ĐƠN VỊ HOẠT TÍNH ENZYME_ ỨNG DỤNG HOẠT TÍNH ENZYME TRONG PHÂN TÍCH VÀ CHẾ BIẾN THỰC PHẨM - TIỂU LUẬN MÔM HÓA SINH

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
TIỂU LUẬN HÓA SINH :
ĐƠN VỊ HOẠT TÍNH ENZYME_
ỨNG DỤNG HOẠT TÍNH ENZYME
TRONG PHÂN TÍCH VÀ CHẾ BIẾN
THỰC PHẨM.
GVHD : NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG
SVTH : ĐHTP6ALT_NHÓM 24
DANH SÁCH SVTH :
NGUYỄN THỊ THẢO QUYÊN 10323501
NGUYỄN THỊ THANH LỆ 10320701
PHẠM XUÂN TÍN 10323011
NGUYỄN THỊ MỸ THỎA 10377471
ĐINH THỊ BÍCH TUYỀN 10306811
PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 10322281
TIỂU LUẬN HÓA SINH :
ĐƠN VỊ HOẠT TÍNH ENZYME_
ỨNG DỤNG HOẠT TÍNH ENZYME
TRONG PHÂN TÍCH VÀ CHẾ BIẾN
THỰC PHẨM.
1

 !"#
$%&'(%$)*!+%
,-+'
%.!'/!+(%
-0"#12
%3!(14'%2
%.3!56'7(+8!(9'+:
';'$23!<

=!>+?;'-0-42@
'A'A(-0B0<)*+#1CD-0(-0
B02E#'A'A-$!#E+D-0!$
%F!$%'A'A+? )G
2
- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng.
- Các quá trình hoá học xảy ra trong cơ thể sống là những phản ứng có
hiệu quả cao nhất. Đó là nhờ tác dụng xúc tác của enzyme, enzyme là
những chất xúc tác sinh học, có thể là protein hoặc acid nucleic, có đầy
đủ tính chất của chất xúc tác, ngoài ra còn có những tính chất ưu việt
hơn so với các chất xúc tác khác như: hiệu suất cao trong điều kiện nhiệt
độ và áp suất bình thường, có tính chất đặc hiệu cao. Các tính chất này
vẫn được giữ nguyên khi tách enzyme ra khỏi hệ thống sống, hoạt động
trong điều kiện invitro (trong ống nghiệm). Vì vậy mà enzyme càng được
sử dụng rộng rãi trong thực tế, trong công nghiệp… nên đã hình thành
nên nhiều ngành lien quan đến enzyme như công nghệ sản xuất enzyme,
công nghệ sản xuất các thiết bị có phẩn tử enzyme như biosensor (các
thiết bị cảm biến sinh học)… để khai thác và sử dụng hiệu quả cần có
kiến thức nhất định về enzyme.
3
1.2 Danh pháp - Cấu tạo - Phân loại:
1.2.1 Danh pháp:
- Tên enzyme = tên cơ chất + ase
Ví dụ: enzyme thuỷ giải protein: protease, enzyme phân huỷ nucleic :
nuclease…, enzyme tổng hợp DNA : DNA-polymerase

Bên cạnh đó còn có những tên thông thường,ví dụ như ligase(enzyme
nối, trong quá trình tự sao DNA), amylase (enzyme thuỷ phân tinh
bột,có trong dịch ruột)…
1.2.2 Cấu tạo:

Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000
dalton (có kích thước nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton)
Enzyme được cấu tạo từ các L – α – axitamin kết hợp với nhau bởi liên
kết peptit. Dưới tác dụng của các peptithydrolase, axit hoặc kiềm các
enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các L – α – axitamin.
Trong nhiều truờng hợp ngoài axit amin còn thu được những thành
phần khác, người ta chia thành hai nhóm:
- Nhóm enzyme đơn cấu tử (enzym đơn giản): enzyme chỉ được cấu tạo
một thành phần hóa học duy nhất là protein.
4
- Nhóm enzyme đa cấu tử (enzym phức tạp): enzyme có hai thành phần:
+ Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme. Apoenzyme thường
quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của
coenzyme.
+ Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”: như ion kim loại,
vitamin, glutation dạng khử, nucleotide và dẫn xuất este phosphat của
monosacaride, Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần “apoenzyme”
(khi cho thẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì những
agon đó còn có tên riêng là coenzyme. Phần agon quyết định kiểu phản ứng
mà enzyme xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền
của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính.
Đa số enzyme thuộc loại enzyme đa cấu tử. Hiện nay người ta cũng đã xác
định được rằng phần lớn các enzyme trong tế bào là những protein có cấu
trúc bậc bốn. Ở những điều kiện xác định, phân tử của chúng có thể phân ly
thuận nghịch tạo thành các phần dưới đơn vị (protome), khi đó hoạt độ
enzyme bị giảm hoặc bị mất hoàn toàn. Ở những điều kiện thích hợp các
phần dưới đơn vị lại có thể kết hợp lại với nhau và hoạt độ xúc tác của
enzyme được phục hồi.
5
1.2.3 Trung tâm hoạt động của enzym :

