Tạo chủng Escherichia coli có khả năng chịu nồng độ ethanol cao để nâng cao hiệu quả biểu hiện protein tái tổ hợp

Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

58

Tạo chủng Escherichia coli có khả năng chịu nồng độ ethanol cao
để nâng cao hiệu quả biểu hiện protein tái tổ hợp
Trần Thị Hậu, Trần Hồng Diễm, Phùng Thị Thu Hường
Viện Kĩ thuật Cơng nghệ cao NTT, Đại học Nguyễn Tất Thành


Tóm tắt
Vi khuẩn Escherichia coli là một trong những vật chủ được sử dụng phổ biến nhất
trong biểu hiện protein tái tổ hợp nhờ thời gian nuôi cấy ngắn và hiệu suất sinh khối
cao. Tuy nhiên, các chủng E. coli thông thường thường khơng có sẵn các khả năng
chịu với các chất ức chế hóa học hay các yếu tố bất lợi trong môi trường nuôi cấy, gây
cản trở sự tăng sinh tế bào và giảm hiệu quả biểu hiện protein mục tiêu. Do đó, nghiên
cứu đã phát triển chủng E. coli có khả năng đáp ứng trực tiếp với nồng độ ethanol cao
nhằm tạo ra những biến đổi của tế bào liên quan đến thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp
DNA và tăng hiệu quả biểu hiện protein tái tổ hợp. Khả năng chịu nồng độ ethanol cao
(7-8) % của chủng E. coli BL21(DE3) và E. coli C41(DE3) đã được cải thiện bằng
phương pháp tiến hóa đáp ứng trong mơi trường Luria-Bertani và môi trường muối cơ
bản M9. Khi ứng dụng các chủng vi khuẩn đáp ứng làm vật chủ biểu hiện protein tái
tổ hợp PETase, bước đầu đánh giá được hiệu quả biểu hiện protein đã được nâng cao
đáng kể so với chủng chưa đáp ứng. Phát triển chủng E. coli có khả năng chịu nồng độ
ethanol cao sẽ là yếu tố tiềm năng góp phần phát triển hệ thống biểu hiện hiệu quả
trong sản xuất protein tái tổ hợp.

Nhận
06/09/2022
Được duyệt 27/10/2022
Cơng bố

02/11/2022

Từ khố
tính chịu ethanol,
E. coli BL21(DE3),
E. coli C41(DE3),
PETase,
protein tái tổ hợp,
tiến hóa đáp ứng

® 2022 Journal of Science and Technology - NTTU

1 Giới thiệu
Trên thế giới, nghiên cứu và ứng dụng công nghệ
protein tái tổ hợp để sản xuất các loại enzyme công
nghiệp đã phát triển mạnh mẽ trong nhiều thập kỉ qua.
Các hệ thống biểu hiện protein bằng E. coli đã được
phát triển và ứng dụng để tái tổ hợp các protein cơng
nghiệp quan trọng vì chúng có nhiều ưu điểm nổi bật
như điều kiện sinh trưởng dễ dàng, tích lũy sinh khối
nhanh chóng và khơng yêu cầu các biến đổi sau dịch
mã [1-3]. Tuy nhiên, các chủng E. coli truyền thống
thường khơng có các khả năng chịu với các yếu tố bất
lợi của môi trường nuôi cấy như các sản phẩm trao đổi
chất (ethanol, axit,…) sinh ra trong quá trình tăng sinh
hay độc tố từ quá trình biểu hiện protein của tế bào vi
khuẩn. Những yếu tố bất lợi này có thể làm giảm hiệu

Đại học Nguyễn Tất Thành

suất sinh khối và hiệu suất tổng hợp protein tái tổ hợp.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu mới tập trung vào vấn đề
công nghệ để tạo ra protein mong muốn mà chưa chú ý
đến việc cải thiện hệ thống vi sinh vật biểu hiện để nâng
cao hiệu suất sản xuất protein tái tổ hợp.
Hiện nay, kĩ thuật tiến hóa đáp ứng trong phịng thí
nghiệm (Adaptive Laboratory Evolution – ALE) đã và
đang được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu trên
thế giới về tạo chủng tiến hóa đáp ứng [4]. Nhiều nghiên
cứu gần đây đã khai thác thành công kĩ thuật này trên đối
tượng vi khuẩn E. coli với các đặc điểm như hiệu quả sử
dụng nguồn carbon được cải thiện, vi khuẩn có khả năng
chịu các chất ức chế hóa học trong mơi trường ni cấy
như dung môi ethanol, butanol,...[5-8]. Tuy nhiên, kết
quả đạt được chỉ dừng ở mức cải thiện tốc độ sinh
trưởng, tăng lượng sinh khối thu được và đáp ứng mục


Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

đích ứng dụng trực tiếp trong sản xuất nhiên liệu sinh
học. Trong khi các nghiên cứu ngoài nước đã cho thấy
hiệu quả và tiềm năng của việc sử dụng các chủng vi sinh
tiến hóa đáp ứng thì tại Việt Nam chưa có công bố nào
về xây dựng hệ thống vi sinh vật qua q trình tiến hóa
đáp ứng để tăng hiệu quả sản xuất sinh khối.
Thêm vào đó, một số nghiên cứu đã cho thấy việc bổ
sung ethanol ở một mức độ không gây ức chế sự tăng
trưởng của E. coli vào mơi trường ni cấy biểu hiện
có thể dẫn đến tăng biểu hiện của một số loại protein

tái tổ hợp [9-11]. Khả năng thích ứng của E. coli với
mơi trường có chứa ethanol có thể được tạo ra từ những
biến đổi của tế bào để thích nghi với yếu tố bất lợi đó
và những biến đổi này được cho là có sự ảnh hưởng đến
hiện tượng liên kết màng, như sao chép DNA, dẫn đến
tăng cường sinh tổng hợp DNA và thúc đẩy tổng hợp
protein của tế bào [12]. Giả thuyết đặt ra là chủng vi
khuẩn E. coli được tạo ra từ q trình tiến hóa đáp ứng
lâu dài với những điều kiện bất lợi cũng có thể có những
biến đổi tương tự trên tế bào. Tuy nhiên, cho đến nay
chưa có nghiên cứu cụ thể nào liên quan đến việc tạo
chủng vi khuẩn E. coli đáp ứng với nồng độ ethanol cao
có thể làm tăng khả năng nâng cao hiệu quả biểu hiện
các loại protein/enzyme tái tổ hợp.
Trong nghiên cứu này, kĩ thuật tiến hóa đáp ứng trong
phịng thí nghiệm được áp dụng trên chủng E. coli
BL21(DE3), E. coli C41(DE3) được sử dụng phổ biến
trong biểu hiện protein tái tổ hợp với mục tiêu chính là
(1) tạo chủng vi khuẩn E. coli có khả năng chịu nồng
độ ethanol cao, nhằm tăng khả năng thích ứng của tế
bào vi khuẩn dưới điều kiện áp lực môi trường với nồng
độ ethanol cao và (2) sử dụng chủng E. coli đã đáp ứng
để đánh giá khả năng nâng cao hiệu quả biểu hiện
protein tái tổ hợp.

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu
Chủng vi khuẩn, môi trường
Hai chủng vi khuẩn E. coli là BL21(DE3) và E. coli
C41(DE3) lưu trữ tại phòng thí nghiệm Sinh học phân

tử tại Viện Kĩ thuật Cơng nghệ cao Nguyễn Tất Thành
là đối tượng nghiên cứu chính. E. coli BL21(DE3) là
vật chủ điển hình cho hệ thống biểu hiện protein bằng
vi khuẩn [13-15]. Chúng sử dụng enzyme T7 RNA
polymerase để phiên mã gen mục tiêu nằm sau vùng T7
promoter trên vector chuyển gen pET [16]. Chủng E.
coli C41(DE3) là chủng đột biến từ E. coli BL21(DE3),

59

được chứng minh có thể nâng cao tính ổn định của
plasmid trong quá trình biểu hiện của các protein sinh
độc tố và có thể biểu hiện thành cơng các protein mà E.
coli BL21(DE3) không biểu hiện được [17].
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường
Luria-Bertani (LB) (Peptone: 10 g/L, NaCl: 5 g/L, cao
chiết nấm men: 5 g/L) và môi trường muối cơ bản M9
(Na2HPO4: 12,8 g/L; KH2PO4: 3,0 g/L; NaCl: 0,5 g/L;
NH4Cl: 1,0 g/L).
Plasmid mang gen mã hóa cho enzyme PETase
PETase là enzyme phân cắt đặc hiệu cơ chất nhựa
polyethylene terephthalate (PET) [18]. Trong nghiên
cứu này, enzyme PETase được sử dụng để đánh giá
hiệu quả nâng cao biểu hiện protein tái tổ hợp của các
chủng vi khuẩn thử nghiệm đáp ứng ethanol. Vector tái
tổ hợp pET21b(+)-Is-PETase-W159H-S238F mang
gen mã hóa cho enzyme PETase được tổng hợp từ
GenScript, Mĩ.
Kháng thể kháng 6*His
Kháng thể kháng 6*His (Proteintech, Singapore) được sử

dụng trong nghiên cứu là kháng thể đơn dòng được sản
xuất từ chuột, nhận diện đặc hiệu đuôi polyhistidine
(6*His). Kháng thể được thiết kế gắn trực tiếp với một
phân tử tín hiệu phát quang là enzyme horseradish
peroxidase (HRP). Do đó, có thể phát hiện vị trí protein
mục tiêu trên màng lai ngay sau một lần ủ kháng thể mà
không cần đến bước ủ kháng thể thứ cấp.
2.2 Phương pháp
Thử nghiệm khoảng chịu ethanol
Chủng E. coli BL21(DE3) và C41(DE3) từ dịch khuẩn
lưu trữ ở −80 0C được nuôi cấy phục hồi trong môi
trường LB/M9 lỏng ở điều kiện ni cấy là 37 0C, lắc
150 vịng/phút trong 24 giờ. Cấy chuyển theo tỉ lệ pha
loãng 1 % và nuôi ở 37 0C trong 16 giờ, sau đó đo giá
trị mật độ quang OD600 và pha lỗng dịch nuôi cấy để
đạt OD600 = 0,01. Bổ sung ethanol 99 % theo các nồng
độ (3, 4, 5, 6, 7 và 8) % (v/v) vào mỗi ống và kèm theo
mẫu đối chứng âm khơng chứa ethanol, đóng kín nắp
và ni ở 37 0C, đo mật độ tế bào sau 24 giờ nuôi cấy.
Xác định khoảng chịu ethanol của E. coli BL21(DE3)
và E. coli C41(DE3).
Tạo chủng đáp ứng
Một khuẩn lạc E. coli BL21(DE3) và E. coli C41(DE3)
được cấy vào môi trường LB/M9 lỏng, ủ 37 0C trong
24 giờ. Dịch nuôi cấy tiếp tục được chuyển vào môi
trường LB/M9 mới để đạt giá trị OD600 = 0,01, bổ sung
X % ethanol 99 % (v/v) (X là nồng độ ethanol tối thiểu
Đại học Nguyễn Tất Thành

Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

60

trong mơi trường nuôi cấy ức chế sự sinh trưởng của vi
khuẩn). Lặp lại quy trình cấy chuyển ba lần ở ethanol
nồng độ X % và mỗi nồng độ ethanol tăng dần 0,2 %
(X + 0,2 %).
Sau mỗi nồng độ ethanol được đáp ứng, một thể tích
ni cấy thích hợp được trải trên mơi trường thạch
LB/M9 để chọn khuẩn lạc. Bất kì khuẩn lạc nào có hình
thái bất thường được lưu ý để tránh nhiễm. Các tế bào
có khả năng chịu ethanol tốt nhất được giữ trong
glycerol 25 % (đã khử trùng) ở −80 0C.
Thử thách khả năng chịu ethanol nồng độ cao
Một khuẩn lạc E. coli BL21(DE3) và C41(DE3) được
cấy vào môi trường LB/M9 lỏng và nuôi lắc ở 37 0C
trong 3 giờ. Dịch nuôi cấy (0,5 mL) được thêm vào 4,5
mL mơi trường LB/M9 sạch có chứa 14 % ethanol (đối
với chủng nuôi trong môi trường LB) và 12 % ethanol
(đối với mơi trường M9), giữ ở nhiệt độ phịng trong 2
phút. Chuẩn bị bốn độ pha loãng liên tiếp (1:10) của
dịch nuôi cấy trên trong môi trường LB/M9 sạch. Dung
dịch pha loãng được trải đều lên đĩa thạch LB/M9 và ủ
ở 37 0C qua đêm để đếm số lượng các tế bào sống sót
(theo số khuẩn lạc). Quy trình pha loãng và đếm khuẩn
lạc được áp dụng tương tự cho các mẫu cấy không trải
qua thử thách ethanol, được sử dụng làm mẫu đối
chứng. Tỉ lệ sống sót của tế bào là tỉ lệ số khuẩn lạc của
môi trường nuôi cấy thử thách với ethanol với số lượng

khuẩn lạc của môi trường nuôi cấy đối chứng.
Đánh giá khả năng nâng cao hiệu quả biểu hiện enzyme
PETase
Vector tái tổ hợp pET21b(+)-Is-PETase-W159HS238F mang gen mã hóa cho protein PETase được
chuyển vào trong tế bào nhận thông qua phương pháp
chuyển gen bằng sốc nhiệt. Thí nghiệm thực hiện đồng
thời với chủng đối chứng là chủng E. coli BL21(DE3)
và C41(DE3) chưa qua đáp ứng. Kết quả biểu hiện
protein tái tổ hợp giữa chủng vi khuẩn đáp ứng và
chủng gốc được so sánh để đánh giá sự khác biệt.
Tế bào E. coli khả nạp được tạo ra bằng cách xử lí tế
bào với CaCl2 [19]. Sau khi trở nên khả nạp, tế bào E.
coli được chuyển qua giai đoạn sốc nhiệt ở 42 0C giúp
kích thích chuyển phân tử plasmid vào trong tế bào. Cụ
thể, thêm vào ống chứa 100 µL tế bào khả nạp (đã được
rã đông trên đá) khoảng 5 ng plasmid mang gen mã hóa
cho các protein PETase. Giữ các ống tế bào trên đá
trong 30 phút. Chuyển ống tế bào vào máy ủ nhiệt ở 42
0
C, ủ tế bào trong vịng 1 phút, sau đó đưa vào đá lạnh
trong 5 phút. Thêm 1 mL LB vô trùng và ủ tế bào ở 37
Đại học Nguyễn Tất Thành

C trong 60 phút. Môi trường dưỡng chất LB cho phép
tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao chép, phiên
mã và dịch mã tạo nên protein mục tiêu. Trải dịch tế
bào lên đĩa thạch LB có chứa 100 µg/mL kháng sinh
ampicillin.
Chủng E. coli BL21(DE3), C41(DE3)/pET21b(+)-IsPETase được nhân lên trong mơi trường LB/M9 có bổ
sung 3 % ethanol và kháng sinh ampicillin nồng độ 100

µg/mL, ni cấy lắc 30 0C, 150 vịng/phút đến khi
OD600 đạt giá trị từ 0,4 đến 0,5. Ngay sau đó, chất cảm
ứng IPTG được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để
cảm ứng biểu hiện protein mong muốn, tiếp tục nuôi
cấy lắc ở 30 0C. Dãy nồng độ IPTG khảo sát là (0;
0,001; 0,005; 0,01; 0,05; và 0,1) mM. Sinh khối vi
khuẩn được thu nhận sau (1, 2, và 4) giờ cảm ứng IPTG
và li giải tế bào bằng phương pháp xử lí nhiệt. Tế bào
thu được được rửa một lần với PBS 1X và hòa tan lại
trong PBS 1X để đạt giá trị OD600 = 10. Một tỉ lệ của
mẫu, SDS 10 %, protein loading dye 4X (9:3:4) được
vortex và đun ở 100 0C trong vòng 10 phút. Lượng
protein thu được được đánh giá ở các điều kiện IPTG
và thời gian cảm ứng khác nhau.
Kết quả biểu hiện PETase được xác nhận bằng phương
pháp điện di Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide
gel Electrophoresis (SDS-PAGE) và phương pháp lai
miễn dịch Western blot với kháng thể kháng 6*His [20].
0

