amino ở đầu 5’
của đầu dò, hoặc sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn các
nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dị . Ngồi ra, một số thuốc
nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào
oligonucleotide theo một dải đệm 18 carbon thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu
so với các đầu dị được đánh dấu trực tiếp .Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh
quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn nhãn chất huỳnh quang
trên cả hai đầu, một phân tử ở đầu 3’ và 4 phân tử ở đầu 5’ được sử dụng như
những miếng đệm thích hợp để ngăn chặn sự che khuất lẫn nhau của các tín hiệu
huỳnh quang.
Trong một số trường hợp, việc dị tìm theo cách gián tiếp thì có hiệu quả hơn.
Người ta thấy rằng, có thể tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH lên bằng cách kết hợp
các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG), sau đó chúng sẽ được dị tìm
thơng qua một chất phản huỳnh quang . Độ nhạy của FISH cịn có thể được tăng lên
đáng kể khi sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu.
Phương pháp này được phát triển bởi Kagiyama và cộng sự (1993) khi nghiên cứu
về di truyền học tế bào, sau đó được Yamaguchi và cộng sự thay đổi để áp dụng
vào định danh vi khuẩn (1996). Ban đầu, mỗi oligonucleotide vẫn sẽ được đánh

6

dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dị tìm bằng một thể kháng
digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzyme phosphatase kiềm.
Enzyme này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide
phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thểnày tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khi
kết hợp với Fast Red TR. Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách thực hiện này
có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotide chỉ gắn nhãn
huỳnh quang duy nhất. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng
được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín
hiệu Tyramide” (TSA) . Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên
khoảng 10 – 20 lần. Tuy nhiên, số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi
một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dị thơng thường được đánh dấu duy nhất
một chất huỳnh quang. Điều này xảy ra là do quá trình xâm nhập của các chất cao
phân tử bào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường.
Mặc dù enzyme lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dị vào trong tế
bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như
không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương, do đó phương pháp này chủ
yếu được dùng để phân tích các quần thể vi khuẩn tạp.

7


Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d)
hay đầu dị polyribonucleotide (e)(Moter et al., 2000).
Có lẽ phương pháp hiệu quả nhất là kết hợp việc sử dụng các đầu dò
polyribonucleotide, được đánh dấu với digoxygenin, đồng thời sử dụng hệ thống
khuyếch đại tín hiệu tyramide (TSA). Kỹ thuật này đã được ứng dụng thành cơng
khi dị tìm và phát hiện trực quan các độc tố trong Listeria(Hình 2e) .
Lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang

đều có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau nên cho phép
phát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật khi chỉlai một lần duy nhất. Cùng
với việc quan sát trực quan bằng kính hiển vi đa màu FISH, các bộ lọc màng nhiều
dải cũng có thể được sử dụng. Các chất huỳnh quang tổng hợp có những điểm phát
xạ sắc nét khác nhau nên sẽ loại bỏ được hiện tượng các phổ huỳnh quang chồng
lên nhau giữa các đầu dò, đồng thời hạn chế các vấn đề về màu nền và sự dây,
nhem màu. Chất màu huỳnh quang có màu sáng nhất và bền quang học nhất nên sử
dụng để dị tìm các trình tự đích mà lượng mẫu rất ít.
8


Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dị tìm vi sinh vật bằng phương pháp
FISH

Bước sóng có thể thay đổi ít nhiều tùy thuộc vào nhà sản xuất. Quang phổ phát xạ có thể
thay đổi trong các dung mơi khác nhau hoặc đặc tính của mẫu.
*FITC : Fluorescein–isothiocyanate
**FluoXE : 5-(-6-)carboxyfluorescein–N-hydroxysuccimideester
***TRITC : Tetramethyl–rhodamine–isothiocyanate
1.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ
Trước khi tiến hành lai, mẫu chứa vi sinh vật và các đầu dò phải được ngâm
trong các hợp chất tạo tủa như ethanol hoặc methanol, hợp chất tạo được liên kết
ngang như aldehyde hoặc hỗn hợp các chất trên để các đầu dị huỳnh quang có thể
thấm vào bên trong tế bào và bảo vệ các rRNA khơng bị biến tính bởi các RNAse
nội bào. Các điều kiện và phương pháp cố định mẫu có thể khác nhau tùy thuộc
vào vi sinh vật đích và loại mẫu. Quá trình cố định mẫu tối ưu sẽ đưa được số
lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đích
RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng. Cố định
9

đầu dò vào mẫu hiệu quả sẽ ảnh hưởng rất tích cực đến kết quả của FISH, nhưng
việc cố định rất khó để có thể tối ưu hóa. Thơng thường một lượng dung dịch
formaldehyde hoặc paraformaldehyde 3-4% (v/v) thì phù hợp cho hầu hết các loại
vi khuẩn Gram âm. Đối với các vi khuẩn Gram dương, sử dụng ethanol (50%), hỗn
hợp ethanol/formalin (tỉlệ9:1 v/v) hoặc xử lý nhiệt là những biện pháp thơng dụng
nhất; ngồi ra có thể bổ sung thêm bước xử lý sơ bộ để tăng tính thấm của đầu dò.
Khi áp dụng phương pháp FISH trên mẫu chứa nhiều đoạn mơ khác nhau, các
q trình tiền xử lý bắt buộc phải được áp dụng để tăng khả năng tiếp cận của các
đầu dị đối với các trình tự đích tương ứng, đồng thời hạn chế được các liên kết
không đặc hiệu. Gần đây, FISH đã được áp dụng trên các mẫu mô tế bào được
ngâm trong dung dịch keo lạnh. Trong các chất dẻo này, sự hiển thị của vi
khuẩn và sự bảo vệ cấu trúc của mơ của các tế bào rất hồn chỉnh mà khơng hề có
bất cứ q trình tiền xử lý nào.
1.4. Lai giữa đầu dị và trình tự đích đặc hiệu
Trước khi tiến hành lai, các tế bào sau giai đoạn xử lý kể trên được cố định vào
một mặt kính. Để q trình gắn mẫu vào mặt kính được tốt hơn, người ta khuyên
nên xử lý bề mặt kính trước bằng cách phủ lên mặt kính một lớp chất tráng kính
ngồi. Các hóa chất được sử dụng cho hiệu quả tốt là gelatin , poly-L-lysine hay các hợp
chất tạo muối.
Quá trình lai phải được thực hiện trong những điều kiện hết sức nghiêm ngặt
nhằm kết hợp chính xác các đầu dị đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ
sung với chúng. Đối với thao tác quan trọng nhất trong thí nghiệm FISH, q trình
làm nóng sơ bộ các phân tử lai phải được thực hiện để các đầu dò huỳnh quang kết
hợp bổ sung với các trình tự RNA đích tương ứng. Sự chính xác khi bắt cặp bổ
10


sung có thể được điều khiển bằng cách thay đổi nồng độ formamide hay nhiệt độ
của quá trình. Formamide sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy của phân tử bằng cách

làm suy yếu liên kết hydro, từ đó cho phép tiến hành quá trình nhuộm ở nhiệt độ
thấp những vẫn đảm bảo độ chính xác cao.
Q trình lai xảy ra trong môi trường tối ẩm, nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC.
Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ. Sau đó, rửa mẫu bằng nước cất
để loại bỏ các đầu dị khơng liên kết được với trình tự đích. Cuối cùng, rửa lại với
nước một lần nữa, sấy và cố định các phân tử lai, có thể bổ sung thêm các chất
chống phai màu.
1.5. Quan sát và xử lý tín hiệu
Để có thể quan sát được các tín hiệu huỳnh quang đa sắc trong thí nghiệm
FISH, kính hiển vi thơng thường sẽ được trang bị thêm một bộ lọc dải hẹp nhiều
tần. Ngoài ra, để thu nhận và phân tích được các hình ảnh đó cần phải sử dụng một
máy ảnh CCD (charged coupled device) kết hợp với phần mềm phân tích xử lý ảnh
kỹ thuật số. Đây là hệ thống cảm biến chính xác nhất hiện nay và nó rất hữu dụng
khi quan sát những mẫu vi sinh vật quan trọng, những nơi có cường độ tín hiệu
thấp. Hệ thống này cũng đã được sử dụng để kiểm tra số lượng các tế bào vi sinh
vật và xác định hoạt tính các dịng tế bào đơn trong màng sinh học thông qua
việc xác định hàm lượng rRNA . Gần đây, phương pháp phân tích sự phân bố
không gian của vi khuẩn đã được cải tiến hơn nữa khi sử dụng kính hiển vi quan
sát huỳnh quang dải rộng. Một loại kính hiển vi khác được sử dụng cho thí
nghiệm FISH là kính hiển vi quét laze đồng tiêu (CLSM). Thông qua việc hạn chế
hệ thống tín hiệu trong những khoảng hẹp của đối tượng nghiên cứu, các tín hiệu
huỳnh quang bị lệch tiêu sẽ bị loại bỏ, tạo ra những hình ảnh rõ nét. Điều này rất
11


hữu dụng cho mẫu có độ phân bố dày đặc, như các lớp bùn, màng sinh học hay
đoạn mơ.

.
Hình 4. Kính hiển vi quét laze đồng tiêu

12


II. NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH
2.1. Kết quả khơng chính xác
2.1.1. Các chất tự phát huỳnh quang
Khi gặp phải những chất có khả năng tự phát huỳnh quang, phương pháp FISH
sẽ có nhiều hạn chế. Vấn đề khó khăn nhất chính là khả năng tự phát huỳnh quang
của bản thân vi sinh vật. Những trở ngại này đều đã được kiểm chứng trên nhiều
loài nấm mốc hay nấm men khác nhau , trên một số loại vi khuẩn: Pseudomonas ,
Legionella , Rhodospirillum centenum, vi khuẩn lam và gần đây nhất là sự thí nghiệm
trên các loại vi khuẩn cổ như methanogenes đều thể hiện những phức tạp của FISH khi
phân tích mơi trường vi sinh vật.

Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida
albicans(Moter et al., 2000)

13


2.1.2. Đầu dị thiếu tính đặc hiệu
Độ chính xác và độ tin cậy của FISH phụ thuộc nhiều vào tính đặc hiệu của các
đầu dò oligonucleotide. Thiết kế cẩn thận và đánh giá giới hạn của các đầu dò mới
là điều thiết yếu. Điều quan trọng cần lưu ý rằng mỗi một oligonucleotide chỉ phù
hợp với duy nhất một dữ liệu thơng tin mà nó có chung nguồn gốc. Do sự báo cáo
thiếu chính xác thơng tin của các trình tự và sự mở rộng nhanh chóng của cơ sở dữ
liệu, nên các trình tự đầu dị cần được kiểm tra một cách thường xuyên để cập
nhật các thông tin mới nhất. Khi phân lập các vi sinh vật khó nuôi cấy hoặc chưa
biết môi trường đặc hiệu, việc cập nhật thơng tin các trình tự tỏ ra rất hữu ích để

kiểm tra tính đặc hiệu trước khi lai thử nghiệm như các phương pháp lai dot-blot
2.2. Kết quả âm tính
2.2.1. Số lượng đầu dị q ít
Cường độ tín hiệu thấp có thể do sự thâm nhập khơng đủ của đầu dò vào bên
trong tế bào vi khuẩn. Các đầu dò polyribonucleotide khi thấm vào tế bào vi sinh
vật gram âm thường không gặp phải bất cứ vấn đề nhỏ nào. Đối với vi sinh vật
gram dương, đặc biệt là những đầu dị có trình tự dài hoặc trung bình thì sử dụng
các acid mycolic kết hợp với cố định đặc hiệu và tiền xử lý có thể rất cần thiết.
2.2.2. Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích
Do cấu trúc ba chiều của rRNA nên khơng phải tất cả các chuỗi trình tự đích
đều tiếp cận được với các đầu dò tương ứng. Cấu trúc vịng hoặc kẹp tóc cũng như
sự tương tác giữa rRNA và protein cản trở dẫn đến sự cảm biến khác nhau của các
đầu dị oligonucleotide. Điều này giải thích tại sao các đầu dò sử dụng tốt trong các
phương pháp lai thơng thường có giai đoạn biến tính RNA hoặc DNA đã không
cho kết quả khả quan trong FISH. Một hệ thống nghiên cứu nhằm giải quyết
14


vấn đề này đã được công bố bởi Fuchs và cộng sự (1998). Các nhà nghiên cứu đã
tạo ra hơn 200 đầu dò oligonucleotide, xác định cụ thể những vị trí khác nhau trên
16S rRNA của E.coli, rồi sử dụng phương pháp flow cytometry đo cường độ tín
hiệu của chúng bằng thí nghiệm FISH. Dựa trên đầu dị phát sáng nhất, các
oligonucleotide được phân thành 6 mức độ sáng khác nhau và dựng sẵn một biểu
đồ thể hiện khả năng tiếp cận của 16S rRNA E.coli. Kể từ khi rRNA 16S được bảo
quản tốt hơn, biểu đồ này có thể đơn giản việc thiết kế đầu dị hợp lý khơng chỉ đối
với E.coli, mà còn cho tất cả các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, theo một số nhà
nghiên cứu khác, đây là điều bắt buộc để đánh giá và tối ưu hóa thiết kế tất cả các
đầu dị tương ứng với các vi sinh vật và thích nghi với những ảnh hưởng tiêu cực
trước khi được áp dụng trên các mẫu hỗn tạp và chưa xác định được thành phần.
2.2.3. Hàm lượng rRNA thấp

Mặc dù thông thường rất phong phú, nhưng hàm lượng rRNA của các tếbào vi
khuẩn khác nhau rất đáng kể khơng chỉ giữa các lồi, mà cịn có sự khác nhau giữa
các tế bào của cùng một chủng tùy theo các đặc điểm sinh lý liên quan trực tiếp đến tốc
độ tăng trưởng của chúng
2.2.4. Ảnh chụp bị mất màu
Nhiều chất nhuộm huỳnh quang bị phai màu nhanh chóng theo sự kích thích
của bước sóng ánh sáng, dẫn đến không thể phục hồi những chỗ hư hỏng. Những
lần phơi sáng chỉ từ vài giây đến vài phút nhưng có ảnh hưởng rất quan trọng, đặc
biệt với ảnh chụp qua kính hiển vi. Để khắc phục những khó khăn này, việc sử
dụng bộ lọc dải hẹp, thuốc nhuộm cyanine bền quang học và các công cụ chống

15


III./ Biện pháp khắc phục
Sử dụng đầu dò vi khuẩn : Cách kiểm soát tốt nhất cho những kết quả bị âm
tính về khía cạnh phương pháp là sử dụng một đầu dò vi khuẩn. Nếu tiến hành lai
với một đầu dò phổ biến cho được kết quả khả quan trong FISH, thì việc cố định,
sự thẩm thấu và hàm lượng rRNA của vi khuẩn khơng cịn là chỉ số hạn chế.
EUB338 là đầu dò thường được sử dụng cho mục đích này. Tuy nhiên, các
phân tích gần đây đã chỉ ra rằng một số ngành vi khuẩn bao gồm Planctomycetales
và Verhowrucomicrobia vẫn còn bị thiếu đầu dò này . Vì vậy, sử dụng một tập
hợp nhiều đầu dị vi khuẩn là điều rất cần thiết có một cái nhìn tồn diện hơn khi
phân tích các quần thểvi khuẩn phức tạp. Để kiểm sốt những liên kết khơng đặc
hiệu giữa các đầu dò của vi khuẩn nhân thật với 16S rRNA đích hay với các thành
phần khác của tế bào so với acid nucleic, việc bổ sung đầu dị có tên là NON338
có thể được sử dụng và nó khơng phải đưa ra bất cứ tín hiệu nào trong FISH.

16

C. ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT FISH
I. Hệ vi sinh vật trong nước thải
Ardern và Lockett (1914) đã phát triển hệ thống hoạt hóa bùn đầu tiên để thanh
lọc nước thải tại Manchester. Tuy nhiên, vai trò của quần thể vi sinh vật trong quá
trình này vẫn chưa được hiểu hết. Bởi vì những kỹ thuật ni cấy thơng thường đã
được thực hiện là quá chọn lọc cung cấp một bức tranh toàn diện và đáng tin cậy
của toàn bộ mạng lưới vi khuẩn , phân tích tập hợp các phân tử rRNA đã
tìm thấy nhiều ứng dụng rộng rãi cho kỹ thuật phân tích của một số mơi trường:
bình phản ứng sinh học hay nhà máy xử lý chất thải. Các chuỗi trình tự được tạo ra
bằng những kỹ thuật phân tích phân tử như kỹ thuật PCR đã được sử dụng tạo ra
các đầu dò oligonucleotide mới cho FISH để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn,
như trong bùn hoạt tính. Gần đây, vào năm 1999 Bond và cộng sự đã
tiến hành xác định các nhóm vi khuẩn trong bùn với sự tăng cường loại bỏ photpho
sinh học. Một số nhóm nhà nghiên cứu khác thì tập trung vào Actinomycetes có
chứa acid mycolic được cho là có chứa nhiều sợi nhỏ tạo bọt trong nhà máy xử lý
nước thải. Ngồi các cá thể của nhóm khuẩn cổ, đặc biệt là
methanogen (một loại khuẩn cổ kị khí có khả năng tạo khí methal), đã được tìm
thấy bằng phương pháp FISH trong q trình phân hủy kị khí và trong hạt bùn nhỏ,
mặc dù khả năng tự phát huỳnh quang của chúng rất mạnh. Gần đây, sự
kết hợp giữa FISH và bộ vi cảm biến cho phép phân tích đồng thời quần thể vi
khuẩn và các hoạt động trao đổi chất, qua đó phát hiện ra các vi khuẩn kị khí nằm
trong các khe nhỏ thiếu oxy trong mơi trường hiếu khí.

17


II. Vi khuẩn cộng sinh
Hầu hết các vi sinh vật cộng sinh bắt buộc đều chưa tiến hành nuôi cấy được.
Sử dụng rRNA 16S, chúng có thể được định danh và phân cấp phát sinh loài. Việc

khoanh vùng vi sinh vật trong những bộ phận khác nhau của vật chủ bằng FISH có
thể chứng minh được tính chất cộng sinh của chúng, như Amann và cộng sự (1991)
đã làm, người đã xác định được vi khuẩn nội cộng sinh chưa nuôi cấy thuộc chi
Holosporatrên lông của Paramecium caudatum. Từ khi lồi Holospora được tìm
thấy trong nhân của các vi sinh vật có lơng mịn, nó có thể được nhận biết rõ ràng
vi khuẩn tiêu hóa hiện diện trong các túi thức ăn. Tương tự, FISH cũng được sử
dụng để chứng minh Paramecium caudatum cũng chứa Caedibacter caryophila,
một “kẻ” tiêu diệt vi sinh vật nội cộng sinh mà sự phát triển có liên quan đến lồi
Rickettsia. Gần đây, những vi khuẩn nội cộng sinh mới cũng liên quan đến
Rickettsia, điều này đã được chứng minh trên các lồi Acanthamoeba[44]. Có một
điều thú vị là các giống amip tương ứng đều đã được phân lập từ các lớp mô mỏng
giác mạc người. Sarcobium lyticum, một loại vi khuẩn có liên quan mật thiết đến
chi Legionella, cũng đã được chứng minh có trong amip được lấy từ mẫu nước bọt
của bệnh nhân viêm phổi. Những chứng minh này cho thấy rằng amip không
những được xem là nguồn gây bệnh cho con người mà còn là vật truyền cho nhiều
loại vi khuẩn cộng sinh khác nhau. Đây có thể là những trường hợp các vi khuẩn
nội cộng sinh không bắt buộc như Legionella pneumophila đã được tìm thấy trong
tế bào Acanthamoeba castellani và trong Tetrahymena pyriformiscó lơng
Trong các mơi trường nước nghèo dinh dưỡng, Legionellae có thể sống sót
nhưng ở trạng thái vơ hoạt, trong đó chúng khơng bị phát hiện bằng các kỹ thuật
nuôi cấy thông thường. Phục hồi những tế bào vô hoạt trở lại trạng thái hoạt động
18


