Xây dựng quy trình định lượng đồng thời allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGƠ THỊ MINH TÂM

XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
ALLOPURINOL VÀ CHẤT CHUYỂN HĨA OXYPURINOL
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGƠ THỊ MINH TÂM

XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
ALLOPURINOL VÀ CHẤT CHUYỂN HĨA OXYPURINOL
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. LÊ THỊ THU CÚC
2. GS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Ngơ Thị Minh Tâm

ii

.


.

MỤC LỤC
Trang
TRANG PHỤ BÌA

i

LỜI CAM ĐOAN

ii

MỤC LỤC

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ix

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
1.1 TỔNG QUAN VỀ ALLOPURINOL VÀ OXYPURINOL ......................................3
1.2 CHUẨN NỘI TRONG PHÂN TÍCH DỊCH SINH HỌC ..........................................8
1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU HUYẾT TƯƠNG ................................ 10
1.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
THEO HƯỚNG DẪN CỦA CƠ QUAN QUẢN LÝ THUỐC VÀ THỰC PHẨM
HOA KỲ VÀ CƠ QUAN QUẢN LÝ THUỐC CHÂU ÂU ...................................12
1.5 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
ALLOPURINOL VÀ OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG ...............................................................................14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 17
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU- NGUYÊN VẬT LIỆU –TRANG THIẾT BỊ .........17
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................28
3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ........................................................................28
3.2 KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU .............................................................. 31

iii
.


.

3.3 KHẢO SÁT CHẤT CHUẨN NỘI .........................................................................33
3.4 XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ ĐỊNH LƯỢNG ..............................................36
3.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ALLOPURINOL,
OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO ................................................................................................ 36

3.6 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ALLOPURINOL VÀ CHẤT
CHUYỂN HÓA OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ
THUẬT HPLC .......................................................................................................46
3.7 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG TRÊN PHÂN TÍCH MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI
BỆNH GÚT ...........................................................................................................49
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 56
4.1 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALLOPURINOL , OXYPURINOL TRONG
HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT HPLC.........................................56
4.2 BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ALLOPURINOL, OXYPURINOL TRÊN
MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BỆNH GÚT ...................................................... 58
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 62
5.1 KẾT LUẬN .............................................................................................................61
5.2 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………….……….………63
PHỤ LỤC

iv
.


.

v
.


.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,

Chữ viết
tắt
ALO

Từ nguyên

Ý nghĩa

Allopurinol

Allopurinol

AUC

Area under curve

Diện tích dưới đường cong

BLK

Blank

Mẫu trắng

Cmax

Maximum concentration

Nồng độ đỉnh

CR

Carry over

Mẫu tồn dư

CV

Coefficient of variation

Hệ số phân tán

EC

Electrical conductivity

Độ dẫn điện

EMA
HQC

European Medicines
Agency
High Quality Control

Cơ quan Quản lý thuốc Châu
Âu
Mẫu kiểm tra nồng độ cao

IS

Internal standard

Chuẩn nội

IUPAC

International Union of Pure
and Applied Chemistry

Hiệp hội Quốc tế về Hóa học
thuần túy và ứng dụng

HT
HPLC

Huyết tương
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

OXY

High Performance Liquid
Chromatography
Oxypurinol

PPE

Protein precipitation

Tủa protein

LC-MS/MS

Liquid chromatography Tandem mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ

LLE
LLOQ

Chiết lỏng – lỏng
Giới hạn định lượng dưới

LQC
MIN
MAX
MQC

Liquid-liquid extraction
Lower Limit of
Quantification
Low Quality Control
Minimum
Maximum
Medium Quality Control

MS

Mass Spectrometry

vi
.

Oxypurinol

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp
Giá trị nhỏ nhất
Giá trị lớn nhất
Mẫu kiểm tra nồng độ trung
bình
Khối phổ


.

PPT

Protein Precipitation

Tủa protein

RSD
S/N
SPE
T1/2
TB
Tmax

Relative standard deviation
Signal/noise

Solid phase extraction
Half-life

Độ lệch chuẩn tương đối
Tỉ lệ tín hiệu/nhiễu
Chiết pha rắn
Thời gian bán thải
Trung bình
Thời gian đạt nồng độ đỉnh

tR
ULOQ
UPLC
US-FDA

Time at which the
maximum concentration
(Cmax) is observed
Retention time
Upper limit of quantitation
Ultra Performance Liquid
Chromatography
United States Food and
Drug Administration

vii
.

Thời gian lưu
Giới hạn định lượng trên

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
Cơ quan Quản lý thuốc và
Thực phẩm Hoa kỳ


.

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Tóm tắt các thơng số dược động học của allopurinol .....................................5
Bảng 1.2 So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA....................................................13
Bảng 1.3 Tóm tắt một số cơng trình nghiên cứu định lượng đồng thời ....................... 15
Bảng 2.1 Chất đối chiếu và chuẩn nội dự kiến sử dụng trong nghiên cứu ...................17
Bảng 2.2 Dung mơi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu ................................ 17
Bảng 2.3 Các lô huyết tương trắng đã sử dụng trong nghiên cứu ................................ 18
Bảng 2.4 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ....................................................... 18
Bảng 2.5 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc ......................................................................19
Bảng 2.6 Cách pha hỗn hợp chuẩn ...............................................................................20
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát cột sắc ký ...........................................................................32
Bảng 3.2 Hiệu suất chiết với dung môi tủa protein (n=5) ............................................32
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát các dung môi chiết (n=5)...................................................33
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hiệu suất chiết (n=6) .......................................................... 35
Bảng 3.5 Nồng độ ALO, OXY lý thuyết trong dãy đường chuẩn .............................. 36
Bảng 3.6 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống (n = 6) ..................................................37
Bảng 3.7 Kết quả xác định tính đặc hiệu và giới hạn định lượng dưới ........................ 38
Bảng 3.8 Mối tương quan giữa giá trị nồng độ và tỷ số diện tích pic (S/SIS) ..............40
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát tính tương thích của phương trình hồi quy........................ 40
Bảng 3.10 Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày và giữa các ngày.................41
Bảng 3.11 Tỷ lệ phục hồi của các chất phân tích trong huyết tương người (n = 6) .....42
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ ổn định trong huyết tương người (n = 6)....................43

Bảng 3.13 Kết quả độ ổn định của dung dịch gốc các chất phân tích .......................... 44
Bảng 3.14 Kết quả thẩm định ảnh hưởng của nền mẫu ................................................45
Bảng 3.15 Kết quả thẩm định ảnh hưởng hệ số pha loãng (D= 2) ............................... 45
Bảng 3.16 Kết quả thẩm định ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư (n=6) ....................... 46
Bảng 3.17 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc ....................................................................47
Bảng 3.18 Cách pha dãy dung dịch chuẩn trong dung môi pha mẫu ........................... 47
Bảng 3.19 Nồng độ lý thuyết của giai mẫu chuẩn và mẫu kiểm chứng ....................... 48
Bảng 3.20 Kết quả tương thích hệ thống 2 ngày phân tích mẫu .................................50
Bảng 3.21 Kết quả đường chuẩn định lượng ALO, OXY trong huyết tương người ....50
Bảng 3.22 Kết quả mẫu QC định lượng ALO, OXY trong huyết tương người ...........51
Bảng 3.23 Kết quả định lượng huyết tương người bệnh gút ngày 1 ............................ 53
Bảng 3.24 Kết quả định lượng huyết tương người bệnh gút ngày 2 ............................ 54

viii
.


.

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo allopurinol .........................................................................3
Hình 1.2 Sự chuyển hóa hypoxanthinvà allopurinol ...................................................4
Hình 1.3 Cơ chế làm giảm sản xuất acid uric của allopurinol và oxypurinol ................4
Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo của oxypurinol. ..................................................................6
Hình 1.5 Allopurinol và các chất chuyển hóa................................................................. 7
Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của acyclovir .......................................................................9
Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của guanin ...........................................................................9
Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của lamivudin ....................................................................10
Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein .....................................22

Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng lỏng .............................. 23
Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát đung dịch đệm ................................................................ 22
Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động ..................................................................30
Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký ........................................................................30
Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát tác nhân tủa protein ........................................................ 32
Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát chất chuẩn nội .................................................................34
Hình 3.6 Sắc ký đồ huyết tương trắng nồng độ MQC sau khi xử lý mẫu ...................35
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn nồng độ LLOQ và mẫu huyết tương trắng .................37
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích pic ..............40
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ của ALO và OXY .................51
Hình 3.10 Sắc ký đồ phân tích mẫu huyết tương người bệnh gút ................................ 52

ix
.


.

