chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC- MÔI TRƯỜNG
BÁO CÁO THỰC HÀNH
VI SINH VẬT KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
LỚP 09MT112
NHÓM 1 - TỔ 2:
1. NGUYỄN TĂNG CƯỜNG
2. NGUYỄN VĂN CƯỜNG
3. DƯƠNG THỊ QUỲNH CHÂU
4. NGUYỄN VĂN ĐÔ
GVHD: VƯU NGỌC DUNG
BÀI BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
I .Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh
a. Pha môi trường:
+môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi cho hòa tan vào nước cất.
+môi trường đặc: cân agar và hóa chất cho vào bình tam giác hay becher
rồi hòa tan trong nước, đun trong bếp hay hấp trong autoclave.
b. Chuẩn bị môi trường(làm thạch petri):
Đun thạch chảy lỏng, để nguội 50 – 60
o
c .
Tay phải cầm bình môi trường đã chảy lỏng, giữ hơi nghiêng, dùng tay trái
xoay và rút nút bông ra, vô khuẩn miệng bình trên đèn cồn.
Dùng tay trái hé mở nắp hộp vừa phải và nhanh tay rót vào hộp 1 lượng
môi trường thích hợp.
Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp từ từ trên bàn để thạch dàn
thành 1 lớp đều trên đáy hộp. không xoay mạnh làm thạch bắn lên.
Hé mở nắp hộp và để yên cho đến lúc thạch đặc hoàn toàn.
Đậy nắp lại, lật ngược hộp cho đáy lên trên.

1. Môi trường Sabouraud ( để nuôi cấy nấm mốc và nấm men)
- Pepton : 2g
- Glucose : 4g
- Agar : 1,8g
- Nước cất : 100ml
(Khử khuấn trong nồi áp suất ở 121 độ c , áp suất 1atm , thời gian 30 phút )
2. Môi trường thạch bán lỏng di động
- Nutrient borth : 1,3g
- Agar : 0.5g
- Nước cất : 100ml
- pH: 7,2
Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất.
Đun cất thủy cho agar hòa tan đều. Phân vào trong các ống nghiệm 16 x
120mm, mỗi ống khoảng 5ml. Đem hấp khử khuẩn 121
0
C(1atm)/ 15-20
phút. Lấy ra để đứng cho môi trường đông lại.
3.Môi trường nutrient Agar (NA)
- Nutrient borth : 1.3g
- Agar : 1.8g
- Nước cất : 100ml
(Khử khuấn trong nồi áp suất ở 121 độ c , áp suất 1atm , thời gian 30 phút )
4.Moâi tröôøng Nutrient Borth (NB)
- pepton: 15 g
- muối : 5 g
- nước : 1000 ml
(hấp khử trùng 121 độ c, áp suất 1 atm, thời gian 25-30 phút)
5. Môi trường Plate count agar (PCA) (g/l):
- Trypton: 5 g
- Yeast extract: 2,5 g

- Glucose: 1 g
- Agar: 15 g vào 1 lít nước cất. Sau đó hấp khử trùng ở 121
o
C, 1atm, và
thời gian 30 phút.
II. Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị 2 bình nón có dung tích 250ml
+ Bình 1 chứa 90ml nước cất vô trùng
+ bình 2 đã vô trùng và không chứa gì
- Cân 1g mẫu đất cho vào bình 2 rối đổ toàn bộ nước ở bình 1 vào
- Lắc 5 phút , để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu theo dãy thập phân .
III.Tiến hành thí nghiệm
1. Nuôi cấy nấm
- Dùng cồn rửa sạch tay( gần hết cách tay ) và không gian xung quanh chỗ
làm việc
- Môi trường sabouraud sau khi vô trùng , lấy ra để nguội còn khoảng 45-50
độ C.
- Hút 0.1ml mẫu vào ống môi trường , đậy nút lại . lắc tròn quanh trục ống
nghiệm .
- Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa petri và đậy thật
nhanh nắp trên lại sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí .
- Tất cả thao tác trong quá trình làm đều phải làm gần ngọn lửa đèn cồn để
tránh bị nhiễm khuẩn .
- Kết quả : sau 24h ta sẽ thấy các sợi bông đen và các chấm nhỏ li ti . Đó là
nấm mốc và các bào tử .
2. Nuôi cấy vi sinh hiếu khí
- Dùng cồn rửa sach tay ( gần hết cách tay ) và khử trùng không gian xung
quanh nơi làm việc .
- Môi trường thạch sau khi hấp khử trùng mang ra để nguội khoảng 45-50 độ
C .