Trung tâm hoạt động : chỉ có 1 phần rất nhỏ của enzyme tham gia phản
ứng, phần này gọi là trung tâm hoạt động, số trung tâm hoạt động có thể
lớn hơn 1.
1.2.4 Phân loại:
Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, từ năm 1960 Hội hoá sinh quốc tế
(IUB) đã thống nhất phân loại enzyme thành 6 lớp, đánh số từ 1 đến 6. Các số
thứ tự này là cố định cho mỗi lớp:
- Oxydoreductasa: các enzyme xúc tác cho pảhn ứng oxy hoá – khử, có nghĩa là
chúng vận chuyển các nguyên tử Hydro hoặc điện tử của chúng từ cơ chất của
chúng sang các phần tử nhận.
- Transpherasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị
- Hydrolasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân
- Liasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nuớc, loại nuớc tạo
thành liên kết đôi hoặc kết hợp phân tử nuớc vào liên kết đôi.
- Izomerasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hoá.
- Ligasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng
luợng ATP…, ligasa giúp cho sự tổng hợp nên Hydro carbon, protein và các
đại phân tử khác.
6
2.1 Đơn vị họat tính là đơn vị để:
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian
nhất định ứng với 1 nồng độ enzyme xác định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay
sản phẩm tương ứng với 1 nồng độ enzyme xác định.

Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự
biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
2.2 Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme:
Phản ứng do enzyme có thể khái quát đơn giản hóa bằng phương trình
phản ứng:

Có thể xác định hoạt độ enzyme bằn gcách phân tích sự biến đổi theo
thời gian trong điều kiện phàn ứng xác định của: cơ chất còn lại; hoặc sản
phẩm tạo thành; hoặc cả cơ chất và sản phẩm. Tùy theo đặc trưng của
phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp, yêu cầu về độ chính xác, điều kiện
của phòng thí nghiệm…mà chọn cách xác định phù hợp nhất.
7
2.3 Điều kiện phản ứng khi tiến hành xác định hoạt độ enzyme:
Trong phản ứng xác định hoạt độ enzyme, cần sử dụng cơ chất và cofactor ở
mức dư thừa (nếu enzyme cần cofactor) và thời gian xác định càng ngắn
càng tốt.
Cần phải chọn lựa các điê2u kiện sao cho có được sự biến đổi tuyến tính giữa
nồng độ enzyme, thời gian phản ứng và mức độ chuyển hóa cơ chất (trong
giới hạn nồng độ cơ chất đa lựa chọn). Một số enzyme bị ức chế bởi cơ chất ở
nồng độ quá cao; hoặc bị giảm hoạt độ nhanh chóng theo thời gian ở nhiệt
độ phân tích. Do đó phản ứng phân tích nên thực hiện trong khoảng thời
gian nhất định và nồng độ enzyme lẫn cơ chất thích hợp.
8
2.4 Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme:
•
Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân
tích ở vùng thích hợp.
•
Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định,
nên phải dùng một loại đệm hay một hệ thống đệm thích hợp nào đó.
Nồng độ đệm thường dùng là 20-50 nM. Tuy vậy các phản ứng sinh acid,
base cần phải dùng đệm ở nồng độ cao hơn tránh thay đổi pH trong quá
trình thí nghiệm.
•
Cơ chất và sản phẩm, đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp
xúc với nhau để bắt đầu phản ứng. Nếu phân tích nhiều mẫu, thời gian

bắt đầu và kết thúc phản ứng phải duy trì như nhau. Luôn có mẫu kiểm
tra thích hợp để tránh sai sót.
•
Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp, tránh làm
biến đổi cơ chất hay sản phẩm cần đo; hay can thiệp quá mạnh vào phép
định lượng sản phẩm phản ứng
9
2.5 Các yếu tố ảnh hưởng dến hoạt tính enzyme :
2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Hoạt động của enzym lệ thuộc khá rõ vào nhiệt độ của môi
trường. Ở nhiệt độ cao (> 70 - 800C) enzym bị tê liệt và phá
huỷ do rối loạn về cấu trúc phân tử bậc 2, 3 làm hỏng trung
tâm hoạt động được tạo nên từ các acid quan trọng và nhóm
ghép. Nếu tác động của nhiệt chưa thật sâu sắc thì enzym có
khả năng khôi phục lại cấu trúc và do đó hoạt động xúc tác
của enzym vẫn còn.

