3 real time pcr

REAL TIME PCR
(REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION)
ThS. Nguyễn Kim Thạch
BM. Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử
Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch

E-mail:
1


1. Nguyên lý của hai hệ thống phát
huỳnh quang

2. Phương pháp định lượng tuyệt đối


Lịch sử
1991-1993: Holland và cộng sự khám phá khả năng hoạt động
5’nuclease của Taq polymerase, sử dụng probe đánh dấu 32P

1992-1993: Higuchi v cộng sự  phn tích động học sản phẩm
PCR. Sử dụng ethidium bromide + ultraviolet + computer +
CCD camera (charge coupled device camera).
1993: Lee và cộng sự thiết kế probe gồm quencher & reporter. Sử
dụng hiệu ứng FRET (Forster resonance energy transfer).


Real-time Polymerase Chain Reaction
(PHẢN ỨNG TỔNG HỢP CHUỖI NUCLEOTID THỜI GIAN THỰC)

• Kỹ thuật sinh học phân tử giúp định lượng DNA và RNA

• Theo dõi sự tiến triển của phản ứng PCR theo từng chu kỳ
• Nguyên tắc so sánh từng chu kỳ với điểm đầu tiên lượng sản
phẩm PCR được nhận ra nhờ tín hiệu phát huỳnh quang
• Số lượng bản copy càng tăng dẫn đến sự gia tăng tín hiệu
huỳnh quang


Ưu điểm khi dùng Real-time PCR
PCR cổ điển định lượng tại pha đỉnh (plateau phase) trong
khi Realtime PCR cho phép thu thập dữ liệu định lượng
tại pha lũy tiến (exponential growth phase) 2n


AMOUNT OF DNA

AMOUNT OF DNA

1600000000
1400000000
1200000000
1000000000
800000000
600000000
400000000
200000000
0
0

5

10

15

20

25

PCR CYCLE NUMBER

30

35

10000000000 10000000000
1000000000 1000000000
100000000
100000000
10000000
10000000
1000000
1000000
100000
100000
10000
10000
1000
1000
100
100

10
10
1
1
0
5
0 10

AMOUNT OF DNA

AMOUNT OF DNA

• Sự gia tăng tính hiệu Fluorescent tỉ lệ với sự gia tăng
số bản sao
• Một phân tử probe được tách ra đảm bảo chính xác
một phiên bản sao chép được hoàn thành.

5 15 10 20 15 25 20

30 25

PCR CYCLEPCR
NUMBER
CYCLE NUMBER

3530


• Tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR
• Không có các giai đoạn sau PCR cổ điển

• Phát hiện được sự biểu hiện sai lệch 2 lần
Nguyên tắc hoạt động cơ bản của máy Realtime PCR


Bộ lọc đơn sắc

Bộ lọc đơn sắc

Cáp quang học
đồng trục
Đèn
Halogen

1 đĩa lọc ánh sáng trắng
dùng hiệu chuẩn

PMT

Đầu đọc quét trên từng giếng
Bộ lọc xoay chuyển tương thích
theo mỗi giếng

96 Well Plate


Bộ lọc đơn sắc
Bộ lọc đơn sắc

Nắp nhiệt
Hệ thống luân nhiệt

Đèn
Tungsten/Halogen
Cáp quang và cánh tay robot


Fluorophore và Quencher
Fluorophore có thể gắn với các

Quencher khác nhau. Phổ hấp
thụ của Quencher phải trùng với
phổ phát quang của Fluorophore
Có 2 cơ chế ức chế phát quang
Ức chế gần: Deep Dark quencher (Eurogentec), Dabsyl (Nasarabadi)
Flourophore ở gần kề Quencher năng lượng truyền từ Flourophore
sang quencher. Năng lượng chuyển thành nhiệt không phát quang
Ức chế FRET: Flourophore truyền năng lượng sang Quencher. Năng
lượng bị phân rã. Hiệu quả phát quang tùy thuộc vào khoảng cách
giữa Flourophore và Quencher.


Dùng TAMRA làm quencher
FAM và TAMRA được dùng khi real-time được phát minh.
TAMRA hạn chế trùng lấp quang phổ với FAM, TET, HEX,
JOE, VIC (Yakima Yellow)
TAMRA là huỳnh quang, nó góp phần tạo background cho
phản ứng. Cơ chế FRET đạt 80% hiệu suất


Dark Quenching

Không phát quang. Không tạo background
Hiệu suất cơ chế FRET 100%
Khoảng cách bước sóng rộng. Khơng trùng lấp với các đầu phát
quang
Sử dụng multiplex dễ dàng


1. Nguyên lý của hai hệ thống phát
huỳnh quang
Published References for real-time PCR Fluorescent Chemistries
180
160
140

No. of references

120
Taqman
SYBR Green
molecular beacons
scorpions

100
80
60
40
20
0
1994

1995

1996

1997

1998
Year

1999

2000

2001


1.1 Hệ thống phát huỳnh quang kém đặc hiệu
SYBR® green I 497nm-520nm
SYBR® Gold
495nm-537nm
Quan trọng: chọn điểm nhiệt độ biến
tính chuỗi đôi DNA (double stranded
DNA_melt) để tách SYBR tiếp tục chạy
cho chu kỳ PCR kế tiếp
 Thường được dùng
để kiểm tra primer sau
khi thiết kế và sự bắt
cặp primer

95°C

95°C
15s

cycle x40 60°C
1min

60°C
20s

20min

Target amplicon

Tm = nhiệt độ phản ứng  SYBR phân tách

Sản phẩm
Primer dimers hoặc bắt cặp sai


SYBR Green: Ưu và Nhược điểm
Ưu đểm:
Kinh tế
Dễ sử dụng
Nhạy hơn so với ethidium bromide (các tác nhân xen vào giữa
khác)
Khơng ức chế phản ứng khuếch đại
Khơng u cầu có fluorescent probe, vì vậy khơng cần kinh

nghiệm thiết kế probe
Khơng gây những đột biến cho DNA đích
Nhược điểm:
Khơng đặc hiệu
Cho kết quả định lượng kém chính xác
Trong cùng phản ứng, sự phát huỳnh quang của phân tử DNA
khuếch đại dài che lấp phân tử DNA khuếch đại ngắn
Khơng có khả năng phát hiện đột biến


1.2 Hệ thống phát huỳnh quang đặc hiệu
Hydrolysis probes (Taqman)


Hydrolysis probes: Ưu và Nhược điểm
Ưu điểm:
Đặc hiệu cao: tính hiệu của quá trình lai giảm khi xuất sự bắt cặp sai
hoặc sự bắt cặp của primer

Hiệu quả trong phản ứng multiplex: trong phản ứng multiplex có thể
xác định sự phát huỳnh quang của các probe khác nhau
Nhược điểm:
Taqman probe kém phù hợp và kém linh động so với các loại khác
trong kỹ thuật realtime để xác định các đột biến.
Nguyên tắc thiết kế probe đòi hỏi nhiều chi tiết


Thiết kế Probe
Chiều dài 30 bases

Số lượng G-C chiếm 50 %
Các probe không được trùng lấp hoặc bổ sung với primer

Probes không được chứa G ở đầu kết thúc 5’
Tm cao hơn 5-10°C so với primer


Hybridisation probes (HybProbes)
Ưu điểm:
- Đặc hiệu cao

- Linh động cao trong thiết
kế
- Probe không bị phá hủy
dùng lại sau mỗi chu kỳ

Nhược điểm: như thiết kế Taqman probe


Molecular beacons

- Đặc hiệu và độ chính xác cao
- Nhiệt độ phản ứng < Tm, cấu trúc kẹp tóc  khơng lai,
khơng tín hiệu huỳnh quang.


Scorpion primer

- Blocker HEG ngăn chặn sự tái bản như phân tử beacon
- Một kỹ thuật tốt nhất

So sánh hiệu năng phát quang giữa các Probe

Scorpion

Beacon
TaqMan


Đồ thị khuếch đại tính hiệu

Baseline – những chu kỳ đầu của PCR, ở nơi này ít có sự thay đổi tín hiệu
fluorescence
Threshold – cắt ngang đồ thi khuếch đại để xác đinh CT. Có thể cài đặt bằng tay
hoặc tự động
CT – (cycle threshold) tín hiệu phát quang cắt ngang threshold và số chu kỳ
Passive reference dye - ROX
Rn – (normalized reporter)
Rn – (Rn- baseline)
NTC – no template control – cho phép xác định ngoại nhiễm vào phản ứng
khuếch đại


Giải thích kết quả

a) Plateau phase (pha đỉnh)
b) Linear phase (pha thẳng)
c) Exponential phase (pha lũy tiến)
d) Background

e) Baseline (pha biên)