Tài liệu Thực tập vi sinh vật chuyên ngành doc

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O
TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I
***
NGUY N XN THÀNH (Ch biên) VŨ TH HỒN
NGUY N TH BÌNH - ðINH H NG DUN

Ch biên & hi u đính
PGS.TS NGUY N XUÂN THÀNH

TH C T P VI SINH V T

Chuyên ngành

H N i - 2007

Tr ng i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………1


M CL C
N i dung

Trang

Bài s 1: Trang thi t b c n thi t trong nghiên c u vi sinh v t

1

Bài s 2: Phương pháp c ñ nh tiêu b n và nhu m t bào vi sinh v t

12

Bài s 3: Chu n b d ng c và môi trư ng nuôi c y vi sinh v t

16

Bài s 4: Nuôi c y vi sinh v t

26

Bài s 5: Phương pháp l y m u ñ phân tích vi sinh v t

31

Bài s 6: Phương pháp phân tích vi sinh v t

33

Bài s 7: ðánh giá đ c tính sinh h c c a vi sinh v t

37

Bài s 8: Phân l p tuy n ch n Azotobacter t ñ t

40

Bài s 9: Phương pháp l y m u và phân l p tuy n ch n vi khu n

42

Rhizobium
Bài s 10: Phương pháp xác ñ nh nhanh trao ñ i ch t

vi sinh v t

46

Bài s 11: Vi sinh v t trong môi trư ng

50

Bài s 12: Phương pháp xác ñ nh n m men, n m m c, t o và

53

nguyên sinh ñ ng v t
Bài s 13: Q trình chuy n hố nitơ dư i tác d ng c a vi sinh v t

60

Bài s 14: Chuy n hoá lưu huỳnh dư i tác d ng c a vi sinh v t

63

Bài s 15: Vi sinh v t phân gi i lân (phospho)

65

Bài s 16: Enzym trong q trình trao đ i nitơ, phospho, lưu huỳnh

67

Bài s 17: Xác ñ nh sinh kh i vi sinh v t ñ t

75

Bài s 18: Sinh trư ng c a vi sinh v t

83

Bài s 19: Thăm quan ki n t p v vi sinh v t

86

Ph l c

88

Tài li u tham kh o

91

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………2


Bài s 1
TRANG THI T B C N THI T TRONG NGHIÊN C U VI SINH V T
M c đích yêu c u:
+ N m ñư c nh ng máy móc, trang thi t b c n thi t trong nghiên c u v
vi sinh v t.
+ Bi t s d ng thành th o m t s máy móc thơng d ng c a phịng nghiên c u.
+ Hi u ñư c t m quan tr ng c a cơng tác tiêu đ c, kh trùng.

+ S d ng thành th o kính hi n vi
+ Phân bi t các d ng hình thái c a vi sinh v t
N i dung :
+ Gi i thi u nh ng trang thi t b c n thi t trong phòng nghiên c u vi sinh v t.
+ Gi i thi u các d ng c và nguyên li u c n thi t ñ nghiên c u vi sinh
v t: d ng c l c, kh trùng, d ng c quang h c, d ng c đo lư ng, mơi trư ng
nuôi c y.
+ Thao tác v n hành và s d ng các trang thi t b trong phòng nghiên c u
vi sinh v t
+ C u t o và s d ng, b o qu n kính hi n vi
+ Quan sát hình thái vi sinh v t
I. MÁY MĨC
1. T ni c y vi sinh v t (Incubator)
T ni c y hay cịn g i là t ñ nh ôn là thi t b quan tr ng dùng trong công
tác nghiên c u vi sinh v t, vì nhi t đ trong t có th thay đ i t 00 – 900 C tuỳ
theo ý mu n c a ngư i nghiên c u và nhi t ñ trong t sau khi ñã ñư c xác ñ nh
thì ln ln tr ng thái n đ nh trong su t th i gian nuôi c y.
1.1. C u t o
C u t o v t nuôi c y có 2 l p: l p trong là kim lo i d n nhi t ñ gi nhi t
ñ bên trong c a t , l p ngoài là kim lo i dày hơn và đư c b c phía trong b i
m t ch t cách nhi t (amiant). Gi a l p trong và l p ngoài là kho ng tr ng ñ gi
cho nhi t ñ trong t ít b bi n đ i.
Trong t có b ph n c m nhi t ñ báo nhi t ñ lên xu ng cho rơ-le ho t
ñ ng và qu t gió đư c l p ph n gi a thân đ đi u hồ nhi t đ bên trong.
Ph n ngồi t ni có h th ng b ng ñi n t ñ ñi u ch nh nhi t ñ theo
yêu c u c a nghiên c u. Phía trên t đư c l p van an tồn, n u nhi t ñ trong t
vư t quá dao ñ ng biên ñ , van an toàn s t ng t.
1.2. Cách s d ng
ðóng m ch đi n, b m nút m cơng t c t (có th gi vài giây ñ n khi xu t
hi n ñèn báo trên b ng đi n t ). Sau đó b m nút ñ t nhi t ñ và th i gian (set

up) theo yêu c u nuôi c y, ñi u ch nh nhi t ñ và th i gian b ng n nút tương
Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………1


ng mũi tên lên ho c xu ng. Nhi t ñ trong t m tăng d n và ñ t t i nhi t ñ ñã
xác ñ nh.
Nhi t ñ s đư c duy trì trong su t th i gian ni c y đã đ nh s n. Trên
b ng đi n t ln xu t hi n ch s báo nhi t ñ th c t trong t . Khi đ th i gian
ni c y, t s phát ra ti ng báo hi u và rơ le t ng t ñ t ñ ng t t ch ñ làm
vi c.
N u mu n nuôi c y liên t c lâu dài có th khơng c n đ t ch ñ th i gian,
ch ñ t nhi t ñ . Khi nào mu n k t thúc thì b m nút t t công t c ngu n.
1.3. Khi s d ng máy c n chú ý nh ng ñi m sau ñây
+ Hi u ch nh thi t b trư c khi s d ng.
+ Ph i n i t v i dây ñ t và ki m tra ñi n th c a máy v i ñi n th
nơi
ñ t máy xem có gi ng nhau không, trư ng h p không gi ng nhau ph i dùng
bi n th .
+ Khi s d ng t m l n ñ u, ph i ki m tra b ph n ñi u ch nh nhi t ñ
xem có chính xác khơng, nhi t đ trong t có ñ u không.
+ C a t luôn luôn ph i đóng kín, tr khi l y ho c cho ngun li u vào
ni c y nhưng cũng khơng đư c m c a t r ng và lâu.
+ Luôn luôn ph i ñ m b o cho t m ñư c khô ráo, s ch s , ph i cho t
ho t ñ ng thư ng xuyên nh t là nh ng hơm tr i m. Khi làm đ các ch t d ch
nuôi c y ho c làm b n trong t , ph i lau chùi và sát trùng ngay.
+ Nên ñ t trong t 1 c c nư c vơ trùng trong q trình ni c y ñ giúp
cho qu t gió ho t ñ ng t t.
+ Khi khơng dùng, t t cơng t c đi n và rút phích c m đi n ra.
2. T s y khô (Drying oven)
2.1. Tác d ng

Dùng t s y khơ đ kh trùng các d ng c th y tinh, ñ s như ng nghi m,
xi lanh, h p l ng, c c, ph u, c i ch y s ..., các đ kim khí như dao, kéo, panh và
các d ng c khác khơng có nư c khác như bông, băng, v i... Tr v t li u làm t
cao su và môi trư ng nuôi c y khơng đư c kh trùng b ng t s y khô.
Nguyên lý c u t o c a t s y khô cũng g n gi ng như t m, ch khác là có
th ti t trùng nhi t ñ 175 - 200o C.
2.2. Cách s d ng t s y khô
Các d ng c ph i r a s ch, đ khơ, bao gói c n th n trư c khi cho vào t , sau
khi s p x p các th vào trong t r i đóng kín c a và đóng các l thơng khí. B t cơng
t c đi n, đ t ch đ làm vi c cho t (ñi u ch nh nhi t ñ và th i gian gi ng như v i
t ñ nh ôn). Thông thư ng d ng c nuôi c y và phân tích vi sinh v t đư c kh trùng
160-180oC trong 2 gi . V i các d ng c , như: pipét, xi lanh,… khơng đư c s y
q 60oC vì nhi t đ cao làm giãn n thu tinh d n ñ n m t ñ chính xác c a d ng
c . Lưu ý khi s y khơng nên đ t d ng c sát thành t vì đ y nhi t đ thư ng cao
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………2


hơn nhi u d làm cháy gi y gói ho c nút bông, cũng không nên x p d ng c q khít
nhau đ khơng khí có th lưu thơng ñư c và làm nóng ñ u các v t c n kh trùng.
Sau khi ng t m ch ñi n, ch nhi t ñ h d n xu ng b ng nhi t đ phịng thì
m i đu c m c a t ñ l y d ng c s y ra. D ng c l y ra ph i ñ trên giá g ,
trên gi y ho c v i, khơng đư c đ
trên g ch men, trên sàn g ch ho c sàn xi
măng vì d ng c đang nóng g p l nh s d v và làm nh hư ng đ n tính vơ trùng
c a d ng c .
3. N i h p hơi nư c cao áp (Autoclave)
3.1. Nguyên lý
N i h p hơi nư c cao áp (hình 1) làm b ng kim lo i ch u ñư c nhi t ñ cao
(ít nh t là 135o C) có th dùng đi n, dùng c i ho c dùng than ñun cho nư c sôi,
hơi nư c s nén d n l i trong n i và n u ti p t c đ cho nư c sơi thì áp l c

trong n i s tăng d n, áp l c càng tăng thì nhi t đ c a hơi nư c trong n i càng
cao, như v y gi a nhi t ñ t0 c a hơi nư c và áp l c P c a nó có liên quan v i
nhau, nhưng không ph i theo m t t l ñư ng th ng (xem ñ th ).
Khi áp l c k ch s 0 có nghĩa là: áp l c P trong n i h p = áp l c P khơng khí.
Cho nên khi áp l c k ch 1kg/cm2 thì chính là ch hi u s gi a áp l c bên
trong v i áp l c khơng khí t n t i trong n i.
1kg/cm2 = P (trong n i) - P (khơng khí trong n i)
Do đó áp l c P trong n i khơng phù h p v i P áp l c k hay nói m t cách
khác, nhi t đ trong n i khơng tương ng v i nhi t đ c a áp l c k . Vì v y
mu n cho nhi t ñ trong n i phù h p v i áp l c k thì ph i lo i b h t khơng khí
trong n i ra (1kg/cm2 = 1atm = 1 phoud).
B ng 1. So sánh m i liên quan gi a áp su t ghi trên áp k c a n i h p
bi u th b ng atmosphere và nhi t ñ trong n i đã lo i h t khơng khí
Áp
su t
(atm)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4

Nhi t
đ (oC)
100,0
102,5
105,0
107,5
110,0

Áp
su t
(atm)
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9

Nhi t
ñ (oC)
112,5
114,5
116,
117,0
119,0

Áp
su t
(atm)
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4

Nhi t
ñ (oC)
121,0
129,9

124,0
125,0
126,0

Áp
su t
(atm)
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0

Nhi t
ñ (oC)
127,0
128,0
129,0
130,0
131,0
132,0

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………3


Hình 1. Sơ đ n i h p áp l c
ð lo i b h t khơng khí trong n i ra có 2 cách:
a) ðóng khóa thốt hơi đ tăng áp l c trong n i lên ñ n kho ng 0,3 atm
r i xì cho thốt h t hơi ra, sau đó khóa l i và cho tăng áp l c.

b) M khóa thốt hơi và đun cho ñ n khi hơi nư c b t ñ u thoát ra thành
m t lu ng hơi tr ng khá m nh, khá đ u thì đóng l i và cho tăng áp l c.
3.2. Cách s d ng n i h p cao áp
- ð nư c vào n i h p v i lư ng v a ñ (xem v ch ngang ghi trên ng
th y tinh ho c bình ch a l p bên ngồi n i h p). Chú ý nư c ph i ng p dây may
so trong n i n u là n i h p xách tay.
- Các d ng c ñem h p ph i đư c bao gói k , đ i v i các bình và ng mơi
trư ng có nút bông ph i b c b ng gi y d u ho c gi y nhơm đ tránh hơi nư c
ñ ng làm ư t nút.
- Khi s p x p d ng c vào n i h p khơng nên đ sát nhau q, đ v t n ng
xu ng dư i v t nh lên trên.
- ð y n p, khóa ch t các c theo t ng đơi đ i x ng nhau đ kh i vênh,
kh i h , khi tháo khóa cũng ph i làm như v y. ðóng van đi u áp và van x hơi.
- M m ch ñi n ho c ñ t nhiên li u ñ cung c p nhi t cho n i, n nút m
công t c n i (nút on), ñ t ch ñ làm vi c (nhi t ñ và th i gian h p) cho n i
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………4


b ng cách ñi u ch nh mũi tên lên xu ng. Ch đ làm vi c ln th hi n trên
b ng ghi ñi n t . Sau khi h p ñ theo nhi t ñ và th i gian ñ nh s n, rơ le s t
ng t, n i phát ra ti ng kêu báo hi u q trình h p đã k t thúc.
V i n i h p xách tay ph i ln ln có m t ñ theo dõi kim ch áp l c trên
ñ ng h áp l c k trong khi h p, lo i h t khơng khí trong n i theo 2 phương
pháp ñã nêu trên. Khi ñ t t i m c c n thi t thì đi u ch nh ngu n nhi t đ duy trì
áp l c khơng đ i trong m t kho ng th i gian c n thi t.
Nhi t ñ và th i gian h p kh trùng ph thu c vào v t đem kh trùng và
m c đích nghiên c u. Ngư i ta thư ng h p nhi t ñ 121oC trong kho ng 20
phút thì nha bào c a m t s lo i vi khu n cũng s b tiêu di t.
- Khi ñ t t i th i gian c n thi t thì ng t ñi n ( n nút off) ho c rút h t
nhiên li u ra và ñ i cho áp l c h d n xu ng 0o C, nhi t ñ trong n i gi m h n

r i m i ñư c m n p l y d ng c ñã kh trùng ra. Chú ý tránh h áp l c ñ t
ng t b ng cách m van xì hơi ra quá m nh s làm r n n t ho c v d ng c .
Cũng không nên ñ n i h p ngu i l nh m i l y d ng c ra, vì lúc này n p n i s
mút ch t vào mi ng đ m cao su r t khó m .
- Các d ng c l y ra khơng đư c ñ n n g ch men, n n ñá, n n xi măng (vì
d ng c đang nóng g p l nh s v , n t) và ñ m bào tính vơ trùng cho d ng c .
4. T l nh (Freezer)
T l nh là m t thi t b quan tr ng dùng ñ gi và b o qu n gi ng vi khu n,
virus và b o qu n các lo i huy t thanh, các lo i vacxin, các mơi trư ng dùng đ
ni c y...
T l nh 0o- 4o C dùng ñ gi gi ng vi khu n.
T l nh -15o C ñ n -30o C dùng ñ gi gi ng virus.
5. Máy ly tâm (Centrifugal machine)
5.1. Cơng d ng
- T p trung đáy ng các ph n t c n nghiên c u ch a trong m t b nh ph m
hay ch t mang.
- T p trung vi khu n nuôi c y trong mơi trư ng l ng đ tách riêng vi
khu n.
- Làm trong m t ch t l ng ch a nhi u ph n t ñ c v n ñ c.
- Tách h ng c u riêng v i huy t tương….
5.2. Cách s d ng
Máy ly tâm thông thư ng có m t tr c quay trịn, v phía trên c a tr c có
m t hình sao ñ nh n các ng ch a ch t l ng c n ly tâm. Các ng này ñư c móc
vào sao b ng m t cái quai. Khi quay các ng s giãn ra th ng góc v i tr c quay
ñ ng và các h t l ng xu ng theo ñư ng tr c c a ng và d n v phía đáy. V i
ki u máy này, t c ñ t i ña là 4500 - 6000 vòng trong m t phút.

Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………5

Các máy ly tâm g n đây có b ph n thăng b ng t đ ng, có máy đ th i
gian t đ ng, có đ ng h ch t c ñ v.v..., khi ly tâm ch c n v n các nút theo ý
mu n.
6. Nh ng thi t b c n thi t khác
- Máy hút chân khơng (vacuum gauge)
- Máy đ m khu n l c (colony counting)
- Máy ño pH (pH meter) hay thang ño pH (pH paper set)
- Máy c t nư c (Deionizers)
- Máy ñánh m u (Mixers)
- Máy ñ m t bào (cell counting)
- Máy l c (shaker)
- Phòng ho c bu ng vô trùng (clean bench, laminars)
II. CÁC D NG C VÀ THI T B PHỊNG THÍ NGHI M
1. Thi t b quang h c
- Kính hi n vi quang h c (Microscopy)
- Kính hi n vi ch p nh
- ðèn soi kính hi n vi
- T quang n n đen
- Thư c đo v t kính và thư c đo th kính
- Kính lúp hai m t đeo trán
- Máy projector
- Máy Over head
- Máy nh
- ðèn t ngo i (UV lamp)
2. Thi t b ño lư ng
- Cân k thu t (technical balance)
- Cân ti u ly có l ng kính
- Cân ti u ly xách tay
- Cân bàn
- Cân phân tích đi n

- Nhi t k treo tư ng và các lo i nhi t k ño nhi t ñ khác
- ð ng h ñi n t ñ m phút, giây
3. Các lo i d ng c khác
- Các lo i d ng c th y tinh: Phi n kính, h p l ng, ng nghi m, l , bình,
ph u, c c ng đong, xi lanh, pipet, que g t, ñèn c n...

Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………6


- Các lo i d ng c kim lo i: Dao m các lo i, kéo th ng, kéo cong, panh,
que c y, đèn xì, h p tiêu đ c, cưa xương...
- Các lo i d ng c ñ men, s : Khay men, c i chày s , xoong n i đ pha
ch mơi trư ng.
- Các lo i d ng c cao su, v i, bông, băng: Găng tay ñ m và ñ r a
d ng c , ng, bông th m nư c, bông không th m nư c, v i g c, v i l c, v i
màn.
- Các lo i hóa ch t đ ch môi trư ng, r a d ng c th y tinh và sát trùng
tiêu ñ c.
- Các lo i thu c nhu m và thu c th ph n ng sinh hóa.
- Các lo i gi ng vi khu n và virus, các lo i kháng huy t thanh ñ ch n
đốn, các lo i khu n t đ ch n đốn.
III. KÍNH HI N VI
Kính hi n vi là m t d ng c quang h c r t c n thi t đ nghiên c u hình
thái vi sinh v t và nghiên c u nh ng v t h t s c nh mà m t thư ng khơng th
nhìn th y đư c, có nhi u lo i kính hi n vi khác nhau.
* C u t o kính hi n vi quang h c
Kính hi n vi quang h c g m có 2 b ph n:
1. B ph n cơ h c
1.1 Chân kính hay đ kính
Dùng đ đ kính hi n vi tr ng thái cân b ng, c u t o t kim khí đ c bi t.

1.2 Thân kính
N i li n v i chân kính, đư c t o t lo i kim khí đ c bi t. Thân kính ñ g n
toàn b các b ph n c a kính hi n vi.
1.3 ng kính
Là m t ng kim khí r ng hình tr l p trên tr kính, ñ u trên c a ng kính l p
th kính, phía dư i c a ng kính là bàn xoay dùng đ l p các v t kính. Tác d ng
c a ng kính là khi v t nh đư c phóng đ i l n th nh t b i v t kính, thì đưa v t
nh qua ng kính t i th kính đ phóng v t nh l n th 2. Như v y v t nh ta
quan sát th y chính là nh o.
1.4 Khay kính hay đĩa kính
Có th hình vng hay hình trịn là nơi ñ t tiêu b n ñ quan sát, gi a có l
th u quang đ đưa ánh sáng t b t quang kính lên tiêu b n. Trên khay kính có
b ph n k p tiêu b n cho v ng và b ph n g i là xa ñ di chuy n tiêu b n theo
hai chi u khác nhau, t trái sang ph i, t trư c ra sau và ngư c l i đ tìm v t
nh. Ngồi ra, khay kính cịn có th di chuy n theo các chi u b ng cách v n hai
c hai bên khay kính.
1.5 c đi u ch nh

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………7


G m có c đi u ch nh l n ( c sơ c p) và c ñi u ch nh nh ( c vi c p). c sơ c p
dùng ñ ñi u ch nh tiêu ñi m, c vi c p dùng ñ ñi u ch nh cho nh v t rõ nét.
2. B ph n quang h c:
2.1. Gương ph n chi u
ð t phía dư i khay kính g m có hai m t, m t m t ph ng và m t m t lõm,
dùng ñ l y ánh sáng.
2.2. T quang kính
ðư c l p vào phía dư i khay kính b i m t c c ñ nh, dùng ñ t p trung ánh sáng
vào tiêu b n.

2.3. B ph n ch n sáng
Có hình gi ng như con ngươi đ t phía dư i t quang kính có th m r ng
hay h p dùng đ đi u hịa ánh sáng vào tiêu b n.
2.4. V t kính
Là m t h th ng quang h c r t quan tr ng và ph c t p, g m m t s th u
kính, nó tr c ti p phóng đ i nh th t c a v t xem, kh năng phóng ñ i c a v t
kính ph thu c vào tiêu c t c là ph thu c vào bán kính cong c a th u kính;
th u kính càng cong, tiêu c càng ng n thì kh năng phóng ñ i càng l n. V t
kính khi dùng ñư c l p vào bàn xoay phía dư i ng kính. Có hai lo i v t kính:
+ V t kính khơ: là v t kính có đ phóng đ i th p x8; x20; x40; dùng ñ
xem tươi, xem vi khu n di ñ ng, xem khu n l c, hay xem ký sinh trùng ho c
xem các tiêu b n t ch c...
+ V t kính d u: là v t kính có đ phóng đ i cao x 90; x100; x 120…, nó
có m t vịng khác màu đ u v t kính đ phân bi t v i v t kính khơ.
V t kính khơ và v t kính d u khác nhau ch t mà ánh sáng ph i ñi qua
tiêu b n (phi n kính) và v t kính. v t kính khơ ch t đi qua là khơng khí mà ch
s khúc x (chi t xu t) c a khơng khí là n = 1 r t khác v i ch s khúc x c a
th y tinh n = 1,52; do đó các tia sáng khi ra kh i tiêu b n s b ph n x và ph n
ngoài c a chùm ánh sáng khơng l t đư c vào v t kính.
v t kính có đ phóng đ i l n ngư i ta dùng d u b ch hương (huile de
cèdre) có ch s khúc x n =1,51 x p x v i ch s khúc x c a th y tinh n = 1,52
ñ t vào gi a tiêu b n và v t kính. Lúc này th y tinh và d u b ch hương là m t
mơi trư ng g n như đ ng nh t, nên ánh sáng khi ñi qua th y tinh s không b
khúc x mà chi u th ng vào v t kính.

Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………8


Tiêu đi m

Tia sáng

T quang kính

2.5. Th kính
G m có hai th u kính l p vào hai đ u c a m t cái ng nh l p trên ñ u ng
kính, m t th u kính hư ng v m t ngư i xem và m t th u kính hư ng v v t quan
sát, kính trên là kính phóng đ i nh th t do v t kính thu đư c, kính dư i là kính th
trư ng làm sáng t th trư ng do đó mà ta nhìn th y rõ nh đư c phóng đ i.
Th kính có đ phóng đ i càng cao thì kho ng cách gi a hai th u kính càng
ng n (tiêu c c a th kính càng ng n) và ngư c l i. ð phóng đ i c a th kính
thư ng có 4 s : x5 ; x7 ; x10 ; x15.
Mu n bi t ñ phóng đ i c a v t quan sát (đ phóng đ i c a kính hi n vi),
ngư i ta nhân đ phóng đ i c a v t kính v i đ phóng đ i c a th kính. Ví d
dùng v t kính d u x90 và th kính x15 thì đ phóng đ i c a v t quan sát hay đ
phóng đ i c a kính hi n vi s là:
90 x 15 = 1350 (l n)

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………9


8
9

7
6
10
13
11

5
3
4

2

12

14

1

Hình 2: C u t o kính hi n vi
1. ð kính
8. Th kính
2. ðèn chi u
9. ng kính
3. B t quang kính
10. Thân kính
4. Vịng b o hi m
11. c sơ c p
5. Khay kính
12. c vi c p
6. V t kính
13. Cơng t c
7. Bàn xoay
14. B ph n đi u ch nh khay kính
3. Cách s d ng kính hi n vi
3.1. Ki m tra kính hi n vi
ð t kính vào v trí làm vi c, c m ñi n ho c quay gương ph n chi u v

phía ánh sáng, đ t kính trên bàn cho ngay ng n tư th có l i nh t cho ngư i quan
sát. Khi quan sát tiêu b n c n s d ng c 2 m t, m t trái dùng quan sát, m t ph i
dùng ñ ghi chép ho c v , không nên nheo m t m t l i đ xem, vì như th r t d
m i m t và ñau ñ u. C n luy n t p đ có th xem kính đư c b ng c hai m t.
3.1. Quan sát tiêu b n tươi v i v t kính khơ
Khơng dùng t quang kính và b ph n ch n sáng, nh t là ñ i v i v t kính
có đ phóng đ i th p (38), khi ngu n sáng h p thì dùng gương ph ng v i v t
Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………10


kính có đ phóng đ i th p, dùng gương lõm v i v t kính có đ phóng đ i cao
(340), khi ngu n sáng r ng thì dùng gương nào cũng ñư c. H th p t t cùng t
quang kính và ít m b ph n ch n sáng.
3.2. Quan sát tiêu b n nhu m v i v t kính d u
Ln ln s d ng t quang kính, nâng cao t quang cho sát vào tiêu b n.
Khi s d ng t quang kính c n chú ý m y ñi m:
ð t phi n kính lên khay kính và c đ nh, dùng v t kính có đ phóng đ i
th p đ có nh trong th trư ng trư c. H th p v t kính cho sát g n tiêu b n (khi
h v t kính m t nhìn ngồi đ tránh ñè m nh làm v tiêu b n). Theo dõi trong
ng kính, r i t t v n c sơ c p lên, đ n khi trơng th y nh (thư ng có hình
ch p) thì ng ng v n c sơ c p và b t ñ u s d ng c vi c p, v n h t s c ch m
ñ n khi th y nh rõ nét thì thơi (có th v n t i ho c v n lui). Sau khi ñã ñi u
ch nh tiêu đi m v i v t kính đ phóng đ i th p thì quay v t kính đó ra, nh m t
gi t d u b ch hương vào ñi m ñ nh soi trên tiêu b n, khơng đ gi t d u lan r ng
ra, xoay ñ u v t kính d u vào, và v n v t kính d u sát xu ng tiêu b n ng m vào
gi t d u, chú ý m t nhìn ngồi đ đ ng v n sát q s đè v phi n kính, đ n khi
th y ch p nh, t c là nh đã trơng th y nhưng chưa th y rõ, lúc này ñi u ch nh
c vi c p cho ñ n khi nh v t rõ nét trong th trư ng.
4. Cách b o qu n kính hi n vi
+ Khi l y kính t trong h p kính hi n vi ra, dùng tay ph i n m ch c, kéo

kính ra theo hư ng n m ngang, khơng đ đ ng vào thành h p, sau đó dùng tay
trái đ chân kính đ mang đi (bao gi cũng ph i dùng 2 tay khi di chuy n). N u
mang ñi xa ph i c ñ nh ch c ch n ñ tránh b l c.
+ Không ñư c s tay vào đ u v t kính và th kính, n u b n có th dùng
v i m m ho c gi y lau kính đ lau. V t kính d u dùng xong l y v i m m m n
hay gi y dai m n lau s ch d u b ch hương đ u v t kính, sau đó t m xylon lau
cho h t d u (xylon có tác d ng làm tan d u b ch hương). Cu i cùng lau l i m t
l n n a b ng v i m m, m n hay gi y m m.
+ Khi dùng xong ph i xoay các b ph n c a kính v đúng v trí quy đ nh,
khơng đư c đ v t kính n m trong tr c kính như lúc quan sát mà ph i ñ t ñúng
l mù ho c xoay v t kính ra hai bên và v n cho áp sát xu ng đĩa kính, t quang
h th p xu ng, gương ph n chi u xoay d c thân kính. Tồn b kính đ u coi như
tr ng thái ngh .

Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………11


* Câu h i ôn t p bài s 1:

1. Trang thi t b , máy móc chuyên d ng cho nghiên c u VSV?
2. Nguyên lý v n hành và cách s d ng n i h p hơi nư c cao áp (Autoclave)?
3. C u t o và cách s d ng kính hi n vi?
4. C u t o và cách s d ng máy ñ m khu n l c?
5 Trình bày phương pháp và cách tính kích thư c t bào VSV?

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………12


Bài s 2
ð NH TIÊU B N VÀ NHU M T BÀO VI SINH

PHƯƠNG PHÁP C
M c đích u c u:
+ Hư ng d n h c viên làm tiêu b n vi sinh v t t các m u v t.
+ N m v ng phương pháp nhu m ñơn, nhu m giemxa và phương pháp
nhu m Gram.
+ Nh n d ng hình thái vi sinh v t và phân bi t vi khu n Gram dương,
Gram âm
N i dung:
+ Phương pháp làm tiêu b n vi sinh v t
+ Pha ch thu c nhu m và các phương pháp nhu m: nhu m ñơn, Gram,
Giem xa, Wright.
+ Quan sát m t s tiêu b n hình thái vi sinh v t: c u khu n, tr c khu n,
c u tr c khu n
I. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU B N VÀ NHU M T BÀO VI SINH V T
1. M c đích c a c đ nh tiêu b n và nhu m t bào VSV
T bào vi sinh v t g n như là không m u, do đó quan sát b ng phương
pháp xem tr c ti p r t khó, vì v y c n ph i làm tiêu b n r i ñem nhu m m u.
Nhu m vi sinh v t có 4 m c đích:
- ð nghiên c u hình thái, c u t o ñ c bi t c a vi sinh v t như giáp mô,
nha bào, …
- ð phân lo i vi sinh v t căn c vào tính ch t b t m u Gram, tính ch t
kháng c n, kháng toan.
- ð d phân bi t và quan sát ñư c các vi c u t o trong t bào VSV.
- ð b o t n tiêu b n trong m t th i gian dài, ñ ch p nh.
2. Phương pháp làm tiêu b n vi sinh v t ñ nhu m
2.1. Chu n b phi n kính
- Ch n phi n kính trong, s ch, khơng m , khơng có d u m , đã ñư c
ngâm trong c n, khi dùng lau khô b ng v i m m và hơ qua trên ng n l a ñèn
c n.

- Khoanh di n ph t vi sinh v t b ng cách dùng bút chì m khoanh m t
vòng m t dư i phi n kính.
2.2. Ph t m u v t
- N u l y m u v t là vi sinh v t t ng canh trùng d ch th thì sau khi ñã
kh trùng que c y và ñ ngu i, l y m t gi t môi trư ng nh lên phi n kính ch
đã khoanh trịn b ng bút chì m , r i dàn m ng ra trong di n ñã khoanh.
C n chú ý thao tác khi l y vi sinh v t đ ph t kính: Tay ph i c m que c y,
nung ñ que c y b ch kim và đưa tồn b ph n kim khí c a que c y qua ng n
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………13


l a ñèn c n 2 - 3 l n, làm trư c khi l y vi sinh v t và sau khi đã ph t kính xong;
tay trái c m ng mơi trư ng đ vào lịng bàn tay và c m nghiêng ng b ng 5
ngón tay. Dùng ngón tay út c a bàn tay ph i m nút bơng, sau khi đã quay nút
bơng m t vịng trong mi ng ng cho trơn (k p nút bông vào gi a ngón tay út và
bàn tay, hay gi a ngón tay út và ngón tay đeo nh n) hơ ng mơi trư ng trên
ng n l a đèn c n, và đ u ng nghi m ln ln ñ sát ng n l a ñèn ñèn c n,
cho que c y vào sâu trong ng môi trư ng l y ra m t gi t môi trư ng, rút que
c y ra, hơ mi ng ng nghi m và đóng nút bơng l i, cho ng nghi m vào giá, sau
đó c m phi n kính đã chu n b s n, mu n c m phi n kính cho v ng thì ngón tay
cái gi m t c nh dài c a phi n kính, ba ngón ti p gi c nh đ i di n, ngón út đ
m t dư i phi n kính, gi cho phi n kính khơng di chuy n trong khi ph t.
- N u là vi sinh v t t canh trùng đ c (mơi trư ng th ch): thì dùng que c y
b ch kim l y m t ít vi sinh v t m t khu n l c, (khơng nên l y nhi u vi sinh v t
vì ph t dày quá s khó xem và khó phân bi t hình thái c a vi sinh v t). ð t que
c y lên phi n kính đã có s n m t gi t nư c c t hay nư c sinh lý ho c nư c th t
vơ trùng đ làm huy n d ch vi sinh v t, tr n ñ u vi sinh v t trong gi t nư c r i
dàn m ng ra.
- N u dùng máu đ ph t kính thì có th l y máu tĩnh m ch rìa tai (đ i
v i ñ ng v t s ng) ho c máu tim (ñ i v i ñ ng v t m khám). ð t gi t máu lên

phi n kính, r i dùng đ u m t phi n kính khác, có c nh nh n và th ng ho c c nh
c a m t lá kính đ t nghiêng m t góc 30 - 45o v i phi n kính đ gi t máu lan
kh p c nh r i ñ y nh và ñ u t i ñ u kia c a tiêu b n, máu theo phi n kính ch
khơng ph i b phi n kính ñ y ñi, tiêu b n t t n u máu đư c dàn đ u trên phi n
kính thành m t l p m ng.
- N u dùng ph t ng lách, gan, th n, h ch, ph i... thì c t m t mi ng nh ,
th m b t nư c b ng bông hay gi y th m, r i ch m nh trên phi n kính đ 3 - 4
ch , khơng đè m nh trên phi n kính, ch th m nh nhàng, ho c có th kéo lư t
nh mi ng ph t ng trên phi n kính thành v t dài cũng ñư c.
- N u dùng ñ m m , t y xương ph t kính thì l y que c y l y đ m ch có
nhi u m nh t, r i dàn m ng ra trên phi n kính, n u m khơ thì trư c khi dàn, nh
m t gi t nư c sinh lý vô trùng trên phi n kính, là tương t v i t y xương.
2.3. S y khơ tiêu b n : Có 2 cách
- ð t khơ nhi t đ phịng thí nghi m.
- Hơ cao trên ng n l a ñèn c n, khơng đ sát tiêu b n vào ng n l a, nóng
quá thân vi sinh v t s co qu p l i, protit trong nguyên sinh ch t đơng nhanh,
nh hư ng đ n hình thái t bào.
2.4. C ñ nh tiêu b n
+ C ñ nh tiêu b n có 3 m c đích:
- Gi t ch t vi sinh v t ñ vi c s d ng không gây nguy hi m.
- Làm cho vi sinh v t g n ch t vào phi n kính, khi r a nư c khơng b trơi đi.
- Làm cho vi sinh v t b t m u t t hơn.
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………14


Có th c đ nh b ng nh ng phương pháp sau ñây:
+ C ñ nh b ng nhi t ñ : Hơ phi n kính trên ng n ñèn c n b ng cách ñưa ñi,
ñưa l i kho ng cách 10-15 cm ñ 3 - 4 l n, n u hơ nóng quá s làm bi n d ng
hình thái vi khu n.
+ C đ nh b ng ch t hóa h c:

- Nh vài gi t c n nguyên ch t hay c n 96o
5 - 10 phút
- Nh vài gi t c n mêtylic
2 - 3 phút
- Ngâm tiêu b n vào axêton
5 phút
+ C ñ nh b ng hơi foocmalin
3 - 5 phút
II. Phương pháp nhu m tiêu b n
2.1. Thu c nhu m ñơn và các phương pháp nhu m ñơn
2.1.1. Dung d ch fucxin (fuchsine) trong axit phênic
+ Chu n b thu c nhu m
Fucxin ki m
1g
o
C n nguyên ch t hay 96
10 ml
Axit phênic k t tinh
5g
Nư c c t
100 ml
Nghi n fucxin v i 5ml c n trong c i s ch, qu y ñ u, ñ t t 2/3 lư ng
nư c vào, qu y ñ u, xong cho thêm axit phênic, tr n đ u cho vào l kín ñ 24
gi , ñem l c qua gi y, tráng c c b ng 1/3 nư c c t và 1/2 c n còn l i, dung d ch
này là dung d ch fucsin ñ c, khi dùng nhu m đơn ho c nhu m Gram thì đem pha
lỗng dung d ch này g p 10 l n v i dung d ch axit phênic 5%.
Dung d ch fucxin
10 ml
Dung d ch axit phênic 5%
90 ml

