Nhân giống in vitro cây cỏ ngọt (stevia rebaudiana)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
oOo

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT
(STEVIA REBAUDIANA)
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM
SVTH: MSSV
PHẠM TRỌNG 10261191
MAI ĐỨC DŨNG 10251691
NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10149321
TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
oOo

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT
(STEVIA REBAUDIANA)
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM
SVTH: MSSV
PHẠM TRỌNG 10261191
MAI ĐỨC DŨNG 10251691
NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10 149321
TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013

Trang i



LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập tại trường ĐH công nghệp Tp.HCM , chúng em
đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy, Cô, Gia đình và bạn
bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Viện Công
Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm– Trường Đại Học Công Nghệp Thành phố Hồ Chí
Minh lời cảm ơn chân thành . Với tri thức và tâm huyết của mình, các thầy, cô đã
truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại
trường.
Chúng em xin chân thành cảm ơn Ths.Nguyễn Thành Sum đã tận tâm hướng
dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo
luận về lĩnh vực trong nghiên cứu khoa học. Nếu không có những lời hướng dẫn,
dạy bảo của thầy thì đồ án của chúng em rất khó có thể hoàn thành.
Bài báo cáo này không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những
ý kiến đóng góp quý báu của Quý Thầy Cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn.







Trang
ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC HÌNH ẢNH v
DANH MỤC BẢNG vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT viii
PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt 2
2.1.1. Vị trí phân loại 2
2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt 2
2.1.3. Phân bố 3
2.1.4. Đặc điểm hình thái 3
2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng: 4
2.1.6. Điều kiện sinh trưởng 5
2.2. Nhân giống cây trồng in vitro 6
2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6
2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6
2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật. 8
2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro 8
2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 10
2.2.6. Điều kiện nuôi cấy 12
2.2.7. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 12
2.2.8. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) 13


Trang
iii

2.2.9. Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam
15
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1. Vật liệu 16
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 16
3.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ 16
3.1.3. Môi trường nuôi cấy 18
3.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro 18
3.2. Phương pháp nghiên cứu 19
3.2.1. Phương pháp khử trùng 19
3.2.2. Phương pháp thí nghiệm 19
3.2.3. Phân tích thống kê 25
3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ
sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro. 26
4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản phù hợp cho sự sinh trưởng
và phát triển cây Cỏ ngọt in vitro 27
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng
lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 29
4.3.1. Thí nghiệm 3a: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung Ki kết
hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 30
4.3.2. Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung Ki
kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 32
4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA
kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 33

Trang
iv



4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA
kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 34
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình
thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. 35
4.4.1. Thí nghiệm 4a: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ
của cây Cỏ ngọt in vitro. 36
4.4.2. Thí nghiệm 4b: Khảo sát ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác
nhau đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. 37
4.4.3. Thí nghiệm 4c: Khảo sát ảnh hưởng của IAA đến sự hình thành rễ
của cây Cỏ ngọt in vitro. 39
PHẦN 5: KẾT LUẬN 42
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


Trang
v



DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) 2
Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt 2

Hình 2.2 Các bộ phận của cây cỏ ngọt. 4
Hình 4.1 Các dạng mẫu trong thí nghiệm khử trùng mẫu: a. mẫu sống và mọc
chồi; 27
Hình 4.2 Kết quả nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro 29
Hình 4.3 Chiều cao và số chồi ở các nghiệm thức nhân nhanh chồi trong môi
trường có sự kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA 31
Hình 4.4 Nghiệm thức nhân nhanh chồi kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA 33
Hình 4.5 Chiều cao và hình thái chồi trong các nghiệm thức kết hợp giữa BA và
0.2 mg/l IBA 34
Hình 4.6 Hình thái cây trong các nghiệm thức nhân nhanh chồi có kết hợp giữa
BA và 0.2 mg/l NAA 35
Hình 4.7 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung IBA 37
Hình 4.8 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung NAA. 39
Hình 4.9 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bố sung IAA 41




Trang
vi



DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong
nhân giống in vitro 9
Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo mẫu Cỏ Ngọt in vitro sạch bệnh
20
Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm tìm môi trường cơ bản cho cây Cỏ Ngọt in
vitro. 21

Bảng 3.3 Các nghiệm trong thí nghiệm nhân nhanh chồi thức nhân nhanh chồi . 22
Bảng 3.4 các nghiệm thức trong thí nghệm tìm môi trường ra rễ cho cây Cỏ Ngọt
in vitro 24
Bảng 4.1 Kết quả nghiệm thức khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu Cỏ
ngọt bằng chất khử trùng TCCA 26
Bảng 4.2 Kết quả của thí nghiệm tìm môi trường cơ bản tối ưu cho cây Cỏ ngọt in
vitro 28
Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có sự bổ sung kết hợp giữa Ki và
0.2 mg/l IBA 30
Bảng 4.4 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2
mg/l NAA 32
Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA
33
Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA
34
Bảng 4.7 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IBA 36
Bảng 4.8 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung NAA 37
Bảng 4.9 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IAA 39



Trang
vii






Trang

viii



CÁC TỪ VIẾT TẮT

MS : Murashige và Skoog
IBA : Indol butyric acid
NAA : Napthlacetic acid
IAA : Indol acetic acid
Ki : Kinetin
BA : Benzyl adenin
ĐC : Nghiệm thức đối chứng
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
1



PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thông kê gn đây, tỉ lệ mắc bệnh đái tháo đường, thường được gọi là bệnh
tiểu đường đang gia tăng nhanh tại Việt Nam. Năm 1990 tỷ lệ mắc bệnh đái tháo
đường chỉ ở mức từ 0,9%( Huế) cho đến 2,52%( thành phố Hồ Chí Minh), nhưng chỉ
sau 10 năm, năm 2001 tỷ lệ này ở các thành phố lớn đã là 4,1%, năm 2002 tăng lên
4,4%- với mức tính ở cả cộng đồng là 2,7% dân số; nếu tính ở nhóm người có yếu tố
nguy cơ mắc bệnh cao thì tỷ lệ bệnh đã tăng trên 10% Theo thống kê năm 2008, tỷ
lệ mắc bệnh đái tháo đường trong cả nước là trên 5% (khoảng 4,5 triệu người), tại các
thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ từ 7,0 đến 10% .

Theo dự đoán, con số người mắc bệnh tiểu đường tại Việt Nam sẽ còn tăng hơn
nữa khi kinh tế tiếp tục tăng trưởng và càng ngày càng nhiều người tại Việt Nam
chuyển sang lối sống thành thị hiện đại.
“Chúng ta sