Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các vitamin b1, b2, b6, b9 trong sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


LÊ THỊ CÚC


XÂY DỰNG QUY TRÌNH
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC
VITAMIN B
1
, B
2
, B
6
, B
9
TRONG SẢN
PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC
CHO TRẺ EM BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



HÀ NỘI - 2015


BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ CÚC


XÂY DỰNG QUY TRÌNH
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC
VITAMIN B
1
, B
2
, B
6
, B
9
TRONG SẢN
PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC
CHO TRẺ EM BẰNG HPLC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Nguyễn Lâm Hồng
ThS. Lê Hồng Dũng
Nơi thực hiện:
Viện Dinh dưỡng Quốc gia.

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn
thành khóa luận là lúc tôi xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình
với những ngƣời đã dạy dỗ, hƣớng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới thạc sĩ Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất
và thạc sĩ Lê Hồng Dũng – Trƣởng phòng khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng,
những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thanh Nga, cô
Nguyễn Thúy Dung, anh Hoàng Trung Hiếu, chị Bùi Thị Thanh Xuân – cán bộ
khoa Hóa thực phẩm, Viện dinh dƣỡng đã luôn quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ
tôi thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội,
các thầy cô giáo, Bộ môn Hóa phân tích – độc chất, anh chị Viện Dinh dƣỡng Quốc
Gia đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè những ngƣời đã luôn động
viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm
nay.


Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Thị Cúc

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. 2
1.1.1. Vài nét về các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
. 2
1.1.2. Một số phƣơng pháp định lƣợng các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong thực
phẩm hiện nay. 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO. 8
1.2.1. Nguyên tắc và phân loại 8
1.2.2. Các thông số đặc trƣng. 9
1.2.3. Các kỹ thuật định lƣợng bằng HPLC. 11

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ. 13
2.1.1. Nguyên vật liệu. 13
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, máy móc. 13
2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu 14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 14
2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B
1
,
B
2
, B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng
phƣơng pháp HPLC. 14
2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng. 14
2.2.3. Ứng dụng. 15
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 15
2.3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B
1
,
B
2
, B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng

phƣơng pháp HPLC. 15


2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích. 15
2.3.3. Ứng dụng. 17
2.3.4. Tính toán và xử lý số liệu. 18
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ. 19
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN
SẮC KÝ. 19
3.1.1. Lựa chọn mẫu. 19
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu. 19
3.1.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 24
3.1.4. Quy trình phân tích các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong sản phẩm dinh
dƣỡng công thức cho trẻ em. 28
3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP. 30
3.2.1. Chuẩn bị mẫu. 30
3.2.2. Độ phù hợp của hệ thống. 31
3.2.3. Độ chọn lọc. 32
3.2.4. Khoảng tuyến tính. 33
3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng. 37
3.2.6. Độ lặp lại, độ chính xác trung gian. 38
3.2.7. Độ thu hồi. 40

3.2.8. Độ ổn định của các vitamin trong dung dịch chạy sắc ký. 42
3.3. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B
1
, B
2
, B
6
, B
9
TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ
EM TRÊN THỊ TRƢỜNG. 43
BÀN LUẬN 47
KẾT LUẬN 48
ĐỀ XUẤT 51



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC
Hiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official
Analytical Chemists)
HPLC:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
LOD:
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ:
Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification)
MeOH:

Methanol
PAD:
Detector mảng diode (Photodiode array detector)
QC
Mẫu kiểm chứng (Quality Control)
RSD (%):
Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)
SD:
Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
TCA:
Axit Trichloroacetic
UPLC-
MS/MS:
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao ghép khối phổ (Ultra high
performance chromatography – Mass spectrometry)
UV:
Tử ngoại (Ultraviolet)
v/v
Thể tích/thể tích (volume/volume)
w/v
Khối lƣợng/thể tích (weight/volume)



DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Nội dung
Trang
1.1
Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B

trong thực phẩm bằng phƣơng pháp HPLC.
6
3.1
Nồng độ của các vitamin với mỗi quy trình
20
3.2
Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau
21
3.3
Nồng độ của các vitamin với mỗi cách lắc khác nhau
23
3.4
Nồng độ của các vitamin với thời gian siêu âm khác nhau
23
3.5
Ba chƣơng trình gradient khảo sát
25
3.6
Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký
31
3.7
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9

34
3.8
Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B
1
37
3.9
Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B
2
, B
6
, B
9

38
3.10
Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp
38
3.11
Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơng pháp
39
3.12
Pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ thấp, trung bình và
cao
40
3.13
Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin
B
1
41
3.14

Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin
B
2
, B
6
, B
9

42
3.15
Kết quả độ ổn định của các vitamin
43
3.16
Hàm lƣợng vitamin B
1
trong một số sản phẩm dinh dƣỡng
công thức cho trẻ em trên thị trƣờng
44
3.17
Hàm lƣợng vitamin B
2
trong một số sản phẩm dinh dƣỡng
công thức cho trẻ em trên thị trƣờng
44


3.18
Hàm lƣợng vitamin B
6
trong một số sản phẩm dinh dƣỡng

công thức cho trẻ em trên thị trƣờng
45
3.19
Hàm lƣợng vitamin B
9
trong một số sản phẩm dinh dƣỡng
công thức cho trẻ em trên thị trƣờng
45


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình
Nội dung
Trang
1.1
Công thức cấu tạo của vitamin B
1
2
1.2
Công thức cấu tạo của vitamin B
2
2
1.3
Công thức cấu tạo của vitamin B
6
2
1.4
Công thức cấu tạo của vitamin B
9
2

3.1
Sắc ký đồ mẫu QC với cột C8 (tại 290nm)
24
3.2
Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm)
25
3.3
Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp chuẩn tại bƣớc sóng 267nm của
3 chƣơng trình gradient
26
3.4
Phổ hấp thụ UV của các vitamin
28
3.5
Sắc ký đồ mẫu trắng tại bƣớc sóng 246nm (đánh giá tính
chọn lọc)
32
3.6
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bƣớc sóng 246nm.
33
3.7
Sắc ký đồ mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem tại bƣớc
sóng 246nm
33
3.8
Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic
và nồng độ của các vitamin B
1
, B
2

, B
6
, B
9

36


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các vitamin có vai trò cần thiết đối với sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là khả
năng tăng trƣởng, phát triển toàn diện ở trẻ nhỏ. Trong số 13 loại vitamin rất quan
trọng, các vitamin nhóm B tan trong nƣớc nhƣ: thiamin (B
1
), riboflavin (B
2
), niacin
(B
3
), pyridoxin (B
6
), cyanocobamine (B
12
) quan trọng cho quá trình trao đổi chất,
điều hòa hoạt động của các cơ quan, đặc biệt khi cơ quan đang hoàn thiện chức
năng; hỗ trợ tăng trƣởng thể chất và phát triển tinh thần, trí tuệ; cung cấp năng
lƣợng và tổng hợp các tế bào máu. Rất nhiều trƣờng hợp do bệnh lý hoặc chế độ
dinh dƣỡng kém dẫn tới thiếu viatmin B, gây ra ảnh hƣởng xấu cho sức khỏe. Ngày
nay, trên thị trƣờng có nhiều sản phẩm giúp bổ sung vitamin nhƣ các thực phẩm

công thức sữa, bột dinh dƣỡng hoặc thuốc dƣới dạng viên vitamin B đơn hay hỗn
hợp các vitamin. Trong đó, thực phẩm công thức là thức ăn bổ sung quan trọng cho
trẻ nhỏ. Hiện nay Bộ Y Tế đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các
sản phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định hàm lƣợng cũng nhƣ phƣơng
pháp phân tích các chất dinh dƣỡng, bao gồm các vitamin nhóm B. Việc xác định
chính xác hàm lƣợng các vitamin đƣợc bổ sung có ý nghĩa trong vấn đề đảm bảo
quyền lợi và sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra, đánh giá chất lƣợng sản phẩm và phục
vụ các nghiên cứu dinh dƣỡng chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong
sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC” với 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm
B gồm B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ
em bằng phƣơng pháp HPLC.

2. Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong một số sản
phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng.
2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU.
Mặc dù các sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng (sữa bột,
bột dinh dƣỡng) chứa hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí 10-11 loại vitamin khác
nhau, nhƣng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi chỉ nghiên cứu định
lƣợng các vitamin B
1
(Thiamin hydroclorid), B
2
(Riboflavin), B
6
(Pyridoxin
hydroclorid) và B
9
(Acid folic).
1.1.1. Vài nét về các vitamin B
1
, B

2
, B
6
, B
9
.
1.1.1.1. Công thức cấu tạo, công thức phân tử [6], [9], [35], [37].

Hình 1.1: Vitamin B
1
Hình 1.2: Vitamin B
2



Hình 1.3: Vitamin B
6
Hình 1.4: Vitamin B
9

1.1.1.2. Tính chất và tác dụng.
 Vitamin B
1
(Thiamin hydroclorid).
3

- Tính chất: Thiamin dạng base không ổn định vì có cấu trúc nitơ bậc 4 nên B
1

thƣờng đƣợc bào chế dạng muối hydrochlorid hoặc mononitrat, hai dạng muối

này có tính chất tƣơng tự nhau. Thiamin hydroclorid là tinh thể không màu hoặc
bột kết tinh trắng, vị đắng, dễ tan trong nƣớc (1g/1ml) và glycerin (1g/18ml);
khó tan trong ethanol (1g/315ml cồn tuyệt đối); không tan trong aceton, ether,
chloroform và benzene [6], [9], [35]. Nó ổn định trong dung dịch có pH axit (2-
4); không ổn định với nhiệt và ánh sáng [37]. Do có dị vòng thơm nên vitamin
B
1
hấp thụ mạnh bức xạ UV [9].
- Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh beri-beri; phối hợp với vitamin B
6
, B
12
điều trị
các trƣờng hợp đau nhức dây thần kinh hông, lƣng, dây thần kinh sinh ba; dùng
trong trƣờng hợp mệt mỏi, chán ăn, suy dinh dƣỡng và rối loạn tiêu hóa [8].
 Vitamin B
2
(Rioflavin).
- Tính chất: Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam, hơi có mùi, khó tan trong
nƣớc, ethanol; không tan trong ether, cloroform, benzen [6], [9]. Nó dễ tan
nhƣng không ổn định trong môi trƣờng kiềm; ổn định trong môi trƣờng acid
[35], [37]; không ổn định với ánh sáng [35], [37]. Do có hệ nối đôi luân phiên
nên vitamin B
2
hấp thụ mạnh bức xạ UV-Vis [9].
- Tác dụng: Dùng trong các trƣờng hợp thiếu B
2
gây tổn thƣơng da, niêm mạc,
viêm giác mạc mắt, viêm kết mạc, loét miệng, suy nhƣợc, mệt mỏi, chậm
lớn,…Thƣờng dùng phối hợp với vitamin PP [8].

 Vitamin B
6
(Pyridoxin hydroclorid).
- Tính chất: Vitamin B
6
là tên chung của 3 chất có cấu trúc hóa học khác nhau ở
vị trí nhóm chức số 4: pyridoxin, pyridoxal và pyridoxamin. Dạng pyridoxin
hydroclorid thƣờng đƣợc dùng trong thực phẩm dinh dƣỡng công thức.
Pyridoxin hydroclorid là những tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màu trắng,
bền vững trong không khí, dễ tan trong nƣớc (1g/4,5ml), tan trong ethanol
(1g/90ml), không tan trong ether, cloroform [6], [9]. Ổn định trong môi trƣờng
nƣớc với pH từ 2-4,5; hấp thụ mạnh bức xạ UV [9].
4

- Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trƣờng hợp thiếu vitamin B
6
, biểu hiện:
tổn thƣơng mắt, mũi, miệng, co giật, thiếu máu. Phòng và điều trị một số bệnh ở
hệ thần kinh do các thuốc khác (isoniazid) gây ra [8].
 Vitamin B
9