+ Phương pháp nhu m ñơn
a) Nh thu c nhu m lên tiêu b n ñã c ñ nh ñ 1 - 2 phút, có khi ñ n 10
phút tùy theo lo i thu c nhu m.
b) R a nư c, đ vịi nư c t t ch y xu ng m t ñ u phi n kính c m hơi
nghiêng đ n khi nư c trong là đư c.
c) Th m khơ b ng gi y th m hay b ng hơi nóng.
d) Quan sát trên kính hi n vi
2.1.2. Dung d ch xanh mêtylen trong axit phênic
+ Chu n b thu c nhu m
Xanh mêtylen
1g
Axit phênic k t tinh
1g
C n nguyên ch t 100o
10 ml
Nư c c t
10 ml
Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………15


Cách pha gi ng như fucxin trên.
+ Phương pháp nhu m cũng gi ng nhu m fucsin.
2.2. Phương pháp nhu m Gram( nhu m kép)
2..2.1. Chu n b thu c nhu m
a) Dung d ch tím gentian trong axit phênic
Tím gentian
1g
o
C n 96
10 g

Axit phênic k t tinh
5g
Nư c c t
100 ml
b) Dung d ch fucxin trong axit phênic
Fucxin ki m
1g
o
C n 96
10 g
Axit phênic k t tinh
5g
Nư c c t
10 g
Cách pha 2 dung d ch này gi ng như dung d ch fucxin nói trên
c) Pha dung d ch lugol
Iơtđua kali (KI)
1g
I t tinh th (I)
0,5 g
Nư c c t
150 ml
Nghi n iơtđuakali v i m t ít nư c c t, sau đó cho i t đã tán nh vào l c
cho tan h t, cu i cùng cho ñ nư c c t, l c ñ u, ñ 24 gi r i ñem l c. ð ng vào
chai m u. Khơng nên pha nhi u vì d b bi n ch t.
d) Pha dung d ch t y m u c n axêtôn.
C n nguyên ch t
5 ph n
Axêtơn
1 ph n

N u khơng có axêtơn thì dùng c n nguyên ch t ho c 90o cũng ñư c.
2.2.2. Phương pháp nhu m Gram
1) Nh dung d ch tím gentian lên tiêu b n 1 - 2 phút.
2) R a nư c nhanh, v y khô nư c.
3) Nh dung d ch lugol ñ 1 phút (tiêu b n có m u nâu đen).
4) R a nư c nhanh, v y khô nư c.
5) Nh c n axêtơn t đ u phi n kính, nghiêng phi n kính cho c n ch y
qua ch ph t vi sinh v t.
6) R a nư c nhanh.
7) Nh dung d ch fucxin lỗng đ 1 phút.
8) R a nư c
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………16


9) Th m khơ - hơ khơ - xem kính.
Vi khu n Gram dương b t màu tím, vi khu n Gram âm b t màu h ng.
* C n chú ý: Bư c t y m u b ng c n axêtôn r t quan tr ng. N u t y
khơng k thì d nh m l n vi khu n Gram âm v i vi khu n Gram dương và
ngư c l i, n u t y lâu quá thì vi khu n Gram dương m t m u tím cho nên khi
nhu m màu đ fucxin thì cũng b t m u đ .
Quan sát trên kính hi n vi nh n th y: h ng c u nhu m m u nâu h ng,
nhân b ch c u nhu m màu tím.
* Câu h i ơn t p: Bài s 2

1. Trình bày 3 phương pháp cơ b n trong nghiên c u v VSV?
2. Th nào là Gram? ình bày s sai khác gi a nhu m ñơn và nhu n kép?
3. Các bư c ti n hành ch t o tiêu b n?

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………17

Bài s 3
CHU N B D NG C VÀ MÔI TRƯ NG NUÔI C Y VI SINH V T
M c ñích, yêu c u:
+ Bi t ñư c và chu n b d ng c nuôi c y VSV
+ N m v ng cách pha ch môi trư ng nuôi c y VSV
+ Hi u ñư c phương pháp kh trùng các lo i d ng c và môi trư ng nuôi
c y VSV
N i dung ki n t p:
+ Chu n b và r a d ng c c n thi t đ pha ch mơi trư ng ni c y VSV
+ H c cách b c gói các d ng c thông d ng và nút bông cho ng nghi m,
pipet, …
+ Cách pha ch môi trư ng th ch nghiêng và ñĩa th ch
I. CHU N B D NG C
1. Các d ng c thư ng ñư c s d ng trong nghiên c u vi sinh v t
- ðĩa petri (h p l ng)
- ng nghi m, bình tam giác, bình c u, chai thu tinh
- Pipét, xi lanh, que g t, que c y
- Lam kính, lamen
2. Yêu c u
Các d ng c ph i s ch v m t hoá h c và vi sinh v t h c (các d ng c ph i
đư c vơ trùng).
3. Cách x lý d ng c trư c khi r a
- ð i v i d ng c thu tinh m i chưa s d ng, c n ngâm nư c lã ho c
dung d ch H2SO4 loãng 24 gi . R a l i b ng xà phòng và nư c nhi u l n cho t i
khi dung d ch r a có pH trung tính.
- Các d ng c đã qua s d ng, nh t là các VSV gây b nh trư c khi r a
nh t thi t ph i ñư c kh trùng b ng hơi nư c áp l c ñ gi t ch t các t bào, ñ m
b o an tồn cho ngư i r a, khơng cho m m b nh cũ nhi m vào môi trư ng m i.
- ð i v i các VSV khơng gây b nh cho ngư i và đ ng th c v t, ch c n

tháo nút bông, x p vào n i ho c ch u nhôm chuyên d ng, đ nư c xà phịng,
dìm d ng c ng p kín nư c, đun sơi 15-30 phút. Gom các c n b n vào túi nilon,
bu c kín r i m i đ b .
- D ch ni VSV trư c khi ñ b c n thêm vài gi t formalin, l c m nh ñ
gi t ch t t bào.
- S d ng dung d ch sunfo-cromic ñ ngâm t y các v t b n trên d ng c
thu tinh.
4. Cách r a d ng c
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………18


Ch n ch i r a thích h p v i t ng lo i ng ho c bình, phía ñ u nên ñ m
dây chun ñ ph n lõi s t khơng ch c th ng đáy ng nghi m ho c đáy bình.
Dùng mi ng nhám th m nư c r a ho c bông th m c n lau s ch các ký
hi u ghi trên thu tinh.
Dùng ch i ho c mi ng r a ñã th m dung d ch nư c r a c kĩ phía trong
ng ho c bình hay đĩa petri t i khi s ch h t các v t b n. Dùng khăn m m c kĩ
phía ngồi. X nư c làm s ch ch t t y r a. Tráng l i b ng nư c c t. D ng ngư c
d ng c vào giá ñ ng cho róc h t nư c. Làm khơ nhi t đ phịng ho c phơi
n ng ho c s y khơ 80-105oC. ðĩa Petri nên r a và x p theo b ñ d l p l i v i
nhau.
Các phi n kính và lá kính dùng xong nên ngâm riêng vào dung d ch t y
r a ho c sát trùng. Dùng khăn m m c r a, tráng nư c c t, th m khô, hong l i
trư c khi c t. Các lá kính r t d v , c n th n tr ng hơn và nên r a dư i vòi nư c
ch y nh .
V i các pipet dùng ñ hút d ch VSV: sau khi s d ng c n ngâm ngay vào
ng nư c sát trùng, kh u b nút bông, ngâm ti p vào dung d ch t y r a 1 ngày
r i chuy n sang bình r a pipet t ñ ng qua ñêm. Tráng nư c c t, hong khô. N u
r a tr c ti p dư i vịi nư c, c n đi u ch nh sao cho dòng nư c ch y qua bên
trong pipet.