MỞ ĐẦU
Bệnh gút là bệnh viêm khớp do vi tinh thể, đặc trưng bởi những đợt viêm khớp
cấp tái phát, có lắng đọng tinh thể muối urat natri trong các mơ, gây ra do rối loạn
chuyển hóa nhân purin tăng acid uric trong máu [3]. Với người bị bệnh gút, khi nồng
độ acid uric quá cao, những tinh thể nhỏ của acid uric được hình thành, tập trung lại ở
khớp đặc biệt là các khớp ở ngón chân cái, gây viêm, sưng và đau đớn cho bệnh nhân.
Tuy nhiên, gút là bệnh lành tính và có thể phịng ngừa và khống chế bằng thuốc cũng
như thay đổi chế độ ăn [3]. Trong nội khoa, các thuốc dùng trong điều trị bệnh gút bao
gồm các thuốc chống viêm (colchicin, NSAIDs, corticoid), thuốc làm giảm acid uric
máu (gồm nhóm ức chế tổng hợp acid uric và nhóm tăng đào thải acid uric).
Allopurinol là thuốc thuộc nhóm ức chế tổng hợp acid uric, được chỉ định khi tình
trạng viêm khớp đã thuyên giảm [2], [3], [8]. Allopurinol được Hội Thấp khớp học

Hoa Kỳ (ACR) khuyến cáo là thuốc được lựa chọn đầu tiên trong điều trị gút trong
hướng dẫn năm 2020 và cũng là thuốc duy nhất được khuyến cáo đầu tiên trong điều
trị gút cho tất cả các bệnh nhân mắc bệnh từ giai đoạn 3 trở lên có bệnh thận mạn tính
[15].
Thuốc này có trong Danh mục thuốc thiết yếu tân dược ban hành lần thứ VI
năm 2013 và Danh mục thuốc tân dược thuộc phạm vi thanh toán của quỹ bảo hiểm y
tế năm 2015 [4], [5]. Thị trường Việt Nam đang lưu hành allopurinol dạng generic với
nhiều biệt dược khác nhau, có giá thành thấp hơn so với thuốc phát minh. Theo định
hướng phát triển y tế để đảm bảo an sinh xã hội và quyền lợi của người bệnh, cần tiến
hành đánh giá khả năng thay thế thuốc phát minh bằng thuốc tương đương thông qua
thử nghiệm chứng minh tương đương sinh học với thuốc phát minh, đòi hỏi phương
pháp định lượng allopurinol và oxypurinol trong huyết tương người có độ nhạy, độ
đặc hiệu và độ chính xác phù hợp. Với liều dùng hằng ngày của allopurinol trong điều
trị từ 100 mg đến tối đa 800 mg, nồng độ tối đa của allopurinol và chất chuyển hoá
oxypurinol lên đến 2-5 µg/mL [2], [8], [10], [16] là có thể định lượng bằng HPLCUV.

1
.


.

Liều lượng allopurinol hằng ngày dựa vào nồng độ acid uric máu và khi sử
dụng thuốc cần lưu ý theo dõi chặt chẽ tác dụng phụ trong những ngày đầu dùng
thuốc, thậm chí sau 1-2 tuần [2], [3], [8], [15]. Có nhiều yếu tố như tuổi, giới tính, hút
thuốc lá và di truyền có liên quan đến nồng độ acid uric trong máu [6], [22], [24].
Hiện nay, đã bắt đầu có nghiên cứu tại Việt Nam nhằm so sánh các biến thể gen ở
người bình thường so với bệnh nhân gút, tìm ra yếu tố nguy cơ gây bệnh và dự đoán
đáp ứng với các liệu pháp điều trị giảm acid uric máu [6], cần có các thơng tin về gen,
nồng độ acid uric, nồng độ thuốc điều trị trong huyết tương bệnh nhân gút, từ đây yêu

cầu một phương pháp định lượng allopurinol và chất chuyển hóa có hoạt tính là
oxypurinol trong huyết tương người bệnh gút trong các nghiên cứu này.
Trên thế giới đã có một số cơng trình định lượng đồng thời allopurinol và
oxypurinol trong huyết tương bằng các kỹ thuật khác nhau như LC-UV, LCMS/MS,
UPLC-MS/MS [10], [11], [14], [16], [17], [18], [20], [26]. Tuy nhiên, cho đến nay
chưa có phương pháp định lượng đồng thời allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol
trong huyết tương người được cơng bố ở Việt Nam. Vì những lý do trên, đề tài “Xây
dựng quy trình định lượng đồng thời allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol
trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện
để góp phần vào việc nghiên cứu dược động học của allopurinol trên bệnh nhân gút
tại Việt Nam cũng như đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa
allopurinol đang lưu hành.
Mục tiêu cụ thể của đề tài là:
-

Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp cho việc định lượng đồng thời allopurinol

và chất chuyển hóa oxypurinol trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC.
-

Lựa chọn IS đạt yêu cầu và khảo sát phương pháp xử lý mẫu huyết tương.

-

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời allopurinol và

oxypurinol trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC theo hướng dẫn của
US-FDA và EMA hiện hành.

2

.


