Quy trình định tính salmonella

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI:
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
GVHD: PHAN THỊ KIM LIÊN
NHÓM: 05
TP. HCM, THÁNG 4 NĂM 2014
DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM
ĐOÀN NGỌC TÂM THIỆN
NGUYỄN THỊ ÁI LY
PHAN THỊ KIM NGÂN
NGUYỄN TIẾN PHƯỚC
NỘI DUNG
TÌNH
HÌNH
NGỘ
ĐỘC
THỰC
PHẨM
ĐẶC
ĐIỂM
VI
KHUẨN
QUY
TRÌNH
ĐỊNH
TÍNH
TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC DO SALMONELLA


Trên thế giới, mỗi năm nhiễm khuẩn salmonella từ thực phẩm xảy
ra ở 1.4 triệu người với 95% các trường hợp có triệu chứng ngộ
độc.

Các nguồn gốc chung của ngộ độc thực phẩm salmonella là các
thực phẩm sống hoặc chưa nấu chín như trứng sống, trứng húp,
sữa chưa được tiệt trùng, nước chưa được đun sôi kỹ, các sản
phẩm từ thịt và từ gia cầm chưa chín kỹ.
Salmonella
xâm nhập vào
cơ thể????
•
Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín.
•
Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa
bảo quản không tốt)
•
Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm
cao.
•
Khi tiếp xúc với người bị nhiễm salmonella hoặc
phân người và súc vật có nhiễm salmonella.
•
Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”
•
Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín.
•
Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa
bảo quản không tốt)
•

Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm
cao.
•
Khi tiếp xúc với người bị nhiễm salmonella hoặc
phân người và súc vật có nhiễm salmonella.
•
Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”
TRIỆU
TRIỆU
CHỨNG
CHỨNG

Tiêu chảy, đau bụng, buồn ói và ói, sốt, đau đầu,
…

Thường xảy ra khoảng 12-36h sau khi ăn.

Các triệu chứng có thể kéo dài từ 2 ngày đến 1
tuần
TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC DO SALMONELLA
Biện pháp ngăn chặn nhiễm khuẩn do Salmonella:
•
Hạn chế ăn trứng sống và chưa nấu chín. Hạn chế hoặc
tránh món ăn có chứa trứng sống.
•
Luộc chín kỹ thịt gà (tới khi thịt không còn đỏ hoặc
màu hồng).Tách biệt giữa thực phẩm nấu chín và chưa nấu.
•
Sau khi chế biến những món sống làm sạch các dụng
cụ chế biến, bếp… bằng xà bông và nước hoặc dung dịch tẩy rửa.

NỘI DUNG
TÌNH
HÌNH
NGỘ
ĐỘC
THỰC
PHẨM
ĐẶC
ĐIỂM
VI
KHUẨN
QUY
TRÌNH
ĐỊNH
TÍNH
ĐẶC ĐIỂM SALMONELLA

Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy:
•
Salmonella là trực
khuẩn Gram(-), hiếu
khí và kỵ khí tùy ý,
có khả năng di
động(trừ
S.gallimarum và
S.pullorum), không
tạo bào tử.
•
Phát triển tốt ở 5-45
độ C, thích hợp nhất từ

37 độ C. pH thích
hợp 6.8-7,2.
•
Phát triển được trong các
môi trường nuôi cấy thông
thường. Trên môi trường
thích hợp sẽ phát triển
sau 24h.
•
Có thể mọc trên các môi
trường có chất ức chế chọn
lọc như DCA và XLD.
•
Khuẩn lạc đặc trưng của
Salmonella trên môi trường
là tròn, lồi, trong suốt, có
tâm đen,
1
Lên men
glucose và
mannitol sinh
acid
2
không lên men
saccharose và
lactose, không
sinh indol,
không phân
giải ure,…
3

Có thể tiết ra 2
loại độc tố:
•
Ngoại độc tố.
•
Nội độc tố.
ĐẶC ĐIỂM SALMONELLA
NỘI DUNG
TÌNH
HÌNH
NGỘ
ĐỘC
THỰC
PHẨM
ĐẶC
ĐIỂM
VI
KHUẨN
QUY
TRÌNH
ĐỊNH
TÍNH
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
Salmonella có
thể được phát
hiện bằng quy
trình gồm 4
bước
Tăng sinh
Tăng sinh

Tăng sinh
chọn lọc
Tăng sinh
chọn lọc
Phân lập
Phân lập
Khẳng
định
Khẳng
định
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
MÔI
MÔI
TRƯỜNG
TRƯỜNG
VÀ
VÀ
HÓA CHẤT
HÓA CHẤT

Nước peptone đệm (Buffered Peptone Water, BPW).

Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone (RV).

Canh Malachite Green Magnesium Chloride (canh RV cải
tiến).

Tetrethionate Muller-Kauffmann( TT).

Thạch Xylose Lysine Desoxycholate ( XLD ).


Thạch Hektoen Entric Agar ( HE ).

Thạch Bismuth Sulphite Agar ( BS ).

Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose
( BPLS ).

Thạch Triple Sugar Iron ( TSI ).

Canh Urea.

Canh Lysine Decarboxylase.

Canh Ornithine Decarboxylase.

Canh Mannitol ( Phenol Red Broth Base).

Canh Sucrose (Phenol Red Broth Base).

Canh Sorbitol (Phenol Red Broth Base).

Canh Tryptone.

Thuốc thử Kovac’s.

