Bài tiểu luận môn chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm bằng sinh học phân tử các phương pháp sắc ký

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỚP: DH06SH
Yo0oZ









Bài tiểu luận môn Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm bằng sinh học phân tử




Đề tài:

CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ




GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Sinh viên thực hiện: ĐINH CÁT ĐIỀM

MSSV: 06126027












Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10/2009


2


I) ĐẶT VẤN ĐỀ

Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau. Các hợp chất này bao
gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng như các hợp chất có trọng lượng
phân tử nhỏ. Những hợp chất trên có thể hiện diện ở số lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay ở
số lượng nhiều (các protein cấu tạo). Người ta muốn biết các thành phần hóa học của tế bào,
nhằm hiểu rõ các quy trình biến đổi căn bản của nó, qua đó giúp cuộc sống ngày càng thêm tốt
đẹp. Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách các tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học.
Từ đó, kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời với tên gọi sắc ký (chromatography).
Ngày nay, sắc ký đã được sử dụng để tách tất cả các hợp chất dù có màu hay không, dù
trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn. Nhưng vì các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với

trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay ít khác nhau nên không thể nào
có một kỹ thuật sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. Vì lý do đó, tôi thực hiện đề tài:
“Các kỹ thuật sắc ký” với sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Hải.

II) TỔNG QUAN

II.1) Lịch sử sắc ký

¾ Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong
ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên
đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới,
mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên
nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháp tách
này là sắc ký (Chromatography). Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa là chất màu,
graphein có nghĩa là viết. Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp
này còn được dùng tách các chất không màu.
¾ Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ
thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực,
¾ Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điện tích theo
trọng lượng phân tử của chúng. Đến năm 1964, Moor gọi là “gel permeation
chromatography” hay gọi là sắc ký lọc gel.
¾ Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát triển mạnh
mẽ, nhất là trong thập niên 1960.
¾ Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp.

II.2) Định nghĩa sắc ký

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dừng để tách các thành phần của một hỗn
hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha
luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (Trong thí nghiệm của

Tvest: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động là ete dầu hoả). Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của
các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ
khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống
trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được
chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác
3
nhau của các chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau
đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi
trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua như giấy,
gelatin hay gel magnesium silicate,
Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học. Sắc ký là phương
pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương pháp được đề nghị trong
nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử.

II.3) Các giai đoạn của quá trình sắc ký:

Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính:
a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ:
đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxi
cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh.
b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh
(dung môi để dầu hoả qua cột), pha động sẽ kéo
theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ
khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau
trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ
(chromatogram). Giai đoạn này gọi là khai
triển sắc ký.
9 Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì
các chất có thể lần lượt bị kéo ra ngoài
pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là quá

trình rửa giải và dung môi dùng được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ
cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate).
9 Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy từng phần pha tĩnh
có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất.
9 Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thu lấy các phân
đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích.
c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể
phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các
chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi
là detector đặt sau cột.

II.4) Phân loại các phương pháp sắc ký

II.4.1) Theo bản chất vật lý các pha
9 Pha động có thể là một chấ
t lỏng hay chất khí
9 Pha tĩnh có thể là một chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay một chất lỏng (được giữ trên
một chất mang rắn).
Ö Do đó, dựa vào bản chất các pha ta phân biệt các phương pháp (trong tên của phương
pháp, pha động được nêu trước pha tĩnh):
1. Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC)
2. Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC)
3. Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC)
4. Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC)
9 Hai phương pháp đầu gọi chung là sắc ký lỏng (LC).
4
9 Hai phương pháp cuối gọi chung là sắc ký khí (GC).

II.4.2) Theo hiện tượng sắc ký

1. Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh là một chất rắn có khả
năng hấp phụ, đó là các phương pháp sắc ký lỏng - rắn và khí - rắn.
2. Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng không hoà lẫn
được với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là giá
hay ch
ất mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bố bao
gồm sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký khí - lỏng.
3. Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa trao
đổi ion chớp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với các ion
cùng dấu của dung dịch hỗn hợp sắc ký).
4. Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): còn gọi là sắc ký trên gel.
Các phân tử cỡ lớn sẽ được loạt các phân tử nhỏ
hơn sẽ được tách theo kích thước
do các phân tử nhỏ di chuyển chậm hơn.
II.4.3) Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký

II.4.3.1) Theo phương pháp giữ pha tĩnh:

1. Sắc ký trên cột (column chromatography: CC) pha tĩnh được chứa trong một cột
bằng kim loại hay thuỷ tinh.
2. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh được tráng đều và
giữ trên mặt phẳng của bản thuỷ tinh, nhựa hay nhôm. Lớp mỏng pha tĩnh thường
là: silicagel, nhôm oxit, xenlulozơ, chất nhựa trao đổi lớn và có chiều dày khoảng
0,25 - 0,5mm.
3. Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) được thấm trên một loại
giấy lọc đặc biệt gọi là giấy sắc ký

II.4.3.2) Theo cách cho pha động chạy ta có:

1. Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép các chất

chạy và tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh).
2. Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy và kép các chất l
ần
lượt ra ngoài pha tính (ra khỏi cột, ra khỏi giấy).

II.5) Tốc độ di chuyển của một chất, peak và hình dáng peak

II.5.1) Tốc độ di chuyển của một chất

Tốc độ di chuyên của một chất có thể được đặc trưng bởi hệ số phân bố của nó giữa hai
pha hoặc bởi các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh (thời gian lưu, th
ể tích lưu)
a. Thời gian lưu và thể tích lưu
Thời gian lưu là thời gian cần để một chất di chuyển qua cột sắc ký, khi ra khỏi cột nhờ
thiết bị detector ghi nhận tín hiệu và xuất hiện rực trên sắc đồ (tính từ lúc bơm mẫu đến khi xuất
hiện peak).
5
Tm là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyển của nó bằng
tốc độ di chuyển trung bình của dung môi, thời gian này được gọi là thời gian chết. tR càng lớn,
chất càng bị lưu giữ mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng nhỏ.





Hình: Sắc ký đồ của một
chất

Thời gian lưu hiệu chỉnh tR được tính theo công thức:

Nếu trên trục hoành của sắc đồ, dùng đơn vị đo là thể tích dung môi thì ta có các đại lượng tương
tự: thể tích lưu VR và thể tích lưu hiệu chỉnh VR' thể tích VM được gọi là thể tích chết của cột
hay còn gọi là thể tích rỗng Vo.

b. Hệ số phân bố
Trong đó: Cs và Cm là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động khi
cân bằng
được thiết lập. Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào bản chất các pha, chất
tan và nhiệt độ K càng lớn thì chất đó phân bố càng nhiều trong pha tĩnh
và di chuyển càng chậm.

c. Hệ số dung lượng K' (hệ số phân bố khối lượng)

Trong đó: Qs và QM là lượng chất tan phân bố trong pha anh và pha động,
K' phụ
thuộc vào bản chất các pha, bản chất chất tan, nhi
ệt độ và đặc điểm của
cột. Để tách một hỗn hợp chất, người ta thường chọn cột, pha động và các
điều kiện phân tích khác sao cho K' nằm trong khoảng từ 1 đến 8.
II.5.2) Peak và hình dáng peak
a. Hình dáng peak: Hình dáng lý tưởng của tức là lực đối xứng, nhưng thực tế lúc sắc ký
chỉ gần đối xứng. Chiều rộng của tục được đo ở 1/10 chiều cao của peak.
b. Sự kéo dài peak: là kết quả của sự di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân tử
của cùng một chất khi đi qua cột sắc khí. Các lực ra chậm bao giờ cũng tù hơn.

c. Hiệu lực của cột: Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết
N và chiều cao đĩa lý thuyết H. Ta có thể coi như cột sắc khí được chia thành N lớp hay N tầng
mỏng, ở m
ỗi một lớp sự phân bố chất tan vào hai pha đạt trạng thái cân bằng. Những tầng mỏng
giả định này được gọi là địa lý thuyết. Nếu cột sắc khí có chiều dài là L thì: H = N/L. Cột có N
lớn là cột có hiệu lực cao.
6
d. Độ phân giải: Độ phân giải Rs là tỉ số khoảng cách giữa hai peak và độ rộng trung bình
của peak.
9 Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều;
9 Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%;
9 Rs = l,5 hai pic tách hoàn toàn (chi xen phủ 0,3%).
9
II.6) Các kỹ thuật sắc ký

II.6.1) Sắc ký giấy

Sắc ký giấy là một phương pháp phân tách dễ dàng các thành phần của một hỗn hợp (acid
amin). Trong sắc ký giấy, pha tĩnh là một tờ giấy bằng cellulose ( thí dụ như tờ giấy thấm, giấy
lọc trong phòng thí nghiệm). Các lọai giấy này có tính ái nước nên trên thực tế, pha tĩnh là một
lớp nước (H2O) thật mỏng đã được che phủ lên trên bề mặt của tờ giấy, chính vì thế sắc ký giấy
là lọai sắc ký phân chia. Pha động là chất lỏng( có thể là chất lỏng hay một hỗn hợp dung môi).
Phương pháp này thường được sử dụng để tách các chất ưa nước như amino acid, đường,
Trong giấy, cellulose có dạng sợi, các sợi này khi nằm cạnh nhau sẽ tạo thành mạng lưới với các
lỗ rỗng to. Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi và các lỗ rỗng sẽ được phủ đầy
dung môi. Như thế, các chất tan bị phân tán nhiều trong lỗ rỗng khiến các vết sắc ký to hơn. Bột
giấy hấp thu nước, nước bị giữ lại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì thế
quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế phân chia.

Hình
: Sắc ký giấy, các chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với các điểm khác nhau.
(a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt ở một góc mảnh giấy lọc, một cạnh giấy nằm trong
dung môi.
(b) Dung môi di chuyển lên tấm giấy bằng lực hút mao mạch, các chất sẽ phân bố theo các tỷ lệ
khác nhau Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước của phân tử của nó và hòa
tan của nó trong dung môi.
(c) Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bảng , tạo thành một sắc
ký đồ.
7
Ö Hiện nay, sắc ký giấy đang dần được thay thế bằng sắc ký lớp mỏng. Do phần lớn các chất
hữu cơ không có màu, nên sắc ký giấy sẽ không cho thấy được vị trí của mẫu chất trong quá
trình dung môi di chuyển đi lên giấy.
Nhược điểm sắc ký giấy:
Trong giấy, cellulose ở dạng những sợi dài nằm song song kề

nhau một cách tự nhiên, và một hệ thống mạng như thế chắc chắn có các lỗ hỗng. Khi dung môi
giải ly di chuyển (mang theo các chất tan, solute) dọc theo bề mặt của sợi, các lỗ rỗng này sẽ
được dịp phủ đầy dung môi, và các chất tan có dịp khuếch tán vào các lỗ rỗng này, khiến các
chất tan càng lúc càng to dần so với vết chấm tạo mức xuất phát ban đầ
u. Còn nếu sợi cellulose
được nén chặt quá dòng chảy sẽ rất khó di chuyển.

II.6.2) Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu
vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển
ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được
tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấ
m kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do
chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
¾ Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh,
hình dạng đa dạng, có nắp đậy.
¾ Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của
một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, )
được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm
kiếng, t
ấm nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu
trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay
một lọai polymer hữu cơ.
¾ Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm
nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng
khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha
lõang 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành
một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên
cao hơn một chút so với mặ

thoáng của chất
lỏng chứa trong bình. Hình: Bình sắc ký lớp mỏng
¾ Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp
mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển càng cao nhờ tính mao quản.
Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi.
Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu
giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
¾ Ưu điểm:
-Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích
-Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích.
-Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng.
¾ Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng:
-Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính trong ống nhỏ, khỏang 1-2mm, một đầu
được vót nhọn, dài 10-20cm. Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác nhau,
chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằng dung môi hữu cơ như aceton.
8
-Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt bản với kiách thước
cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát và mức tiền tuyến
dung môi.
-Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng, còn mẫu là
dung dịch quá sễt, có thể pha loãng mẫu. Với mẫu là chất rắn phải hòa tan trong dung môi hữu
cơ phù hợp, nồng độ 2-5%. Nhờ một vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng
một cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Mỗi vết chấm trên bản
không chứa nhiều hơn 12ug (10ug là tối ưu) mẫu chất.
-Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bả
n vào dung dịch giải ly
-Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm
mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới đáy bình. Cạnh đáy của
tấm lớp mỏng nậgp trong dung môi giải ly khỏang 0.5-1cm. Các vết mẫu không được ngập trong
dung môi giải ly, vì như thế dung môi sẽ khuếch tán vào trong dung môi.

-Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường,
nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử
dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiện bằng tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này
nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng; đèn chiếu
tia UV 366nm ánh sàng này phát hiện nhữgn hợp chất có phát hùynh quang, các vết sẫm của chất
mẫu có màu sáng trên nền bản mỏ
ng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học (Bằng cách dung
thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát
hiện aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay caton, clorur
antimony phát hiện steroid hay vitamin hay carotenoid,…)
- Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính
bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính
bằng cm, b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.









9

Hình: Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng



II.6.3) Sắc ký cột:

Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là
những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy
tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một
lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải
ly được đặt phái trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột
được hứng vào những lọ nhỏ đặ ngay ống dẫn ra của cột. Phương pháp này
thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao
áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ
tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn.
¾ Các bước thực hiện sắc ký cột:
-Lựa chọn chất hấp thu :pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân
cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Vơí 2
phân tử không phân cực, phân tử naò có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính
phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di
chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nóở
lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân cực.
- Lựa chọn dung môi:Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung
môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị
4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm
khoảng 2-5ul dd(A). Mỗi bản mỏng đượ
c triển khai với một loại dung
môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử. Với
đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp. Từ kết quả
đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực

và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate.
-Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng
trên giá, cho dung môi loại kém phân c
ực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao
cột. Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần
một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp thu
đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới
để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới
cột, dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho
dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột
đồng nhất.
-Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở
dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại
dung môi cho khởi đầu sắc ký.
Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau:
10
+Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát
với mặ thoáng của chất hấp thu trong cột.
+Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng một pipet hút dung
dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet
dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất
hấp thu.
+mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào
chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô.
+Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi này để rửa
sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột.
+Mở khoá cho dung môi chảy ra. Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp
thu, dung môi trong suốt không lây màu của chất mẫu.
+Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo
vệ mặt cột.

+Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly trên cột.
II.6.4) Sắc ký trao đổi ion
Sự trao đổi ion là sự gắn kết có tính chất thuận nghịch giữa các phân
tử có mang điện tích. Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm
chức G mang điện tích. Giả sử cho đi ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất
ban đầu có chứa nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan nào có mang
điện tích ngược dấu với điện tích của nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan
dẽ đuổi đối ion C ra thế chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ
bị giữ lại trong cột, trong khi đó những chất khác của hỗn hợp mẫu chất ban
đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột. kỹ thuật này tách riêng được hợp
chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu.
RG- + S+ Æ RG-S+ + C+
Hoặc RG+ +S- Æ RG+S- + C-
Trong đó: R là pha tĩnh hay gọi là nhựa (resin), G là nhóm chức mang
điện tích được cố định trên pha tĩnh hay còn gọi là nhóm chức họat động của
nhựa. C là đối ion của G. S là chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G.
¾ Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer
carbohydrate.
¾ Các bước trong sắc ký trao đổi ion:
-Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột. Nhựa trao
đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa và thể tích dung môi sao cho có
thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra những bọt khí nằm giữ các hạt nhực. Để
yên 5-10
phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa
lắng xuống. Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân bằng cột bằng chách cho dung dịch đệm chày qua cột,
cuối cùng kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột.
-Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp vào cỗt, lọc bằng tờ
giấy lọc hay ngang qua một lớp celite. Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao
đổi của nhựa. Đầiu quan trọng nhất là làm sao để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất
được hấp thu hết vào nhựa, tức là chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu. Để nạp mẫu lên

cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại. dùng
pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên
đầu cột. Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa.
11
-Khi tất cả mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua, nối
cột với bình cung cấp dung dich giải ly.
-Giải ly bằng cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu đang gắn vào nhựa trao đổi
ion trong dung dịch đệm có nồng độ thấp. Để có thể tách mẫu chất ra khỏi nhựa thường, cần phải
gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cách cho thêm NaCl. Khi có thêm NaCl trong dung
dịch đệm, ion của dung dịch đệm sẽ cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhóm
chức họat động cảu nhựa, đẩy hợp chất ra khỏi nhựa, rồi theo dòng chảy đi ra khỏi cột.
¾ Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích
nhất định, nhữ
ng hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với
chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến
trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích
dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-
cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang
điện tích âm. Vì thế,
những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột.
Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân
tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm
muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột
với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích
ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.

II.6.5) Sắc ký gel

Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này
được phủ đầy dung môi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có

trọng lượng phân tử khác nhau cò thể tách riêng được hay không là tuỳ vào kích
thước lỗ rỗng. Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ rỗng, không thể chui lọt vào
bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. các
phân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phần
hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi cũng theo dòng chảy đi ra
khỏi cột nhưng sẽ chậm trễ hơn.
Dòng chảy pha động khiến các phân tử lớn không thể chui vào lỗ rỗng
củ
a mạng gel, nhanh chóng đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khi phân tử nhỏ ra
khỏi cột lâu hơn vì còn chui vào và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel. Như vậy, các thành
phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽ ra khỏi cột
lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi ra khỏi cột
sau.

12

Sắc ký gel phải thực hiện trong cột hình ống trụ bằng thuỷ tinh, gồm các bước sau:
-Nhồi gel vào cột: các hạt gel trương nở hiện diện ở dạng huyền phù trong dung môi phù hợp cho
vào cột. Huyền phù được chỉnh sao cho thật sệt nhưng khi rót vẫn chảy vào cột thành dòng dễ
dàng. Cân bằng cột bằng cách cho dung môi giải ly chảy ngang qua cột, lượng dung môi có thể
tích bằng 2-3 lần thể tích cột. Kiểm tra sự chặt chẽ của cột bằng cách cho một lượng mẫu thử vào
đầu cột. mẫu thử thường được chọn là dextran blue 2000, có màu xanh dương để có thể được
quan sát bằng mắt thường sự di chuyển của mẫu trong cột.
-Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải được lọc bỏ những hợp
chất còn ở dạng rắn, cặn. Dung dịch mẫu hoà tan vào dung dịch đệm, đặt lên đầu cột giống như
sắc ký cột.
-Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly rất đơn giản, chỉ sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ
(nghĩa là sử dụng một loại dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, khi bắt đầu cho tới khi kết thúc
quá trình giải ly chỉ sứ dụng một loại dung môi đó). giải lycó thể bằng trọng lực nhưng rất tốt khi
sử dụng bơm đẩy từ đầu cột. hứng dung môi giải ly trong những lọ nhỏ, mỗi lọ có một thể tích

nhất định. Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần.
¾ Ứng dụng: kỹ thuật này dùng để tách các đại phân tử có nguồn gốc sinh học như: protein,
polysaccharide, acid nuleic, enzyme, Người ta ứng dụng vào việc đóan TLPT của một
hợp chấ
t chưa biết.
II.6.6) Sắc ký ái lực

Sắc ký ái lực hấp thụ phát hiện các ái lực sinh học mà một phân tử
sinh học có với một phân tử khác được cố định trên một pha ổn định. Có
nhiều phương pháp để rửa giải các phân tử ái lực vì có nhiều loại sắc ký ái lực
khác nhau, các bước theo gradient vẫn thường được sử dụng. Thường sử dụng
trên các hệ thống có áp suất thấp. Các giá thể (thường là agarose) thường chịu
được áp suất dưới 50psi.
Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết
ligand lên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn.
Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh sạch trên protein A (protein A
là antigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng
nguyên thủy còn họat tính với dạng biến tính.


13


 Sử dụng sắc ký ái lực cho tương tác giữa kháng nguyên kháng thể: ta có thể tinh sạch
một kháng nguyên bằng chách cho mẫu đi qua cột có chứa giá thể liên kết với kháng thể
để thu nhận protein. Ngược lại, một giá thể có liên kết với một kháng nguyên chuyên biệt
sẽ bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên đó. Ứng dụng nhiều nhất là gắn kết
protein A vào gel để gắn kết với các globulin miễn dịch.
-
II.6.7) Sắc ký tương tác kỵ nước

Sắc ký tương tác kỵ nước là phuơng pháp bổ sung khá tốt cho các kỹ thuật
phân tách khác. Trong những năm gần đây, phương pháp này trở nên thông
dụng như là bước đầu tiên trong quá trình sắc ký.
Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất là nhóm kỵ nước, có thể là gốc methyl hay
t-butyl. Các gốc này hấp dẫn các gốc kỵ nước khác có trên bề mặt protein.
Khi cho mẫu protein vào trong điều kiện nồng độ muối cao ép các phần kỵ
nước lại gần nhau và đính với nhau. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng
cách giảm dần nồng độ muối cho đến khi các phần kỵ nước đi lại vào trong
dung dịch.
Đặc điểm: Phân tách các phân tử theo tính kỵ nước của phân tử
Các nhóm kỵ nước khác nhau đựợc cố đinh trên bề mặt giá thể.
Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ nước trên
phân tử tương tác các nhóm cố định.
Các phân tử gắn kết được rứa giải bằng cách giảm áp lực ion và
vì vậy hòa tan các phân tử ra khỏi giá thể.
Ưu điểm: Là bước cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu được thu nhận trong
nồng độ muối thấp.
Nhược điểm: một số protein có thể bị tủa ở nồng độ mu
ối cao, khó nâng cấp quy mô lớn.
14

II.6.8) Sắc ký khí
Sắc ký khí là phương pháp được dùng để tách các chất ở
thể khí bay hơi, với pha động là chất khí, gọi là khí mang (carrier
gas). Sắc ký khí còn áp dụng cho các chất khí, lỏng, rắn dễ bay
hơi và bền nhiệt độ cao, có TLPT M<500.
Sắc ký khí rắn (GSC - gas solid chromatography): pha
tĩnh rắn là một chất hấp phụ, đây là sắc ký khí hấp phụ và sắc ký
khí lỏng (GLC - gas liquid chromatography): pha tĩnh lỏng được
bao hay gắn trên một chất mang rắn (solid support) đây là sắc ký

khí phân bố.
Sử dụng phương pháp sắc ký khí có khả năng tách được
hoàn toàn những chất hữu cơ tương tự, ví dụ như o-; m-; p-xilen
không thể tách được bằng phương pháp chưng cất phân đoạn
nhưng tách được khá đơn giản bằng sắc ký khí, cũng như sử
dụng đề tách những hỗn hợp rất phức tạp như khí thải ô tô chứa
trên 300 hợp chất. Với việc ra đời của nhiều loại detector nhiều
phương pháp mới xuất hiện như: sắc ký khí - khối phổ (GS -
MS), sắc ký khí - hồng ngoại (GC - IR) đã làm tăng khả năng
phân tích của sắc ký khí.