.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về allopurinol và oxypurinol
1.1.1 Allopurinol

Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo allopurinol
Cơng thức phân tử: C5H4N4O
Danh pháp IUPAC: 1,5-dihydro-4H-pyrazolo[3,4-d] pyrimidin-4-on [1].
CAS Number: 315-30-0 [8], [27].
Tên khác: 1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ol [30]; Alopurinol [2].
Khối lượng phân tử: 136,11 g/mol [1], [29].
Tính chất lý hóa:
-

Bột trắng hay gần như trắng [1], [30].

-

Độ tan: 80,0 mg/dL nước, tan tốt hơn trong mơi trường kiềm [30].

-

Rất khó tan trong ethanol 96% [1], tan trong các dung dịch kiềm loãng [1].

-

pKa = 10,2 ở 25 C [30].

1.1.1 Cơ chế tác dụng và dược động học
1.1.1.1 Cơ chế tác dụng
Allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol làm giảm sản xuất acid uric do
cạnh tranh enzym xanthin oxydase là enzym chuyển hypoxanthin thành xanthin và
chuyển xanthin thành acid uric. Do đó allopurinol làm giảm nồng độ acid uric cả
trong huyết thanh và trong nước tiểu [2], [8].

3
.


.

Hình 1.2 Sự chuyển hóa hypoxanthin thành xanthin và acid uric, từ allopurinol
thành oxypurinol [9]

Hình 1.3 Cơ chế làm giảm sản xuất acid uric của allopurinol và oxypurinol [27]

4
.


.

1.1.1.2 Dược động học
Các thông số dược động học của allopurinol và oxypurinol trong huyết tương
có sự thay đổi theo nhóm tuổi và các bệnh mắc kèm [2], [8], [15], [16], [17], [24].
Bảng 1.1 Tóm tắt các thơng số dược động học của allopurinol

Liều

ALO

Cmax
(µg/mL)
Mean ± SD
2-3

OXY

5 - 6,5

-

ALO

0,5 -1,4

1-2

OXY

2,4-6,4

3-4

ALO
Generic

1,94±0,83

9,286 ± 5,9

2,01±0,90

9,39 ± 5,23

5,88 ±1,71

221,06 ± 67,30

6,04± 1,59

225,88 ± 59,36

1,24 ±0,21

4,38 ±0,67

0,6-2,5

1,24 ±0,21

4,38 ±0,67

0,6-2,5

Hoạt chất

300 mg
ALO
100 –
300 mg
ALO

300 mg
ALO
ALO
Thuốc phát minh
OXY
Generic
OXY
Thuốc phát minh
ALO
Cao tuổi
ALO
trẻ tuổi
200 mg
ALO
OXY
Cao tuổi
OXY
trẻ tuổi
-

AUC0-t
(µg.giờ/mL)
Mean ± SD

Tmax (giờ)
Mean ±
SD
2-6

TLTK
[2]
[8]

2,32 ±
1,06
2,10 ±
0,96
6,32 ±
2,66
6,12 ±
2,45

[10]

[16]
5,63±0.83

260±46

2,0-10

3,75±0.25

166±23

2,0-10

Hấp thu: Sau khi uống, khoảng 80 – 90 % liều được hấp thu nhanh qua đường

tiêu hóa [2], [8].
-

Phân bố: Allopurinol đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 2 – 6 giờ ở liều

thường dùng [2]. Allopurinol không gắn với protein huyết tương [2], [8]. Sau khi
uống một liều 300 mg, Cmax trong huyết tương của allopurinol khoảng 2 µg/mL [2].
-

Chuyển hóa: Khoảng 70 – 76 % allopurinol được chuyển hóa chủ yếu ở gan

thành oxypurinol. Thời gian bán thải của allopurinol khoảng 1 – 3 giờ. Các chất

5
.


.

chuyển hóa khác của allopurinol là allopurinol-riboside và oxypurinol-7-riboside [2],
[8].
-

Thải trừ: Cả allopurinol và oxypurinol được liên hợp thành dạng ribonucleosid

tương ứng. Khoảng 70 % liều dùng hàng ngày được thải trừ trong nước tiểu là
oxypurinol và tới 10 % là allopurinol. Dùng kéo dài có thể thay đổi tỉ lệ này, vì
allopurinol ức chế chuyển hóa của chính nó. Phần còn lại của liều được thải trừ qua
phân. Cả allopurinol và oxypurinol được tìm thấy trong sữa mẹ [2], [8].
-