3 Kết quả
3.1 Khoảng chịu ethanol của E. coli BL21(DE3) và
C41(DE3)
Khảo sát khoảng chịu ethanol của E. coli BL21(DE3)
và C41(DE3) ở các nồng độ ethanol (3, 4, 5, 6, 7, và 8)
% cho thấy E. coli BL21(DE3) trong mơi trường ni
cấy LB có chứa 5 % ethanol và trong mơi trường M9
có chứa 4 %, tế bào vi khuẩn vẫn sinh trưởng tốt (giá
trị OD600 từ 0,4 đến 0,5). Ở các nồng độ ethanol cao
hơn, vi khuẩn bắt đầu sinh trưởng kém và gần như

không có sự phân chia tế bào vi khuẩn ở nồng độ từ 6
% đến 8 % ethanol (Hình 1). Đối với chủng E. coli
C41(DE3), tế bào vi khuẩn vẫn sinh trưởng tốt trong
mơi trường LB có chứa 4 % ethanol và trong mơi
trường M9 có chứa 3 % ethanol; sự ức chế sinh trưởng
xảy ra tương tự như chủng E. coli BL21(DE3) khi nồng
độ ethanol tăng dần (Hình 1). Ở thí nghiệm khảo sát
ban đầu, chủng E. coli BL21(DE3) có tốc độ tăng
trưởng và khả năng chịu ethanol cao hơn so với chủng
E. coli C41(DE3).


Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

Hình 1 Khả năng chịu ethanol của E. coli BL21(DE3) và
C41(DE3) ở các nồng độ (3, 4, 5, 6, 7 và 8) % trong môi
trường nuôi cấy LB/M9.

3.2 Tạo chủng E. coli BL21(DE3) và C41(DE3) đáp
ứng với mơi trường có nồng độ ethanol cao
Sau khi khảo sát khoảng chịu ethanol của các chủng vi
khuẩn, các nồng độ ethanol được đánh giá là nồng độ
ức chế đáng kể sự sinh trưởng của vi khuẩn sẽ được
chọn để thực hiện thí nghiệm tạo chủng đáp ứng. Dịch
khuẩn được cấy chuyển lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ
ethanol. Sau mỗi nồng độ ethanol đã đáp ứng, vi khuẩn
được chuyển sang mơi trường có nồng độ ethanol cao
hơn nồng độ cũ 0,2 %. Kết quả ghi nhận được sự sinh
trưởng của vi khuẩn ngày càng giảm theo dãy nồng độ
ethanol đáp ứng tăng dần và duy trì ở mức thấp hơn so

với sự tăng trưởng của vi khuẩn ở mơi trường ni cấy
bình thường (dữ liệu khơng trình bày). Điều này chứng
minh rằng nồng độ ethanol cao trong môi trường nuôi
cấy đã ức chế đáng kể sự sinh trưởng và phân chia tế
bào vi khuẩn, qua q trình đáp ứng, chỉ những tế bào
đã có sự thay đổi để thích nghi với mơi trường bất lợi
mới có khả năng sống sót. Tuy nhiên, nghiên cứu của
Wang và cộng sự đã cho thấy, khi tăng thời gian đáp
ứng của chủng E. coli KC01 ở mỗi nồng độ ethanol lên
7 ngày. Trong (3-4) ngày đầu, sự tăng trưởng của vi
khuẩn chậm nhưng ở ngày nuôi cấy thứ 6, thứ 7, vi
khuẩn có thể tăng trưởng tốt, mật độ tế bào tăng cao
[7]. Do đó, ở thử nghiệm này, tăng thời gian nuôi cấy
đáp ứng tại mỗi nồng độ ethanol có thể có khả năng cải
thiện sự tăng trưởng và thích nghi của tế bào với mơi
trường có nồng độ ethanol cao.
3.3 Đánh giá khả năng chịu ethanol của chủng
đáp
ứng
Khả năng chịu ethanol trong môi trường nuôi cấy của vi
khuẩn E. coli BL21(DE3) và C41(DE3) được đánh giá
bằng cách xác định tỉ lệ sống sót của các tế bào trong

61

mơi trường có nồng độ ethanol cao gấp hai lần mức đáp
ứng trong 2 phút. Kết quả cho thấy tế bào đã đáp ứng
với ethanol ít bị thiệt hại hơn so với tế bào chưa đáp ứng
(Bảng 1). Đối với chủng E. coli BL21(DE3) đáp ứng, tỉ
lệ sống sót của tế bào qua thử thách nồng độ ethanol cao

(14 %) trong môi trường LB/M9 lần lượt là 66,75 % và
65,13 %, trong khi tỉ lệ sống sót của chủng đối chứng
trong điều kiện thách thức ethanol tương tự thấp hơn
đáng kể so với chủng đáp ứng với các tỉ lệ lần lượt là
34,97 % và 42,19 %. Đối với chủng E. coli C41(DE3)
đáp ứng, tỉ lệ sống sót của tế bào vi khuẩn trong mơi
trường LB/M9 có bổ sung 12 % ethanol là 90,24 % và
97,16 %, tỉ lệ này cao hơn so với chủng đối chứng là
65,6 % và 69,23 %. Nồng độ ethanol cao trong môi
trường nuôi cấy đã ức chế sự sinh trưởng và phân chia
của tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) và C41(DE3)
chưa đáp ứng. Chỉ những tế bào có khả năng chịu
ethanol mới có khả năng sống sót và nhân lên. Do đó, tỉ
lệ sống sót của tế bào vi khuẩn đã thích nghi với mơi
trường có ethanol cao hơn so với chủng chưa đáp ứng.
Kết quả này tương tự với kết quả từ nghiên cứu của
Wang và cộng sự năm 2011 [7].
Sau quá trình thử nghiệm tạo chủng đáp ứng, nghiên
cứu đã tạo được hai chủng E. coli BL21(DE3) mới (E.
coli BL21-LE và E. coli BL21-ME) có khả năng chịu ở
nồng độ ethanol 8 % và 7 % tương ứng trong môi
trường nuôi cấy LB và M9, nồng độ ethanol đáp ứng
cao hơn so với mức chịu ban đầu của chủng gốc là 2 %.
Đồng thời, thử nghiệm đáp ứng cũng tạo ra hai chủng
E. coli C41(DE3) mới (E. coli C41-LE và E. coli C41ME) được cải thiện khả năng chịu ethanol và có thể
sống sót trong mơi trường LB có chứa 7 % ethanol và
mơi trường M9 có chứa 6 % ethanol, mức chịu ethanol
cao hơn so với chủng gốc 2 %. Một khuẩn lạc của mỗi
chủng đáp ứng được lưu trữ trong glycerol 25 % trong
môi trường LB/M9 ở điều kiện −80 0C để sử dụng cho

các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 1 Tỉ lệ sống sót của tế bào vi khuẩn trong môi trường
nồng độ ethanol cao
Đối chứng Ethanol nổng Tỉ lệ
(số khuẩn
Chủng
độ cao
sống
lạc)
(số khuẩn lạc) sót (%)

