Luận án Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii

- 1 -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN




NGUYỄN HỮU QUÂN


NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TỰ NHIÊN
VÀ BIỂU HIỆN CHITINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG
NẤM LECANICILLIUM LECANII



Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16




TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2015



- 2 -
Công trình được hoàn thành tại Khoa Khoa học Sự Sống,
Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Phòng
Công nghệ Sinh học Enzyme - Viện Công nghệ Sinh học -
Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.





Người hướng dẫn khoa học:1. PGS.TS. Quyền Đình Thi
2. PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh



Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:


Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại
học Họp tại trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
Vào hồi giờ , ngày tháng năm 201

Có thể tìm hiểu luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái
Nguyên, Thư viện Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và
Thư viện Quốc gia Việt Nam.


- 3 -
CÁC CÔNG TRÌNH
CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Huu Quan Nguyen, Dinh Thi Quyen, Sy Le Thanh Nguyen, Van Hanh Vu
(2015), “An extracellular antifungal chitinase from Lecanicillium lecanii:
purification, properties and application in biocontrol against plant
pathogenic fungi”, Turkish Journal of Biology, 39, tr. 6-14.
2. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi (2014), “Cloning and
expression of a gene encoding chitinase from Lecanicillium lecanii 43H
in Pichia pastoris”, In: the 3
rd
Academic conference on natural science
for master and PhD students from Asean countries, tr. 438-445.
3. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi, Phạm Thị Huyền
(2013), “Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ nấm
Lecanicillium lecanii 43H”, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn
quốc, Nxb Khoa học Tự nhiên & Công nghệ,1, tr. 426-430.
4. Vũ Văn Hạnh, Nguyễn Hữu Quân, Quyền Đình Thi (2012), “Nghiên cứu
độc tính của nấm kí sinh côn trùng trên rệp hại ngô Aphids maydis để sản
xuất thuốc trừ sâu sinh học”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 50(3D), tr. 1009-1015.
5. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2012), “Nghiên cứu
độc tính và đặc tính sinh học của chủng nấm Lecanicillium đối với rệp

đào”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, 50(3D), tr. 862-868.
6. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi (2012), “ Biological
characteristics and virulence of Lecanicillium lecanii strains against
Chinese cabbage aphids”, In: The 2
nd
Academic conference on Natural
Science for Master and PhD Students from Cambodia-Laos-Malaysia, tr.
423-427.
Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế
1. Nguyen HQ, Vu VH and Quyen DT (2012) Lecanicillium lecanii strain
43H 28S ribosomal RNA gene, partial sequence. GenBank: JX665044.
2. Nguyen HQ, Vu VH and Quyen DT (2012) Lecanicillium lecanii strain
43H chitinase gene, partial cds. GenBank: JX665045.

- 4 -
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, các biện pháp sinh học như sử dụng nấm kí
sinh hay các loài thiên địch trong việc phòng chống sâu hại cây trồng đang
được quan tâm nghiên cứu. Các chế phẩm sinh học từ nấm ra đời đã được sử
dụng để diệt trừ các loại sâu, nhện, bọ trĩ và bọ cánh phấn. Tuy nhiên, việc
sử dụng biện pháp vi nấm kí sinh đối với rệp là vấn đề đang còn mới mẻ
trong nông nghiệp. Cùng với sự phát triển kinh tế - xã hội, con người ngày
càng có nhu cầu sử dụng các sản phẩm rau quả sạch, hạn chế mức thấp nhất
việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học dùng trong sản xuất rau, củ quả. Các loài
thiên địch như nấm kí sinh côn trùng gây hại cây trồng đã được sử dụng, do
chúng có khả năng phát tán rất nhanh và chỉ diệt các loài côn trùng có hại
mà không ảnh hưởng tới nguồn nước, môi trường sinh thái và sức khỏe con
người, vật nuôi.

Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như
tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease)
của nấm. Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme
càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh,
tiết kiệm được thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một
lượng lớn enzyme đặc biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất
cần thiết.
Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl
glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết
β-1,4-glucoside giữa C
1
và C
4
của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp
nhau trong chitin. Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông
nghiệp, y học. Từ thực tế trên, việc nghiên cứu đặc tính chitinase và qui
trình tạo ra chitinase cao góp phần làm tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử
nấm là rất cần thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận
án: “Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase
tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tinh sạch và phân tích được đặc tính hóa lý của chitinase chiết rút từ
nấm L. Lecanii và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong nấm men Pichia

- 5 -
pastoris X33 phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt rệp và nấm hại cây
trồng.
2.2. Mục tiêu cụ thể

(i) Tuyển chọn được chủng nấm L. lecanii có khả năng sinh tổng hợp
chitinase cao. Tinh sạch và đánh giá được tính chất hóa lý của chitinase
chiết rút từ chủng nấm đã tuyển chọn;
(ii) Xác định được trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase từ chủng
nấm L. lecanii đã tuyển chọn;
(iii) Biểu hiện được chitinase tái tổ hợp của gen mã hóa phân lập được từ
chủng nấm L. lecanii tuyển chọn trong nấm men Pichia pastoris X33;
(iv) Tinh sạch, khảo sát tính chất lý hóa của chitinase tái tổ hợp và đánh giá
vai trò diệt rệp, nấm bệnh hại cây trồng của chitinase.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm L. lecanii sinh chitinase cao và khảo
sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase.
(2) Nghiên cứu tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của chitinase tự nhiên.
(3) Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập
từ chủng nấm đã tuyển chọn
(4) Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase, tinh sạch và phân tích một
số tính chất lý hóa của chitinase tái tổ hợp.
(5) Nghiên cứu khả năng ức chế của chitinase đối với sự phát triển một số
loài nấm bệnh và rệp hại cây trồng.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Exochitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H đã được tinh sạch, đánh giá
một số tính chất lý hóa và chứng minh được khả năng ức chế sự phát triển
của nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani. Bước đầu đánh giá
được khả năng diệt được rệp của bào tử nấm L. lecanii.
4.2. Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống từ khâu phân lập, tách dòng,
biểu hiện gen chitinase và đánh giá khả năng diệt rệp hại cây trồng. Cụ thể là:
(i) Gen Chit từ chủng nấm L. lecanii 43H được phân lập, tách dòng thành
công và xác định được trình tự nucleotide; đoạn gen Chit được đăng kí trong
GenBank với mã số JX665045. (ii) Biểu hiện thành công gen Chit mã hóa
endochitinase thuộc họ 18 glycosyl hydrolase trong nấm men P. pastoris X33

cho hoạt tính cao. Tinh sạch được chitinase tái tổ hợp và đánh giá được một số

- 6 -
tính chất lý hóa cơ bản. (iii) Chứng minh được rChit có khả năng làm suy
giảm lớp vỏ chitin của rệp.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
5.1. Về khoa học
i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương
pháp tinh sạch chitinase, các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase và
khả năng diệt nấm bệnh của chitinase từ chủng nấm L. lecanii.
ii) Cung cấp những thông tin về gen mã hóa chitinase ở chủng nấm L.
lecanii 43H, chitinase tái tổ hợp và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính rChit
và khả năng thủy phân lớp vỏ rệp của rChit.
iii) Cung cấp thông tin về khả năng diệt rệp của bào tử và đặc điểm sinh học
của nấm L. lecanii.
5.2. Về thực tiễn
Những kết quả đánh giá toàn diện từ khâu lựa chọn điều kiện sinh tổng
hợp chitinase, tinh sạch và xác định tính chất lý hóa, khả năng diệt nấm bệnh
và rệp của chitinase, cũng như quá trình nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa
chitinase làm căn cứ để đánh giá và ứng dụng của chitinase với bào tử nấm
trong quá trình tạo chế phẩm sinh học diệt rệp của chủng nấm L. lecanii.
6. Cấu trúc luận án: Luận án có 114 trang (cả tài liệu tham khảo) được chia
thành các chương, phần: Mở đầu 3 trang, chương 1: Tổng quan tài liệu 27
trang; chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18 trang; chương 3: Kết
quả nghiên cứu và thảo luận 43 trang; kết luận và đề nghị 1 trang; các công
trình công bố liên quan đến luận án 1 trang; Tài liệu tham khảo 18 trang; phụ
lục 2 trang. Luận án có 12 bảng, 38 hình và tham khảo 151 tài liệu.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo 13 tài liệu tiếng Việt và 138 tài liệu tiếng Anh để

tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Chitinase, (2) Ứng dụng
của nấm L. lecanii và chitinase, (3) Một số nghiên cứu về gen và biểu gen
mã hóa chitinase.
Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết β-
1,4-glycoside giữa C
1
và C
4
của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp
nhau trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase được tổng hợp
từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự nhiên như thực vật, động vật

- 7 -
và vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp chitinase
nhiều hơn so với động vật và thực vật.
Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại
côn trùng như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng,
bướm. Do vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học
diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium là cần thiết.
Dựa vào đặc tính thủy phân chitin, chitinase đã được lựa chọn cho những
ứng dụng cụ thể trong thực tiễn như: ứng dụng trong y tế, nông nghiệp, bảo
vệ môi trường và trong công nghệ sinh học.
Gen mã hóa chitinase được nghiên cứu trên nhiều đối tượng vi sinh vật
như nấm Lecanicillium, Beauveria, Trichoderma, Gen mã hóa chitinase từ
một số chủng nấm được nhiều tác giả nghiên cứu biểu hiện ở các hệ thống
biểu hiện khác nhau như biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, trong vi khuẩn
Bacillus, trong nấm men và trong thực vật.
Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu chitinase chủ yếu tập chung vào quá
trình tối ưu khả năng sinh chitinase trên một số chủng vi sinh vật và sử dụng
chitinase để ức chế sự phát triển, cũng như nghiên cứu biểu hiện gen

chitinase trong thực vật giúp cây trồng có khả năng chống lại được một số
nấm bệnh.
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và hóa chất
Nấm L. lecanii do Phòng Các chất chức năng Sinh học, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
Vi khuẩn E. coli DH5α được sử dụng để nhân dòng gen và tế bào nấm
men P. pastoris X33 dùng để biểu hiện gen. Vector pJET1.2/blunt để nhân
dòng và pPICZαA được dùng để biểu hiện gen Chit.
Rệp (Myzus persicae) được thu thập từ ruộng cải ở khu vực thuộc thành
phố Thái Nguyên.
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm đều mới, hiện đại và có độ
chính xác cao thuộc Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hóa chất trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết. Các dung dịch và đệm
dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm
chuẩn.


- 8 -

2.2. Phương pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các nhóm phương pháp nghiên cứu như: (1) Phương
pháp nuôi cấy; (2) Xác định hoạt tính chitinase; (3) Tinh sạch và nghiên cứu
ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ bền của chitinase tự
nhiên và tái tổ hợp; (4) Phương pháp sinh học phân tử; (5) Phương pháp thử
nghiệm khả năng ức chế rệp, nấm bệnh của chitinase và bào tử; (6) Phương
pháp phân tích, xử lý số liệu.
2.2.1. Nhóm các phương pháp nuôi cấy
Hoạt hóa chủng nấm; nuôi cấy nấm thu sinh khối; nuôi cấy vi khuẩn E. coli,

nấm men P. pastoris; nuôi cấy thu bào tử; nuôi rệp để thử nghiệm; nuôi tối ưu
và biểu hiện sinh tổng hợp chitinase.
2.2.2. Xác định hoạt tính chitinase
Hoạt tính chitinase được định theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và
dựa trên sự thủy phân chitin huyền phù bằng chitinase sau đó bất hoạt
enzym và tạo phản ứng màu bằng DNS. Lượng đường N-acetyl glucosamine
tạo ra được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm
dựa vào cường độ màu tạo ra bởi phức với thuốc thử.
2.2.3. Tinh sạch và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên
hoạt tính và độ bền của chitinase tự nhiên và tái tổ hợp
2.2.4. Phương pháp sinh học phân tử
2.2.4.1. Nhóm các phương pháp nhân dòng gen
Tách chiết và tinh sạch DNA, RNA tổng số từ nấm và DNA plasmid từ vi
khuẩn → Nhân bản gen Chit bằng PCR → Nhân dòng gen và xác định trình
tự nucleotide: i) Tinh sạch sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector
nhân dòng pJET1.2, iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli
DH5α; iv) Tách chiết plasmid, v) Cắt kiểm tra sản phẩm cắt, vi) Xác định và
phân tích trình tự nucleotide.
2.2.4.2. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen
Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA mang gen Chit.
Vector tái tổ hợp được biến nạp bằng xung điện vào nấm men P. pastoris
X33 và hội nhập với genome tại điểm AOX1.
2.2.5. Nhóm phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế rệp, nấm của
chitinase và bào tử nấm L. lecanii
Nghiên cứu khả năng diệt rệp bằng bào tử nấm L. lecanii 43H.

- 9 -
Nghiên cứu khả năng nảy mầm của bào tử.
Nghiên cứu khả năng phát triển sợi nấm.
Khả năng ức chế sự phát triển nấm bệnh và rệp của chitinase.

2.2.6. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel và chương trình DNAStar.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc, kiểm tra và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ
nấm L. lecanii
3.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao
Trong tự nhiên, khả năng sinh tổng hợp chitinase từ các chủng nấm trong
cùng một loài là khác nhau. Do đó, quá trình sàng lọc, lựa chọn ra một
chủng nấm L. lecanii có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất là rất cần
thiết.
Kết quả khảo sát các chủng nấm L. lecanii nhận thấy, hoạt tính chitinase
từ chủng 43H sinh ra là cao nhất (đạt 0,449 U/ml), tiếp theo là chủng 1039
(đạt 0,381 U/ml) và chủng 1036 cho hoạt tính thấp nhất (đạt 0,300 U/ml).
Chủng nấm L. lecanii 43H được chọn để tổng hợp, tinh sạch, đánh giá tính
chất của chitinase tự nhiên và nhân dòng, biểu hiện chitinase tái tổ hợp.
3.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA
Trong bảo quản và giữ giống, chủng nấm L. lecanii 43H rất dễ bị nhiễm
các loài nấm khác có hình dạng và màu sắc tương tự. Để khảng định chắc
chắn chủng nấm này chính là L. lecanii, chúng tôi đã sử dụng đoạn gen 28S
rRNA để kiểm tra sự thuần khiết của chủng giống phục vụ cho các nghiên
cứu tiếp theo. Đoạn gen 28S rRNA của chủng nấm L. lecanii 43H đã được
chúng tôi phân lập bằng PCR từ DNA hệ gen sử dụng cặp mồi NL1 và NL4.
Sau khi điện di kiểm tra, sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 600
bp (Hình 3.2A). Sản phẩm PCR sau đó được gắn trực tiếp vào vector
pJET1.2/blunt hình thành plasmid tái tổ hợp pJ28S và biến nạp vào tế bào vi
khuẩn E. coli DH5. Các dòng biến nạp được nuôi cấy để tách plasmid.
Plasmid tái tổ hợp pJ28S có kích thước lớn hơn đối chứng (Hình 3.2B).
Plasmid tái tổ hợp được chọn lọc và cắt kiểm tra bằng XhoI và XbaI. Sản
phẩm cắt kiểm tra trên gel agarose 0,8% có 2 băng DNA kích thước khoảng
3 kb tương ứng với vector pJET1.2/blunt và băng còn lại có kích thước

khoảng 600 bp tương ứng với đoạn gen 28S rRNA (Hình 3.2C).


- 10 -
Đoạn gen 28S rRNA của chủng nấm L. lecanii 43H được xác định trình
tự nucleotide có kích thước 604 nucleotide.
Trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng nấm L. lecanii 43H được so
sánh với trình tự đoạn gen 28S rRNA của các loài đã đăng kí trên GenBank.
Kết quả cho thấy, trình tự đoạn gen 28S rRNA từ chủng nấm nghiên cứu có
quan hệ họ hàng gần gũi với một số loài thuộc chi Lecanicillium. Trong đó,
có độ tương đồng 99,8% với các chủng nấm Lecanicillium sp. VL7
(DQ849287.1), Lecanicillium sp. Vl-19 (AY312606.1). Trình tự đoạn gen
28S rRNA của chủng nấm L. lecanii 43H đã đăng kí trong GenBank với mã
số JX665044 và chứng minh chủng nấm nghiên cứu của chúng tôi là thuần
khiết không bị nhiễm tạp.

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản
phẩm PCR từ khuôn DNA của
chủng nấm L. lecanii 43H (A);
Sản phẩm Plasmid (B) và Sản
phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng
XhoI và XbaI (C)
Giếng 1: Sản phẩm PCR từ DNA,
giếng 2: pJET1.2/blunt, giếng 3:
pJ28S mang gen 28S rRNA,
giếng 4: sản phẩm cắt pJ28S bởi
XhoI và XbaI

3.1.3. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase
3.1.3.1. Thời gian sinh chitinase

Chủng L. lecanii 43H bắt đầu sinh chitinase sau 48 giờ nuôi (hoạt tính
đạt 0,323 U/ml), hoạt tính tăng khi tăng thời gian lên men và đạt cực đại sau
144 giờ, hoạt tính đạt 0,416 U/ml. Khi thời gian tiếp tục tăng thì sinh tổng
hợp enzyme lại giảm, hoạt tính còn 0,247 U/ml sau 240 giờ (Hình 3.4A).
A B


- 11 -
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian (A) và nhiệt độ (B) nuôi cấy
đến khả năng sinh tổng hợp chitinase

3.1.3.2. Nhiệt độ nuôi cấy
Chủng nấm L. lecanii 43H sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở 28°C (đạt
0,433 U/ml) khi khảo sát nhiệt độ lên men từ 28-37°C (Hình 3.4B).
3.1.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
A
B
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù (A) và nguồn nitơ (B)
đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
PT: pepton, CT: cao thịt, CS: casein, BĐT: bột đậu tương, UR: urê, Na:
NaNO
3
, KN: KNO
3
, NO: (NH
4
)
2
SO
4

, NN: NH
4
NO
3

Khi sử dụng chitin vào môi trường nuôi cấy sẽ tác động mạnh đến sinh
trưởng và sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm L. lecanii 43H. Kết quả
cho thấy, ở nồng độ chitin 0,75% hoạt tính chitinase sinh ra cao nhất, hoạt
tính đạt 0,51 U/ml, cao hơn so với lượng chitin ban đầu (0,5%) (Hình 3.5A).
3.1.3.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Hình 3.5B cho thấy, ở các nguồn nitơ khảo sát, hoạt tính chitinase đều
giảm so với đối chứng (pepton). Ở nguồn nitơ là pepton hoạt tính đạt 0,693
U/ml, tiếp theo là casein (hoạt tính đạt 0,523 U/ml) và thấp nhất là KNO
3
,
hoạt tính đạt 0,408 U/ml.
3.1.3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Ở nguồn cacbon là bột ngô hoạt tính chitinase đạt 0,789 U/ml, tiếp theo là
CMC (đạt 0,705 U/ml) và cao hơn so với môi trường chứa cao nấm men. Trong
môi trường có nguồn cacbon là glucose và bã sắn hoạt tính lần lượt là 0,311 và
0,319 U/ml, thấp hơn so với môi trường chứa cao nấm men (Hình 3.6A).
3.1.3.6. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy
Ở các pH môi trường khảo sát, khả năng sinh chitinase từ chủng nấm L.
lecanii 43H là khác nhau. Hoạt tính chitinase đạt cực đại ở pH 6,5 (đạt 0,73