Liều lượng: Liều khởi đầu với bệnh nhân gút mỗi ngày 100 mg, tăng dần sau

mỗi tuần thêm 100 mg, đến khi nồng độ urat trong huyết thanh giảm xuống 0,36
mmol/lit hoặc thấp hơn hoặc cho tới khi đạt tới liều tối đa khuyến cáo 800 mg. Liều
thường dùng mỗi ngày ở người lớn trong trường hợp bệnh nhẹ là 200 - 300 mg/ngày,
gút có sạn urat (tophi) trung bình là 400 - 600 mg/ngày. Liều đến 300 mg uống một
lần trong ngày, liều trên 300 mg phải chia nhiều lần để giảm nguy cơ kích ứng dạ dày.
Duy trì uống đủ nước để phòng ngừa lắng đọng xanthin ở thận. Sau khi nồng độ urat
huyết thanh đã được kiểm sốt, có thể giảm liều. Liều duy trì trung bình ở người lớn
là 300 mg/ngày và liều tối thiểu có tác dụng là 100 - 200 mg/ngày. Phải dùng
allopurinol liên tục, ngừng thuốc có thể dẫn đến tăng nồng độ urat huyết thanh.
1.1.2 Oxypurinol

Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo của oxypurinol
Công thức phân tử: C5H4N4O2 [22].
Danh pháp 1H,2H,4H,5H,6H-pyrazolo[3,4-d] pyrimidin-4,6-dion [22].
CAS Number: 2465-59-0 [22].
Tên khác : Oxipurinol, alloxanthin [22].
Khối lượng phân tử: 152,1 g/mol [22].

6
.

.

Tính chất lý hóa:
-

Dạng rắn [22] Ít tan trong nước, tan trong dung dịch hydroxyd kiềm loãng [22].

-

Oxypurinol là một chất chuyển hóa có hoạt tính của allopurinol. Dưới tác dụng

của enzym xanthin oxydase, allopurinol bị oxy hoá thành oxypurinol [2], [6].

Hình 1.5 Allopurinol và các chất chuyển hóa [21]
Dược động học của oxypurinol::
-

Phân bố: Oxypurinol đạt nồng độ đỉnh 2-10 giờ sau khi uống allopurinol [2].

Oxypurinol không gắn với protein huyết tương [2], [8]. Sau khi uống một liều 300 mg
allopurinol nồng độ cao nhất trong huyết tương của oxypurinol khoảng 5 – 6,5 µg/ml,
có thể tăng lên đến 30 – 50 µg/ml ở bệnh nhân suy thận [2].
-

Chuyển hố: Khoảng 70 – 76 % allopurinol được chuyển hóa chủ yếu ở gan

thành oxypurinol. Oxypurinol tiếp tục được chuyển hoá thành oxypurinol-7-riboside
[2], [8]. T1/2 trong huyết tương của oxypurinol khoảng 12 – 30 giờ, kéo dài rõ rệt ở
bệnh nhân suy thận.
-

Thải trừ: Oxypurinol được liên hợp thành dạng ribonucleosid. Thải trừ chủ yếu

qua thận nhưng thải chậm do oxypurinol được tái hấp thu ở ống thận. Khoảng 70 %
liều dùng hàng ngày được thải trừ trong nước tiểu là oxypurinol [2], [8].

7
.


.

1.2 Chuẩn nội trong phân tích dịch sinh học
1.2.1 Mục đích và yêu cầu chuẩn nội trong phân tích dịch sinh học
Các quy trình định lượng các chất trong dịch sinh học với nền mẫu phức tạp
thường phải qua nhiều giai đoạn tách chiết, có thể làm mất mẫu dẫn đến kết quả phân
tích khơng chính xác. Mục đích chính của việc sử dụng chuẩn nội (IS) là giảm sai số
và đạt độ lặp lại cao trong phép định lượng liên quan đến lượng chất phân tích có
trong mẫu [7]. Do đó, IS cần được thêm vào trong quy trình xử lý mẫu càng sớm càng
tốt, thường được thêm ngay sau khi lấy mẫu hoặc trước khi xử lý mẫu. Ngồi ra, cấu
trúc hóa học, tính chất hóa học và vật lý của IS phải càng gần với các chất phân tích
càng tốt. Cùng điều kiện sắc ký, IS phải có thời gian lưu gần với thời gian lưu của
chất cần phân tích có trong mẫu. IS có độ tinh khiết cao, khơng có các tạp chất gây
nhiễu cho chất phân tích trong mẫu [25].
Nồng độ IS được thêm vào mẫu thử phải được lựa chọn dựa trên một số yếu tố,
bao gồm cường độ tín hiệu của chất phân tích và IS, khoảng nồng độ tuyến tính, độ
nhạy, sự tăng cường hoặc giảm tín hiệu ion giữa chất phân tích và IS. Nồng độ IS
khơng phù hợp có khả năng ảnh hưởng đến độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác
của phương pháp sắc ký lỏng [25].
Có hai loại IS chính, bao gồm:

-

Cấu trúc tương đồng, tương tự cấu trúc với một chất phân tích

-

Các chất đồng vị bền, thường là các chất deuterium (D), 13C hoặc 15N của

một chất phân tích (dùng trong LC-MS) [25].
Việc tìm ra chất chuẩn nội đáp ứng yêu cầu và sử dụng tỷ số tín hiệu chất phân
tích / IS để định lượng, các sai số trong các quá trình xử lý mẫu liên quan đến nồng độ
chất phân tích có thể được điều chỉnh, giúp duy trì độ chính xác và độ đúng của các
kết quả định lượng [25].

8
.


.

1.2.2 Một số chuẩn nội dự kiến
1.2.2.1 Acyclovir

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của acyclovir
Danh pháp IUPAC:
2-amino-9-[(2-hydroxyethoxy)methyl]-1,9-dihydro-6H- purin-6-on [1].
Cơng thức phân tử: C8H11N5O3 [1].
Khối lượng phân tử: 225,2 g/mol [1]
pKa = 11,98 ( trong acid mạnh) và pKa = 3,02 (trong kiềm mạnh) [32].
Acyclovir là chất bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, khó tan trong nước, dễ tan

trong dimethyl sulfoxyd, rất khó tan trong ethanol 96 % [1].
1.2.2.2 Guanin

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của guanin
Danh pháp IUPAC: 2-amino-1,9-dihydro-6H-purin-6-on [34].
Tên khác: 2-aminohypoxanthin [34].
Công thức phân tử: C5H5N5O [34 ].
Khối lượng phân tử: 151,1 g/mol.
pKa = 3,42 (trong kiềm mạnh); pKa = 9,13 (trong acid mạnh).
Guanin là chất bột vơ định hình màu trắng hoặc trắng ngà, ít tan trong nước, tan trong
dung dịch acid loãng hoặc kiềm [34].

9
.


.

1.2.2.3 Lamivudin

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của lamivudin
Danh pháp IUPAC:
4-amino-1-[(2R,5S)-2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl]pyrimidin-2(1H)-on [1].
Công thức phân tử: C8H11N3O3S [1].
Khối lượng phân tử: 229,3 g/mol [1].
pKa = - 0,16 (trong kiềm mạnh); pKa = 14,29 (trong acid mạnh) [31].
Lamivudin là chất bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình, thực tế tan trong
nước, hơi tan trong methanol và ít tan trong ethanol 96 % [1].
1.3. Một số phương pháp xử lý mẫu huyết tương
Mẫu huyết tương là môi trường sinh học phức tạp, do đó q trình định lượng

thuốc và chất chuyển hóa thường chịu ảnh hưởng nền mẫu. Vì vậy, nhiều phương
pháp xử lý mẫu được sử dụng để tách có hiệu quả các thành phần thuốc từ dịch sinh
học. Giai đoạn xử lý mẫu là quá trình làm sạch mẫu trước khi phân tích nhằm loại trừ
các chất gây nhiễu, loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu trước khi mẫu thử được tiêm vào
cột. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương bao gồm phương pháp kết tủa protein
(PPT), chiết lỏng - lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) [19].
Muốn lựa chọn phương pháp thích hợp để xử lý mẫu cần biết tính chất lý hóa
của chất phân tích, tính phân cực của hoạt chất. Độ phục hồi của phương pháp xử lý
mẫu phải phù hợp và có độ lặp lại [19].
1.3.1 Phương pháp chiết lỏng- lỏng
Chiết lỏng – lỏng là phương pháp dựa trên sự phân bố của chất hịa tan trong
hai dung mơi khơng hỗn hịa vào nhau. Sự phân bố của các chất phụ thuộc vào độ tan
của chúng trong các dung môi khác nhau. Trong phân tích dịch sinh học, LLE giúp
tách các chất phân tích ra khỏi những chất gây nhiễu có trong nền mẫu [19], [23].

10
.


.

Ưu điểm [19], [23]:
-

Dễ thực hiện, kỹ thuật đơn giản.

-

Mẫu sau khi chiết tương đối sạch.

-

Nồng độ mẫu được tăng lên làm tăng tín hiệu các chất, hạn chế ảnh hưởng của

nền mẫu, thích hợp với chất có nồng độ trong huyết tương thấp.
-

Khả năng thu hồi tốt nhờ nhiều lần chiết liên tục.