¾ Máy sắc ký khí

Hình: Sơ đồ của một máy sắc ký khí


1. Khí mang
Khí mang là một khí trơ như nhờ, hen, ngon, hidro trong đó hai là khí mang phổ biến
nhất. Khí được chứa trong bom khí có gắn van giảm áp và đi
ều chỉnh. Khí mang cần có độ tinh
khiết cao và phải không tương tác với mẫu, chỉ mang mẫu đi qua cột: Tín hiệu đetectơ có phụ
thuộc vào sự khác nhau về tính chất giữa khí mang vàchất cần phân tích.
2. Bộ bơm mẫu
Thường dùng bơm tiêm đề bơm trực tiếp mẫu qua một vách polime silicon chịu nhiệt cao
vào cột hoặc vào phòng đun nóng mẫu để mẫu lỏng có thể bay hơi nhanh chóng. Yêu cầu cần
15
thiết là mẫu phải có đủ áp suất hơi để có thể được làm bay hơi trong phòng mẫu. Nhiệt độ phòng
mẫu có thể cao hơn nhiệt độ trong cột một chút để quá trình bay hơi được thực hiện dễ dàng.
3. Cột sắc ký
Cột được đặt trong lò có thể điều chỉnh nhiệt độ trong quá trình thực hiện. Cột thông

dụng nhất trong phân tích là những ống bằng thép không rỉ (đồng, thép) hoặc bằng thuỷ tinh dài
từ 1 đến 10 m và có đường kính từ 2 đến 4 mm. Chúng được uốn cuộn tròn cho khớp với phòng
lò. Cột được nhồi bằng những phần tử rắn hoạt động như một pha tĩnh (GSC): đó là những hạt
nhỏ xếp gắn trên mặt trong cột hoặc pha tĩnh được tẩm trên các hạt nhỏ đó. Trong sắc ký khí
lỏng (GLC), pha tĩnh được giữ trên chất mang, đó là nh
ững hạt chất rắn nhỏ, bền nhiệt, trơ về
mặt hoá học, có lỗ cỡ 1 - 5 μm, bề mặt riêng lớn từ 1 - 10 m2/g. Pha tĩnh phải chịu nhiệt, hoá
lỏng ở nhiệt độ phân tích, trơ về hoá học. Thường hay sử dụng các polyme xốp hoặc gel
aluminosilicat khử nước.
4. Detector
Yêu cầu về detector rất nghiêm ngặt: Mọi hợp phần có trong 0,1 μl mẫu phải được phát
hiện ở mức 1% cho nên phải nhanh chóng phát hiện được 0,002 μl (có khối lượng cỡ 10
-6
g) mẫu.
Các detector hiện nay đo được những lượng nhỏ hơn đến mấy bậc. Hiện nay trong phương pháp
GC người ta sử dụng những loại detector sau:
9 Detector dẫn nhiệt (TCD): Việc vận hành của detector dựa trên sự cân bằng nhiệt
cửa một dây dẫn nung nóng. Khi có chất cần phân tích đi qua thì độ dẫn điện của
hỗn hợp khí sẽ thấp đi, dây sẽ nóng lên, xuất hiện một tín hiệu điện. Detector dẫn
nhiệt thích hợp với nhiều chất cần phân tích.
9 Detector ion hoá ngọn lửa (FID): Khi đốt cháy các hợp chất hữu cơ trong ngọn
lửa, chúng sẽ tạo ra các ion. Các điện cực ở gần ngọn lửa sẽ phát hiện ra sự có
mặt của các ion bằng sự xuất hiện một dòng điện nhỏ chạy qua mạch điện. Có thể
đo được những dòng ngay cả khi chứng chỉ xấp xi bằng 10
-12
A. Đây là detector
được dùng nhiều nhất, phát hiện được đến 10
-9
g.
9 Detector hấp thụ electron (Detector bắt electron - ECD): Nhờ có nguồn phóng xạ

như
3
H hoặc
63
Ni, khí mang bị ion hoá tạo nên một "dòng nhất định" trong mạch
detector. Khi một chất phân tích hấp thụ electron được giải hấp nó sẽ làm giảm
dòng này, đặc biệt khi hợp chất có chứa nguyên tố có độ âm điện cao. Dòng sẽ
giảm đi, tạo ra tín hiệu ghi để. Detector đặc biệt nhạy cảm với những hợp chất
chứa halogen. Detector hấp thụ electron rất thuận lợi cho việc phân tích môi
trường. Độ nhạy cao, đạt tới 10-12g.
5. Thông tin GC
Sắc ký đồ thông thường biểu thị trên hai trục x và y, trong đó tín hiệu detector ghi trên
trục y và thời gian ghi trên trục x. Khi một hợp phần của mẫu được giải hấp và phát hiện nhờ
detector thì tín hiệu đó sẽ được ghi lại. Thời gian ghi được ở lúc tín hiệu là hàm của KD và vì thế
nó cung cấp thông tin định tính về mẫu giống như thế bán sóng trong cực phổ, và sẽ nhận biết
đượ
c một hợp phần trong mẫu. Thông tin định lượng từ sắc đồ được rút ra từ chỗ tín hiệu
detector là hàm của thời gian. Diện tích dưới lúc tỷ lệ với lượng chất phân tích. Lượng này có thể
biểu thị bằng đơn vị mol hoặc đơn vị khối lượng, tuy nhiên hằng số tỷ lệ sẽ khác nhau:
SA = diện tích dưới pic - R A
Trong đó R là diện tích trên một một khí A được biểu thị b
ằng một hoặc là diện
tích trên một gam khí A biểu thị bằng gam.
 Sắc ký khí ghép khối phổ (GC_MS: gas chromatography mass spectrometry):
Một trong những phương tiện hữu ích cho các nhà hóa học xác định cấu trúc hóa học của hợp
chất cần khảo sát là máy sắc ký khí ghép khối phổ. Dòng khí thoát ra khỏi máy sắc ký khí được
16
cho đi qua một khóa đễ vào ống, nơi mà có một lỗ phân tử và dẫn đến buồng ion hóa của máy
khối phổ.

