(Luận Văn Thạc Sĩ) Nghiên Cứu Phân Loại Rong Câu Vùng Tây Nam Bộ Bằng Chỉ Thị Phân Tử.pdf

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------------

Trần Thị Mộng Thúy

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI RONG CÂU VÙNG TÂY NAM BỘ
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Thành phố Hồ Chí Minh - 2021


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------------

Trần Thị Mộng Thúy

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI RONG CÂU VÙNG TÂY NAM BỘ

BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Văn Tú

Thành phố Hồ Chí Minh - 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là cơng trình
nghiên cứu của tơi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tơi tự tìm hiểu và
nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và
khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ
một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu
sai tơi hồn tồn chịu trách nhiệm.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 11 năm 2021
Học viên cao học

Trần Thị Mộng Thúy


Lời cảm ơn
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn đến Ban giám đốc Học
viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; quý thầy cô Khoa Công nghệ Sinh
học và Phòng Đào tạo của Học viện đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi

trong thời gian học tập nâng cao trình độ trong thời gian qua.
Để hồn thành luận văn thạc sĩ, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất
tới TS. Nguyễn Văn Tú (Viện Sinh học Nhiệt đới) đã tận tình hƣớng dẫn, giúp
đỡ, động viên và có nhiều ý kiến đóng góp q báu giúp tơi hồn thành luận
văn “Nghiên cứu phân loại rong câu vùng Tây Nam Bộ bằng chỉ thị phân tử”.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo cùng toàn thể viên chức, nhà
khoa học của Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ tơi trong q trình thu mẫu,
phân tích mẫu, xử lý số liệu phục vụ cho việc thực hiện luận văn này.
Xin cảm ơn các anh/chị lớp Cao học Sinh học thực nghiệm 2017A,
2017B TP.HCM đã cùng chia sẻ, hỗ trợ tơi trong q trình thực hiện đề tài.
Sau cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện
luận văn này.


i

MỤC LỤC
Lời cảm ơn ..................................................................................................................4
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ............................................................... iii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ..............................................................................v
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .................................................................4
1.1.

ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN VÙNG TÂY NAM BỘ CỦA VIỆT NAM ...........4

1.1.1.

Vị trí địa lý khu vực nghiên cứu..........................................................4

1.1.2.

Khí hậu và thủy văn.............................................................................5

1.2.

ĐẶC ĐIỂM CỦA RONG CÂU (Gracilariaceae) ........................................6

1.2.1.

Vị trí phân loại .....................................................................................6

1.2.2.

Thành phần lồi và phân bố ................................................................7

1.2.3.

Sơ lƣợc về Gracilaria tenuistipitata (Rong Câu Chỉ) .........................9

1.2.4.

Sơ lƣợc về Gracilaria salicornia (Rong Câu Đốt) ...........................11

1.3.

TIẾP CẬN SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU RONG CÂU13

3.3.1.

Chỉ thị phân tử COI (Cytochrome c Oxydase subunit 1) ..................14

3.3.2.
Chỉ thị phân tử COI-5P (the 5′ portion of mitochondrial cytochrome c
oxidase subunit I) ..............................................................................................15
3.3.3.
Chỉ thị phân tử rbcLS (ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase/oxygenase spacer) .........................................................................16
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................18
2.1

ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ............................................18

2.2.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................................18

2.2.1.

Khảo sát thực địa thu thập mẫu .........................................................18

2.2.2.

Phân tích trong phịng thí nghiệm .....................................................20


ii

2.2.3.

Xử lý số liệu ......................................................................................25

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................26
3.1

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI RONG CÂU KHU VỰC TÂY NAM BỘ.........26

3.1.1

Gracilaria tenuistipitata C.F.Chang & B.-M.Xia, 1976 ......................26

3.1.2

Gracilaria salicornia (C.Agardh) E.Y.Dawson, 1954 .........................28

3.1.3

Gracilaria blodgettii Harvey, 1853 ......................................................29

3.2
ĐỘ

THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT DNA THEO GRADIEN NHIỆT
30

3.3

CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI .............................................................32

3.3.1

Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu .................................32

3.3.2

Đa dạng trình tự DNA ..........................................................................38

3.3.3

Cây phát sinh lồi .................................................................................39

3.4 ĐẶC ĐIỂM SINH THÁI MÔI TRƢỜNG VÀ PHÂN BỐ MỘT SỐ LOÀI
RONG CÂU ...........................................................................................................42
3.4.1

Đặc điểm phân bố rong Câu Chỉ G. tenuistipitata................................42

3.4.2

Phân bố rong Câu Đốt G. saliconia ......................................................46

3.1.2. Phân bố rong Câu Thắt G. blodgettii Harvey, 1853 ...............................49
Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................51
4.1

KẾT LUẬN .................................................................................................51

4.2

KIẾN NGHỊ .................................................................................................51

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................52
PHỤ LỤC ..................................................................................................................57


iii
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ĐBSCL
NTTS

Đồng bằng sông Cửu Long
Nuôi trồng thủy sản


iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1. Các loài thuộc chi Gracilaria ở Việt Nam [8]

8

Bảng 2. 1. Trình tự và vùng khuếch đại ba cặp mồi của ba marker COI, COI-5P, 23
rbcLS
Bảng 2. 2. Nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng bộ hóa chất BIO- 23
21105
Bảng 2. 3. Nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng bộ hóa chất BIO- 23
25041
Bảng 2. 4. Chu trình nhiệt khuếch đại chung của 3 chỉ thị phân tử