-

Hiệu quả để loại bỏ các muối.
Nhược điểm [19], [23]:

-

Tốn thời gian và chi phí do sử dụng một lượng lớn dung môi độc hại.

-

Hiệu suất chiết và độ lặp lại không tốt.

-

Nhiệt độ tăng trong quá trình bay hơi do đó khơng sử dụng được cho các chất

khơng bền nhiệt.
-

Cần kiểm sốt pH của mẫu.

-

Khơng phù hợp để chiết xuất cùng lúc nhiều chất phân tích có độ phân cực

khác nhau như thuốc và chất chuyển hóa từ cùng một mẫu.
1.3.2 Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
SPE thường dùng những ống nhựa nhỏ sử dụng một lần được nhồi một lượng
chất hấp thụ phù hợp (khoảng 50 – 200 mg). Các dạng chất hấp phụ của SPE bao gồm
chất liên kết pha đảo, pha thuận, trao đổi ion như trong sắc ký lỏng. Sự hấp phụ dựa
trên ái lực tương tác giữa chất phân tích và chất hấp phụ [23].
Bản chất và lượng chất hấp thụ, thể tích mẫu đã nạp, thành phần và thể tích của
dung dịch hoạt hóa và rửa giải (khơng làm mất chất phân tích) là các thơng số ảnh
hưởng đến hiệu suất chiết của SPE [19], [23].
Ưu điểm [19], [23]:
-

Lượng dung mơi hữu cơ sử dụng ít hơn so với LLE, do đó thân thiện hơn với

mơi trường.
-

Phương pháp có độ thu hồi và độ lặp lại tốt, độ nhạy cao phù hợp với mẫu có

nồng độ thấp, có thể tự động hóa.
Nhược điểm [19], [23]:
-

Khá đắt tiền và tốn kém.
11

.


.

1.3.3 Phương pháp kết tủa protein
Nguyên tắc của phương pháp là kết tủa protein bằng một trong các phương
pháp sau:
-

Dung môi hữu cơ như acetonitril, methanol, aceton, ...

-

Muối vô cơ như amoni clorid, amoni sulfat bão hòa, …

-

Thêm acid tricloroacetic, acid percloric, thay đổi pH của mẫu thử.

-

Liên kết của các ion kim loại tích điện dương làm giảm độ hòa tan protein và

tạo điều kiện cho sự kết tủa như kẽm sulfat.
Sự kết tủa protein rất quan trọng vì sự hiện diện của protein, lipid, muối và các
chất nội sinh khác trong mẫu có thể gây ra nhiễu khi định lượng và giảm tuổi thọ cột
HPLC [19], [23].
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thao tác, ít độc hại mơi trường, ít tốn thời gian, mang
tính kinh tế, ít tốn dung mơi [19], [23].

Nhược điểm: Mẫu sau xử lý ít tinh khiết hơn, bị pha lỗng nhiều, vẫn cịn muối
và các ion trong mẫu sau xử lý [19], [23].
1.4 Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo hướng dẫn
của cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ và cơ quan quản lý thuốc Châu
Âu
Do quá trình phân tích mẫu sinh học bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như lượng
mẫu ít, nồng độ thấp, lẫn nhiều tạp chất là các chất nội sinh (lipid, protein, chất nội
sinh, chất chuyển hóa, …) và sự khác nhau giữa các cá thể, nên phương pháp phân
tích phải được thiết lập và thẩm định để đảm bảo độ tin cậy [1].
Theo EMA [12] và US-FDA [13], các chỉ tiêu cần phải thẩm định đối với một
qui trình định lượng dược chất và/hoặc chất chuyển hóa có tác dụng trong mẫu sinh
học bao gồm: kiểm tra tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tỷ lệ thu hồi (hiệu suất
chiết), đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, giới hạn định
lượng dưới, độ ổn định của mẫu thử, ảnh hưởng của nền mẫu và lượng mẫu tồn dư,
ảnh hưởng của sự pha loãng.

12
.


.