Hệ máy GC_MS có thể khảo sát một đơn chất hay một hỗn hợp, trước tiên máy tách mẫu, phân
tích mẫu, kế đó bộ phân máy tính của máy khối phổ so sánh các dữ kiện thu được với các số liệu
phổ chuẩn đang chứasẵn trong thư viện máy, đễ đề nghị cấu trúc hóa học của hợp chất (đơn chất
hay hỗn hợp) khảo sát. Máy in ra một bảng danh sách những hợp chất có khả năng giống với các
chất khảo sát, mỗi hợp chất đề nghị này đầu có ghi kèm thao độ tương hợp. Độ tương hợp càng
lớn (trên 90%) cấu trúc của hợp chất khảo sát càng có khả năng là chất mà máy đề nghị.

II.6.9) Sắc ký lỏng cao áp:
- Áp dụng cho phân tích mẫu dạng lỏng, rắn có TLPT M>2000.
- Các thành phần chính của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
1) Bình chứa dung môi
Thường làm bằ
ng thuỷ tinh, đôi khi làm bằng thép không rỉ, trong phương pháp rửa giải
thông thường chỉ cần một bình chứa dung môi, trong phương pháp rửa giải gradient thường dùng
2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung
môi trên trộn lẫn với nhau theo ti lệ đã được xác định. Cần loại các hạt và các khí hoà tan trong
dung môi.
2) Hệ thống bơm
Bơm dùng trong phương pháp phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 250 -
500at), lưu lượng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/ph, phải trơ với các dung môi. Hệ thống bơm này
phải có khả năng bơm pha động qua cột ở áp suất cao mà không bị ngắt quãng hoặc tạo nhịp
sóng có thể làm sai lệch các lực thu được. Có nhiều kiểu bơm đã dùng trong các máy HPLC;
nhưng kiểu phông xoay chiều hiện nay được dùng phổ biến nhất.
3) Hệ bơm mẫu (hệ tiêm mẫu)
17
Mẫu được bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu. Người ta bơm mẫu vào vòng mẫu với thể tích
thường là từ 10 đến 20 μl.
4) Cột sắc ký
Kiểu cột thường phụ thuộc vào phương pháp dùng để tách, nhưng thường là những cột bằng
thép không gỉ, có cỡ lỗ chính xác đường kính từ 3 đến 4 túm và dài từ 10 đến 30cm (những cột

dùng cho SEC đường rộng hơn và dài đến 100cm). Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số (ra lý
thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1m chiều dài cột)
5) Detector
Là bộ phận phát hiện các chất khi chứng ra khỏi cột và ghi nhận các tín hiệu ghi trên sắc ký
đồ. Hiện đang sử dụng các loại detector sau:
Detector tử ngoại (UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm. Nhiều chất hấp thụ ở bước
sóng này.
Detector tử ngoại và khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sóng từ 195 đến
750 nm. Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất.
Detector điện hoá và detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao dùng trong phân
tích vết. Dùng detector điện hoá có thể phát hiện được những lượng picrogam (10-12g)
 Các phương pháp sắc ký hiệu năng cao
a) Sắc ký phân bố hiệu năng cao
Gồm hai loại: Sắc khí lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết.
- Sắc ký lỏng - lỏng (LLC): Pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạt chất mang,
tức là được hấp phụ trên chất mang.
- Sắc ký pha liên kết (BPC): Pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo ra liên kết siloxan nối
nhóm cơ - silic với silicagen.
b. Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (sắc ký lỏng - rắn LSC)
Pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt có chứa các nhóm hiđroxil phân cực, pha động là một dung
môi không phân cực.
c) Sắc ký trao đối ion hiệu năng cao (IEC)
Pha tĩnh rắn chứa các nhựa trao đổi lớn dưới dạng bột mịn, pha động thường là dung dịch nước.
d. Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel (sốc ký loại cỡ SEC)
Phương pháp này được ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lượng lớn. Chất nhồi cho SEC
là những hạt xốp của silicagent hay các polyme có kích thước nhỏ ( 10 μm). Pha tĩnh là dung
môi nằm trong các lỗ xốp của hạt, pha động là dung môi chảy giữa các hạt. Ch
ỉ những phân từ
nhỏ mới khuếch tán vào lớp xốp, khi rửa giải các phân tử sẽ lần lượt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ.