- Tính chất: Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng cam, thực tế không tan trong
nƣớc và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong các dung dịch acid và kiềm
loãng [6], [9], [35]. Dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, chất oxy hóa, chất khử,
acid, kiềm và khi bị đun nóng. Dung dịch trong nƣớc kém bền trong môi
trƣờng pH dƣới 6 [9].
- Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trƣờng hợp thiếu vitamin B
9
(thiếu máu

tan máu, thiếu máu hồng cầu to). Bổ sung acid folic cho ngƣời đang điều trị
bằng các thuốc kháng acid folic (methotrexat), đang điều trị thuốc chống
động kinh hydantoin, bệnh nhân sốt rét, ngƣời nhu cầu tăng [8].
1.1.2. Một số phƣơng pháp định lƣợng các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong thực
phẩm hiện nay.
1.1.2.1. Trên thế giới.
Nghiên cứu các vitamin nhóm B trong thực phẩm đã phát triển từ lâu với nhiều
kỹ thuật đã đƣợc tiêu chuẩn hóa, tuy nhiên các kỹ thuật tiêu chuẩn này hầu hết là
các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng loại vitamin. Các kỹ thuật tiêu chuẩn AOAC để
phân tích vitamin B
1
, B
2
thƣờng dùng phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang [23],
[24], [29]; phân tích vitamin B
3
, B
6
, B
12
, B
9

hiện nay là phƣơng pháp vi sinh [25],
[26], [27]. Phƣơng pháp sắc ký cũng ngày càng phát triển nhƣ tiêu chuẩn AOAC
2004.07 phân tích vitamin B6 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức trẻ em [30].
Bên cạnh đó phƣơng pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (UPLC/MS)
cũng đƣợc sử dụng ngày càng nhiều để phân tích các vitamin nhƣ vitamin B5 vì
tính chọn lọc và độ nhạy cao, đồng thời giảm bớt công đoạn xử lý mẫu phức tạp
[28].
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã công bố các phƣơng pháp phân
tích đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm. Một số nghiên cứu dùng
5

phƣơng pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm [40],
[38]; phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [33], [39], [34], [22].
Một số quy trình xử lý mẫu dùng để định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B
trong chế phẩm dinh dƣỡng công thức:
Quy trình 1: Joon Hyuk Suh và cộng sự [34]:
Cân chính xác 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 15ml

Thêm 2ml nƣớc cất, lắc đều, lắc xoáy 3 phút ở nhiệt độ phòng

Thêm 6 ml acetonitrile, lắc đều

Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút

Hút lấy dịch trong, thổi khô dung môi bằng khí nitơ

Hòa tan phần còn lại trong 5ml nƣớc cất

Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC

Quy trình 2: Soledad Albalá-Hurtado cùng cộng sự [22]
Cân chính xác 8 g mẫu bột vào ống ly tâm 50ml

Thêm 10ml nƣớc cất, lắc đều

Thêm 1g TCA, lắc tan, lắc bằng khuấy từ 10 phút

Ly tâm 1250 vòng trong 10 phút

Thu dịch trong. Tủa: thêm 3ml TCA 4%, lắc 10 phút, ly tâm, loại tủa.

Gộp dịch chiết, định mức bằng TCA 4% vừa đủ 10ml

Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC
6

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm bằng phƣơng pháp HPLC.
Tài
liệu
Mẫu thử
Xác định
vitamin
Dung môi
chiết
Pha động
Cột
Detector
Thể tích
tiêm mẫu
( µl )

LOQ, LOD
[33]
Bột dinh
dƣỡng trẻ
em
B
5
, B
8
,
B
9
, B
12

Methotrexate,
dung dịch
amoni axetat,
chloroform
- Rửa giải gradient: Gồm
acetonitrile và nƣớc có
chứa 0,1% axit formic
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Cột Acquity
UPLC Ben C18
(2,1 mm × 100
mm, 1,7μm)
- Nhiệt độ cột:
35°C
UPLC MS-MS

- Chế độ MRM:
mảnh có m/z
220,1 → 89,9 cho
B
5
; 245,1
→227,1 cho B
8
;
442,3→ 295,2
cho B
9
và 678,9
→147,0 cho B
12

10
- LOD (µg/L):
B
5
: 0,005
B
8
: 0,030
B
9
: 0,006
B
12
: 0,006

- LOQ (µg/L):
B
5
: 0,016
B
8
: 0,090
B
9
: 0,020
B
12
: 0,019
[39]
Thịt sau
khi nấu
B
1
, B
6
,
B
12

TCA
- Pha A: octanesulfonic
axit 5 mM, trietylamine
0,5%, axit acetic 2,4%
và MeOH 15%
- Pha B: acetonitrile 100%.