Nhưng nhiệt độ quá thấp (gần hoặc dưới O0C) hoạt động của
enzym yếu dần và hầu như dừng hẳn lại nhưng enzym không
bị phá huỷ.ứng dụng trong việc bảo quản thực phẩm dễ hỏng
ở tủ lạnh.

Đa số các chất enzym ở động vật có hoạt độ cao nhất ở điều
kiện thân nhiệt (37 - 400C).sự tăng nhiệt độ ở giới hạn thích
hợp (35 - 500C) Có tác dụng kích thích hoạt động của enzym
tức là kích thích quá trình trao đổi vật chất.
10
2.5.2 Ảnh hưởng của pH
Enzym rất nhạy cảm đối với phản ứng môi trường và mỗi enzym có

vùng pH hoạt động tết nhất riêng cho mình. Sở d có ảnh hưởng của
độ pH đến hoạt độ của enzym là vì enzym có nguồn gốc protein nên
khi pH thay đổi sẽ ảnh hưởng tới độ phân ly các nhóm chức cấu trao
nên trung tâm hoạt động của enzym như OH, SH
Độ pH thích hợp của một số enzym thường gặp: Pepsin dịch vị 1,5 - 2,5
- Trypsin dịch tụy 7,8 - 9,5
- Amylase nước bọt 6,8 - 7,2
- Lipase dịch tụy 7,0 - 8,0
- Phosphatase huyết thanh 9,0 - 10,0
Trong nhiều trường hợp, khi pH thay đổi thì hướng xúc tác thuận
nghịch của enzym cũng bị đảo ngược.
11
2.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ enzym và cơ chất
* Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Đặc điểm chung của các chất xúc tác là với một lượng rất nhỏ, cũng có khả năng
thực hiện phản ứng cho một lượng cơ chất lớn gấp nhiều lần.
Tuy nhiên tốc độ phản ứng cũng phụ thuộc vào cơ chất, nếu nồng độ đó thấp thì
tốc độ enzym xúc tác chậm dần, nhưng nếu nâng nồng độ lên mãi thì đến một
lúc tốc độ xúc tác thôi không tăng vì nó đã đạt được tối đa (Vmax) lúc này
phản ứng lập hợp chất trung gian (ES) và giải phóng sản phẩm (ES → E + P)
tiến hành nhanh nhất.
Người ta dùng hằng số Michaelis- Men ten để biểu diễn trạng thái phân ly của ES.
Hằng số Michaelis- Men ten Khi (molllit) là nồng độ cơ chất cần để một enzym
tương ứng hoạt động với tốc độ bằng 1/2 tốc độ tối đa nói trên tức là: Vmax/2
12
* Ảnh hưởng của nồng độ enzym
Nồng độ của enzym cũng có tác dụng quan trọng đối với tốc độ xúc tác. Nói
chung trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính
vào nồng độ enzym: V=k [E].
Trong đó: V là tốc độ phản ứng, [E] là nồng độ enzym

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzym quá lớn, tốc độ phản ứng tăng
chậm Theo qui định quốc tế, đơn vị enzym là số lượng enzym có khả năng
xúc tác phản ứng biến đổi 1 micro-phân tử gam trong 1 phút ( 1 ~l -
mollphút) ở những điều kiện cụ thể cho trước như to , pH . .
2.6 Cơ chế hoạt động của enzyme trong phân tích thực phẩm:
Muốn cho phản ứng xảy ra thì enzyme phải gắn vào trung tâm hoạt động
của enzyme tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES). Trung tâm hoạt
động của enzyme có nhóm hóa học đặc biệt trực tiếp tham gia vào cơ chế
xúc tác. Dưới tác dụng của enzyme, hoạt tính hóa học tăng lên rõ rệt và do
đó chỉ cần một năng lượng hoạt hóa nhỏ hơn nhiều cũng đủ làm cho phản
ứng xảy ra tức thì để biến cơ chất thành sản phẩm. Từ đó, ta xác định được
lượng chất cần phân tích.
Tác dụng của enzyme khác những chất xúc tác khác là ở chỗ làm giảm năng
lượng hoạt hóa của phản ứng làm tăng nhanh tốc độ phản ứng. Một số yếu
tố dẫn đến sự hoạt hóa của enzyme trong phân tích thực phẩm:
13
- Enzyme có thể kết hợp với cơ chất theo một cách thức sao cho liên kết cảm thụ
của cơ chất được tiếp cận với các nhóm hoạt động của enzyme và được định
hướng chính xác với các nhóm ấy. Quá trình này có thể gây ra sự biến đổi cấu
trúc và quỹ đạo điện tử của cơ chất là cho phức hợp ES rơi vào trạng thái hoạt
hóa.