- 12 -
U/ml), tiếp theo là các pH 4,0; 8,0 và 8,5 hoạt tính lần lượt đạt 0,649-0,676
U/ml. Ở pH 7,0 hoạt tính chitinase sinh ra thấp nhất đạt 0,513 U/ml (Hình
3.6B).
A

B

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A) và pH nuôi cấy (B) lên
khả năng sinh tổng hợp chitinase
Glu: glucose, BN: bột ngô, LN: lõi ngô, BM: bã mía, VL: vỏ lạc, VCP: vỏ cà
phê, TC: trấu cám, CMC: cacborxyl methyl cellulose, VQ: vỏ quýt, TB: tinh
bột, BS: bã sắn, CNM: cao nấm men, BĐT: bột đậu tương
3.1.3.7. Môi trường thay thế
Từ những kết quả trên, chúng tôi lựa chọn môi trường từ các nguyên liệu
có sẵn trong tự nhiên bằng cách giữ nguyên các thành phần khoáng trong
môi trường MT, thay cao nấm men bằng bột ngô với nồng độ 0,5%, nồng độ
chitin huyền phù là 0,75%. Khả năng sinh tổng hợp chitinase trong môi
trường thay thế tăng 1,63 lần so với môi trường MT.
3.2. Tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L.
Lecanii 43H
3.2.1. Tinh sạch chitinase
Hoạt tính chitinase đạt 92,11 U/mg protein sau khi tủa với muối
ammonium sulphate 65%, độ sạch 1,4 lần và hiệu suất thu hồi đạt 15,7%.
Chitinase sau khi tủa với muối ammonium sulphate được đưa qua cột
DEAE-Sephadex A-50. Chitinase đã được tinh sạch với độ sạch 2,5 lần và
hiệu suất thu hồi đạt 1,9%. Enzyme tinh sạch này có hoạt tính riêng đạt
167,5 U/mg (Bảng 3.1) và chỉ ra một băng protein duy nhất trên bản gel khi
nhuộm bằng AgNO
3
0,1%, khối lượng phân tử của protein này khoảng 33
kDa (Hình 3.7A). Dịch chitinase trước tinh sạch và các phân đoạn qua cột
có hoạt tính được định tính trên đĩa thạch có chứa chitin huyền phù 0,5%,

- 13 -
các giếng đều xuất hiện vòng phân giải chitin màu trắng sau khi nhuộm bằng

lugol 1,0% (Hình 3.7B). Như vậy, chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H đã
được tinh sạch.
Bảng 3.1. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng nấm L .lecanii 43H
Bước tinh sạch
Protein
tổng số
(mg)
Hoạt tính
tổng số
(U)
Hoạt tính
riêng
(U/mg)
Độ
sạch
(lần)
Hiệu
suất
(%)
Enzyme thô 0,800 52,800 66,00 1,0 100,0
Tủa muối (NH
4
)
2
SO
4
0,090 8,290 92,11 1,4 15,7
DEAE-Sephadex A-50 0,006 1,005 167,50 2,5 1,9

A

B
Hình 3.7. Hình ảnh
điện di SDS-PAGE của
chitinase từ chủng nấm
L. lecanii 43H (A) và
hoạt tính chitinase của
các phân đoạn trên đĩa
thạch có bổ sung chitin
huyền phù 0,5% (B)
Giếng 1: enzyme thô, giếng 2 và 4: enzyme tủa bằng muối ammonium
sulphate 65%, giếng 3; 5-9 ứng với các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex
A-50, M: chỉ thị phân tử.
3.2.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H
3.2.2.1. Xác định nhiệt độ và pH thích hợp
Chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H hoạt động ở dải nhiệt độ rộng từ
20-70C. Hoạt tính chitinase tăng dần từ 185,1 U/mg ở 20°C đến tối đa
663,9 U/mg ở 40°C và giảm dần đến 64,5 U/mg ở 70°C (Hình 3.8A).
Chitinase này cũng hoạt động ở dải pH rộng từ 3,5 đến 8,0. Hoạt tính
chitinase tăng dần từ 61,7 U/mg ở pH 3,5 đến tối đa 568,2 U/mg ở pH 6,0 và
giảm xuống đến 436,4 U/mg ở pH 7,5 (Hình 3.8B).
A B


- 14 -
Hình 3.8. Biểu đồ nhiệt độ (A) và pH tối ưu (B) của chitinase
3.2.2.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase
Chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H bền ở nhiệt độ 30, 37 và 40C sau
khi ủ trong 8 giờ và hoạt tính enzyme duy trì trên 80%. Hoạt tính chitinase
duy trì trên 40% sau khi ủ trong 60 giờ ở 30C và cao hơn ở 37 và 40C.
Hoạt tính chitinase giảm đáng kể sau khi ủ trong 84 giờ và mất hoạt tính ở

40C (Hình 3.9A).
A

B

Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện độ bền nhiệt (A) và độ bền pH (B) của chitinase
Enzyme này cũng bền ở pH 6,0 sau khi ủ trong 36 giờ và hoạt tính duy
trì 56% so với đối chứng. Trong khi đó, ở dải pH từ 4,0-5,0 và 7,0-8,0 hoạt
tính chitinase giảm mạnh so với đối chứng và hoạt tính còn lại thấp hơn
40% sau khi ủ trong 48 giờ (Hình 3.9B).

3.2.2.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA lên hoạt tính của chitinase
Các ion kim loại Ba
2+
, Cu
2+
, K
+
, Mg
2+
, Ni
2+
, Zn
2+
và EDTA ở nồng độ 5-
15 mM; ion Fe
2+
, Mn
2+
ở nồng độ 5-10 mM; ion Ca

2+
ở nồng độ 5 và 15 mM
làm tăng hoạt tính chitinase từ 44-126%. Trong khi việc bổ sung Ag
+
, Hg
2+
,
Al
3+
ở 3 nồng độ khảo sát làm giảm mạnh hoạt tính chitinase xuống còn một
nửa so với hoạt tính ban đầu (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính chitinase
% hoạt tính tương đối của chitinase ở các nồng độ Ion kim loại và
EDTA
5 mM 10 mM 15 mM
Ag
+
72,0 ± 2,3 56,0 ± 0,0 58,0 ± 1,4
Al
3+
62,0 ± 1,6 67,0 ± 4,0 56,0 ± 0,0
Ba
2+
113,0 ± 0,1 122,0 ± 4,6 156,0 ± 18,7
Ca
2+
115,0 ± 2,5 98,0 ± 4,8 166,0 ± 6,1
Cu
2+
130,0 ± 0,7 142,0 ± 8,7 156,0 ± 14,1

Fe
2+
131,0 ± 7,4 128,0 ± 2,6 71,0 ± 0,1

- 15 -
Hg
2+
56,0 ± 0,0 56,0 ± 0,0 56,0 ± 0,0
K
+
107,0 ± 6,8 102,0 ± 5,9 128,0 ± 1,3
Mg
2+
130,0 ± 0,3 123,0 ± 6,8 101,0 ± 1,3
Mn
2+
98,0 ± 8,2 113,0 ± 2,7 56,0 ± 0,0
Ni
+
135,0 ± 3,6 128,0 ± 10,2 157,0 ± 8,9
Zn
2+
144,0 ± 3,7 192,0 ± 5,6 226,0 ± 8,5
EDTA 156,0 ± 6,2 122,0 ± 6,5 101,0 ± 4,5
ĐC 100,0 ± 3,2
3.2.2.4. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính chitinase
Tác động của các chất tẩy rửa mang điện (SDS) và không mang điện
(Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và Triton X-114) hiện được sử dụng để
biến tính cấu trúc glycoprotein đã được nghiên cứu lên hoạt tính chitinase.
Việc bổ sung Tween 80 0,5%; Tween 20 1,0-2,0% và Triton X114 1,0% làm

tăng hoạt tính chitinase lên tới 25%. Trong khi, những chất tẩy rửa còn lại ở
các nồng độ khác làm giảm hoạt tính chitinase so với đối chứng. Đặc biệt,
việc bổ sung SDS 0,5-1,5% làm giảm đến một phần ba hoạt tính và ở nồng
độ cao hơn 2,0% hoạt tính chitinase bị ức chế hoàn toàn (Hình 3.10A).
A B
Hình 3.10. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của chất tẩy rửa (A) và dung môi hữu
cơ (B) của chitinase
CT: đối chứng; TW80: Tween 80, TW20: Tween 20, TX100: Triton X100,
TX114: Triton X114; MeOH: methanol, IsOH: isopropanol, EtOH: ethanol,
Acet: acetone, BtOH: n-butanol.

3.2.2.5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính chitinase
Các dung môi hữu cơ đã được sử dụng cho việc hòa tan các chất kị nước
trong phản ứng enzyme, do đó chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của các
dung môi hữu cơ khác nhau đối với enzyme. Việc bổ sung các dung môi
hữu cơ methanol, acetone ở nồng độ từ 10-30% làm ức chế nhẹ hoạt tính
chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H, hoạt tính chitinase duy trì từ 89-95%.
Hoạt tính chitinase giảm mạnh khi ủ chitinase với các dung môi hữu cơ

- 16 -
isopropanol, ethanol và butanol ở nồng độ từ 10-30%, đặc biệt là n-butanol
ở nồng độ 20% làm hoạt tính chỉ duy trì 37% so với đối chứng (Hình
3.10B).
3.2.2.6. Động học của phản ứng enzyme
Để đánh giá tính đặc hiệu của chitinase với cơ chất, hoạt tính chitinase
được xác định với chitin huyền phù ở các nồng độ khác nhau, và mối quan
hệ giữa 1/[S] và 1/V được thiết lập để tính giá trị K
m
và V
max

của enzyme
này theo phương trình Lineweaver-Burk. Giá trị Km và Vmax của chitinase
tinh sạch từ chủng nấm L. lecanii 43H lần lượt là 0,82 mg chitin huyền
phù/ml và 4,51 U/mg protein.
3.2.2.7. Sản phẩm của sự thủy phân enzyme với cơ chất
Sản phẩm chính của quá trình thủy phân chitin huyền phù bởi chitinase tinh
sạch từ chủng nấm L. lecanii 43H đã được xác định là N-acetyl glucosamine
trên bản TLC (Hình 3.11).

Hình 3.11. Phân tích TLC các sản phẩm thủy
phân chitin bởi chitinase
Giếng 1: chitinase tinh sạch, giếng 2: sản phẩm
thủy phân chitin huyền phù sau 96 h, giếng 3:
chitin huyền phù 0,5%, giếng 4: N-acetyl
glucosamine chuẩn
3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H
Sản phẩm PCR từ DNA hệ gen của chủng nấm L. Lecanii 43H thu được có
kích thước khoảng 1,4 kb. Sản phẩm PCR sau đó được gắn trực tiếp vào
vector pJET1.2/blunt hình thành plasmid tái tổ hợp pJEChit và biến nạp vào vi
khuẩn E. coli DH5. Plasmid tái tổ hợp pJEChit thu được có kích thước lớn
hơn đối chứng. Plasmid pJEChit được chọn lọc và cắt kiểm tra bằng enzyme
EcoRI và XbaI. Sản phẩm cắt kiểm tra trên gel agarose 0,8% có 2 băng DNA
kích thước khoảng 3 kb tương ứng với vector pJET1.2/blunt và băng còn lại
có kích thước khoảng 1,4 kb tương ứng với đoạn gen Chit (Hình 3.12).

Plasmid pJEChit được tách và tinh sạch để đọc trình tự nucleotide. Đoạn
gen Chit từ DNA của chủng nấm L. lecanii 43H được xác định có chiều dài
1429 nucleotide. Chủng nấm L. lecanii 43H là sinh vật nhân chuẩn và kết
hợp với khảo sát các trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase của các

- 17 -
nấm L. lecanii trên GenBank cho thấy gen mã hóa Chit từ nấm L. lecanii
43H có chứa 3 đoạn intron xen kẽ 4 đoạn exon. Kích thước của 4 đoạn exon
lần lượt là 140, 99, 50 và 980 pb và 3 đoạn intron lần lượt là 57, 51 và 52
bp. Trình tự gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H được đăng kí
trong GenBank với mã số JX665045. Trình tự đoạn gen Chit từ DNA của
chủng nấm L. lecanii 43H có độ tương đồng 99,9% so với nấm V. lecanii
(mã số GenBank là DQ412944.1).

Hình 3.12. Kết quả nhân dòng
gen Chit từ DNA hệ gen
Giếng M: marker, giếng 1: sản
phẩm PCR từ khuôn DNA,
giếng 2: pJET1.2/blunt, giếng 3:
pJEChit, giếng 4: sản phẩm căt
pJEChit bằng EcoRI và XbaI.

Để loại bỏ các intron trước khi đưa vào vector biểu hiện, gen Chit được
khuếch đại sau phản ứng RT-PCR từ mRNA. RNA tổng số của chủng nấm
L. lecanii 43H được dùng làm khuôn thực hiện phản ứng RT-PCR tạo
cDNA. Sản phẩm PCR từ khuôn cDNA được điện di trên gel agarose, có
kích thước ~1,3 kb đúng như lý thuyết. Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp
vào vector pJET1.2/blunt tạo plasmid tái tổ hợp pJEChit1 và biến nạp vào E.
coli DH5. Plasmid pJEChit1 thu được có kích thước lớn hơn đối chứng.
Sản phẩm cắt pJEChit1 cho 2 băng tương ứng với cDNA gen Chit1 (~1,3
kb) và pJET1.2/blunt (~3 kb) (Hình 3.15).
Trình tự cDNA gen Chit sau khi được giải trình tự có chiều dài 1269
nucleotide tổng đúng bằng kích thước của 3 đoạn exon từ gen DNA hệ gen.
Như vậy, cDNA gen Chit mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii dài
1269 nucleotide (bao gồm cả mã mở đầu và kết thúc), thuộc họ glycosyl

hydrolase 18 thủy phân liên kết glycoside. Trình tự amino acid suy diễn dài
423 amino acid, trong đó 20 amino acid đầu N là peptide tín hiệu (phân tích
bằng DNAStar và signal peptide SignalP-3.0
( Theo phân tích lý thuyết, protein
này có khối lượng phân tử khoảng 45 kDa, gồm 36 amino acid mang tính

- 18 -
base mạnh, 41 amino acid có tính acid mạnh, 147 amino acid kị nước và 126
amino acid phân cực.

Hình 3.15. Kết quả nhân
dòng gen Chit từ mRNA
Giếng M: marker, giếng 1:
sản phẩm PCR từ mRNA,
giếng 2: pJET1.2/blunt, giếng
3: pJEChit1 mang gen Chit từ
mRNA, giếng 4: sản phẩm
cắt pJEChit1

Trình tự amino acid suy diễn của rChit có độ tương đồng 100% so với
chitinase từ các nấm L. lecanii 432 (DQ412944), L. attenuatum
CGMCC5328 (KC904797); 99,8% với chitinase từ nấm C. confragosa
(KF041477) và 69-91% với chitinase từ nấm L. lecanii DAOM 175104
(AY705927) và T. roseum (GU361767) (Hình 3.16).
3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của rChit trong
nấm men P. pastoris X33
3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men
Plasmid pJEChit1 mang gen Chit và vector pPICZαA cùng được cắt
bằng EcoRI và XbaI. Sau đó được nối với nhau bằng T4 ligase tạo plasmid
tái tổ hợp pPIChit. Dịch lai được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α bằng

sốc nhiệt. Plasmid pPIChit có kích thước lớn hơn, nên nằm cao hơn so với
pPICZαA (Hình 3.17A). Plasmid pPIChit tinh sạch được cắt bằng enzyme
EcoRI và XbaI cho hai băng là vector pPICZαA (~3,6 kb) và cDNA gen
Chit (1269 bp) (Hình 3.17B).

Hình 3.17. Kết quả thiết kế cấu
trúc vector biểu hiện pPChit
Plasmid pPIChit (1), plasmid
pPICZαA (ĐC), sản phẩm cắt
pPIChit với EcoRI và XbaI (2),
sản phẩm cắt pPIChit với PmeI
(3), Marker 1kb (M)


- 19 -
Plasmid pPIChit được đọc trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu hiện trước
khi biến nạp và biểu hiện ở nấm men P. pastoris X33. Kết quả đọc trình tự
cho thấy cấu trúc của vector biểu hiện đúng khung đọc, cDNAgen Chit chèn
vào đúng vị trí mong muốn, đủ điều kiện để đưa vào biểu hiện trong nấm
men P. pastoris X33.
3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris
3.4.2.1. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris X33/pPChit
Plasmid tái tổ hợp pPIChit được cắt mở vòng bằng PmeI thu được 1 băng
có kích thước ~5,0 kb (ứng với kích thước của vecor pPICZαA và cDNA
gen Chit) (Hình 3.17C), sau đó được biến nạp vào genome của nấm men P.
pastoris X33 với mục đích tạo được chủng tái tổ hợp biểu hiện rChit hiệu
quả, bền và ổn định đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
Các dòng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường YPG bổ sung zeocin
qua đêm, tách DNA, sau đó PCR với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra. Một số
khuẩn lạc (1-4, 6-11) (Hình 3.18) có kích thước tương ứng với cDNA gen

Chit. Như vậy, có thể kết luận các dòng nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp
có chứa đoạn gen Chit.

Hình 3.18. Điện di sản phẩm
kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong
nấm men P. pastoris X33
ĐC: khuôn pPIChit, 1-11: khuôn
DNA từ các dòng tái tổ hợp, 12:
khuôn DNA của nấm men P.
pastoris X33 gốc, M:marker

3.4.2.2. Sàng lọc các dòng nấm men P. pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp
Sau khi biến nạp, 32 dòng tái tổ hợp được nuôi và xác định mức độ biểu
hiện rChit. Kết quả nhận thấy, 29 dòng có hoạt tính chitinase, 3 dòng không
có hoạt tính. Trong 29 dòng có hoạt tính chitinase, dòng 18 có hoạt tính cao
nhất (đạt 0,636 U/ml). Dòng 18 được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.3. Lựa chọn môi trường biểu hiện
Hoạt tính biểu hiện rChit cao nhất trong môi trường YP (đạt 0,753 U/ml).
Môi trường YP được chọn để biểu hiện rChit cho các nghiên cứu tiếp theo.

