PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR (Phần phụ)

LỜI CẢM TẠ
Xin tạc dạ ghi lịng cơng lao biển trời của cha mẹ đã sinh thành và nuôi nấng tơi.
Tơi xin chân thành cảm tạ:
• Ban Giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt q trình học tại trường.
• ThS. Nguyễn Thái Thủy, ThS. Phan Thị Ngọc Thủy đã hết lòng hướng dẫn, giúp
đỡ tơi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
• TS. Phạm Hùng Vân, chị Phạm Thanh Thùy Trang, chị Võ Thị Thanh Thảo đã
tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tơi trong q trình thực tập tại cơng ty Nam
Khoa.
• TS. Nguyễn Hữu Thịnh đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kiến thức q
báu.
• Ban Giám đốc công ty Nam Khoa và quý Thầy Cô, cán bộ cơng chức trẻ Trung
Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí
Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
• Các bạn bè thân u của lớp Cơng nghệ sinh học khóa 27 đã chia sẻ cùng tôi
những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tơi
trong thời gian thực tập.
Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 08 năm 2005.
Phạm Thị Mỹ Hạnh

iii


TĨM TẮT
PHẠM THỊ MỸ HẠNH, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “PHÁT
HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM
SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR”.
Hội đồng hướng dẫn:
ThS. PHAN THỊ NGỌC THỦY

ThS. NGUYỄN THÁI THỦY
Đề tài “Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú
(Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - time PCR” được thực hiện tại Công Ty Nam
Khoa và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trường Đại Học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí
Minh từ ngày 01/ 03/ 05 đến ngày 01/ 08/ 05. Đề tài được thực hiện trên đối tượng là
virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. Virus này gây dịch bệnh ảnh hưởng
nghiêm trọng đến sản lượng tôm sú nuôi (Penaeus monodon) trên thế giới và ở nước ta.
Sử dụng kỹ thuật Real - time PCR trong phát hiện và định lượng WSSV trên tôm sú ở
các giai đoạn ni nhằm phát hiện nhanh, chính xác; định lượng WSSV trên các mẫu
tơm sú; góp phần phịng ngừa sự lây lan và bùng phát dịch bệnh đốm trắng.
Những kết quả đạt được:
• Xác định được quy trình ly trích ADN phù hợp cho phản ứng Real – time PCR
và Non Stop Nested PCR.
• Ứng dụng thành cơng phương pháp Real - time PCR để phát hiện và định lượng
số bản sao của virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tơm sú.
• Xác định khả năng định lượng chính xác của phương pháp Real – time với độ lặp
lại cao.
• Xác định được độ nhạy của phương pháp Real - time PCR so với Non Stop
Nested PCR
• Ứng dụng Real - time PCR để phát hiện và định lượng WSSV trên 30 mẫu tôm
sú thu từ thực tiễn ở các giai đoạn ni, có 22 mẫu bị nhiễm WSSV từ rất nhẹ
đến nặng và 8 mẫu âm tính về bệnh đốm trắng.
• Bước đầu đánh giá về khả năng thành công của các ao thả nuôi tôm bị nhiễm
WSSV.

iv


SUMMARY
PHAM THI MY HANH, Nong Lam University. August, 2005. “DETECTION AND

QUANTIFICATION OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) IN BLACK
TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) BY USING REAL – TIME PCR”.
Guidance council:
Ms. PHAN THI NGOC THUY
Ms. NGUYEN THAI THUY
Thesis “Detection and Quantification of White Spot Syndrome Virus (WSSV) in
Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon) by Using Real - time PCR” was carried out in
Nam Khoa company and at Chemical & Biological Analysis and Experiment Center of
Nong Lam University from March 1st, 2005 to August 1st, 2005. The object of the thesis
is White Spot Syndrome Virus (WSSV) in black tiger shrimp. This virus has caused an
epidermic viral disease outbreak occurred on cultured black tiger shrimp (Penaeus
monodon) which had caused severe economic losses to the shrimp production in
Vietnam and around the world. Using Real – time PCR for detection and quantification
WSSV in cultured black tiger shrimp at all stages aims to rapidly, precisely detect and
quantify WSSV in cultured black tiger shrimp in order to prevent the occurrence and
outspread of the disease outbreak.
My obtained results include:
• An appropriate DNA extraction protocol for Real - time PCR and Non Stop
Nested PCR reactions.
• Successful application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in black
tiger shrimp.
• Capacity of precise WSSV quantification of Real - time PCR with highly
repeated results.
• Comparision the sensitivity of Real - time PCR with Non Stop Nested PCR.
• Application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in 30 collected
samples of cultured black tiger shrimp at all stages. The result indicated that there
are 22 samples infected with WSSV from very light to severe infection and 8
samples uninfected with WSSV.
• Preliminary evaluation of the success of cultured ponds stocked with WSSV
infected shrimp seeds or cultured shrimp infected with WSSV.

v


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Lời cảm tạ..................................................................................................................iii
Tóm tắt.......................................................................................................................iv
Mục lục......................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt..........................................................................................x
Danh sách các hình.....................................................................................................xii
Danh sách các bảng....................................................................................................xv
1. MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề........................................................................................................1
1.2. Mục đích yêu cầu.............................................................................................2
1.2.1. Mục đích..................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu....................................................................................................2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................3
2.1. Giới thiệu khái quát về tôm sú (Penaeus monodon).........................................3
2.1.1. Phân loại..................................................................................................3
2.1.2.Vùng phân bố............................................................................................3
2.1.3. Chu kỳ sống.............................................................................................4
2.2. Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới và Việt Nam....................................5
2.2.1. Trên thế giới.............................................................................................5
2.2.2. Ở Việt Nam..............................................................................................5
2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm..................................................................................7

2.3.1. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV).........................................................7
2.3.1.1. Định danh và phân loại...................................................................7
2.3.1.2. Đặc điểm hình thái..........................................................................8
2.3.1.3. Đặc tính sinh học.............................................................................8
2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh WSSV.............................................................9
2.3.3. Các con đường lây truyền WSSV............................................................9
2.3.4. Cơ chế xâm nhập.....................................................................................10
2.3.5. Triệu chứng của bệnh..............................................................................10
vi


2.3.6. Phương pháp chẩn đoán...........................................................................11
2.4. Phương pháp PCR và các cải tiến....................................................................12
2.4.1. Phương pháp PCR....................................................................................12
2.4.1.1. Nguyên tắc....................................................................................12
2.4.1.2. Các thành phần của phản ứng PCR..............................................13
2.4.1.3. Các bước phản ứng.......................................................................13
2.4.1.4. Ứng dụng......................................................................................14
2.4.1.5. Ưu và nhược điểm........................................................................14
2.4.2. Kỹ thuật Nested PCR...............................................................................15
2.4.2.1. Nguyên tắc....................................................................................15
2.4.2.2. Ưu và nhược điểm........................................................................16
2.4.3. Kỹ thuật Real - time PCR........................................................................16
2.4.3.1. Lịch sử phát triển..........................................................................16
2.4.3.2. Khái niệm.....................................................................................17
2.4.3.3. Nguyên tắc....................................................................................17
2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR............................................................17
2.4.3.5. Phương pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR.........................18
2.4.3.6. Nguyên lý định lượng của kỹ thuật Real - time PCR...................22
2.4.3.7. Ưu và nhược điểm........................................................................23

2.4.3.8. Ứng dụng......................................................................................23
3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................25
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................25
3.1.1. Thời gian thực hiện..................................................................................25
3.1.2. Địa điểm thu mẫu....................................................................................25
3.1.3. Địa điểm phân tích mẫu...........................................................................25
3.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................25
3.3. Nguyên vật liệu................................................................................................25
3.3.1. Mẫu xét nghiệm.......................................................................................25
3.3.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất..........................................................26
3.3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ..............................................................26
3.3.2.2. Hoá chất........................................................................................27
vii


3.4. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................28
3.4.1. Thu mẫu và bảo quản mẫu.......................................................................28
3.4.2. Ly trích mẫu.............................................................................................28
3.4.2.1. Pha dung dịch tách chiết...............................................................28
3.4.2.2. Tiến hành ly trích.........................................................................29
3.4.3. Tiến hành thực hiện Real - time PCR......................................................30
3.4.3.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Real - time PCR............30
3.4.3.2. Thiết lập chương trình thực hiện Real - time PCR trên phần
mềm máy iCycler iQ................................................................................30
3.4.3.3. Chạy Real - time PCR..................................................................31
3.4.3.4. Phân tích kết quả trên màn hình máy vi tính................................31
3.4.4. Thực hiện Non Stop Nested PCR............................................................33
3.4.4.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Non Stop Nested
PCR...........................................................................................................33
3.4.4.2. Thiết lập chương trình thực hiện Non Stop Nested PCR

trên phần mềm của máy iCycler................................................................33
3.4.4.3. Chạy Non Stop Nested PCR.........................................................33
3.4.4.4. Điện di và phân tích kết quả.........................................................34
3.4.5. Cách đọc kết quả......................................................................................36
3.4.5.1. Real - time PCR............................................................................36
3.4.5.2. Non Stop Nested PCR..................................................................39
3.5. Bố trí thí nghiệm...............................................................................................40
3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH,
sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene
Matrix................................................................................................................40
3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát
hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính,
âm tính với WSSV.............................................................................................41
3.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time
PCR....................................................................................................................42
3.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real - time PCR
viii


và Non Stop Nested PCR...................................................................................43
3.5.5. Thí nghiệm 5: ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra
mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tơm thu từ thực tế.............................................43
3.5.6. Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã
được thu mẫu kiểm tra.......................................................................................44
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................................45
4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt
và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene
Matrix......................................................................................................................45
4.2. Kết quả sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện virus
gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính

với WSSV................................................................................................................46
4.3. Kết quả khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR..............53
4.4. Kết quả khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real - time PCR và Non
Stop Nested PCR.....................................................................................................57
4.5. Kết quả ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh
WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế....................................................................60
4.6. Kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu
mẫu kiểm tra............................................................................................................67
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...............................................................................70
5.1. Kết luận............................................................................................................70
5.2. Đề nghị.............................................................................................................70
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................72
7. PHỤ LỤC..........................................................................................................75
Phụ lục A TRỌNG LƯỢNG MẪU LY TRÍCH..................................................75
Phụ lục B HÌNH ẢNH VÀ SỐ LIỆU THÔ KẾT QUẢ CHẠY REAL – TIME
PCR VÀ NON STOP NESTED PCR...................................................................76
Phụ lục C CÁC THUẬT TỪ THƯỜNG DÙNG TRONG REAL – TIME
PCR.......................................................................................................................88
Phụ lục D CÁC BƯỚC VẬN HÀNH MÁY iCycler iQ......................................90

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT
ADN: acid deoxyribonucleic
KHCN: Khoa học Công nghệ
NTTS: nuôi trồng Thủy sản
Copy number: số bản sao
Correlation coefficient: hệ số tương quan (r2)

Ct: threshold cycle: chu kỳ ngưỡng - chu kỳ ở đó tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu
nền
Cycle: chu kỳ
Log starting quantity: log số lượng bản sao ban đầu
MK: thang ADN chuẩn (ADN marker)
N/A: not available: kết quả âm tính, khơng xác định
PCR baseline subtracted CF RFU: nồng độ huỳnh quang đo được trong suốt phản ứng
PCR khi đã trừ tín hiệu nền
PCR efficiency: hiệu quả phản ứng PCR
PL: Postlarvae – hậu ấu trùng tôm
SD: standard deviation: độ lệch chuẩn
Slope: độ nghiêng
Std: standard: chuẩn
SQ: starting quantity: số lượng bản sao ban đầu
Unknown: mẫu cần kiểm tra (các hiển thị tương ứng với chu kỳ ngưỡng và log số bản
sao ban đầu nằm trên đường chuẩn)

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG ANH
x


bp: base pair
CCD: charge coupled device
dNTP: 2’ – deoxynucleoside – 5’ - triphosphate
EDTA: ethylen diamine tetraacetic acid
FAO: Food and Agriculture Organization
FRET: fluorescence resonance energy transfer
MBV: Monodon Baculovirus
PCR: polymerase chain reaction
RFU: relative fluorescence unit

SDS: sodium dodecyl sulfate
Taq: Thermus aquaticus
TE: tris EDTA
UNG: uracil N – glycosylase
UV: ultraviolet
WSSV: White Spot Syndrome Virus

DANH SÁCH CÁC HÌNH
xi


HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Vịng đời tơm sú Penaeus monodon....................................................4
Hình 2.2 Virus đốm trắng (WSSV) hình que dưới kính hiển vi điện tử ............8
Hình 2.3 Virus nhuộm âm ở trong huyết tương của tơm sú nhiễm bệnh
WSSV, một số thể virus có đi.........................................................................8
Hình 2.4 Hai vịng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng WSSV trong
ao ni 10
Hình 2.5 Tơm sú bị bệnh đốm trắng dạt vào bờ và chết.....................................11
Hình 2.6 Vỏ đầu ngực tơm bị bệnh đốm trắng...................................................11
Hình 2.7 Ngun tắc của Nested PCR................................................................15
Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR....................................................................17
Hình 2.9 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real - time PCR..........................18
Hình 2.10 SYBR Green I chèn vào ADN sợi đơi................................................19
Hình 2.11 Ngun tắc của Molecular Beacons probe.........................................20
Hình 2.12 Ngun tắc của FRET probe..............................................................21
Hình 2.13 Nguyên tắc của TaqMan probe...........................................................22

Hình 3.1 Máy ly tâm và vortex mixer.................................................................26
Hình 3.2 Máy nhiệt khơ......................................................................................26
Hình 3.3 Máy iCycler..........................................................................................26
Hình 3.4 Bộ kit Real - time PCR phát hiện WSSV trên tơm..............................27
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ..................................................................................................................36
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn..............................................................37
Hình 3.7 Kết quả điện di qua Non Stop Nested PCR.........................................40
Hình 3.8 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10................................41
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ của mẫu ly trích theo quy trình 1 và 2.....................................................45
Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ của 12 mẫu tơm sú...................................................................................46
Hình 4.3 Kết quả kiểm tra WSSV qua Non Stop Nested PCR của 12 mẫu
xii


tơm sú..................................................................................................................47
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ của 3 mẫu tơm sú.....................................................................................49
Hình 4.5 Kết quả Non Stop Nested PCR của 3 mẫu tơm sú...............................49
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 12 mẫu tơm sú...............................50
Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 3 mẫu tơm sú.................................52
Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ ở từng nồng độ pha lỗng lặp lại 3 lần của mẫu 1..................................53
Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn ở từng nồng độ pha lỗng lặp lại
3 lần của mẫu 1...................................................................................................54
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7..................................55
Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn ở từng nồng độ pha loãng lặp lại

3 lần của mẫu 7...................................................................................................56
Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ của mẫu nhiễm WSSV pha loãng từ 10-1 đến 10-8...................................58
Hình 4.13 Kết quả kiểm tra Non Stop Nested PCR ở các nồng độ pha
lỗng của mẫu nhiễm WSSV..............................................................................59
Hình 4.14 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế.....................................................................61
Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 10 mẫu tơm thu thực tế...............62
Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo......................................................63
Hình 4.17 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 10 mẫu tơm thu thực tế
tiếp theo...............................................................................................................64
Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ của 10 mẫu tơm thu thực tế cịn lại.........................................................65
Hình 4.19 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 10 mẫu tơm thu thực tế
cịn lại..................................................................................................................66
SƠ ĐỒ
xiii


Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các bước phản ứng chuỗi polymerase......................................14
Sơ đồ 3.1 Quy trình thực hiện Real - time PCR..................................................32
Sơ đồ 3.2 Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR........................................35

DANH SÁCH CÁC BẢNG
xiv


BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng.................................................8
Bảng 3.1 Bảng kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR...............................39
Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra WSSV trên 12 mẫu tôm sú......................................48
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú...........................................................50
Bảng 4.3 Số bản sao ban đầu trung bình của 12 mẫu tôm sú sau hai lần
lặp lại..................................................................................................................51
Bảng 4.4 Số bản sao ban đầu trung bình của 3 mẫu tơm sú sau hai lần
lặp lại..................................................................................................................52
Bảng 4.5 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng
độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại...........................................................54
Bảng 4.6 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng
độ pha lỗng của mẫu 7 sau 3 lần lặp lại...........................................................57
Bảng 4.7 Kết quả chạy Real - time PCR và Non Stop Nested PCR
trên mẫu tôm nhiễm WSSV ở các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8..............60
Bảng 4.8 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình của 10 mẫu
tơm thu thực tế...................................................................................................62
Bảng 4.9 Số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo.................64
Bảng 4.10 Số chu kỳ ngưỡng và số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu
thực tế còn lại.....................................................................................................66
Bảng 4.11 Bảng kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao ni tơm
đã được thu mẫu kiểm tra..................................................................................68

xv