24

Bảng 3.1. Các trình tự tham chiếu trên Genbank

33

Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền giữa 31 mẫu nghiên cứu

34

Bảng 3. 3. Ƣớc lƣợng khoảng cách di truyền giữa các trình tự trong mỗi

37

nhóm/quần thể
Bảng 3.4. Ƣớc lƣợng khoảng cách di truyền giữa các nhóm/quần thể

38

Bảng 3.5. Chỉ số đa dạng DNA trung bình giữa các quần thể

39

Bảng 3.6. Các loại hình thủy vực ghi nhận sự sinh trƣởng của G. tenuistipitata

44

Bảng 3.7. Một số đặc điểm sinh thái môi trƣờng cơ bản khu vực có rong G.
tenuistipitata

45

Bảng 3.8. Các loại hình thủy vực ghi nhận sự sinh trƣởng của G. salicornia

48

Bảng 3.9. Một số đặc điểm sinh thái môi trƣờng cơ bản khu vực có G. saliconia

49


v
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1. 1. Bản đồ khu vực Đồng bằng sơng Cửu Long (Tây Nam Bộ)

4

Hình 1. 2. Rong Câu Chỉ trong ao nuôi tôm quảng canh cải tại tỉnh Cà Mau

10

Hình 1. 3. Chu trình sống của rong câu [8]

11

Hình 1. 4. Hình ảnh lồi G. salicornia

12

Hình 1. 5. Cấu tạo giải phẫu của G. salicornia [8]

13

Hình 2. 1. Bản đồ vị trí các điểm khảo sát

18

Hình 2. 2. Mẫu rong câu thu tại điểm khảo sát

21

Hình 3.1. Hình thái Gracilaria tenuistipitata chụp dƣới vật kính 10X

26

Hình 3. 2. Hình ảnh mẫu và giải phẫu rong Gracilaria tenuistipitata

27

Hình 3.3 Hình thái giải phẫu của rong chụp ở vật kính 20X

27

Hình 3.4. Sinh cảnh sống và mẫu tiêu bản của rong G. saliconia

28

Hình 3.5. Rong Gracilaria blodgettii làm tiêu bản

29

Hình 3.61. Kết quả điện di thể hiện sự ảnh hƣởng của nhiệt độ bắt cặp lên khuếch 30
đại 3 chỉ thị phân tử COI, COI-5P, và rbcLS
Hình 3.7. Cây phát sinh lồi xây dựng bằng phƣơng pháp Maximum Likelihood và 41
thuật tốn Tamura-Nei [24]
Hình 3.8. Phân bố của G. tenuistipitata ở vùng Tây Nam Bộ

43

Hình 3.9. Một số loại hình thủy vực ghi nhận sự hiện diện lồi G. tenuistipitata

46

Hình 3.10. Bản đồ phân bố rong G. salicornia khu vực Tây Nam bộ

47

Hình 3.11. Giá thể bám của rong G. salicornia

48


1

MỞ ĐẦU
Rong biển là một trong những nhóm sinh vật có sự đa dạng sinh học
cao và có phân bố rộng tại Việt Nam. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, thành
phần lồi rong biển Việt Nam có khoảng 827 lồi [1] trong đó có nhiều lồi
có sinh khối lớn và có giá trị kinh tế cao [2, 3].
Chi rong Câu (Gracilaria), thuộc họ rong Câu (Gracilariaceae), bộ

rong Câu (Gracilariales), ngành rong Đỏ (Rhodophyta), có khoảng 100 lồi
[4]. Ở Việt Nam rong Câu đƣợc ghi nhận có 20 lồi, trong đó có nhiều lồi
đƣợc đánh giá là có sinh lƣợng lớn nhƣ loài Gracilaria tenuistipitata C.F.
Chang & B.M. Xia, G. salicornia (C. Agardh) E.Y. Dawson, Hydropuntia
eucheumatoides (Harvey) Gurgel & Fredericq và Gracilariopsis heteroclada
J.-F. Zhang & B.-M. Xia [5, 6]. Sự phân loại rong Câu ở Việt Nam cho tới
nay chủ yếu dựa vào hình thái học nhƣ các đặc điểm hình thái giải phẫu tản và
cơ quan sinh sản, việc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái giải phẫu thƣờng
gặp nhiều khó khăn đối với các lồi có quan hệ gần nhau và có hình thái biến
đổi (thƣờng biến) theo điều kiện môi trƣờng nơi chúng phát triển nên việc
định loại chỉ mang tính tƣơng đối [7]. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy,
thành phần loài rong Câu có những điều chỉnh đáng kể khi áp dụng phƣơng
pháp phân loại hiện đại hơn là phƣơng pháp phân loại sử dụng chỉ số phân tử.
Vì lẽ đó, việc ứng dụng chỉ số phân tử để nghiên cứu sâu hơn về thành phần
loài và phân bố rong Câu là một chủ đề hết sức cần thiết và phù hợp trong
điều kiện khoa học phát triển và góp phần vào sự phát triển kinh tế chung của
Việt Nam hiện nay.
Vùng Tây Nam bộ có tiềm năng ni trồng thủy sản lớn, với diện tích
mặt nƣớc lớn và nhiều điều kiện thuận lợi cho nhóm rong Câu sinh trƣởng và
phát triển. Cho đến nay, khơng có dữ liệu nghiên cứu chính thức về thành
phần loài của rong Câu vùng Tây Nam bộ. Các nghiên cứu đánh giá về thành
phần loài rong Câu Tây Nam bộ là hết sức cần thiết làm cơ sở cho các nghiên
cứu ứng dụng trong lĩnh vực thủy sản và trong công nghệ thực phẩm.
Từ những thực tế đã nêu trên, đề tài “Nghiên cứu phân loại rong Câu
vùng Tây Nam bộ bằng chỉ thị phân tử” là thực sự cần thiết, hoàn toàn khả thi


3

và có tính thực tiễn cao. Kết quả nghiên cứu hứa hẹn sẽ giúp cho sự hiểu biết

về đa dạng sinh học rong Câu vùng Tây Nam bộ theo hƣớng tiếp cận hiện đại;
bên cạnh đó kết quả nghiên cứu này cũng sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu
phát triển nuôi trồng thƣơng phẩm rong Câu để phục vụ phát triển nghề nuôi
trồng thủy sản tại vùng Tây Nam bộ Việt Nam nói riêng và của Việt Nam nói
chung trong tƣơng lai.
* Mục tiêu của đề tài: Phân loại các loài rong Câu phân bố ở vùng
biển Tây Nam bộ.
Để đạt đƣợc mục tiêu trên, đề tài sẽ thực hiện các nội dụng chính sau:
+ Khảo sát thu mẫu rong câu phân bố vùng biển Tây Nam bộ.
+ Phân loại rong Câu bằng hình thái.
+ Phân loại rong Câu bằng phƣơng pháp PCR, giải trình tự gen.


4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN VÙNG TÂY NAM BỘ CỦA VIỆT NAM
1.1.1. Vị trí địa lý khu vực nghiên cứu
Vùng Tây Nam Bộ hay còn đƣợc gọi là Vùng Đồng bằng sông Cửu
Long (ĐBSCL) là vùng cực nam của Việt Nam. Khu vực gồm Thành phố Cần
Thơ và 12 tỉnh: Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu
Giang, Sóc Trăng, Đồng Tháp, An Giang, Kiên Giang, Bạc Liêu và Cà Mau.
Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam năm 2019, ĐBSCL là đồng
bằng có tổng diện tích lớn nhất Việt Nam (40.547,2 km²), chiếm 13% diện
tích cả nƣớc.

Hình 1. 6. Bản đồ khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (Tây Nam Bộ)

(Nguồn: Đồng bằng sông Cửu Long – Wikipedia tiếng Việt)
Vùng Tây Nam bộ là đồng bằng bồi tích trong giai đoạn cuối của kì

trầm tích Pleistocen. Đồng bằng có cao trình thấp, với độ cao trung bình so
với mặt nƣớc biển <2m, có hệ thống sơng ngịi dày đặc. Có vị trí nằm liền kề
vùng Đơng Nam bộ, phía Bắc giáp Campuchia, phía Tây Nam là vịnh Thái
Lan, phía Đông Nam là biển Đông. Các điểm cực của đồng bằng trên đất liền,


5

điểm cực Tây ở phƣờng Mỹ Đức, thành phố Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang; cực
Đông ở xã Thừa Đức, huyện Bình Đại, tỉnh Bến Tre; cực Bắc ở xã Hƣng Điền
A, huyện Vĩnh Hƣng, tỉnh Long An; cực Nam ở xã Đất Mũi, huyện Ngọc
Hiển, tỉnh Cà Mau. Ngoài ra, cịn có các đảo xa bờ của Việt Nam nhƣ
đảo Phú Quốc, quần đảo Thổ Chu, Hịn Khoai.
Về phía Tây, ĐBSCL đƣợc giới hạn bởi sông Châu Đốc và kênh Vĩnh
Tế một dòng kênh nhân tạo chảy dọc theo biên giới Việt Nam-Campuchia,
nhận nƣớc sông Hậu Giang qua sông Châu Đốc tại thành phố Châu Đốc đổ
nƣớc ra Vịnh Thái Lan, giới hạn một vùng đất thấp ngập nƣớc theo mùa gọi
là tứ giác Long Xuyên.
Vùng ĐBSCL của Việt Nam đƣợc hình thành từ những trầm tích phù sa
và bồi dần qua những kỷ nguyên thay đổi mực nƣớc biển; qua từng giai đoạn
kéo theo sự hình thành những giồng cát (đất bằng) dọc theo bờ biển. Những
hoạt động hỗn hợp của sơng và biển đã hình thành những vạt đất phù sa phì
nhiêu dọc theo đê ven sơng lẫn dọc theo một số giồng cát ven biển và đất
phèn trên trầm tích đầm mặn trũng thấp nhƣ vùng Đồng Tháp Mƣời, tứ giác
Long Xuyên – Hà Tiên, Tây Nam sông Hậu (khu vực ngã ba Hậu Giang, Bạc
Liêu và Cà Mau) ở bán đảo Cà Mau.
1.1.2. Khí hậu và thủy văn
Vùng Tây Nam bộ của Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa từ
tháng 5 đến cuối tháng 9 bị ảnh hƣởng của gió mùa Tây Nam đến từ biển cả,
ẩm ƣớt nhiều mƣa, từ tháng 5 đến tháng 10 là mùa mƣa; từ tháng 11 đến trung

tuần tháng 3 năm liền sau bị ảnh hƣởng gió mùa Đơng Bắc đến từ đất liền,
khơ khan ít mƣa, từ tháng 10 đến tháng 11 là mùa khô, từ tháng 9 đến tháng 3
năm liền sau có thủy triều sáng và tối.
Mƣa dơng có cƣờng độ rất lớn, thời gian xảy ra khá ngắn, phạm vi ảnh
hƣởng khá nhỏ đều rất thƣờng xuyên trong suốt mùa mƣa. Bởi vì mùa tiết của
mƣa phân bố không đồng đều, các nơi ở lƣu vực mỗi năm đều phải trải qua
một đợt hạn hán có cƣờng độ và thời gian xảy ra khác nhau.


6

Tam giác châu thổ sơng MeKong có lƣợng nƣớc chảy vào biển trung
bình nhiều năm là 475 tỷ mét khối. Trữ lƣợng lý thuyết thủy năng ở lƣu vực
sông MeKong là 58 triệu kilowatt, thủy năng đƣợc khai phát ƣớc tính là 37
triệu kilowatt, lƣợng phát điện hằng năm là 180 tỷ kilowatt giờ, trong đó 33%
ở Campuchia và 51% ở Lào.
Dịng chảy ở lƣu vực tam giác châu sơng MeKong đến từ mƣa, bởi vì
ảnh hƣởng gió mùa khơng thay đổi hằng năm, cho nên đƣờng tiến trình mức
nƣớc chủ yếu từ một năm thủy văn trƣớc đến một năm thủy văn sau hầu nhƣ
không thay đổi, chênh lệch giữa mức nƣớc cao và mức nƣớc thấp không lớn.
Theo công bố của Bộ Tài nguyên và Môi trƣờng (Việt Nam), khoảng
40% vùng Đồng bằng sơng Cửu Long có thể bị ngập trong nƣớc biển do biến
đổi khí hậu. Bên cạnh đó, do ảnh hƣởng của hiện tƣợng Elnino, nhiều vùng
ven biển của ĐBSCL gặp tình trạng hạn và nƣớc mặn xâm nhập sâu vào nội
địa. Năm 2016, ĐBSCL hứng chịu đợt hạn hán và xâm nhập mặn nặng nề
nhất trong vòng 100 năm, gây thiệt hại hơn 160.000ha lúa.
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA RONG CÂU (Gracilariaceae)
1.2.1. Vị trí phân loại
Họ rong câu Gracilarieae đƣợc Fredericq và Hommersand (1990) phân
thành 7 chi: Gracilaria Greville (1830), Hydropuntia Montagne (1842),

Melanthalia Montagne (1843), Curdiea Harvey (1855), Gracilariophila
Setehell et Winson in Winson (1910), Gracilariopsis Dawson (1949) và
Congracilaria Yamamoto (1986).
Ở Việt Nam cho đến nay đã xác định đƣợc có sự phân bố của một số
lồi thuộc 3 chi: Gracilaria Greville, Gracilariopsis Dawson và Hydropuntia
Montagne [8].
Trong hệ thống phân loại, theo Greville, (1830) vị trí phân loại của rong
câu nhƣ sau:


7

Giới thực vật Plantae
Phân giới Biliphyta
Ngành tảo Đỏ Rhodophyta
Phân ngành 3 Eurhodophytina
Lớp Florideophyceae
Phân lớp Rhodymeniophycidae
Bộ Gracilariales
Họ Gracilariaceae
Phân họ Gracilarioideae
Tông Gracilarieae
Chi Gracilaria
Chi Gracilariopsis
Chi Hydropuntia
1.2.2. Thành phần loài và phân bố
Chi rong Câu (Gracilaria) là một nhóm rong biển nƣớc ấm, thuộc họ
rong Câu Gracilariaceae, bộ rong Câu Gracilariales, ngành rong Đỏ
Rhodophyta, có hơn một trăm lồi trên thế giới, một số trong đó có giá trị
kinh tế rất quan trọng. Trong dữ liệu của Algaebase.org (2021) có 285 lồi

đƣợc cập nhật trong đó có 170 lồi đƣợc chấp nhận. Theo thống kê của FAO
vào năm 2011, trên thế giới đã có hơn 700.000 tấn rong câu đƣợc sản xuất.
Năm 2016, Johor & ctv đã lập danh sách kiểm tra tảo biển ở biển Đông
kết hợp với số liệu của Lê Nhƣ Hậu và Nguyễn Hữu Đại, 2008 tổng hợp các
loài thuộc chi rong Câu ở Việt Nam đƣợc trình bày ở Bảng 1.1. Bên cạnh đó,
số lƣợng lồi thuộc chi Gracilaria là 26 loài ở Việt Nam, đa dạng hơn so với
các nƣớc khác ở biển Đông. Cụ thể là chi Gracilaria ở Singapore có 18 lồi,
Philippines – 17 lồi, Malaysia – 13 loài, Thailand – 9 loài, Indonesia – 1 lồi.
Tính đến năm 2016, tổng cộng đƣợc 26 lồi đƣợc ghi nhận tại Việt Nam so
với thống kê năm 2008 có 13 lồi đƣợc chấp nhận [1].


8

TT
(1)

Bảng 1. 2. Các loài thuộc chi Gracilaria ở Việt Nam [8]
Tên khoa học
Tên Việt Nam
(2)
(3)

1

G. arcuata Zanardini

2

G. articulata Chang & Xia

3

G. blodgettii Harvey

4

G. bursa-pastoris (S.G. Gmelin) P.C. Silva

5

G. canaliculata Sonder

6

G. chondracantha (Kützing) A.J.K. Millar

*

7

G. confervoides (Linnaeus) Greville f. ecorticata Valerie

*

8

G. coronopifolia J. Agardh

*

9

G. cuneifolia (Okamura) I.K. Lee & Kurogi

rong câu nêm

10

G. firma Chang & Xia

rong câu thắt

11

G. foliifera (Forsskål) Børgesen

*

12

G. gigas Harvey

*

13

G. hainanensis C.F. Chang & B.M. Xia

*

14

G.longirostris Zhang & Wang

15

G. mammillaris (Montagne) M.A. Howe

16

G. punctata (Okamura) Yamada

17

G. rubra Chang & Xia

rong câu đỏ

18

G. salicornia (C. Agardh) Dawson

rong câu đốt

19

G.spinulosa (Okamura) C.F. Chang & B.M. Xia

rong câu gai

20

G.stellata I.A.Abbott, Zhang & B.M.Xia

21

G. tenuispitata Chang & Xia

22

G. tenuispitata Chang & Xia var. liui Zhang & Xia

23

G. textorii (Suringar) De Toni

24

G. vermiculophylla (Ohmi) Papenfuss

*

25

G. vieillardii P.C. Silva

*

26

G. yamamotoi J. Zhang & B.M. Xia

*: Những lồi rong hiện chưa có tên Việt Nam

rong câu cong
*
rong câu gậy
*
rong câu nom

rong câu vòi voi
rong câu phiến quăn
*

rong câu chỉ
rong câu chi mảnh
rong câu dẹp

rong câu nan quạt


9

1.2.3. Sơ lƣợc về Gracilaria tenuistipitata (Rong Câu Chỉ)
Có 2 chủng loài rong Câu Chỉ khác nhau là G. tenuistipitata Chang và
Xia (rong Câu Chỉ) và G.tenuispitata Chang & Xia var. liui Zhang và Xia
(rong Câu Chỉ Mảnh). Trong đó, rong Câu Chỉ (G. tenuistipitata) lần đầu tiên
vào năm 1976 đƣợc mô tả bởi hai nhà khoa học Chang & Xia; rong câu chỉ
mảnh đƣợc mô tả lần đầu bởi Zhang & Xia vào năm 1988. Tên G.

tenuistipitata đƣợc định danh lại bằng tên khoa học khác đƣợc xác nhận bởi
nhà phân loại học Gurgel, J.N.Norris & Fredericq là Agarophyton
tenuistipitatum (C.F.Chang & BM.Xia) vào năm 2018.
Ban đầu, rong Câu Chỉ đƣợc trồng ở Trung Quốc nhƣ một nguồn thạch
và làm thức ăn gia súc, các trang trại bào ngƣ [9]. Theo nhu cầu của thị
trƣờng, rong Câu Chỉ có lợi ích thƣơng mại vì lƣợng agar có chất lƣợng tốt,
có độ bền gel tƣơng đƣơng với lƣợng agar của G. fishingi [10]. Bên cạnh đó,
ni cấy rong tƣơng đối dễ dàng ở nhiều điều kiện khác nhau nên đƣợc xuất
hiện trong nhiều đề tài nghiên cứu sinh về tảo đỏ [9].
1.2.3.1. Phân bố
Rong Câu Chỉ (G. tenuistipitata C.F.Chang & B.M.Xia) thƣờng sinh
trƣởng ở thủy vực nƣớc lợ, nơi có độ mặn 5 – 25ppt [11]. Theo các nghiên
cứu về phân bố rong Câu, loài G. tenuistipitata đã đƣợc ghi nhận phân bố ở
Đình Vũ (Hải Phịng), Cửa Hội (Nghệ An), Sơng Danh (Quảng Bình), Cửa
Tùng (Quảng Trị), Phá Tam Giang (TT-Huế), Hội An (Quảng Nam), Đầm Ô
Loan (Phú Yên), cửa Sông Cái (Nha Trang), và cửa Sông Long Đất (Bà Rịa Vũng Tàu) [2, 12].
G. tenuistipitata thƣờng mọc trên sỏi và vỏ sị ở các vùng cận nhiệt đới
có độ mặn thấp, cụ thể là những vùng triều giữa đến vùng triều thấp, dƣới
triều, vùng cửa sông và đầm phá.


10

Hình 1. 7. Rong Câu Chỉ trong ao ni tơm quảng canh cải tại tỉnh Cà Mau

1.2.3.2. Đặc điểm sinh học
G. tenuistipitata mọc thành bụi hay thành thảm dày, cao 10-12cm, màu
đỏ tím hoặc đỏ nâu. Thân rong dạng trụ tròn, phân nhánh theo kiểu chuyền
nhau, gốc chi thắt lại hoặc là không thắt.
Cơ quan dinh dƣỡng của tế bào rong Câu Chỉ gồm 2 phần chính là phần

vỏ và phần lõi: phần vỏ có vách tế bào bao gồm các sợi cellulose xen lẫn chất
keo, tiếp đến là nhiều lớp tế bào nhỏ hình trịn hoặc bầu dục, sắp xếp khít
nhau chứa các sắc tố (phycoerthin). Phần lõi chứa tế bào lớn, trong suốt, hình
trịn hay đa giác là các không bào chứa các chất dự trữ chủ yếu là agar. Cơ
quan sinh sản chính của rong câu chỉ ở cây đực là tinh tử (giao tử đực không
roi) và cây cái là quả bào (giao tử cái – carpogonium).
1.2.3.3. Đặc điểm sinh sản
Trong điều kiện nuôi cấy mô, rong Câu Chỉ có thể phát triển thành cây
trƣởng thành trong khoảng 135 ngày, ngắn hơn so với vòng đời của các loài
cùng chi khác nhƣ G. foliifera - 8 tháng [13], G. debilis - 5 tháng, Gracilaria
sp. -9 tháng (Oliveira và Plastino, 1984) and G. domingensis - 6 tháng
(Guimaraes & ctv, 1999). Tuy nhiên, thời gian sinh trƣởng của rong cũng phụ
thuộc vào điều kiện môi trƣờng [14].
Rong Câu Chỉ có 3 cách sinh sản gồm sinh sản sinh dƣỡng, vơ tính,
hữu tính [8]. Cụ thể ở sinh sản sinh dƣỡng, rong sinh trƣởng ở đỉnh và hình
thành các nhánh từ tế bào vỏ và hấp thụ dinh dƣỡng qua tế bào vỏ. Đây là
cách sinh sản đƣợc nuôi trồng rộng rãi. Thứ hai là sinh sản vơ tính là các thể


11

tử bào tử (tetrasporophyte). Trong giai đoạn đầu, các tứ bào tử (sporophyte)
trải qua quá trình giảm phân cho ra bốn bào tử đơn bội trong túi bào tử
(tetrascope), ở lớp tế bào mặt thân chính hoặc nhánh. Giai đoạn tiếp theo, túi
bào tử chín, túi tự vỡ ra, các bào tử bay lơ lửng cho tới khi bám vào vật thể và
phát sinh thành cây giao tử. Cuối cùng, đối với sinh sản hữu tính cần có sự
thụ tinh giữa tinh tử và noãn diễn ra trong túi chứa nỗn. Từ đó, túi hình thành
nên hợp tử đƣợc ni sống bằng nội chất nhờ cây mẹ. Hợp tử lớn dần rồi phân
cắt thành hai loại nhân đơn bội và lƣỡng bội. Trong hợp tử, các sợi sản bào
phân chia rồi cắt ngang phần đỉnh hình thành quả bào tử (carpospore). Quả

bào tử trƣởng thành sẽ phóng thích qua lỗ mở ở đỉnh túi. Quả bảo tử lơ lửng
trong nƣớc trong một thời gian ngắn rồi bám vào vật thể và phát triển thành
cây tứ bào tử thực vật [8].

Hình 1. 8. Chu trình sống của rong câu [8]
1.2.4. Sơ lƣợc về Gracilaria salicornia (Rong Câu Đốt)

1.2.4.1. Phân bố
G. salicornia lần đầu tiên xuất hiện ở bến cảng Hawaii và khu vực lân
cận (Smith Hunter và Smith, 2002).


12

G. salicornia phổ biến ven biển Việt Nam, mọc trên đá, san hô chết ở
vùng triều cao, triều thấp và dƣới triều khu vực vùng triều ven biển, ven đảo
và xuất hiện trong các ao đầm nƣớc mặn [8].
Ở Việt Nam, G. salicornia phân bố tại khu vực các tỉnh nhƣ: Quảng
Ninh (Cơ Tơ, Tơ Nam), Hải Phịng (Đồ Sơn, Cát Bà), Nghệ An (Quỳnh Lƣu,
Quỳnh Tiến, Nghi Lộc, Nghi Tiến), Đà Nẵng (bán đảo Sơn trà), Quảng Nam
(Cù Lao Chàm), Quảng Ngãi (đảo Lý Sơn), Bình Định ( bán đảo Phƣơng
Mai), Phú Yên (vịnh Xuân Đài), Khánh Hòa (bãi Tiên, Hịn Rùa, Hịn Tre,
Hịn Chồng, Sơng Lơ, quần đảo Trƣờng Sa), Ninh Thuận (Mỹ Tƣờng, Mỹ
Hóa, Thái An, đầm Cà Ná), Bình Thuận (Hƣng Chánh), Bà Rịa-Vũng Tàu
(Cơn Đảo), Kiên Giang (đảo Phú Quốc) [8].
Trên thế giới, G. salicornia phân bố tại các quốc gia, vùng lãnh thổ
nhƣ: Việt Nam, Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin, Singgapore, Malaysia, Thái
Lan, Micronesia, Queensland, Western Australia, Kenya, Mauritius, South
Africa, Tanzania.
1.2.4.2. Đặc điểm sinh học

G. salicornia mọc thành bụi cao từ 5-10cm hay cao hơn, màu vàng đến
nâu, gồm có nhiều nhánh bị, phía dƣới hình thành nhiều đĩa bám phụ và mọc
các nhánh đứng lên phía trên. Các nhánh bị thƣờng dính vào nhau thành một
đám rối, thắt thành các đốt hay không. Các nhánh đứng thắt thành gióng đều
suốt từ gốc đến ngọn với 2-4 nhánh ở các đốt. Phần thân của rong hình trụ,
với đƣờng kính 3-5cm, thƣờng phân nhánh chạc hai đều hoặc khơng [8].

Hình 1. 9. Hình ảnh lồi G. salicornia


13

Hình 1. 10. Cấu tạo giải phẫu của G. salicornia [8]
(a, b,c, d) Hình dạng rong. (e, g) Mặt cắt dọc qua các túi tinh tử. (g) Mặt cắt
dọc qua túi tứ bào tử. (h) Mặt cắt dọc qua tảo quả. (i) Mặt cắt dọc qua vỏ quả
bao ở mẫu khô. (k) Mặt cắt dọc qua vỏ quả bao ở mẫu tƣơi thấy có sợi dinh
dƣỡng nối với mặt trong của vỏ quả bao.

1.2.4.3. Đặc điểm sinh sản
G. salicornia sinh sản chủ yếu thông qua sự phân nhánh và nhân giống
tự nhiên (Smith Pers. Comm, 2003).
1.3. TIẾP CẬN SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU RONG CÂU
Trong quá khứ, nhiều lồi thuộc chi Gracilaria đƣợc phân loại dựa trên
hình thái, tuy nhiên đặc điểm bên ngồi thì ln thay đổi. Các giống rong khi
nuôi trồng sẽ xảy ra sự sinh sản hữu tính tạo ra cây con và hình thành một lồi
mới từ đó gây hiểu nhầm cho ngƣời trồng trọt, nghiên cứu sinh cũng nhƣ khó
khăn trong việc giảng dạy [5]. Vì vậy, để giải quyết vấn đề này, trên thế giới
đã có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng các công cụ sinh học phân tử để hỗ
trợ phân loại và định danh lồi. Trong đó, phân tích và giải trình tự DNA là

14

kỹ thuật phân tử đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để tìm ra các mối quan hệ gen
giữa các lồi.
Vào năm 1977, John & Edna đã dựa vào số nhiễm sắc thể từ thể bốn
lƣỡng bội của tảo đỏ tìm ra sự khác nhau để phân biệt các loài thuộc chi
Gracilaria. Về sau, các nghiên cứu để định danh các loài rong đỏ phần lớn
đều dùng chỉ thị phân tử trong đó phổ biến có COI, cox2-3, rbcL và ITS có
trong lạp thể và ty thể. Ví dụ nhƣ phân loài G. gracilis nhờ marker RAPD
[14], so sánh loài Gracilaria chilensis dọc bờ biển Chilean dựa vào ba chỉ thị
phân tử cox2-3, RUBISCO spacer và ITS2 (Cohen & ctv, 2004). Đến năm
2008, Eun Chan Yang & ctv đã dựa vào trình tự gen COI ở ty thể và rbcL ở
lạp thể trong phân biệt G. vermiculophylla.
Với những hạn chế của phƣơng pháp so sánh hình thái, tại Việt Nam
hiện nay dựa vào sự tiến bộ về sinh học phân tử nên việc ứng dụng phƣơng
pháp phân loại rong dựa vào phân tích DNA là cần thiết và hữu ích. Cùng tình
hình chung của thế giới, việc ứng dụng sinh học phân tử để định danh, phân
loại các loài rong Câu ở Việt Nam đã có nhiều kết quả khả quan, đã áp dụng
xác định tên nhiều loài rong Câu mới. Cụ thể, năm 2005, ở hai cơng trình của
Lê Nhƣ Hậu & ctv xác định lại tên loài rong Câu Chỉ Vàng (G. tenuistipitata)
và rong Câu Thắt (G. firma), các tác giả đã sử dụng phƣơng pháp phân tích
trình tự nucleotide trên hai đoạn gen ITS-1 ở ribosome và rbcL trong lục lạp.
Nhờ đó, hệ thống phân loại học cho các loài rong Câu Việt Nam trên cơ sở
kết hợp hai phƣơng pháp hình thái giải phẫu các cơ quan dinh dƣỡng, sinh sản
và phân tích sinh học phân tử DNA đƣợc hệ thống hóa từng bƣớc rõ ràng,
minh bạch hơn [5]. Vào năm 2019, Lê Nhƣ Hậu & ctv làm rõ tình trạng phân
loại của các mẫu vật đƣợc xác định sai do các loài thuộc chi Gracilaria bị san
phẳng ở biển Đơng dựa trên phân tích hình thái học và trình tự gen rbcL.
Trong bài luận văn này, sẽ đề cập đến 3 loại chỉ thị phân tử là COI, COI-5P

và rbcLS.
3.3.1. Chỉ thị phân tử COI (Cytochrome c Oxydase subunit 1)
Cytochrome C oxidase là một protein của ty thể, nằm ở màng trong ty
thể và là một enzyme quan trọng trong chuỗi vận chuyển điện tử. Vì vậy, nó


15

đóng vai trị trung tâm trong q trình trao đổi chất của sinh vật hiếu khí nhân
thực. Việc sử dụng chỉ thị phân tử nhƣ một công cụ phân tử phổ biến
(universal marker) để hỗ trợ phân biệt các loài bằng cách sử dụng gen
cytochrome c oxidase sunit 1 (COI) [15] vì hai đặc điểm nổi bật: thứ nhất là
COI sở hữu một lƣợng lớn các tín hiệu phát sinh loài (phylogenetic signal)
nhiều hơn các gen ty thể khác, thứ hai primer của loại gen này thì cứng cáp và
có thể tự phục hồi ở đầu 5’[16].
Cytochrome C Oxydase subunit I là vùng để mã hóa protein và sự sắp
xếp tƣơng đối là đơn giản và khơng có sự hiện diện của khoảng trống nếu nhƣ
khơng có các đoạn introns [15]. Từ đó, các nhà khoa học đã thiết kế hơn 7
triệu chuỗi DNA primer cho marker này, có độ dài ít nhất 500bp đƣợc lƣu trữ
trong
Barcode
of
Life
Datasystems
database
(BOLD,
tính đến tháng 3 năm 2020. Vào 2003, Hebert
& ctv đã lập luận rằng hệ thống nhận dạng dựa trên COI có thể đƣợc phát
triển cho tất cả các loài động vật và đã thực hiện một số nghiên cứu về các
nhóm động vật khác nhau. Hiện nay, dựa trên chỉ thị phân tử COI có thể đƣợc

sử dụng thành cơng để định danh trên nhiều loại thực vật khác nhau [17] nhƣ
tảo và thực vật bậc cao nấm Noãn thuộc chi Phytophthore, và nhiều loài thuộc
chi rong đỏ [18]. Tuy nhiên, vào năm 2010 Michaela & ctv đã chỉ ra rằng các
vị trí gắn mồi của gen có tỷ lệ đột biến dẫn đến tỷ lệ thành cơng trong giải
trình gen [19]. Theo các nghiên cứu của Geller & ctv (2013) đã chỉ ra rằng sự
đột biến dẫn đến tỷ lệ khuếch đại gen thành cơng chỉ có 44% [20]. Trong
khóa luận này, chúng tôi sử dụng cặp primer COXI43F và COXI1549R [21],
để so sánh với hai marker còn lại và lựa chọn marker phù hợp nhất để thể hiện
mối quan hệ của rong câu chỉ trong chi rong câu.
3.3.2. Chỉ thị phân tử COI-5P (the 5′ portion of mitochondrial
cytochrome c oxidase subunit I)
Vùng 5’ của tiểu đơn vị Cytochrom C oxyase I (COI-5P) là một phần ở
đầu 5’ của vùng cytochrome c oxidase. Chỉ thị phân tử này đƣợc đánh giá là
có cấu trúc và chức năng bảo tồn gen tốt [17]. Chức năng bảo tồn của gen có
nghĩa là trong q trình dịch mã có thể tạo ra một cơng cụ phát hiện và sửa


16

các lỗi sai trong khung đọc với độ chính xác lên đến 95,7% [22]. Trong đó,
phải kể đến cặp primer HCO2198-LCO1490, đặt tên là primer Fol Folmer đã
khuếch đại một đoạn 658 (bp) của COI-5P giúp phân loại khá tốt đối với các
lồi sinh vật biển [23]. Điển hình nhƣ vào năm 2000, Simison & W.B đã nói
rằng chỉ một số ít lồi trong lớp Chân Bụng là phân loại thành cơng với
primer Fol Folmer [24]. Tuy nhiên, cũng có những nghiên cứu thất bại; vào
năm 2009, Lohman & ctv đã cố gắng khuếch đại đoạn gen COI-5P của những
con chim đậu bằng cặp mồi phổ biến LCO1490 - HCO2198, nhƣng những nỗ
lực này đã không thành công tƣơng tự, vì thế họ phải kết hợp marker COI-5P
với các mồi khác nhau để thực hiện nghiên cứu [25]. Vì vậy, để vƣợt qua
những hạn chế của primer phổ biến này thì một lƣợng lớn mồi đƣợc thiết kế

để đặc hiệu riêng cho từng tập hợp lồi. Đặc biệt, đã có nghiên cứu sử dụng
cặp primer này trong phân cấp loài Gracilaria blodgettii, kết luận rằng
markers CO1-5P đƣợc các nhà nghiên cứu ƣa dùng vì khả năng xác định rong
biển đỏ ở cấp độ loài [26]. Trong nghiên cứu lần này, chúng tôi sẽ sử dụng
cặp primer GazF2, GazR2 [27] để xem xét liệu marker này có phù hợp nhất
để định danh các loài thuộc chi rong câu.
3.3.3. Chỉ thị phân tử rbcLS
carboxylase/oxygenase spacer)

(ribulose-1,5-bisphosphate

Enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO)
là một enzyme xúc tác cho con đƣờng cố định CO2 thành carbon hữu cơ của
hầu hết các sinh vật nhƣ vi khuẩn, tảo xanh, rong [28]. Khơng chỉ vậy, đây
cịn là một protein phong phú nhất trên trái đất, có ý nghĩa to lớn trong nông
nghiệp và môi trƣờng [28]. Gen RubisCO từ sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân
chuẩn đƣợc cấu tạo chủ yếu từ hai loại tiểu đơn vị, lớn (rbcL) và nhỏ (rbcS)
các đơn vị con trong cấu trúc L8S8 hexadecameric cơ bản [29]. Theo nghiên
cứu của Tabita & ctv, đã đề cập mặc dù trình tự nucleotid của đơn vị nhỏ là
đa dạng, phù hợp để chuẩn đốn lồi nhƣng sự bảo tồn cấu trúc nucleotic của
đơn vị lớn đƣợc đề cao hơn đơn vị nhỏ. Do đó, ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase/oxygenase spacer (rbcL) đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu về tiến hóa, phát sinh lồi, địa lý sinh học, di truyền quần thể và


17

hệ thống hóa bởi vì nó có thể đƣợc sao chép dễ dàng và không khác biệt đáng
kể đối với các lồi liên quan. Bên cạnh đó, vùng operon rbcLS đã chọn là
marker nhận biết các loài rong nâu ở Pháp và đƣợc nhận xét có khả năng định

danh tốt [30]. Tuy nhiên, gần nhƣ chƣa có nghiên cứu sử dụng marker này để
phân loại lồi rong Đỏ. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi quyết định sử
dụng primer rbcLS3F, rbcLSS97R [30] để định danh loài trong chi rong câu
đối với các mẫu thu đƣợc tại vùng khảo sát.