đã được điều khiển thành công bằng FISH trong tế bào chủ Acanthamoeba
castellanii. Những nghiên cứu này có một tác động to lớn đối với ngành dịch
tễ học của những mầm bệnh này.
Sử dụng các cách thức lai tại chỗ (ISH) khác nhau, vi khuẩn nội cộng sinh đã
được tìm thấy trong mang của động vật thân mềm hai vỏ Solemya reidii.. Sinh vật
này đã xử lý như một khuôn mẫu để đánh giá kỹ thuật cố định metacrylate và tách

acetone nhằm tăng cường độ tín hiệu và nâng cao độ nhạy của ISH trên các đoạn
mô. Gần đây, Methanobrevibacter– một lồi có liên quan với vi khuẩn cổ–
đã được tìm thấy bằng FISH trong một lượng nội bào của Reticulitermes speratus,
một loài mối cánh được thu thập từ các quần đảo Nhật bản .
III. FISH trong y học
3.1. Các quần thể vi khuẩn phức tạp
3.1.1. Khoang miệng
Phân tích các quần thể bằng FISH đã thể hiện sự đặc biệt hữu ích trong việc mơ
tả các hỗn hợp vi khuẩn phổ biến hay các hệ vi sinh vật nhiễm tạp. Những phân
tích này cho thấy trong khoang miệng người có chứa hơn 300 lồi vi khuẩn khác
nhau, trong đó có nhiều lồi rất phức tạp khi tiến hành ni cấy hoặc chưa từng
được nuôi cấy. Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên quan
đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này. Sử dụng kỹ thuật ni cấy chun biệt
sẽ chỉ có được sự xem thường đối với đa dạng vi sinh vật. Những lợi ích khi sử
dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện trên những vi khuẩn kị khí gram âm, như
Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythusvà Prevotella intermediatrong
thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng. Phân tích sâu hơn
trên mơi trường phân tử cho thấy một sự đa dạng không ngờ của các loại xoắn
19


khuẩn trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển nhanh chóng
của viêm răng. Số lượng lớn các vi khuẩn hình xoắn và sự đa dạng hình thái
của chúng.

Hình 6. Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng. (a) lai với các đầu
dò vi khuẩn là EUB338 gắn nhãn FITC (xanh lá cây) để hiển thị hình thái khác nhau của
vi khuẩn ở cấp độ đơn bào và TRE I gắn nhãn Cy3 (vàng) để dị tìm các lồi phát sinh
thuộc xoắn khuẩn nhóm I, hầu hết chưa được ni cấy. (b) trên cùng một đối tượng, tiến
hành lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh lá cây) và TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng)

dị tìm xoắn khuẩn trong khoang miệng thuộc các lồi phát sinh nhóm II . Cần lưu ý rằng
sự phân loại xoắn khuẩn theo các nhóm phát sinh lồi dựa trên những dữ liệu của rRNA
16S .

Hình 7. FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I.
(a) độ phân giải thấp với chất mang FluoX Cy3.
20