- 20 -
3.4.2.4. Lựa chọn nồng độ methanol
Mức độ biểu hiện rChit tăng dần khi tiếp methanol từ nồng độ 0-2,5% và
đạt cực đại ở nồng độ 1,5%, hoạt tính đạt 1,094 U/ml (Hình 3.19A). Trên
điện di đồ protein tổng số, băng 45 kDa ở nồng độ mathanol 1,5% rất đậm
(Hình 3.19B).

A B

Hình 3.19. Khả năng sinh tổng

hợp rChit của chủng tái tổ hợp
khi được cảm ứng ở các nồng
độ methanol khác nhau
A. Hoạt tính rChit và động thái
sinh trưởng

B. Điện di đồ kiểm tra protein
trong dịch ngoại bào
Giếng M: marker, giếng 1-5
ứng với nồng độ methanol lần
lượt là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5
3.4.2.5. Lựa chọn thời gian nuôi biểu hiện
Hoạt tính rChit cao nhất sau 96 giờ nuôi (đạt 1,11 U/ml) và giảm dần ở
120 giờ (đạt 1,05 U/ml) (Hình 3.20A). Trên điện di đồ protein tổng số, băng
45 kDa đậm dần theo thời gian nuôi (Hình 3.20B).


A B

Hình 3.20. Khả năng sinh tổng
hợp rChit ở các khoảng thời
gian khác nhau
A. Hoạt tính rChit và động thái
sinh trưởng
B. Điện di đồ kiểm tra protein
trong dịch ngoại bào
Giếng M: marker, giếng 1-5
ứng với thời gian 24; 48; 72; 96
và 120 giờ
3.4.3. Tinh sạch rChit

rChit từ nấm men P. pastoris X33 có hoạt tính 1,11 U/ml (hoạt tính riêng
đạt 11,21 U/mg protein). Dịch enzyme này được cô lại bằng cột Millipore
10 kDa có hoạt tính đạt 11,54 U/mg protein, độ sạch là 1 và hiệu suất thu
hồi đạt 92%. Dịch enzyme sau khi cô lại được đưa lên cột DEAE-Sephadex

- 21 -
A-50. rChit đã được tinh sạch với độ sạch 1,8 lần và hiệu suất thu hồi đạt
10%. rChit tinh sạch có hoạt tính 11,93 U/mg protein (Bảng 3.5) và chỉ ra
một băng protein duy nhất trên bản gel nhuộm bằng AgNO
3
0,1%, khối
lượng phân tử của protein này khoảng 45 kDa (Hình 3.21). Như vậy, rChit
từ nấm men P. pastoris X33 đã được tinh sạch.
Bảng 3.5. Kết quả tinh sạch rChit từ nấm men P. pastoris X33
Bước tinh sạch Protein
tổng số
(mg)
Hoạt tính
tổng số
(U/ml)
Hoạt tính
riêng
(U/mg)
Độ
sạch
Hiệu suất
(%)
Enzyme thô 4,95 55,5 11,21 1 100
Enzyme cô mẫu 4,41 50,9 11,54 1,0 92
DEAE- sephadex A50 0,27 5,4 19,93 1,8 10

Hình 3.21. Hình ảnh điện di SDS-
PAGE của rChit tinh sạch từ nấm
men P. pastoris X33
Giếng DN: dịch nổi, giếng LC: dịch
lên cột DEAE-Sephadex A50,
giếng 11-14, 16-18: ứng với các
phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex
A50 có hoạt tính chitinase lần lượt
là 11-14, 16-18. giếng M: marker.

3.4.4. Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P. pastoris X33
3.4.4.1. Xác định nhiệt độ và pH thích hợp của rChit
rChit từ nấm P. pastoris X33 hoạt động ở dải nhiệt độ rộng từ 20-65°C.
Hoạt tính chitinase tăng dần từ 15,79 U/mg protein ở 20°C đến tối đa 23,85
U/mg ở 40°C và giảm dần xuống 9,24 U/mg protein ở 65°C (Hình 3.22A). Ở
dải pH khảo sát, rChit bị mất hoạt tính hoàn toàn ở pH 3,5-4,0. Hoạt tính
chitinase tăng dần từ 12,53 U/mg protein ở pH 4,5 đến tối đa 18,78 U/mg
protein ở pH 5,5 và giảm xuống đến 11,85 U/mg protein ở pH 8,0 (Hình 3.22B).
A B

- 22 -
Hình 3.22. Đồ thị nhiệt độ tối ưu (A) và pH tối ưu (B) của rChit
3.4.4.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit
Hoạt tính rChit giảm không đáng kể ở 30 và 35°C sau 20 giờ ủ, hoạt tính
duy trì trên 90%. Trong khi ở 40°C, hoạt tính rChit chỉ còn 40% (Hình
3.23A). Ở pH 6,0 hoạt tính rChit còn 80% sau16 giờ ủ. Trong khi, ở dải pH
7,0-8,0 hoạt tính rChit mất hoàn toàn sau 4 giờ ủ (Hình 3.23B). Như vậy,
rChit bền ở dải nhiệt độ dưới 35°C và pH 6,0.

A

B

Hình 3.23. Đồ thị thể hiện độ bền nhiệt (A) và độ bền pH (B) của rChit
3.4.4.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA tới hoạt tính rChit
Hoạt tính rChit tăng lên khi bổ sung các ion Pb
3+
, Co
2+
ở nồng độ 5-15 mM;
các ion Cu
2+
, Fe
2+
ở nồng độ 5-10 mM và các ion K
+
, Ca
2+
, Ba
2+
, Mn
2+
ở nồng
độ 15 mM, hoạt tính tăng từ 1-21%. Trong khi, các ion này ở nồng độ còn lại
làm giảm không đáng kể hoạt tính rChit. Đặc biệt, các ion Ag
+
, Al
3+
, Hg

2+
và
EDTA ở cả 3 nồng độ khảo sát đều làm giảm hoạt tính rChit, hoạt tính giảm
mạnh ở nồng độ 15 mM (hoạt tính chỉ còn 27%) (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit
% hoạt tính tương đối của chitinase ở nồng độ
Ion kim loại và
EDTA
5 mM 10 mM 15 mM
K
+
99,0 ± 0,2 99,0 ± 0,2 100,0 ± 0,2
Zn
2+
99,0 ± 2,7 99,0 ± 2,7 96,0 ± 0,4
Ni
2+
99,0 ± 1,9 99,0 ± 1,9 87,0 ± 2,1
Ca
2+
99,0 ± 2,0 99,0 ± 2,0 121,0 ± 9,0
Ba
2+
96,0 ± 0,9 96,0 ± 0,9 102,0 ± 3,1
Mg
2+
79,0 ± 5,0 73,0 ± 4,3 59,0 ± 4,4
Mn
2+
85,0 ± 3,1 101,0 ± 7,0 105,0 ± 1,9

Fe
2+
108,0 ± 1,2 101,0 ± 4,4 94,0 ± 0,1
Cu
2+
106,0 ± 0,6 111,0 ± 2,8 99,0 ± 0,9
Co
2+
114,0 ± 1,8 110,0 ± 5,1 110,0 ± 4,6
Pb
3+
112,0 ± 3,8 102,0 ± 3,2 105,0 ± 3,7

- 23 -
Ag
+
35,0 ± 1,7 27,0 ± 0,0 27,0 ± 0,0
Al
3+
87,0 ± 1,4 34,0 ± 0,4 37,0 ± 0,3
Hg
2+
89,0 ± 2,0 32,0 ± 1,1 27,0 ± 0,3
EDTA 77,0 ± 0,5 73,0 ± 1,5 65,0 ± 3,7
ĐC 100,0 ± 2,5

Như vậy, các ion ở nồng độ khác có ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme là khác
nhau. Hầu hết các ion ở nồng độ càng cao, hoạt tính của enzyme càng bị giảm.
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này ion Mn
2+

ở nồng độ 15 mM lại xúc tác hoạt
tính rChit, cao hơn so với ở nồng độ 5 mM.

3.4.4.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ
Việc bổ sung acetone 10% làm tăng mạnh hoạt tính rChit lên đến 20%.
Trong khi, bổ sung methanol, isopropanol, ethanol 10% và n-butanol 20%
cho thấy một sự thay đổi nhỏ lên hoạt tính ban đầu. Đặc biệt, hoạt tính rChit
chỉ còn lại 38-60% so với hoạt tính ban đầu khi rChit được xử lý với các
dung môi hữu cơ ở nồng độ 30% (Hình 3.24A).

3.4.4.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa
Các chất tẩy rửa Tween 80; Tween 20 0,5-2,0% và Triton X114 0,5%
làm tăng hoạt tính rChit so với đối chứng, cao nhất là Tween 80 1,0% làm
tăng hoạt tính lên 13%. Trong khi, bổ sung Triton X100 0,5-2,0% và Triton
X114 1,0-2,0% làm giảm nhẹ hoạt tính rChit so với đối chứng. Đặc biệt, khi
bổ sung SDS 0,5-2,0%, hoạt tính rChit bị ức chế mạnh, hoạt tính duy trì từ
27-40% so với ban đầu (Hình 3.24B).
A B

Hình 3.24. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ (A) và chất tẩy rửa (B) lên hoạt
tính rChit
CT: đối chứng; TW80: Tween 80, TW20: Tween 20, TX100: Triton X100,
TX114: Triton X114; MeOH: methanol, IsOH: isopropanol, EtOH: ethanol,

- 24 -
Acet: acetone, BtOH: n-butanol
3.4.4.6. Động học của rChit
Giá trị Km và Vmax của rChit tinh sạch từ nấm men P. pastoris X33 là
0,77 mg chitin huyền phù/ml và 1,33 U/mg protein.
3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và bào

tử từ nấm L. lecanii
3.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây trồng
Chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H có khả năng ức chế sự phát triển của
nấm bệnh F. oxysporum và R. solani (Hình 3.25). Đường kính vòng ức chế của
2 chủng nấm này lần lượt là 0,54 và 0,44 cm, trong khi ở giếng đối chứng (bổ
sung nước) không xuất hiện vòng ức chế.

Hình 3.25. Ức chế sự
phát triển của nấm
bệnh F. oxysporum
(A) và R. solani (B)
bởi chitinase từ chủng
nấm L. lecanii 43H
Giếng 1: nước, giếng
2-5: chitinase
Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 160× cho thấy, sự ức chế quá
trình phát triển sợi nấm bởi chitinase đi kèm với sự thủy phân sợi nấm và giải
phóng các tế bào riêng lẻ, trong khi sợi nấm được xử lý với nước vẫn duy trì
hình dạng (Hình 3.26). Lượng đường N-acetyl glucosamine giải phóng khi xử
lý nấm bệnh F. oxysporum và R. solani với chitinase được xác định lần lượt là
11,07 và 9,18 μg/ml.



Hình 3.26. Sợi nấm của R. solani (A, B) và F. oxysporum (C, D) được xử lý
với nước (A, C) và với chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H (B, D)

- 25 -
3.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp
rChit từ nấm men P. pastoris X33 có khả năng thủy phân lớp vỏ chitin

của rệp. Lượng đường N-acetyl glucosamine giải phóng khi xử lý rệp với
chitinase được xác định là 32,5 μg/ml. Quan sát dưới kính hiển vi ở độ
phóng đại 160× cho thấy, sự thủy phân lớp vỏ chitin của rệp bởi chitinase đi
kèm với sự giải phóng các khối chitin riêng lẻ, trong khi rệp được xử lý với
nước vẫn duy trì hình dạng của lớp vỏ chitin (Hình 3.27).
A B
Hình 3.27. Hỗn hợp
chitin của rệp được
xử lý với nước (A) và
rChit từ nấm men P.
pastoris X33 (B)
(phóng đại 160 lần)
3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới tốc độ phát triển sợi nấm của đa số các loài
nấm. Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy, ở 25°C chủng nấm L. lecanii 43H
cho đường kính phát triển sợi nấm đạt 12,8 mm/ngày cao hơn so với ở nhiệt
độ 30°C (đường kính đạt 7,22 mm/ngày). Như vậy, tốc độ phát triển sợi nấm
của chủng nấm L. lecanii 43H phụ thuộc đáng kể vào nhiệt độ và thích hợp
ở dải nhiệt độ dưới 30°C.
3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm
Kết quả cho thấy, chủng nấm L. lecanii 43H cho tỉ lệ bào tử nảy mầm
cao nhất ở nhiệt độ 25°C (đạt khoảng 92%) sau 12 giờ ủ. Sau 24 giờ ủ ở cả 3
nhiệt độ khảo sát, hầu hết bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H đều nảy
mầm, tỉ lệ đạt 98% (Hình 3.28).

Hình 3.28.
Ảnh hưởng của
nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm
của bào tử nấm L. lecanii
43H