V i các pipet dùng cho các ph n ng hoá h c, khơng c n ngâm nư c sát
trùng, đ t pipet dư i vịi nư c ch y đ x b t hố ch t bám dính bên trong,
ngâm vào ng nư c xà phòng m t ngày, r a s ch r i tráng nư c c t. Pipet ch
nên hong khơ nhi t đ phịng. N u s y nhi t ñ cao, thu tinh giãn n làm
sai l nh th tích.
* Pha dung dich r a
a) Dung d ch sunfo-cromic:
Bicromat kali: 50 g
H2SO4 ñ c: 500 ml
b) Dung d ch ki m trong alcol:
NaOH viên: 120 g
Nư c c t: 120 ml
Alcol 95o: 1000 ml
5. Chu n b d ng c ñ kh trùng
D ng c trư c khi kh trùng ph i ñư c r a s ch, làm khơ và gói gi y đ
b o đ m tính vơ trùng sau khi s y.
M i pipet đư c gói trong d i gi y dài có chi u r ng 4 - 5cm. ð u pipet
ñư c dùng ñ hút b ng mi ng ñư c đút nút b ng m t ít bơng, nút bông c n v a
ph i, n u ch t quá s khó hút d ch và khó l y ra khi r a. Pipét đư c gói b t ñ u
t phía ñ u nh gi t, qu n gi y d n d n vào theo ki u xốy trơn c cho đ n khi
h t phía đ u có nút bơng. Ph i qu n gi y cho sát khít vào pipet. Sau khi qu n
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………19


gi y, ta ph i gi cho kh i b n và kh i rách b ng cách bu c thành t ng bó cùng
kích c ho c cho vào ng ñ ng pipet làm b ng kim lo i hay b ng bìa c ng.
Các que g t cũng ñư c gói riêng t ng cái và sau ñó cũng bó l i như pipét.
Các đĩa Petri đư c gói thành t ng ch ng, m i ch ng kho ng 4-5 b .
Các chai l , ng nghi m và ng Burri dùng đ ni c y vi sinh v t nh t
thi t ph i ñư c ñ y nút (nút nh a ho c kim lo i hay cao su nhân t o ch u nhi t

ho c b ng nút bông). N u làm nút bông ph i dùng bông không th m nư c (bơng
m ). Nút bơng c n làm đúng ki u cách đ thu n ti n khi thao tác thí nghi m, có
th làm nút bơng tr n ho c nút bơng có b c v i màn.
L y bơng theo l p, tuỳ vào kích c mi ng bình, chai l và ng nghi m ñ
l y lư ng bơng phù h p. Có 2 cách làm nút bơng thông d ng:
+ Nh i bông vào gi a, dàn đ u ra xung quanh thành hình trịn, l y ñ u m t
ngón tay ñ t vào gi a, các ngón c a bàn tay kia gi đ u phía ngồi r i đ y sát
lên ngón tay đ t gi a t o thành nút bông.
+ ð t mi ng bơng v a l y (theo hình ch nh t) trên m t bàn s ch, cu n
tròn l i theo chi u dài ñ n h t, r i g p làm đơi t o thành nút bơng.
Xoay đ u nút v a t o ra vào mi ng ng ho c bình, sâu kho ng 2-3 cm, đi u
ch nh sao cho khơng t o thành rãnh trên nút bơng đ ngăn ch n s t p nhi m t
khơng khí, vu t đ u ph n cịn l i bên ngồi r i b n ch t l i như hình ng n l a.
Nút bơng đ t u c u c n v a ph i, không ch t quá, cũng không l ng quá, d
dàng l y ra khi th c hi n các thao tác ni c y VSV.
V i các bình mơi trư ng th ch có th bao gi y b c thay cho nút bông.
6. Kh trùng các d ng c thu tinh
Phương pháp cơ b n ñ kh trùng các d ng c th y tinh là phương pháp
kh trùng b ng s c nóng khơ (b ng nhi t). Cơng vi c này đư c th c hi n trong
t s y (Drying oven) nhi t ñ 160 - 1800C trong vịng 2 gi . Khi đó có th tiêu
di t c t bào dinh dư ng l n các bào t c a VSV.
Các d ng c ñã kh trùng ñư c b o qu n trong túi polyethylen c t gi
ch kín, tránh b i b m. Ch bóc gi y ngay trư c khi s d ng. Sau khi kh trùng,
các que g t, que c y ch nên s d ng trong vòng 24 gi , h p petri trong vòng 3
ngày, ng nghi m, bình nón kho ng 7-10 ngày n u b o qu n t t. N u ñ lâu,
d ng c ph i ñư c kh trùng l i trư c khi s d ng.
M t s d ng c như que g t, que c y, ng nghi m, pipet có th kh trùng
b ng hơi nư c áp l c cao (s d ng n i h p cao áp), thông thư ng 121oC/30’.
Kh trùng xong nên s d ng ngay.
II. CHU N B CÁC MÔI TRƯ NG ð NUÔI C Y VI SINH V T

Cũng như các sinh v t khác, ñ sinh trư ng và phát tri n các t bào vi sinh
v t c n các ch t dinh dư ng thích h p. Khi nuôi c y nhân t o, ngư i ta làm các
lo i “th c ăn” cung c p cho t ng nhóm vi sinh v t khác nhau. D ng “th c ăn”

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………20


này đư c g i là mơi trư ng ni c y. Tuỳ t ng gi ng VSV khác nhau mà có mơi
trư ng ni c y chun tính khác nhau.
1. Các yêu c u v môi trư ng nuôi c y
- ð y ñ các ch t dinh dư ng phù h p v i t ng ki u trao đ i ch t c a
t ng nhóm vi sinh v t, không ch a các y u t ñ c h i, môi trư ng nuôi c y ph i
ñư c ñ m b o cho s sinh trư ng bình thư ng c a vi sinh v t.
- Vơ trùng tuy t đơí đ khi ni c y ch phát tri n m t lo i VSV mong
mu n.
2. Cách g i tên môi trư ng
Môi trư ng thư ng ñư c g i theo tên ngư i ch t o cơng th c (ví d mơi
trư ng Hansen, MacConkey…) ho c theo ngu n dinh dư ng chính có trong mơi
trư ng (mơi trư ng tinh b t-th ch, malt-th ch, glucoza-pepton,…)
3. Phân lo i môi trư ng
Mơi trư ng đư c phân lo i theo thành ph n hố h c, ch đ dinh dư ng
và công d ng
3.1. Phân lo i theo thành ph n hóa h c
3.1.1. Mơi trư ng có thành ph n xác đ nh (mơi trư ng t ng h p) - defined
medium
Mơi trư ng đư c ch t o t các ch t có thành ph n đư c xác đ nh rõ ràng.
Ví d mơi trư ng A có ch a 5g glucoza, 1g (NH4)2SO4, 2g K2HPO4, 1 lít nư c.
N u như b sung 1 lư ng nh t đ nh axit amin c th nào đó (Lyzin) vào thì mơi
trư ng A v n đư c g i là mơi trư ng có thành ph n xác đ nh.
Mơi trư ng có thành ph n xác ñ nh ñư c s d ng ñ nghiên c u các nhu