Một số enzyme có thể kết hợp với cơ chất bằng liên kết đồng hóa trị tạo ra một
hợp chất trung gian có hoạt tính cao nhờ vậy năng lượng hoạt hóa của phản ứng
hóa học sẽ giảm đi và cơ chất có thể dễ dàng tham gia phản ứng và tạo thành sản
phẩm.
2.7 Phưong pháp xác định hoạt tính enzyme
2.7.1 Phân tích liên tục: là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản
phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian. Tuy nhiên yêu cầu đối với thiết
bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt đây là mặt hạn chế của phương pháp. Đồng

thời, do phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó
thực hiện phân tích hoạt độ nhiều mẫu enzyme cùng lúc.
14
2.7.2 Phân tích gián đoạn:
Một số phương pháp xác định:
• Phương pháp đo độ nhớt:
Dùng nhớt kế đo sự biến đổi độ nhớt của dung dịch phản ứng.
Áp dụng với các enzyme mà cơ chất có độ nhớt cao hơn hẳn so với
sản phẩm (chất có phân tử lớn như acid nucleic, protein,
cellulose…).
• Phương pháp phân cực kế:
Sử dụng khi cơ chất và sản phẩm có khả năng làm quay mặt
phẳng ánh sáng phân cực và có góc quay riêng khác nhau.
• Phương pháp đo áp suất hay áp kế:
Dùng với các phản ứng enzyme có sự tiêu hao hay sinh khí, như
các phản ứng oxy hóa, decarboxyl hoá, loại amin hóa. Phản ứng
sinh hay tiêu hao khí có thể trực tiếp hay gián tiếp.
15
• Phương pháp quang phổ kế:
Được sử dụng phổ biến hiện nay, dựa trên khả năng hấp thu ánh
sáng ở các bước sóng xác định của cơ chất, hoặc sản phẩm phản ứng.
• Phương pháp chuẩn độ:
Dùng cho các phản ứng enzyme có sự hình thành acid hoặc base.
Phương pháp yêu cầu giữ pH môi trường cố định, lượng kiềm hoặc
acid chuẩn dung để chuẩn độ theo thời gian phản ánh hoạt độ
enzyme.
• Phương pháp sắc ký:
Sử dụng sắc ký để phân tách sản phẩm phản ứng, như tách amino
acid sau khi cho hai enzyme aminotranspherase lên cơ chất hay
protein tác dụng lên cơ chất và sau đó dịnh lượng các amino acid thu

được. Đây là phương pháp tốn nhiều thời gian, ít sử dụng.
16
• Phương pháp hóa học:
Dùng các phản ứng hóa học để định lượng cơ chất mất đi hay lượng
sản phẩm tạo thành. Thông thường phải chọn phản ứng tạo nên các
phức chất màu có độ hấp thu ánh sáng cực đại ở vùng nào đó để từ đó
định lượng hợp chất này. Phương pháp định lượng cơ chất còn lại hay
sản phẩm tạo thành có thể đơn giản là sự đo cơ chất còn lại hay sản
phẩm tạo thành một cách trực tiếp. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp,
có thể đo một cách gián tiếp và do đó phép đo phức tạp hơn.
• Phương pháp phóng xạ:
Dựa trên sự hình thành các bức xạ của các chất đồng vị phóng xạ
gắn vào cơ chất tại nhóm chức thích hợp để có thể đo độ phóng xạ (sự
phân rã) của cơ chất còn lại, hay sản phẩm tạo thành. Thường áp dụng
xác định hoạt độ các enzyme mà các phương pháp thông thường ko thể
đo được. Có thể kết hợp phương pháp điện di với phương pháp phóng
xạ để xác định hoạt độ enzyme.
17
• Phương pháp huỳnh quang:
Dựa trên sự phát quang của một số hợp chất dưới tác dụng của một
nguồn sang kích thích đặc trưng. Mức độ phát huỳnh quang được đo
nhờ máy huỳnh quang kế. Đây cũng là phương pháp cho độ nhạy cao,
cho phép phát hiện hoạt độ enzyme ở mức độ thấp.
Bên cạnh những phương pháp phân tích hoạt độ có tính định lượng
nêu trên, nhiều trường hợp phân tích định tính hay bán định lượng
cũng được sử dụng để nhanh chóng bước đầu xác định sự có mặt của
enzyme. Thường được dung hơn hết là phương pháp khuếch tán trên
đĩa thạch có chứa đệm và cơ chất (tinh bột với amylase, casein với
protease…) sau đó nhuộm màu (iod nhuộm với tinh bột, xanh
coomassie hay amido đen với casein…) để phát hiện hay đánh giá hoạt