- Tỷ lệ: 90% A, 10% B.
- Cột Luna 5µm
C8 (250 mm × 4,6
mm) từ
Phenomenex
(USA)
- Nhiệt độ phòng
PAD:
- λ
B1
=249 nm
- λ
B6
=290 nm
- λ
B12
=361 nm

20

7

[34]
Bột dinh
dƣỡng.
ngũ cốc,
thực phẩm
năng
lƣợng
thấp

B
1
, B
2
,
B
3
, B
5
,
B
6
, B
9

Nƣớc và
acetonitrile
- Rửa giải gradient:
A: 20 mM kali
phosphate pH 3.0
B: 50% acetonitrile (v/v)
trong 20 mM kali
phosphate pH 3,0
- Tốc độ dòng chảy giữa
0,8 và 1,0mL / phút.
- Develosil
RPAQUEOUS
C30 (4,6 mm ×
250 mm, 5 µm)
- Nhiệt độ cột:

30
0
C
PAD:
- λ= 275nm,
- λ
B5
= 205nm
20
- LOQ (µg/g):
B
1
: 0,2
B
2
: 0,2
B
3
: 2,0
B
5
: 0,5
B
6
: 0,2
B
9
: 0,1
[22]
Sữa cho

trẻ sơ sinh
(lỏng, bột)
B
1
, B
2
,
B
3
, B
6
,
B
9
, B
12

TCA, nƣớc
- Gồm 5 mM acid
octanesulfonic; 0,5%
trietylamine; 2,4%
glacial acetic acid và
MeOH 15%.
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Cột Tracer
Spherisorb ODS-
2 C
18
(250x 4,6
mm, 5 µm)

- Nhiệt độ phòng

UV:
- λ
B1
=246 nm
- λ
B2
=268 nm
- λ
B3
=261 nm
- λ
B6
=290 nm
- λ
B9
=282 nm
- λ
B12
=361 nm
20
- LOD (µg/ml):
0,02 đến 0,10
- LOQ (µg/ml):
0,03 đến 0,25
8

1.1.2.2. Ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, các kỹ thuật tiêu chuẩn để định lƣợng các vitamin nhóm B trong

thực phẩm cũng mới dừng lại là các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng vitamin. Một số
tiêu chuẩn dùng phƣơng pháp HPLC để phân tích vitamin B
1
[21] , B
2
[18]; phƣơng
pháp vi sinh hoặc HPLC với B
6
[19], [17]; phƣơng pháp vi sinh với B
9
[20]. Hiện
nay, Bộ Y Tế cũng đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản
phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định phƣơng pháp phân tích riêng từng
vitamin nhóm B – áp dụng các phƣơng pháp của AOAC.
Việc nghiên cứu định lƣợng đồng thời nhiều vitamin nhóm B cũng đã phát triển
trong những năm gần đây nhƣng đó hầu hết là các nghiên cứu trên đối tƣợng dƣợc
phẩm [1], [14], [15]; nghiên cứu trên đối tƣợng thực phẩm còn rất ít. Tác giả Phạm
Thị Thanh Hà và cộng sự [12] đã định lƣợng đồng thời vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
, C,
PP trong cốm dinh dƣỡng bằng phƣơng pháp điện di mao quản.
Phƣơng pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm
đƣợc ứng dụng trong phân tích vô cơ, hữu cơ, môi trƣờng, dƣợc phẩm, nhƣng yêu
cầu sử dụng các thuật toán phức tạp, cần có máy tính và phần mềm chuyên dụng.