E. coli BL21(DE3)
E. coli BL21-LE
E. coli BL21(DE3)
E. coli BL21-ME

366
418
128
218

128
279
54
142

34,97
66,75
42,19
65,13

Đại học Nguyễn Tất Thành


Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

62

E. coli C41(DE3)
E. coli C41 - LE
E. coli C41(DE3)
E. coli C41 - ME

157
82
143
106

103
74
99
103

65,60
90,24
69,23
97,16

3.4 Đánh giá khả năng nâng cao hiệu quả biểu hiện
enzyme PETase của chủng E. coli BL21(DE3) đáp ứng

ethanol nồng độ cao
Chủng E.coli BL21-ME đã đáp ứng với môi trường
nuôi cấy M9 có chứa 7 % ethanol được sử dụng để biểu
hiện enzyme PETase ở các điều kiện khác nhau. Ở tất
cả các điều kiện khảo sát bao gồm nồng độ IPTG từ
(0,001 đến 0,1) mM, thời gian cảm ứng trong (1, 2, và
4) giờ, E.coli BL21-ME đều biểu hiện enzyme PETase
tốt hơn so với chủng gốc (Hình 2). Kết quả Western
blot cho thấy lượng protein PETase biểu hiện bằng
chủng đáp ứng E.coli BL21-ME (kí hiệu “E”) cao hơn
so với chủng chưa đáp ứng (kí hiệu “M”). Sự khác biệt
về hiệu quả biểu hiện protein PETase giữa chủng đáp
ứng E. coli BL21-ME và chủng gốc E. coli BL21(DE3)
khác biệt rõ ràng nhất ở nồng độ IPTG là 0,01 mM sau
4 giờ cảm ứng. Dựa trên kết quả phân tích từ phần mềm
ImageJ, tính tốn được lượng protein PETase tạo ra từ
chủng đáp ứng cao hơn so với chủng gốc 1,8 lần. Ở
nồng độ IPTG (0,001 và 0,005) mM, lượng protein
PETase tạo ra thấp, thể hiện thông qua các vạch protein
mờ trên màng lai. Ở cả hai chủng vi khuẩn đáp ứng và
chủng đối chứng, nồng độ IPTG (0,05 và 0,1) mM là
nồng độ phù hợp để PETase biểu hiện tốt nhất.

*Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm ImageJ
Hình 2 Biểu hiện enzyme PETase của chủng E. coli
BL21-ME kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
(A) và phương pháp lai Western blot (B). M: chủng E. coli
BL21(DE3) đối chứng; E: chủng E. coli BL21-ME đã đáp
ứng; C: enzyme PETase tinh sạch.
Đại học Nguyễn Tất Thành

Trong môi trường nuôi cấy biểu hiện LB, chủng E.coli
BL21-LE có khả năng chịu 8 % ethanol cũng cho thấy
hiệu quả nâng cao biểu hiện protein PETase so với
chủng gốc (Hình 3). Ở nồng độ IPTG 0,1 mM, sự khác
biệt về hiệu quả biểu hiện protein tái tổ hợp của chủng
đáp ứng và chủng gốc thể hiện rõ ràng nhất và hiệu suất
biểu hiện PETase từ chủng đáp ứng là cao nhất, gấp 1,5
lần so với chủng gốc (dữ liệu phân tích bằng phần mềm
ImageJ). Ở nồng độ IPTG 0,05 mM, mức độ biểu hiện
PETase không có sự khác biệt đáng kể.

Hình 3 Biểu hiện enzyme PETase của chủng E. coli BL21LE. L: chủng E. coli BL21(DE3) đối chứng; E: chủng E. coli
BL21-LE đáp ứng; C: enzyme PETase tinh sạch.

Như vậy, chủng E. coli BL21(DE3) đã đáp ứng với mơi
trường có ni cấy LB/M9 có nồng độ ethanol cao cho
hiệu suất biểu hiện protein PETase cao hơn so với
chủng gốc.
3.5 Đánh giá khả năng nâng cao hiệu quả biểu hiện
enzyme PETase của chủng E. coli C41(DE3) đáp ứng
ethanol nồng độ cao
Chủng E. coli C41-ME đã đáp ứng với mơi trường ni
cấy M9 có chứa 6 % ethanol được sử dụng làm vật chủ
biểu hiện để khảo sát biểu hiện của enzyme PETase.
Đồng thời hiệu quả biểu hiện cũng đã được so sánh với
sự biểu hiện PETase của chủng gốc E. coli C41(DE3)
thực hiện ở điều kiện thí nghiệm tương tự. Kết quả thu
được cho thấy lượng enzyme PETase tạo ra từ chủng
E. coli C41-ME vượt trội hơn so với chủng gốc (Hình