Kháng huyết thanh Salmonella đa giá.
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
MÔI TRƯỜNG-HÓA
CHẤT

VAI TRÒ
BPW Tăng sinh
Canh RV, RV cải tiến, TT Tăng sinh chọn lọc
XLD, HE, BS, BPLS Phân lập, nhận diện Sal
TSI, canh urea, canh
tryptone,…
Khẳng định lại sự hiện diện
của Sal trong mẫu
Thuốc thử:
Thuốc thử kovac
Thuốc thử methyl red
Phenol red
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
Đồng nhất 25g mẫu trong
225ml môi trường tăng sinh
BPW, ủ ở 37
0
C, 18-24 giờ
Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang
môi trường tăng sinh chọn lọc
RV, ủ ở 42
0
C, 18-24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít
nhất 2 môi trường chọn lọc
phân biệt, ủ 37
0
C, 24 giờ
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng
cho Sal, cấy sang BHI hay

TSA, ủ qua đêm
Thử nghiệm sinh hóa
Thử nghiệm ngưng kết kháng
huyết thanh
Kết luận
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
BƯỚC 1: TĂNG SINH

Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong
quy trình kiểm nghiệm.

Là môi trường tăng sinh không chọn lọc, giàu
dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế.

Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của
mẫu, chọn quy trình tăng sinh phù hợp.

Tỷ lệ thông thường giữa mẫu và môi trường là
1:9, trong nhiều trường hợp có thể thay đổi
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
BƯỚC 1: TĂNG SINH
Tên môi trường Thành phần
BPW
Pepton 10g
NaCl 5g
Na
2
HPO
4
3,5g

KH
2
PO
4
1,5g
Ngoài ra còn có thể sử dụng một số môi trường:
-
Môi trường dịch thể Tryptic soy broth(TSB)
-
Môi trường dịch thể lactose
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
BƯỚC 1: TĂNG SINH
25g mẫu
2
2
5
m
l

B
P
W
Đồng nhất mẫu bằng
máy Stomacher
15 hoặc 30 giây
25g mẫu
+
225ml BPW
Ủ ở 37 độ C
trong 18-24h

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
25g mẫu
+
225ml BPW
Lấy 0,1ml
10ml môi
trường tăng
sinh RV đã
được ủ ấm
đến độ 42
10ml môi
trường tăng
sinh RV đã
được ủ ấm
đến độ 42
Ủ ở 42 ± 0,2
0
C
trong 18-24h
BƯỚC 2: TĂNG SINH
CHỌN LỌC
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
BƯỚC 2: TĂNG SINH
CHỌN LỌC
Tên môi trường Thành phần
RV
- Môi trường cơ
bản( tryptone, NaCl,
K
2

PO
4
, nước cất)
- Dung dịch MgCl
2
- Dung dịch Malachite
green oxalate
Canh RV ức chế vi khuẩn khác nhờ MgCl
2
bằng cách tác động lên
tế bào vi khuẩn và nhờ màu xanh Malachite ức chế các vi khuẩn
Gr(+)
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
BƯỚC 2: TĂNG SINH
CHỌN LỌC
Một số môi trường
tăng sinh chọn lọc
khác cũng được
dùng
Selenite Cysteine Broth
Môi trường dịch thể TGB
•
Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm
phát triển của Salmonella.
•
Mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ khác nhau
để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella cần
dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho
cùng một mẫu.
•

Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm
phát triển của Salmonella.
•
Mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ khác nhau
để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella cần
dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho
cùng một mẫu.
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
BƯỚC 3: PHÂN LẬP
VÀ NHẬN DIỆN
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật
cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ
dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi
trường chọn lọc phân biệt đặc trưng của
Salmonella.
Môi trường XLD: khuẩn lạc có
màu hồng trong suốt, có hay không
có tâm đen. Một số dòng
Salmonella có thể có tâm đen bóng
rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn
lạc
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
Môi trường Thành phần môi trường
XLD
(Xylose Lysine
Desoxycholate)
Cao nấm men: 3g
L-lysine: 5g
Xylose: 3.75g
Lactose: 7.5g

Sucrose: 7.5g
Sodium deoxycholate: 2.5g
Ferric ammonium citrate: 0.8g
Sodium thiosulfate: 6.8g
NaCl: 5g
Agar:15g
Phenol red: 0.08g
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
BƯỚC 3: PHÂN LẬP
VÀ NHẬN DIỆN
Môi trường HE: khuẩn lạc có màu
thay đổi từ xanh dương đến màu
xanh lục, có hay không có tâm đen.
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
Môi trường Thành phần
HE
(Hektoen Entric Agar)
Proteose Peptone: 12.0g
Yeast Extract: 3.0g
Bile Salts No. 3: 9.0g
Lactose: 12.0g
Saccharose: 12.0g
Salicin: 2.0g
Sodium Chloride: 5.0g
Sodium Thiosulfate: 5.0g
Ferric Ammonium Citrate : 1.5g
Agar: 14.0g
Bromthymol Blue: 65.0mg
Acid Fuchsin : 0.1g
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

BƯỚC 3: PHÂN LẬP
VÀ NHẬN DIỆN
Môi trường BS:
-
Bismuth sulfite và brilliant
green: ức chế Gr(+).
-
Disodium phosphate: tạo tính
đệm cho môi trường.
-
Dextrose: cung cấp năng
lượng cho VSV.
-
…
Khuẩn lạc có màu nâu xám hay
màu đen, thỉnh thoảng có xuất
hiện ánh kim tím.
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
BƯỚC 4:
KHẲNG ĐỊNH
Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy
chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi
trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 37
0
C, 18-24 giờ.
Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được
sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:
Thử nghiệm sinh H
2
S trên môi

trường KIA
Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: môi
trường KIA không có VSV. Ống 2:
xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên
men lactose tốt (lên men glucose cũng
tốt). Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên
men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên
phần thạch nghiêng, màu vàng dưới
đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men
glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện
chứng tỏ có quá trình khử lưu huỳnh
và sinh H2S.