Phƣơng pháp vi sinh có nhƣợc điểm là tính chọn lọc, độ lặp lại kém và thời gian
phân tích kéo dài. Phƣơng pháp điện di mao quản có ƣu điểm sử dụng tiết kiệm
dung môi, hóa chất và thân thiện với môi trƣờng nhƣng độ lặp lại không cao.
Kỹ thuật HPLC đã khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của các phƣơng pháp định
lƣợng trên. Phƣơng pháp HPLC đƣợc sử dụng rộng rãi vì thao tác đơn giản, khả
năng tách tốt các vitamin trong mẫu nhiều thành phần, rút ngắn thời gian phân tích,
đồng thời cho độ chính xác và tính chọn lọc cao.
1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.
1.2.1. Nguyên tắc và phân loại.
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao [2].
Thứ tự rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột phụ thuộc vào khả năng lƣu giữ
khác nhau của các chất phân tích với hai pha tĩnh và pha động [10].
9

Tùy vào bản chất các pha, cơ chế tách mà HPLC phân làm nhiều loại sắc ký
khác nhau. Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân cho sắc
ký hấp thụ hoặc pha tĩnh là chất mang rắn đƣợc liên kết hóa học với các nhóm hữu
cơ cho sắc ký phân bố. Ngoài ra còn có các loại sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ,
sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó, sắc ký lỏng phân bố đƣợc
dùng phổ biến nhất hiện nay.
Sắc ký phân bố đƣợc chia thành sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký pha đảo,
với sắc ký pha đảo đƣợc sử dụng nhiều hơn cả trong kiểm nghiệm. Kỹ thuật này có
pha tĩnh gồm các nhóm không phân cực (octyl C
8
, octadecyl C
18
hay phenyl C
6
H

5
),
pha động là những dung môi phân cực (nƣớc, methol, acetonitril,…), thứ tự rửa giải
là các chất phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên [2], [10], [11], [13].
1.2.2. Các thông số đặc trƣng.
1.2.2.1. Thời gian lưu.
Thời gian lƣu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân
tích xuất hiện đỉnh pic trên sắc ký đồ.
Với một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là xác định. Vì
vậy có thể dùng thời gian lƣu để định tính các chất.
1.2.2.2. Hệ số phân bố K.
Là đại lƣợng đặc trƣng cho sự phân bố của chất phân tích giữa pha động và pha
tĩnh.






Với: C
S
: nồng độ mol chất phân tích trong pha tĩnh.
C
M
: nồng độ mol chất phân tích trong pha động.
K phụ thuộc vào bản chất chất phân tích và bản chất hai pha. Trị số K càng lớn,
sự di chuyển của chất phân tích qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn
hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ [10].

1.2.2.3. Hệ số dung lượng k’.
k’ là hệ số phân bố khối lƣợng giữa hai pha.
10



















Với: K : hệ số phân bố
V
S
, V
M
: thể tích pha tĩnh và pha động.
Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho: 1 < k' < 8 [2], [10], [13].
1.2.2.4. Hệ số chọn lọc α.

Đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B ta dùng hệ số chọn lọc
α:










 



 


Với k’
B
>k’
A
.

Tối ƣu với 1,5 < α < 2 [2], [10], [13].
1.2.2.5. Hệ số đối xứng F.
Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng F:





Với: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đƣờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đƣờng cong
phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0.
1.2.2.6. Số đĩa lý thuyết N.
Đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký:
















Với: W
0,5
là chiều rộng đo ở vị trí ½ chiều cao pic.
W là chiều rộng đo ở đáy pic
1.2.2.7. Độ phân giải R
S

.
R
S
đánh giá mức độ tách của các chất trong một hệ pha.





 




 






 




 


Với: t

RA
, t
RB
: thời gian lƣu hiệu lực của hai pic liền kề nhau A, B.
11

W
A
, W
B
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W
0,5A
, W
0,5B
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu: R
S
>1,25; tối ƣu R
S
≥1,5 [2], [10], [13].
1.2.3. Các kỹ thuật định lƣợng bằng HPLC.
Tất cả các kỹ thuật định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ
của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 kỹ thuật định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký: kỹ thuật chuẩn ngoại, kỹ
thuật chuẩn nội, kỹ thuật thêm chuẩn, kỹ thuật chuẩn hóa diện tích. Chúng tôi xin
trình bày cụ thể kỹ thuật chuẩn ngoại và kỹ thật thêm chuẩn đƣợc sử dụng trong
khóa luận.
 Kỹ thuật chuẩn ngoại: Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện mẫu chuẩn và mẫu
thử. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều

cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử
dụng phƣơng pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.
 Chuẩn hóa 1 điểm: Chuẩn bị mẫu thử có nồng độ xấp xỉ nộng độ mẫu
chuẩn. Nồng độ của mẫu thử đƣợc tính theo công thức: 








C
X
, C
S
: Nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn.
S
X
, S
S
: Diện tích của pic mẫu thử, mẫu chuẩn.
 Chuẩn hóa nhiều điểm:
Cách tiến hành: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ tăng dần
rồi tiến hành sắc ký. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc
chiều cao H) pic với nồng độ chất chuẩn C. Sử dụng khoảng tuyến tính của
đƣờng chuẩn để tính nồng độ của chất cần xác định. Xây dựng phƣơng trình hồi
quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ chất
cần xác định:  


Trong đó: Y: diện tích hoặc chiều cao pic.
a: giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung.
b: độ dốc của đƣờng chuẩn.
C
X
: nồng độ của chất phân tích.
12

Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong khoảng
tuyến tính của đƣờng chuẩn [2], [10], [13].
 Kỹ thuật thêm chuẩn:
Cách tiến hành: Chuẩn bị 2 mẫu thử, thêm một lƣợng chất chuẩn ngoại vào mẫu
thử thứ hai. Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ của
mẫu thử đƣợc tính theo công thức 






Trong đó: C
X
, S
X
: Nồng độ, diện tích pic của mẫu thử.
ΔC, ΔS: Chênh lệch về nồng độ, diện tích của pic mẫu thử và mẫu
thử nạp chuẩn.

13

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ.
2.1.1. Nguyên vật liệu.
- Chất chuẩn:
 Thiamine hydrochloride C
12
H
17
ClN
4
OS.HCl: hàm lƣợng 100%, độ ẩm
3,5%, CAS number 67-03-8, hãng Sigma-aldrich.
 Riboflavin C
17
H
20
N
4
O
6
: hàm lƣợng 99,9%, CAS number 83-88-5, hãng
Sigma-aldrich.
 Pyridoxine hydrochlororide C
8
H
11
NO
3
.HCl: hàm lƣợng 99,64%, CAS

number 58-56-0, LOT number 02F86602, hãng Phyto Technology.
 Acid Folic C
19
H
19
N
7
O
6
: hàm lƣợng 99,57%, độ ẩm dƣới 8,5%, hãng Wako
Nhật.
- Dung môi, hóa chất:
 TCA, acetonitrile, NaOH, HCl, natri bicarbonat (NaHCO
3
), natri heptan
sulfonat đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết phân tích (PA) của Merck- Đức.
 Methanol (MeOH) và H
3
PO
4
đặc loại HPLC của Merck - Đức.
 Khí nitơ 99,99%.
 Nƣớc khử ion 18MΩ.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, máy móc.
- Hệ thống máy HPLC Waters Alliance gồm bơm Waters 2695 - Photodiode
Array Detector 2996 (Mỹ) với phần mềm Empower software.
- Máy siêu âm Elmasonic S80H (Đức).
- Máy lắc ngang Edmund M6103000 (Đức)
- Máy lắc xoáy Thermolyne Maxi-Mix II Type 37600, M37619-26 (Mĩ).
- Máy ly tâm Hettich Rotofix II (Đức)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi; lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm.
- Cân phân tích Sartorius BP 121S (d = 0,1 mg; Max 120g) (Đức)
- Ống nghiệm thủy tinh 15ml, ống ly tâm 50ml.
- Các dụng cụ khác: Bình định mức, pipet thủy tinh, pipetman, cốc có mỏ,….
14

2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
- Mẫu QC do công ty Abbott cung cấp.
- Mẫu nghiên cứu: Sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em (bột dinh
dƣỡng, sữa bột bổ sung vi chất) mua trên thị trƣờng.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B
1
, B
2
,
B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng
phƣơng pháp HPLC.
 Quy trình xử lý mẫu: Khảo sát một số quy trình xử lý mẫu phân tích đồng thời
các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B

9
để từ đó lựa chọn và xây dựng một quy trình chiết
phù hợp với yêu cầu phân tích.
 Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu.
 Khảo sát thể tích dung môi chiết
 Khảo sát cách lắc mẫu thử.
 Khảo sát thời gian chiết.
 Lựa chọn điều kiện sắc ký: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp
để phân tích đồng thời vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
có trong mẫu:
 Cột sắc ký.
 Chƣơng trình gradient của pha động.
 Detector và bƣớc sóng.
2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng.
Theo hƣớng dẫn chung thẩm định quy trình phân tích đối với chế phẩm định
tính, định lƣợng [7], [16], [32], [36] chúng tôi tiến hành thẩm định phƣơng pháp
phân tích đã đƣợc lựa chọn với các chỉ tiêu:
 Độ phù hợp của hệ thống.
 Độ chọn lọc.
 Khoảng tuyến tính và khoảng nồng độ xác định.
 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng.
 Độ lặp lại, độ chính xác trung gian.
15

 Độ thu hồi.
2.2.3. Ứng dụng.
Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong một số sản phẩm
dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B
1
, B
2
,
B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng
phƣơng pháp HPLC.
2.3.1.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu.
Chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình xử lý mẫu đƣợc xây dựng dựa trên
hai quy trình của Joon Hyuk Suh cùng cộng sự [34] và của Soledad Albalá-Hurtado
cùng cộng sự [22].
Với quy trình đã chọn, tiếp tục khảo sát các yếu tố: thể tích TCA 20%, cách lắc,

thời gian chiết.
2.3.1.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký.
Dùng phƣơng pháp HPLC pha đảo để tách, định lƣợng đồng thời các vitamin
B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong mẫu. Cụ thể, chúng tôi khảo sát các điều kiện nhƣ sau:
- Cột sắc ký: Khảo sát các cột C
8
, C
18
pha đảo hiện có ở phòng thí nghiệm.
- Pha động: Khảo sát các chƣơng trình gradient khác nhau.
- Detector: Khảo sát trên detector DAD, lựa chọn bƣớc sóng phù hợp.
2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích [7], [16], [31], [32], [36].
2.3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký.
- Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một
mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ các vitamin nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại
thời gian lƣu và diện tích pic của các lần sắc ký.
- Yêu cầu: chênh lệch diện tích pic, t
R
giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu
thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) không lớn hơn 2,00%.
2.3.2.2. Tính chọn lọc
- Chuẩn bị các mẫu sau:

16

 Mẫu trắng
 Mẫu chuẩn hỗn hợp các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
.
 Mẫu thử
- Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các pic trên các sắc ký đồ thu đƣợc.
- Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu trắng thu đƣợc, tại thời điểm xuất hiện pic
của các vitamin không đƣợc xuất hiện pic lạ.
2.3.2.3. Khoảng tuyến tính và khoảng nồng độ xác định.
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp bốn vitamin có nồng độ tăng dần. Tiến
hành sắc ký, xây dựng phƣơng trình hồi quy và xác định hệ số tƣơng quan r.
- Yêu cầu: đƣờng hồi quy thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và 0,995 ≤ r ≤1.
2.3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [16].
- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu
thử có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc theo phƣơng pháp đã
xây dựng. Giới hạn định lƣợng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong
mẫu thử có thể định lƣợng đƣợc theo phƣơng pháp đã xây dựng với độ chính xác và
độ đúng thích hợp.
- Cách xác định: Sử dụng phƣơng pháp dựa trên độ lệch chuẩn, làm trên mẫu
thử. Làm 10 lần song song.
Tính LOD: Tính giá trị trung bình x
tb

và độ lệch chuẩn SD
LOD = 3×SD
LOQ = 10×SD
Đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính R= x
tb
/LOD.
 Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính đƣợc
là đáng tin cậy.
 Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít
chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R
 Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung
dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.
2.3.2.5. Độ lặp lại, độ chính xác trung gian.