4). Ở tất cả các nồng độ IPTG được khảo sát từ (0,001
đến 0,1) mM, vạch hiển thị kết quả lượng protein
PETase thu được sau (1, 2, và 4) giờ nuôi cấy biểu hiện
ở chủng E. coli C41-ME (kí hiệu “E”) ln cao hơn so
với chủng gốc E. coli C41(DE3) đối chứng (kí hiệu
“M”). Lượng protein thu được từ chủng đáp ứng và
chủng đối chứng khác biệt rõ nhất ở nồng độ IPTG là
(0,05 và 0,1) mM sau 4 giờ cảm ứng biểu hiện, lượng
protein PETase do E. coli C41-ME biểu hiện cao hơn
lần lượt là 3,5 lần và 2,9 lần so với chủng đối chứng
(dữ liệu phân tích từ phần mềm ImageJ). Ở các nồng
độ còn lại bao gồm (0,001; 0,005; và 0,01) mM, lượng
protein tạo ra ít, vạch protein mục tiêu hiển thị trên
màng lai mờ.


Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

*Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm ImageJ
Hình 4 Kiểm tra biểu hiện enzyme PETase của chủng E.
coli C41-ME bằng phương pháp điện di SDS-PAGE (A)
và phương pháp lai Western blot (B). M: chủng E. coli
C41(DE3) đối chứng; E: chủng E. coli C41-ME đáp ứng;
C: enzyme PETase tinh sạch; L: thang protein.

Chủng E. coli C41-LE đã đáp ứng với môi trường LB
có chứa 7 % ethanol cũng được sử dụng để đánh giá
hiệu quả biểu hiện enzyme PETase. Thử nghiệm được
khảo sát ở các nồng độ IPTG là (0,01; 0,05 và 0,1) mM,
thời gian cảm ứng là 4 giờ. Kết quả thể hiện Western

blot trên cho thấy hiệu quả biểu hiện PETase bằng
chủng E. coli C41-LE đã đáp ứng cao hơn so với chủng
gốc (Hình 5). Ở nồng độ IPTG là 0,05 mM, lượng
enzyme PETase biểu hiện biểu hiện giữa chủng đáp
ứng E. coli C41-LE và chủng gốc E. coli C41(DE3) có
sự khác biệt rõ ràng nhất, hiệu suất tổng hợp protein
mục tiêu của E. coli C41-LE cao hơn 2,1 lần (dữ liệu
phân tích từ phần mềm ImageJ). Tuy nhiên, sự khác
biệt về hiệu quả biểu hiện PETase của chủng E. coli
C41-LE đáp ứng trong môi trường LB không nổi bật
như chủng E. coli C41-ME.

Hình 5 Kết quả biểu hiện enzyme PETase của chủng
E. coli C41-LE. L: chủng E. coli C41(DE3) đối chứng;
E: chủng E. coli C41-LE đáp ứng; C: enzyme PETase
tinh sạch

4 Thảo luận
Nghiên cứu “Tạo chủng Escherichia coli có khả năng
chịu nồng độ ethanol cao để nâng cao hiệu quả biểu

63

hiện protein tái tổ hợp” đã tạo ra chủng vi khuẩn E. coli
BL21-LE có khả năng chịu 8 % ethanol trong mơi
trường LB và E. coli BL21-ME có khả năng chịu 7 %
ethanol trong môi trường M9. Đồng thời, nghiên cứu
cũng tạo ra chủng E. coli C41-LE có khả năng sống sót
ở nồng độ ethanol 7 % trong mơi trường LB và C41ME có khả năng sống sót ở 6 % ethanol trong môi
trường M9. Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy E. coli

BL21(DE3) có khả năng sinh trưởng tốt hơn và có khả
năng chịu với ethanol cao hơn so với chủng E. coli
C41(DE3). Trong thí nghiệm thử thách khả năng chịu
ethanol nồng độ cao của chủng E. coli BL21(DE3) và
C41(DE3), nồng độ ethanol cao ít gây thiệt hại cho tế
bào đã đáp ứng hơn so với tế bào chưa đáp ứng. Điều
này cho thấy nồng độ ethanol cao trong môi trường
nuôi cấy đã ức chế sự sinh trưởng, phân chia và có thể
gây chết tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) và
C41(DE3) chưa đáp ứng, chỉ những tế bào có khả năng
chịu ethanol mới có khả năng sống sót và nhân lên.
Chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) và C41(DE3) đã
đáp ứng cũng được ứng dụng để làm vật chủ biểu hiện
cho enzyme PETase nhằm đánh giá khả năng nâng cao
hiệu quả biểu hiện protein tái tổ hợp của chúng so với
chủng gốc. Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn đáp ứng
với mơi trường có chứa nồng độ ethanol cao đã góp
phần nâng cao hiệu quả biểu hiện enzyme PETase. Đối
với chủng E. coli BL21-ME, sự khác biệt về hiệu quả
biểu hiện PETase thể hiện rõ nhất ở nồng độ chất cảm
ứng là 0,01 mM sau 4 giờ cảm ứng trong môi trường
nuôi cấy biểu hiện M9. Đối với chủng E. coli
C41(DE3), chủng đáp ứng mang lại hiệu quả biểu hiện
enzyme PETase cao hơn rõ rệt so với chủng gốc ở tất
cả các nồng độ IPTG được khảo sát. Đặc biệt, trong
điều kiện môi trường nuôi cấy LB, nồng độ chất cảm
ứng IPTG là (0,05 và 0,1) mM, thời gian cảm ứng là 4
giờ, lượng enzyme PETase biểu hiện từ chủng đáp ứng
cao nhất và cho thấy sự khác biệt rõ so với chủng đối
chứng.

Nhìn chung, việc sử dụng các chủng E. coli đáp ứng với
môi trường nuôi cấy có chứa nồng độ ethanol cao đã
nâng cao hiệu quả biểu hiện protein tái tổ hợp PETase
so với chủng gốc. Mức độ cải thiện biểu hiện tùy thuộc
vào chủng vi khuẩn biểu hiện, môi trường nuôi cấy,
nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng biểu
hiện khác nhau. Trong quá trình tạo đáp ứng của chủng
E. coli BL21(DE3) và C41(DE3) với mơi trường có
nồng độ ethanol cao, ethanol có thể tạo ra ảnh hưởng
Đại học Nguyễn Tất Thành


Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

64

lớn đến môi trường sống của tế bào vi khuẩn và gây ra
những biến đổi về tính lưu động của màng, vận chuyển
qua màng, thành phần lipid màng và sự sắp xếp của các
protein màng [21-23]. Những thay đổi này có thể ảnh
hưởng đến hiện tượng liên kết màng, chẳng hạn như quá
trình sao chép DNA, dẫn đến tăng cường tổng hợp DNA
[12]. Việc tăng cường tổng hợp DNA có thể dẫn đến
tăng quá trình phiên mã và dịch mã protein mong muốn
trong các tế bào được xử lí bằng ethanol. Do đó, lượng
enzyme PETase được biểu hiện từ chủng đáp ứng cao
hơn so với chủng gốc. Ngồi ra, trong q trình nuôi cấy
biểu hiện, việc tăng sinh và biểu hiện protein của vi
khuẩn có thể sản sinh ra các loại độc tố, các sản phẩm
trao đổi chất hoặc xuất hiện các yếu tố bất lợi trong q

trình ni cấy như sự không ổn định về nhiệt độ, thay
đổi pH, nồng độ các chất dinh dưỡng thấp,…, gây ức
chế ngược lại sự sinh trưởng và khả năng biểu hiện
protein của vi khuẩn. Do đó, việc tạo ra các chủng vi
khuẩn có khả năng thích ứng trực tiếp với các yếu tố bất
lợi trong mơi trường sinh trưởng có thể sẽ làm tăng khả
năng sống sót và cải thiện hiệu quả biểu hiện protein tái
tổ hợp.

5 Kết luận
Đây là nghiên cứu đầu tiên trong nước tạo chủng vi
khuẩn tiến hóa đáp ứng với nồng độ ethanol cao trong
phịng thí nghiệm và ứng dụng làm chủng chủ biểu hiện

Đại học Nguyễn Tất Thành

trong công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp. Bước đầu
nghiên cứu đã mang lại những kết quả nổi bật. Qua
nhiều thế hệ nuôi cấy đáp ứng, chủng vi khuẩn E. coli
BL21(DE3) và C41(DE3) có khả năng chịu với nồng
độ ethanol cao trong môi trường LB/M9 được tạo ra và
khi ứng dụng làm chủng chủ trong biểu hiện protein tái
tổ hợp đã góp phần nâng cao hiệu quả biểu hiện protein
PETase. Tuy nhiên, ở thí nghiệm tạo chủng đáp ứng,
thời gian cấy chuyển ở mỗi nồng độ ethanol đáp ứng
ngắn (3 ngày), do đó, chưa thể thấy rõ được sự đáp ứng
của tế bào với môi trường bất lợi, những tế bào chưa
hồn tồn thích nghi vẫn tiếp tục bị ức chế sự sinh
trưởng bởi ethanol. Vì vậy nghiên cứu cần tăng thêm
thời gian nuôi cấy đáp ứng tại mỗi nồng độ ethanol để

có thể đánh giá rõ sự tăng trưởng và thích nghi của tế
bào với mơi trường có nồng độ ethanol cao. Đối với thử
nghiệm đánh giá hiệu quả nâng cao biểu hiện protein
tái tổ hợp, cần sử dụng chủng đáp ứng để biểu hiện
thêm một số enzyme có giá trị ứng dụng nhằm đánh giá
toàn diện về hiệu quả nâng cao biểu hiện protein tái tổ
hợp của chủng vi khuẩn đáp ứng với mơi trường có
nồng độ ethanol cao.
Lời cám ơn
Nghiên cứu được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học
và Công nghệ − Đại học Nguyễn Tất Thành, mã đề tài
2021.01.106/HĐ-KHCN.


Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

65

Tài liệu tham khảo
1. Chen, S., Pan, L., Liu, S., Pan, L., Li, X., & Wang, B. (2021). Recombinant Expression and Surface Display of
a Zearalenone Lactonohydrolase from Trichoderma Aggressivum in Escherichia coli. Protein Expr. Purif, 187,
105933. />2. Seyfi, R., Babaeipour, V., Mofid, M. R., & Kahaki, F. A. (2019). Expression and Production of Recombinant
Scorpine as a Potassium Channel Blocker Protein in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem, 66(1), 119-129.
/>3. Janatunaim, R. Z., & Fibriani, A. (2020). Construction and Cloning of Plastic-Degrading Recombinant
Enzymes (MHETase). Recent Pat. Biotechnol, 14(3), 229–234.
/>4. Dragosits, M., & Mattanovich, D. (2013). Adaptive Laboratory Evolution - Principles and Applications for
Biotechnology. Microb. Cell Fact, 12(1), 1. />5. Matsusako, T., Toya, Y., Yoshikawa, K., & Shimizu, H. (2017). Identification of Alcohol Stress Tolerance Genes
of Synechocystis Sp. PCC 6803 Using Adaptive Laboratory Evolution. Biotechnol. Biofuels, 10(1), 1-9.
/>6. Horinouchi, T., Suzuki, S., Hirasawa, T., Ono, N., Yomo, T., Shimizu, H., & Furusawa, C. (2015). Phenotypic
Convergence in Bacterial Adaptive Evolution to Ethanol Stress. BMC Evol. Biol, 15(1), 1–14.

/>7. Wang, Y., Manow, R., Finan, C., Wang, J., Garza, E., & Zhou, S. (2011). Adaptive Evolution of Nontransgenic
Escherichia coli KC01 for Improved Ethanol Tolerance and Homoethanol Fermentation from Xylose. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol, 38(9), 1371-1377. />8. Horinouchi, T., Tamaoka, K., Furusawa, C., Ono, N., Suzuki, S., Hirasawa, T., Yomo, T., & Shimizu, H. (2010).
Transcriptome Analysis of Parallel-Evolved Escherichia coli Strains under Ethanol Stress. BMC Genomics, 11(1),
579. />9. Basu, T., & Poddar, R. K. (1997). Over Expression of Inducible Proteins in Escherichia coli by Treatment with
Ethanol. Biochem. Mol. Biol. Int, 41(6), 1093-1100. />10.Zheng, H., Yu, Z., Shu, W., Fu, X., Zhao, X., Yang, S., Tan, M., Xu, J., Liu, Y., & Song, H. (2019). Ethanol
Effects on the Overexpression of Heterologous Catalase in Escherichia coli BL21 (DE3). Appl. Microbiol.
Biotechnol, 103(3), 1441-1453. />11.Chhetri, G., Kalita, P., & Tripathi, T. (2015). An Efficient Protocol to Enhance Recombinant Protein Expression
Using Ethanol in Escherichia coli. MethodsX, 2, 385-391. />12.Basu, T., & Poddar, R. K. (1994). Effect of Ethanol on Escherichia coli Cells. Enhancement of DNA Synthesis
Due to Ethanol Treatment. Folia Microbiol. (Praha), 39(1), 3-6. />13.Liu, C., Zheng, K., Xu, Y., Stephen, L. T., Wang, J., Zhao, H., Yue, T., Nian, R., Zhang, H., Xian, M., & Liu,
H. (2017). Expression and Characterization of Soybean Seed Coat Peroxidase in Escherichia Coli BL21(DE3).
Prep. Biochem. Biotechnol, 47(8), 768-775. />14.Lopes, C., Dos Santos, N. V., Dupont, J., Pedrolli, D. B., Valentini, S. R., de Carvalho Santos-Ebinuma, V., &
Pereira, J. F. B. (2019). Improving the Cost Effectiveness of Enhanced Green Fluorescent Protein Production Using
Recombinant Escherichia coli BL21 (DE3): Decreasing the Expression Inducer Concentration. Biotechnol. Appl.
Biochem, 66(4), 527-536. />15.Yu, B., Sun, W., Huang, Z., Sun, G., Li, L., Gu, J., Zheng, M., Li, X., Chun, C., Hui, Q., & Wang, X. (2021).
Large-Scale Preparation of Highly Stable Recombinant Human Acidic Fibroblast Growth Factor in Escherichia
coli BL21(DE3) PlysS Strain. Front. Bioeng. Biotechnol, 9, 641505. />16. PET System Manual. No. 11th Edition.
17. Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., & Vuillard, L. (2004). The Toxicity of Recombinant Proteins in Escherichia
coli: A Comparison of Overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr. Purif, 37(1), 203206. />Đại học Nguyễn Tất Thành


66

Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 18

66
Tạp Yoshida,
chí Khoa họcS.,
& Công
nghệK.,

Số 18
18.
Hiraga,
Takehana, T., Taniguchi, I., Yamaji, H., Maeda, Y., Toyohara, K., Miyamoto, K.,
Kimura, Y., & Oda, K. (2016). A Bacterium That Degrades and Assimilates Poly (Ethylene Terephthalate).
Science, 351(6278), 1196-1199. />19. Chung, C. T., & Miller, R. H. (1993). Preparation and Storage of Competent Escherichia coli Cells. Academic
Press, 218, 621-627. />20. Kurien, B. T., & Scofield, R. H. (2015). Western Blotting: An Introduction. Methods Mol. Biol, 1312, 17-30.
/>21. Ingram, L. O. (1986). Microbial Tolerance to Alcohols: Role of the Cell Membrane. Trends Biotechnol, 4(2),
40-44. />22. Ingram, L. O., & Buttke, T. M. (1985). Effects of Alcohols on Micro-Organisms. Academic Press, 25, 253-300.
/>23. Dombek, K. M., & Ingram, L. O. (1984). Effects of Ethanol on the Escherichia coli Plasma Membrane. J.
Bacteriol, 157(1), 233-239. />
Enhancing ethanol tolerance of Escherichia coli to improve the efficiency of recombinant protein
expression
Tran Thi Hau, Tran Hong Diem, Phung Thi Thu Huong
NTT Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University

Abstract Escherichia coli is one of the most common hosts to produce recombinant proteins due to its short
culturing time and high biomass yield. However, the traditional strains often lack the resistance against chemical
inhibitors or environmental stresses which impact on cell division and lessen the effectiveness of target protein
expression. In this study, the E. coli strains with direct ethanol tolerance was developed to promote the cellular
alterations associated with the enhancement of DNA synthesis and the improvement of the production of
recombinant proteins. The result showed that the E. coli BL21(DE3) and E. coli C41(DE3) have been improved in
ethanol tolerance (7-8) % by applying laboratory adaptive evolution in Luria Bertani medium and M9 minimal
medium. Additionally, the protein expression efficiency has been significantly increased when using them as a host
for PETase protein expression compared to the original strains. The evolution of E. coli with high ethanol tolerance
might be a potential factor contributing to the development of an effective expression system for recombinant
protein production.
Keywords adaptive evolution, E. coli BL21(DE3), E. coli C41(DE3), ethanol tolerance, PETase, recombinant
protein.

Đại học Nguyễn Tất Thành