18

So Sánh Giữa 2 Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) và Sắc Ký Khí (GC)
- Độ bay hơi
+ HPLC: Không yêu cầu bay hơi, mẫu phải tan được trong pha động
+ GC: Mẫu phải bay hơi được
- Độ phân cực
+ HPLC: Tách được cả 2 loại hợp chất phân cực và không phân cực
+ GC: Mẫu phân cực và không phân cực
- Độ bền nhiệt
+ HPLC: Phép phân tích được thực hiện tại nhiệt độ thấp (nhiệt độ phòng hay thấp hơn)
+ GC: Mẫu buộc phải tồn tại ở nhiệt độ cao (nhiệt độ tách của cột và buồng tiêm mẫu)
- Khối lượng phân tử
+ HPLC: Không có giới hạn trên về mặt lý thuyết, trên thực tế độ hoà tan là giới hạn
+ GC: Đặc trưng < 500 amu
- Chuẩn bị mẫu
+ HPLC: Mẫu buộc phải lọc, mẫu nên có dung môi hoà tan như pha động
+ GC: Dung môi phải bay hơi và có nhiệt độ sôi thấp hơn các chất phân tích
- Lượng mẫ
u
+ HPLC: Lượng mẫu phụ thuộc vào đường kính (trong) của cột
+ GC: Thường từ 1 –5 μl
- Cơ chế tách
+ HPLC: Thực hiện ở cả 2 pha động và tĩnh
+ GC: Chỉ có pha động là mang mẫu
- Detecter – Đầu dò
+ HPLC: Thông dụng nhất là UV-VIS

+ GC: Thông dụng là FID, dùng cho phân tích các chất hữu cơ



19
III. KẾT LUẬN:
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế giới. Việt
Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện cuộc sống ngày càng
cao, nên đòi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để đáp ứng nhu cầu. Bên cạnh đó
cũng có một số ít người, vì lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất cả. Ngày nay, để kiểm soát kiểm
tra tình hình chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm,
hoá chất… Vì thế kỹ thuật sắc ký càng có vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng
mà kỹ thuật này hoàn toàn đảm đương được nhưng yêu cầu trên. Ví dụ như: kiểm tra dư lượng
kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol,
salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu đã bị cấm có
trong thực phẩm và mỹ phẩm như: Sudan có trong trứng gia cầm và trong son môi, 3 MCPD
(3_monoclo_propan_1,2_diol) có trong nước tương, formone có trong bánh phở, xác định một số
phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sự phát triển của các nấm mốc gây độc (có độc tố
Aflatoxin) trong các lô hàng nông sản dự trữ và xuất khẩu đặc biệt đậu tương và lạc …Trong
công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong dược phẩm, dư luợng
chất có thể gây độc hại… Ngoài ra còn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như quan trắc, môi
trường… Vì vậy, với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương pháp sắc ký phù
hợp để phân tích mẫu tương ứng.

IV) TÀI LIỆU THAM KHẢO

1) Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM, 2007,
Trang 151-451.
2) Trần Nhật Phương, Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học- Proteomic/Sắc ký, 2008,
12trang.

3) Nguyễn Tuấn Anh, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thế Hùng, Giáo trình phân tích môi trường, ĐH
Nông Lâm Thái Nguyên, trang 49-59.
4) Sắc ký giấy:


/>
20Chromatography.ppt
5) Sắc ký lớp mỏng:
Piia Salo, Thin-Layer Chromatography with Ultravioletand Mass Spectrometric Detection:
From Preparative-Layer to Miniaturized Ultra-Thin-Layer Technique ,Division of
Pharmaceutical Chemistry Faculty of Pharmacy University of Helsinki, Finland.
/>

6) Sắc ký cột:
/>
7) Sắc ký trao đổi ion:
/>inciplesofChromatography/IonExchange/
8) Sắc ký gel:
/>inciplesofChromatography/SizeExclusion/
9) Sắc ký tương tác kỵ nước:
20
/>inciplesofChromatography/HydrophobicInteraction/
10) Sắc ký ái lực:
/>
/>inciplesofChromatography/Affinity/
11) Sắc ký khí:

/>
/>
12) Sắc ký lỏng cao áp: