Nghiên cứu khoa học " PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI SAO LÁ HÌNH TIM (HOPEA CORDATA VIDAL) THUỘC HỌ DẦU (DIPTEROCARPACEAE) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ " pot

1
Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 10/2006, 75-77.

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI SAO LÁ HÌNH TIM (HOPEA CORDATA VIDAL)
THUỘC HỌ DẦU (DIPTEROCARPACEAE) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ
Nguyễn Hoàng Nghĩa
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Đức Thành

Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CNVN

Tóm tắt

Sao lá hình tim (Hopea cordata Vidal) là loài cây bản địa họ Dầu, hiện chỉ còn thấy tại 3 điểm nhỏ thuộc hai
xã của huyện Cam Ranh, Khánh Hoà, hiện có số cây cá thể không quá 250 và luôn bị đe doạ chặt phá, vì
vậy đánh giá đa dạng di truyền để đưa ra biện pháp bảo tồn thích hợp là rất cần thiết. Kết quả phân tích
một số gen lục lạp và chỉ thị nhân (RAPD) cho thấy về mặt tiến hóa, các mẫu Sao lá hình tim có cùng
nguồn gốc vì không tìm thấy sự đa hình các gen lục lạp đã nghiên cứu. Có sự khác biệt nhỏ trong bộ gen
nhân mà nguyên nhân có thể là có thể do biến đổi của các tính trạng thích nghi lên điều kiện sinh thái của
từng vùng cụ thể. Do thực tế là nguồn gen bị suy giảm mạnh và đa dạng di truyền của loài rất thấp nên
việc bảo tồn loài đứng trước thách thức lớn. Cần phải bảo vệ 3 quần thể cuối cùng của loài để duy trì càng
nhiều gen càng tốt cho sự tồn tại của loài trong tương lai. Mặt khác cần sớm thu hái hạt giống từ cả 3 vùng
trong một số năm để gieo ươm, gây trồng bảo tồn loài ở nơi có điều kiện bảo vệ tốt nhất.

Từ khoá: Đa dạng di truyền, RAPD, cpADN, Hopea cordata Vidal,

Mở đầu
Cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố rộng khắp trên thế giới, là một họ thực vật điển hình của rừng nhiệt
đới Đông Nam Á trong đó Việt Nam cũng có 42 loài của 6 chi và có ý nghĩa lớn về kinh tế và sinh thái học

(Ashton, 1982; Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999; 2005). Ngoài việc cung cấp gỗ tròn, gỗ xẻ dùng trong xây dựng
và sản xuất đồ gia dụng, sản xuất ván nhân tạo, các loài cây họ Dầu còn cho một số sản phẩm dầu nhựa
làm sơn, được trồng làm cây cảnh quan đường phố, cây bóng mát trong công viên. Do hậu quả của chiến
tranh, khai thác không hợp lý, đốt nương làm rẫy và chuyển đổi đất trồng cây nông nghiệp mà rừng hỗn
giao cây họ Dầu đã giảm đi đáng kể cả về diện tích và trữ lượng.
Sao lá hình tim (Hopea cordata Vidal) là loài cây bản địa họ Dầu, hiện chỉ còn thấy tại 3 điểm nhỏ thuộc hai
xã của huyện Cam Ranh, Khánh Hoà (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999; 2005). Số lượng cây cá thể hiện chỉ
còn không quá 250 cây trưởng thành, sống trên đất cát khô cằn ven biển, vẫn luôn bị đe doạ chặt phá làm
củi. Để có cở sở triển khai bảo tồn loài, cần phải đánh giá mức độ đa dạng di truyền của loài sau những
biến động mạnh về phạm vi phân bố và suy giảm số lượng cá thể.
Phân tích đánh giá mức độ đa dạng di truyền của một số loài thực vật trong những năm gần đây ở nước ta
đã được thực hiện bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử, trong đó có Lim xanh và một số loài họ Dầu
(Dipterocarpaceae)(Quách Thị Liên et al., 2004; Nguyễn Hoàng Nghĩa et al., 2005; Nguyễn Đức Thành et
al., 2005; Nguyễn Thuý Hạnh et al., 2005; Dayanandan et al., 1999; Lee et al., 2000, 2001, 2004).
Trong các nghiên cứu trước, chúng tôi đã tìm hiểu mối quan hệ di truyền của 6 chi thuộc họ Dầu
(Dipterocarpaceae) và 12 loài chi Dầu (Dipterocarpus). Trong nghiên cứu này, dựa vào chỉ thị RAPD và chỉ
thị ADN lục lạp, chúng tôi đi sâu đánh giá đa dạng di truyền của 50 mẫu lá loài Sao lá hình tim thuộc họ
Dầu để đề xuất các biện pháp bảo tồn thích hợp.

Vật liệu và phương pháp
Vật liệu: Năm mươi (50) mẫu lá Sao lá hình tim (Hopea cordata Vidal) đã được thu thập từ ở 3 điểm phân
bố cuối cùng của loài: Thuỷ Triều 1 (Cam Hải Đông, ký hiệu từ A1- A9), Thuỷ Triều 2 (Cam Hải Đông, ký
hiệu từ B1- B15) và Trạm Xá (Cam Hải Tây, ký hiệu từ C1- C26) đều thuộc huyện Cam Ranh, Khánh Hoà.
Hoá chất. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu gồm:
5 mồi RAPD là OPC8, OPC11, OPB11, OPB14, OPB15 mua từ hãng Operon, Mỹ.
4 mồi lục lạp (cpADN): trnH- trnK, psbC- trnS, trnD- trnT, rbcL- trnL(UAA) được cung cấp bởi hãng IDT, Mỹ.
Các enzym giới hạn: Hinf I, Hae III, HhaI mua từ hãng Promega, Mỹ.
Phương pháp:
ADN tổng số được tách chiết từ 50 mẫu lá Sao lá hình tim theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromicle) của Saghai Maroof và cs (1994).

Phản ứng PCR với các mồi RAPD
PCR được tiến hành với tổng thể tích là 25 l/mẫu, gồm những thành phần sau: ADN tổng số (75 ng); mồi
RAPD (20 ng); dNTP (200 M mỗi loại); MgCl
2
(1,5 mM); enzyme Taq polymeraza (0,5 đơn vị) và đệm
thích hợp cho enzym. Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94
o
C - 3 phút; 94
o
C - 1 phút; 35
o
C - 1phút; 72
o
C -
2 phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72
o
C - 5 phút; giữ nhiệt độ ở 4C. Sản phẩm PCR được
điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím.


2
Phản ứng PCR với các mồi lục lạp
Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp được tiến hành với tổng thể tích là 25l/mẫu gồm những thành phần sau:
ADN tổng số (20 ng); mồi cpADN(10 ng); dNTP (200 M mỗi loại); MgCl
2
(1,5 mM); enzym Taq polymeraza
(0,5 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym. Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94
o
C - 4phút; 94
o

C - 1phút;
57
o
C - 1phút; 72
o
C - 2phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72
o
C - 7phút; giữ nhiệt độ ở 4
o
C. Sản
phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5 %, quan sát dưới đèn cực tím.
Phân tích số liệu
Các băng ADN được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo
ADN chuẩn (ADN marker). Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được đưa
vào sử lý theo chương trình NTSYS pc để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu (Rohlf, 1993). Việc
tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức:
J
ij
= a/(n-d)
a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j
d: Số băng ADN không có băng cả hai dòng i và j
n: Tổng số băng thu được
J
ij
: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j
Sau đó các mẫu nghiên cứu được sử lý tiếp trong NTSYS - SIMQUAL để tính hệ số tương đồng di truyền
và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa 50 mẫu Sao lá hình tim.

Kết quả và thảo luận
1. Kết quả phân tích với các mồi lục lạp

Sản phẩm PCR với các mồi lục lạp được thể hiện trên hình 1, 2 và 3.

Kết quả cho thấy với mỗi mồi lục lạp đều nhận được băng đặc trưng và không cho đa hình giữa các mẫu
nghiên cứu. Khi dùng các enzym giới hạn cắt các sản phẩm PCR của các ADN genome với các mồi lục lạp
cũng không nhận được đa hình. Kết quả trên cho thấy về mặt tiến hóa các mẫu Sao lá hình tim có cùng
nguồn gốc vì các đoạn gen lục lạp rất bảo thủ và mang đặc trưng của loài, nó cũng chứng tỏ nguồn gen
của loài hiện đã bị suy giảm mạnh và hầu như không còn sự đa dạng di truyền.

2. Kết quả phân tích với các mồi RAPD
Sản phẩm PCR với các mồi RAPD được thể hiện trên hình 4 và 5. Với việc sử dụng 5 mồi RAPD đã nhân
bản được 1166 phân đoạn ADN từ 50 mẫu cây đại diện cho 50 mẫu loài Sao lá hình tim tại 3 địa điểm khác
nhau, trong đó có 616 phân đoạn cho đa hình giữa các mẫu. Số phân đoạn đa hình giao động từ 3 đến 49
Hình1. Sản phẩm PCR của mồi trnD – trnT với ADN genome các cây
Sao lá hình tim

Hình 2. Sản phẩm PCR của mồi trnH- trnK với
ADN genome các cây Sao lá hình tim cắt với enzym
HhaI
Hình 3. Sản phẩm PCR của mồi psbC-trnS với
ADN genome các cây Sao lá hình tim cắt với
enzym HinfI


3
tương đương với 37,1% đến 78,4%. Mồi OPC8 cho nhiều băng đa hình nhất (181 băng) còn mồi OPB14
cho ít băng đa hình nhất (93 băng).

Số liệu thu được chúng tôi đưa vào xử lý theo chương trình NTSYS pc và NTSYS - SIMQUAL để tính hệ
số tương đồng di truyền và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa 50 mẫu Sao lá hình tim
(hình 6).

Qua hình 6 cho thấy quan hệ di truyền giữa 50 mẫu của loài Sao lá hình tim phân thành 3 nhóm tương ứng
với 3 địa điểm thu mẫu với hệ số tương đồng di truyền khá cao (khoảng 70% đến 80%). Tuy nhiên, các
mẫu tại mỗi địa điểm có sự khác biệt nhau nhưng cũng không lớn: nhóm B (Thuỷ Triều 2) có mức độ đa
Hình 4. Sản phẩm PCR của mồi OPB14 với ADN
gennome các cây Sao lá hình tim

Hình 5. Sản phẩm PCR của mồi OPB11 với
ADN genome các cây Sao lá hình tim

Coefficient
0.67 0.75 0.83 0.92 1.00

A1
A2
A3
A8
A5
A7
A9
A6
A4
C1
C3
C9
C14
C4
C21
C25
C24
C15
C20
C5
C22
C13
C18
C16

C17
C19
C2
C8
C7
C6
C11
C10
C12
C23
C26
B1
B5
B6
B7
B15
B14
B4
B13
B11
B9
B12
B2
B3
B8
B10
Hình 6. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 50 mẫu Sao lá hình tim


4

dạng cao hơn cả và có hệ di truyền tương đồng với hai nhóm A và C là 67 %, nhóm A (Thuỷ Triều 1) và
nhóm C (Trạm Xá) có quan hệ gần nhau hơn với hệ số tương đồng di truyền ở mức 78%. Trong mỗi
nhóm, các mẫu cây thu được đều có sự khác nhau, tuy nhiên ở mức độ rất thấp (từ 0 đến 20%).

Kết quả phân tích RAPD cho thấy, các mẫu Sao lá hình tim thu từ ba địa điểm khác nhau có sự khác biệt
nhỏ ở mức độ genome, các mẫu thu trong một vùng đều nằm trong cùng một nhóm riêng biệt. Sự khác
nhau ở mức độ genome có thể do biến đổi của các tính trạng thích nghi lên điều kiện sinh thái của từng
vùng cụ thể.

Kết luận: Từ kết quả phân tích một số gen lục lạp và chỉ thị nhân (RAPD) có thể kết luận như sau:
 Xét về mặt tiến hóa thì các mẫu Sao lá hình tim có cùng nguồn gốc vì không có sự đa hình các gen lục
lạp đã nghiên cứu.
 Hiện tồn tại sự khác biệt nhỏ trong bộ gen nhân, có thể do biến đổi của các tính trạng thích nghi lên
điều kiện sinh thái của từng vùng cụ thể.
 Do thực tế là nguồn gen bị suy giảm mạnh và đa dạng di truyền của loài rất thấp nên việc bảo tồn loài
đứng trước thách thức lớn. Cần phải bảo vệ 3 quần thể cuối cùng của loài để duy trì càng nhiều gen
càng tốt cho sự tồn tại của loài trong tương lai. Mặt khác cần sớm thu hái hạt giống từ cả 3 vùng trong
một số năm để gieo ươm, gây trồng bảo tồn loài ở nơi có điều kiện bảo vệ tốt nhất.

Tài liệu tham khảo
1. Ashton, P.S.J,1982. Dipterocarparceae. In C.G.G.J. Van Steenis [ed.], Flora Malesiana, Series 1,
Spermatophyta, vol.9, 237-552. Martinus Nijhoff Pulishers, The Hague.
2. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999. Một số loài cây bị đe doạ ở Việt Nam. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Cây họ Dầu Việt Nam. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Đức Thành, 1999. ứng dụng và phát triển các chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu đa
dạng phân tử ở lúa. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội: 1205-1215.
5. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa 2004. Sử dụng các chỉ thị RAPD và
ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophloeum
fordii Oliv. Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà
xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2004. 464 – 468.

6. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Quốc Trọng, Nguyễn Đức Thành, 2005. Kết quả bước đầu đánh giá đa
dạng di truyền của ba xuất xứ Lim xanh bằng chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp. Tạp chí Nông
nghiệp &PTNT, 15/2004, 80 - 81.
7. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Nghiên cứu quan hệ di
truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN
genome và lục lạp. Hội Nghị khoa học toàn quốc, Hà Nội 2005 - Những vấn đề Nghiên cứu cơ bản
trong khoa học sự sống. Bài đã gửi đăng.
8. Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Nghiên cứu mối quan hệ di
truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (họ Dipterocarpaceae) dựa trên các chỉ thị phân tử. Hội
nghị Khoa học toàn quốc “Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản”, Trường Đại học Nông
nghiệp I, Hà Nội, 2005. 89 – 92.
9. Dayanandan S., Ashton P.S., Williams S.M., Primack R.B., 1999. Phylogeny of the tropical tree
family Dipterocarpaceae based on nucleotide sequences of chloroplast rbcL gene. Amer. Journal of
Botany, 86: 1182-1190.
10. Lee, S. L, Tani, N, K. K. S. NG and Tsumura, Y., 2004. Characterization of 15 polymophic
microsatellite loci in an endangered tropical tree Hopea bilitonensis (Dipterocarpaceae) in
Peninsular Malaysia. Molecular Ecology Notes 4:147-149.
11. Lee, S. L., K. C. Ang & M. Norwati., 2000. Genetic diversity of Dryobalanops Aromatica Gaertn. F
(Dipterocarpaceae) in Peninsular Malaysia and its pertinence to genetic conservation and tree
improvement. Forest Genetics 7 (3): 211-219.
12. Lee, S. L., Wickneswari. R, Mahani. M. C, Zakri. A. H., 2001. Comparative genetic diversity studies
of Shorea Leprosula (Dipterocarpaceae) using RAPD and Allozyme markers. Journal of Tropical
Forest Science 13 (1): 202-215.
13. Lee. S. L, Wickneswari. R, Mahani. M. C, Zakri. A. H., 2000. “Mating System parameters in a
Tropcal Tree Species, Shorea leprosula Miq. (Dipteerocarpaceae), from Malaysian Lowland
Dipterocarp Forest”. Biotropica 32(4a): 693-702.
14. Rohlf F. J., 1993. “NTSYS-pc Numerical taxonomomy and multivariate analysis system”, Version
1.80. Applied Biostatitics, New York.
15. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W., 1994, Extraodirnarily
polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population

dynamics, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 91: 5466-5470.



5
Analysis of genetic diversity of Hopea cordata Vidal, a species of Dipterocarpaceae by DNA
markers
Nguyen Hoang Nghia
Forest Science Institute of Vietnam
Nguyen Thuy Hanh, Nguyen Duc Thanh
Institute of Biotechnology, VAST

Summary
Hopea cordata Vidal is a native tree species which occurs naturally only in 3 small areas in Cam Ranh
district, Khanh Hoa province where not more than 250 mature individuals can be found and they are facing
danger of cutting for fuelwood, therefore evaluation of genetic diversity in order to suggest conservation
mrasures should be very necessary. Results from analysis by using cpDNA and RAPD markers showed
that based on evolutionary viewpoint, samples collected from 3 areas come from one origin beacause we
could not find any polymorphism in studied cpDNA. There was a small difference in nuclear genome. Due
to strongly reduced genetic resources and low genetic diversity, conservation of the species is very difficult.
The last 3 populations should be protected strictly to keep as many genes as possible for survival of the
species in future, on the other hand, seeds should be collected in some years from 3 areas for sowing and
planting in such area where species can be protected best.

Keywords: Genetic diversity, RAPD, cpDNA, Hopea cordata Vidal,