độ enzyme qua vòng phân giải cơ chất.
HI=CJKLMNOPQR=KIFSTMUVH=P&WMXYZMX
 !"#
$%"&'()*%+,"#$ 
+"/!%"&0'()1),*)2 
-3

4567489:;4<
=>
9?"@

9+9'ABC9+,B'A49:D)EC)F)G
&
4749:?)#
 
H!)GI"&9+ J6
! "#$%39+ "#K:'A,B1D)4!
())
&'(;J9))I@
)*+;+*L*-*MMN9)-'!@3
,-;9-9-@3
.;0!"@3
.;0!"@3
[\FKOMPFT]^QPVY]T=
a. Glucose
Y'+_T=` TY`_'+a+

b. Fructose
Y'+_T=`hexokinaseTY`_b'+a+


b'+a+Glucose phosphate isomeraseX'+a+
c. Galactose:

Y5_MTYP_P
_
Galactose dehydrogenase Y+_MTY
_
d. Manose:
Y+_T=`hexokinase TY`_H+a+
H+a+Phosphomanose isomerasb'+a+

+

X'+a+_MTY`
_
Glucose 6-phosphate-dehydrogenase
Y'a+_MTY`P_P
_

&*/&
L!-OH
P
QP- FructosidaseR=9-OR=S!-
T9-OH
P
Qα- GlucosidaseP=RU9-
0/&
V-OH
P
Qβ – Galactosidase R=9-OR=9-

12/&
WX-OHPQα – GalactosidaseR=9-O-!-
3
Y)1O;U4@H
P
QAmyloglucosidas&UR=9-

[\FKOMPTFcYPdeFL
-&!
ZOZY[O\ZAcetyl-CoA synthetase Z9=\ZOZT[O
[!"-"

Z9=\ZOQ9OH
P
QCitrate-dehydrogenase )!O\Z

V=9O0ZR
O
L-malate dehydrogenase 9O0ZRHOH
O
-/!
VU-!1))*;]H
P
@OTYY4'***!-!1))*;]@O
SOH
O
Z-1'A)I"3
V=-!1))*O^Ascorbate oxidaseR*!-!1))*OHPQ
-/#!
V=Z-"!O_=9!,53Q9OV=9

Q9O0ZRHOH
O
LMDHV=9O0ZRO
!6!
\)!Citrate (pro 35) lyase Q9O


&78!
`!O0ZROOH
P
QFomate dehydrogenase H*!!1O0ZRHO
H
O
Sa9))*3
R=9OZY[ gluconate kinaseR=9>="-"OZR[
R=9=>="-"O0ZR[
O
6.PGDH R=!)19-=b="-"O
0ZR[H
O
OH
O
O\Q
P

,8!
V=9O0ZR
O
OH
P

QGlutamate dehydrogenase Z=Q9!O
0ZRHO0Hc
O
-!/
R=)-)!O0ZR[
O
Iso-citrate dehydrogenase Z=Q9!O
0ZR[HO\Q
P
OH
O
-!0
VU9O0ZR
O
L-lactate dehydrogenas[!O0ZRHOH
O




RU9O0ZR
O
L-lactate dehydrogenase[!O0ZRHOH
O
9-!'
V=9O0ZR
O
L-lactate dehydrogenaseQ9O0ZRHOH
O


Q9OV=9GOT V=-"!OZ=9!
-!5:
Q9oxalate dehydrogenase`!O\Q
P
8-!4;
[!O0ZRHOH
O
L-lactate dehydrogenase V=9O0ZR
O
-!*

L)O6Y[O\ZSuccinyl- CoA-synthetase 6R[O-)9=\ZO[
6R[O[d[Pyruvat kinase 6Y[O"!

 