Bảng 1.2 So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA
Chỉ tiêu

US-FDA 2018

EMA 2015
- ≥ 6 lô mẫu sinh học trắng
- Độ nhiễu ở LLOQ ≤ 20 %

- Độ nhiễu tại đáp ứng của IS ≤ 5 %
- Điểm thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ)
- LLOQ ≤ Cmax/20
- Tín hiệu ở LLOQ ≥ 5 lần so với mẫu trắng
- Độ chính xác ≤ 20 % và
- Độ đúng 80 % - 120 % so với nồng độ thực
- Đường chuẩn ít nhất 6 mẫu với nền mẫu
được xử lý gồm có chất phân tích và IS
- Xây dựng ít nhất 3 đường chuẩn
- Ở LLOQ: độ lệch ≤ 20 % so với nồng độ
thực và ≤ 15 % ở các nồng độ khác

Tính đặc
hiệu

- ≥ 6 lơ mẫu sinh học trắng
- LLOQ đạt độ đúng và chính xác

Giới hạn
định
lượng
dưới

- Điểm thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ)
- Đáp ứng LLOQ ≥ 5 lần so với mẫu trắng
- Độ chính xác ≤ 20 % và
- Độ đúng 80 % - 120 % so với nồng độ thực

Đường
chuẩn và

khoảng
tuyến tính

- Đường chuẩn ít nhất 6-8 mẫu với nền mẫu
được xử lý có chất phân tích và IS
- Ở LLOQ: đọ lệch ≤ 20 % so với nồng độ
thực và ≤ 15 % ở các nồng độ khác

Mẫu kiểm
tra (QC)

- Ở 3 mức nồng độ: LQC, MQC, HQC
- Mẫu QC là độc lập với các mẫu của đường
chuẩn

Độ đúng
và độ
chính xác
trong
ngày và
khác ngày

- Thực hiện ít nhất 3 nồng độ
- Độ đúng:
± 20 % ở nồng độ LLOQ;
± 15 % ở nồng độ LOQ, MQC, HQC
- Độ chính xác:
CV ở nồng độ LLOQ ≤ 20 %.
Ở nồng độ khác CV ≤ 15 %

Hiệu suất
chiết

- Tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chuẩn
nội phải ổn định, chính xác và có tính tái lặp
- Thực hiện ở 3 nồng độ: LQC, MQC và
HQC

- Không đề cập

- Dung dịch chuẩn gốc, IS
- Độ ổn định trong huyết tương:
+ Ngắn hạn
+ Dài hạn
+ Đông-rã đông
+ Sau khi xử lý mẫu

- Dung dịch chuẩn gốc, IS
- Độ ổn định trong huyết tương ở nồng độ
thấp và cao:
+ Ngắn hạn ở nhiệt độ phòng
+ Dài hạn (-20 ºC/ -70ºC)
+ Đơng-rã đơng
+ Sau khi xử lý mẫu

Xem xét có sự thay đổi của nền mẫu hay
không, để bảo đảm phương pháp phân tích
khơng ảnh hưởng của nền mẫu

CV của nền mẫu đối với chất phân tích và IS

khơng q 15 % ở LQC và HQC, tính trên 6
lơ nền mẫu

Độ ổn
định

Ảnh
hưởng
của nền
mẫu
Lượng
mẫu tồn
dư

- Khơng đề cập

Ảnh
hưởng
của pha
lỗng

- Pha lỗng mẫu có nồng độ cao hơn ULOQ
- Độ đúng và độ chính xác của các mẫu pha
lỗng phải được thẩm định

13
.

- Ở 3 mức nồng độ: LQC, MQC, HQC
- Mẫu QC là độc lập với các mẫu của đường

chuẩn
- Thực hiện ít nhất 4 nồng độ, phải có nồng độ
LLOQ, 3 lần LLOQ, MQC, HQC
- Độ đúng:
± 20 % ở nồng độ LLOQ;
± 15 % ở nồng độ LOQ, MQC, HQC
- Độ chính xác:
CV ≤ 20 % ở nồng độ LLOQ
CV ≤ 15 % ở nồng độ khác

- Tiêm mẫu trắng ngay sau khi tiêm mẫu có
nồng độ cao
- Lượng mẫu tồn dư ≤ 20 % ở LLOQ và ≤ 5
% với chuẩn nội
- Pha lỗng mẫu có nồng độ cao hơn ULOQ
(ít nhất 5 mẫu đối với mỗi hệ số pha lỗng)
- Độ đúng và độ chính xác nằm trong khoảng
± 15 %.


.

1.5 Một số cơng trình nghiên cứu định lượng đồng thời allopurinol và oxypurinol
trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng
Trong nước: Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu cơng bố
phương pháp định lượng đồng thời allopurinol và oxypurinol trong huyết tương
người.
Ngoài nước: Trên thế giới đã có một số cơng trình cơng bố phương pháp định
lượng đồng thời allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol trong huyết tương người
cũng như nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học bằng các phương pháp phân tích

khác nhau như HPLC-UV, UPLC-MS/MS, HPLC-MS/MS, được tóm tắt trong bảng.

14
.


.

Bảng 1.3 Tóm tắt một số cơng trình nghiên cứu định lượng đồng thời
allopurinol và oxypurinol trong huyết tương

15
.