- Đổ môi trường vào 1/3 đĩa petri , để môi trường đông đặc lại
- Dùng pipet lấy 0.1ml mẫu cho vào đĩa petri , dùng que trang đã khử trùng
trang đều mẫu trên mặt môi trường .
- Đậy nắp đĩa petri lại và úp ngược đĩa petri lại để tránh khi vi khuẩn hô hấp
sẽ đọng hơi nước trên mặt đĩa , rớt xuống môi trường sẽ bị nhiễm khuẩn.
- Tất cả thao tác trong quá trình làm đều phải làm gần ngọn lửa đèn cồn để
tránh bị nhiễm khuẩn .
- Kết quả : sau 24h sẽ thấy những chấm trắng nhỏ trên đĩa petri , đó là khuẩn
lạc .
3. Nuôi cấy E.coli và Coliform
- Cách tiến hành

- Định lượng e.coli và colifom bằng phương pháp MPN còn gọi là phương
pháp pha loãng tới hạn . Phương pháp định lượng dưa trên một loạt sự lặp lại
các thí nghiệm với sự pha loãng nồng độ khác nhau. Dùng cồn rửa sạch tay
( gần hết cách tay) và khử trùng xung quanh nơi làm việc .
-Lấy mẫu nước thải pha loãng theo nồng độ : 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
. Lấy 3 đĩa petri ,
lần lượt hút 1 ml ở mỗi ống nghiệm đã pha loãng khác nhau cho vào 3 đĩa thạch,
xoay nhẹ nhàng để trộn đều dung dịch . Đậy nắp đĩa petri lại và úp ngược lại để
tránh bị nhiểm khuẩn . Ủ ấm từ 35 – 37
0
C sau 24
- Kết quả : sau 24h các khuẩn lạc đặc trưng là E.coli và Coliform có màu đỏ
tía , đường kính 0.5mm hoặc hơn , đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi

đỏ của mật kết tủa .
hình ảnh của vi khuẩn e.coli và coliform
4. Pha loãng mẫu:
Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, một số ống
nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng và một số ống hút (1ml) vô trùng.
Ta lấy 10ml nước cất đã vô trùng cho vào 3 ống nghiệm. Lấy 0,1g đất cho
vào ống nghiệm thứ 1 lắc đều cho đến khi đất tan hoàn toàn.
Dùng ống hút hút 1ml nước ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2 lắc
đều, sau đó cũng lấy 1ml nước ở ống nghiệm 2 cho vào ống nghiệm 3 lắc
đều.
Tùy theo số lượng vi sinh vật trong mẫu mà ta pha loãng nhiều hay ít. Ở
đây ta lấy 1ml nước mẫu tương đương với độ pha loãng là 10
-1
.
a. Mẫu ở trạng thái lỏng :
- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân
Hình 5.1 : Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân
b. Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực
phẩm)
- Chuẩn bị 2 bình hình nón có dung tích 250 ml
+ Bình 1 chứa 90ml nước cất vô trùng
+ Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì
- Khử trùng cối chày sứ bằng cách cho một ít cồn vào và đốt lên. Sau đó
để nguội.
- Cân 1 g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu.
- Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2.
- Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng
thí lỏng.
- Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng
nhiều hay ít

Hình 5.2 Phương pháp pha loãng mẫu đất
5. Phương pháp phân lập vi sinh vật:
a. Kỹ thuật hộp ria:
- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống.
- Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria
bốn góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi
thực hiện đường ria tiếp theo.
- Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
Hình 5.3 Kỹ thuật hộp ria
b. Kỹ thuật hộp trải:
- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch
chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri.
- Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 70
0
, hơ qua ngọn lửa
để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
- Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri.
Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải,
thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho
thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.
- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích
hợp trong tủ ấm.
Hình 5.4 Kỹ thuật hộp trãi
IV. Tính toán:
đĩa 1 đĩa 2 đĩa 3
TVSVHK 30 45 50
TVNẤM 35 45 60
Ecoli & colyfom 5 60 40
(nồng độ pha loãng 10
-3

, mẫu đất)
1. Vi sinh vật hiếu khí :
- Phương pháp : đếm khuẩn lạc quan sát được
- Công thức :

Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng
CFU/g= …………………………………………
Thể tích mẫu (ml)
* tính toán:
- độ pha loãng: 10
3
- thể tích mẫu : 0,05 ml
Số trung bình TVSVHK: (30+45+50)/3 = 42
CFU/g = ( 42 x 10
3
) /0,05 = 840000


đĩa 1 đĩa 2 đĩa 3
CFU 30 45 50
CFU
tb
(30+45+50)/3 = 42
CFU/g (42 x 10
3
)/0,05 = 840000
2. Tổng vi nấm:
- Phương pháp : đếm khuẩn lạc quan sát được
- Công thức :
Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng

CFU/g=…………………………………………
Thể tích mẫu (ml)
*tính toán:
- độ pha loãng: 10
3
- thể tích mẫu: 0,05 ml
Số trung bình TVNẤM : (35+45+60)/3 = 47
CFU/g= (47 x 10
3
)/0,05 = 940000
Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3
CFU 35 45 60
CFU
tb
(35+45+60)/3 = 47
CFU/g (47 x 10
3
)/0,05 = 940000
3. E.coli và Coliform
- Phương pháp MPN
+ Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả tính của một loạt thí
nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau .
+ Thông thường việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp .
+ Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần
kiểm định trong từng ống nghiệm .
+ Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh
vật được trinh bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu . độ chính
xác của chỉ số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ
pha loãng .

- Kết quả : sau 2 ngày ta có kết quả sau
Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3
5 60 40
- Theo bảng MPN thì số lương vi khuẩn là 15MPN/100ml . tuy nhiên đây là
số lượng vi sinh vật nếu ta cho 10ml mẫu vào hệ thống ống nghiệm đầu tiên .
Thực tế ta chỉ hút 0.1ml mẫu cho nên kết quả chính xác cho mẫu trên là 15 x
10 = 150MPN/100ml mẫu hay 150000MPN/0.1ml mẫu .
V. Phương pháp nhuộm Gram:
1. Dụng cụ:
- Môi trường có vi khuẩn
- tiêu bản phết kính
- muối sinh lí
- tím kết tinh
- lugol
- safranin O (fuchsin)
- giấy thấm
- dầu soi kính
2. Các bước tiến hành:
- Rửa lam kính thật sạch, lau khô hoặc hơ trên đèn cồn.
- Dùng bút lông vẽ 1 hình tròn nhỏ và ghi tên người thí nghiệm.
- Lật mặt sau lam kính dùng que cấy nhúng vào nước thải lấy 1 lượng vừa đủ cho
vào hình tròn đã vẽ và dàn đến vi sinh.
- Chờ cho khô hoặc hơ trên đèn cồn.
- Sau khi khô, ta nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi bằng Crystal violet.
- Sau 1-2 phút rửa lại bằng cồn 96
0
rồi tiếp tục rửa bằng nước cất. Sau đó hơ khô
trên đèn cồn.
- Nhỏ tiếp iodine(lugol)
- Để 1-2 phút rửa bằng cồn và nước cất.

- Cho 1 giọt safranin sau đó để 1-2 phút rồi rửa bằng nước cất và hơ khô.
- Nhỏ 1 giọt dầu soi lên phết kính và dùng kính hiển vi quan sát vi khuẩn.
3.Kết quả:
- Dưới kính hiển vi quan sát thấy 2 màu: màu tím – Gram( +). màu hồng – Gram
(-).Hình thái tế bào: tụ cầu, cầu.
VI. Câu hỏi ôn tập:

1. Hỏi: Tại sao phải vô trùng? Các phương pháp vô trùng và tiệt trùng?
Trả lời: vô trùng để tránh vi khuẩn có hại xâm nhập vào môi trường nuôi cấy.
- có 2 phương pháp tiệt trùng: nhiệt khô và nhiệt ẩm
* phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô: sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 170

–
180
0
C
* phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: Được thực hiện trong thiết bị tiệt
trùng áp suất 1 atm, 121
0
C trong thời gian 20-30 phút.
- phương pháp vô trùng:
*dùng hóa chất: cồn 70
0
, iod, phenol
* phương pháp vật lý: dùng nhiệt hoặc các tia và sóng điện tử.
2. Hỏi: Tại sao khi chuẩn bị môi trường thạch đĩa petri lại mở nắp?
Trả lời: mở nắp để tránh quá trình thoát hơi nước, vì hơi nước đọng trên nắp sẽ
là điều kiện tốt cho vi khuẩn phát triển.
3. Hỏi: Tại sao phải điều chỉnh độ pH môi trường?
Trả lời: vì vi sinh vật sống và phát triển ở nồng độ pH nhất định.

4. Hỏi: Có mấy loại môi trường thạch ống nghiệm? nêu các đặc trưng cho từng
loại môi trường?
Trả lời: có 2 loại môi trường thạch ống nghiệm: thạch đứng và thạch nghiêng.
5. Hỏi: Tại sao phải pha loãng mẫu? các bước pha loãng mẫu?
Trả lời: pha loãng mẫu để dễ dàng quan sát được số lượng vi sinh vật có trong
mẫu. Các bước pha loãng (xem phần 4 ).
6. Hỏi: Vi sinh vật hiếu khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác
định tổng vi khuẩn hiếu khí?
Trả lời: vi sinh vật hiếu khí có ở khắp mọi nơi nào có oxi.Ý nghĩa việc xác định
tổng vi khuẩn hiếu khí là để biết được nơi đó có ô nhiễm hay không.
7. Hỏi: Tại sao phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ: môi trường, dụng cụ,
tay trong quá trình thao tác?Ý nghĩa việc khử trùng và sát trùng?
Trả lời: phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ để vi khuẩn có hại không xâm nhập
và lan truyền trong quá trình thao tác.Ý nghĩa của việc khử trùng và sát trùng là
đảm bảo môi trường vi sinh vật sống và phát triển tốt.