c u dinh dư ng ho c các con đư ng sinh hố đ c bi t c a vi sinh v t
Tuy nhiên, khái ni m môi trư ng xác đ nh cũng ch có tính ch t tương đ i
b i vì các hố ch t s d ng đ pha ch mơi trư ng ngồi thành ph n chính đư c
xác đ nh, cịn có các nguyên t vi lư ng t p nhi m khơng đư c xác đ nh.
Ngu n nư c pha ch mơi trư ng cũng c n đư c chú tr ng. V i lo i môi
trư ng này nh t thi t ph i s d ng nư c c t tinh khi t đ pha ch .
3.1.2. Mơi trư ng thành ph n khơng xác đ nh
(mơi trư ng t nhiên ho c bán t ng h p)- Undefined medium, complex medium
Mơi trư ng có ch a các h p ch t có thành ph n khơng xác ñ nh rõ ràng
như các ch t chi t t mơ đ ng th c v t hay t bào n m men.
Ngoài các ch t chi t t nhiên, mơi trư ng cịn có c các hố ch t có thành
ph n xác đ nh. Ví d như mơi trư ng A trên ñư c b sung thêm pepton.
3.2. Phân lo i theo ch đ dinh dư ng
3.2.1. Mơi trư ng t i thi u (Minimal medium)
Lo i môi trư ng cung c p nhu c u t i thi u c a VSV, khơng dư th a. Ví
d n u m t lo i VSV nào đó ch a thông tin di truy n sinh t ng h p t t c các
Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………21


lo i axit amin c n thi t c a chúng thì khơng c n thêm axit amin vào mơi trư ng.
Ho c n u VSV bình thư ng c n 2 lo i axit amin, ch c n b sung 2 lo i đó mà
khơng c n thêm b t kỳ lo i nào khác.
Tuỳ t ng trư ng h p, môi trư ng t i thi u cho t ng lo i VSV khác nhau
cũng khác nhau. Nhi u môi trư ng t i thi u ch dùng ñ nuôi c y m t ph m vi
tương ñ i h p các VSV.
3.2.2. Mơi trư ng đ ho c giàu (All purpose ho c Rich medium)
Môi trư ng ch a hàng lo t ch t dinh dư ng vư t xa nhu c u t i thi u c a
VSV. Môi trư ng giàu tr giúp sinh trư ng c a nhi u lo i VSV. Trong môi trư ng
giàu, VSV sinh trư ng và phát tri n nhanh và t t hơn so v i môi trư ng t i thi u.
S dĩ như v y là vì các ngu n dinh dư ng mà VSV c n có th l y d dàng t các

h p ch t như axit amin, axit béo, vitamin, nucleic có s n trong môi trư ng.
3.3. Phân lo i môi trư ng theo công d ng
3.3.1. Môi trư ng ch n l c hay môi trư ng tuy n ch n (Selective medium)
Mơi trư ng này đ m b o cho s phát tri n c a các VSV mà ta mong
mu n và c ch s phát tri n c a các VSV ngồi ý mu n.
Mơi trư ng ch n l c ch y u dùng ñ phân l p các ch ng VSV thu n
khi t t t nhiên ho c dùng đ ni c y tích lu (enrichment). Có 2 cách làm
tăng tính ch n l c c a môi trư ng:
- Cho thêm ch t c ch các VSV không mong mu n nhưng không nh
hư ng t i sinh trư ng c a các lo i VSV ta đ nh ni c y ho c tuy n ch n. Các
ch t c ch bao g m các lo i thu c nhu m như tím k t tinh (crystal violet), các
ch t kháng sinh, các ch t ch ng n m, NaN3... N ng ñ cao c a mu i, ñư ng tác
ñ ng ñ n áp su t th m th u c a t bào ñư c s d ng như m t nhân t ñ ch n
l c VSV.
- Lo i b m t ch t mà các VSV khác c n t i khi n chúng không phát tri n ñư c.
3.3.2. Môi trư ng phân bi t (differental medium)
Môi trư ng phân bi t cho phép nhi u lo i VSV phát tri n và phân bi t
nhanh chóng lồi này v i lồi khác. Ví d mơi trư ng có ch a bromcresol (ch t
ch th màu) tr giúp sinh trư ng c a nhi u loài VSV nhưng d a vào kh năng
chuy n màu c a ch t ch th có th nh n bi t ngay lo i nào có kh năng hình
thành axit t ñư ng.
3.3.3. Môi trư ng ch n l c - phân bi t (Selective - differental medium)
Môi trư ng này bao g m c 2 ch c năng ch n l c và phân bi t. Nó giúp
cho vi c ch n l c m t nhóm nh VSV đ ng th i phân bi t chúng v i nh ng
nhóm VSV khác.
3.4. Phân lo i mơi trư ng theo tr ng thái v t lý
3.4.1. Môi trư ng l ng (d ch th ) -Liquid medium
Thư ng ñư c s d ng đ ni c y VSV nh m thu nh n sinh kh i, các s n
ph m trao ñ i ch t (enzim, kháng sinh, vitamin…) hay phát hi n các ñ c ñi m
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………22

sinh hố và đ gi gi ng và b o qu n nhi u lo i VSV không phát tri n đư c t t
trên các mơi trư ng đ c.
3.4.2. Mơi trư ng đ c (c th ) - Solid medium
ð làm đơng mơi trư ng, ngư i ta thư ng s d ng th ch (agar) đơi khi s
d ng gelatin (keo da, xương ñ ng v t) ho c s d ng silicagel (ch t o t thu
tinh l ng và HCl).
Mơi trư ng đ c dùng ñ phân l p gi ng thu n khi t, ñ m s lư ng VSV,
gi gi ng VSV, nghiên c u hình thái khu n l c, ho t ñ ng ñ i kháng…
Th ch là m t lo i polysaccharit chi t t m t lo i t o bi n. Vì khơng b
VSV phân gi i nên th ch là ch t làm đơng mơi trư ng khá lý tư ng. Trong
nư c, th ch nóng ch y g n 100oC và đơng đ c kho ng 43oC. Th ch thư ng
đư c b sung vào mơi trư ng v i s lư ng kho ng 16-20g/l. Trong mơi trư ng
trung tính, hơi axit ho c hơi ki m, th ch v n gi ñư c kh năng t o gel khá b n
v ng. Trong môi trư ng axit pH <5,0 th ch b thu phân trong q trình kh
trùng, m t tính t o gel sau khi đ ngu i.
3.4.3. Mơi trư ng m m
Thư ng s d ng ñ gi ch ng. Th ch ñư c b sung v i s lư ng 6-10g/l
3.4.4. Môi trư ng bán l ng
Thêm th ch vào v i lư ng 2-5 g/l. Do n ng ñ oxi xâm nh p vào bên
trong môi trư ng bán l ng ch m c ñ nh t ñ nh nên mơi trư ng này đư c s
d ng đ ni các vi khu n h o khí (microaerophilic).
3.4.5. Mơi trư ng x p
Mơi trư ng x p đư c ng d ng trong s n xu t (VSV h c công nghi p).
Ch t x p như tr u, cám… ñư c tr n v i các thành ph n dinh dư ng khác.
4. Chu n b môi trư ng
C n đ c k cơng th c c u t o mơi trư ng, chu n b các hố ch t và d ng
c liên quan
4.1. Pha ch

Nhìn vào các công th c môi trư ng, l n lư t cân đong các thành ph n.
ðánh d u vào cơng th c các thành ph n ñã cân ho c đong. N u cơng th c có
th ch thì nên ñong nư c cho vào n i ñ ng, cân th ch cho vào nư c ñ th ch
ng m d tan khi đư c đun sơi và l n lư t cân ñong các thành ph n khác.
N u mơi trư ng ph i đun n u, ngồi th tích nư c theo cơng th c nên b
sung m t lư ng nh nư c ñ bù l i th tích bay hơi khi đun (kho ng 15-20ml/l)
M i hố ch t xúc b ng m t thìa riêng khi cân. Cho hoá ch t ho c các
thành ph n đư c cân lên đĩa có gi y cân m t cách t t t i khi v a ñ . N m
v ng cách s d ng các lo i cân.

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………23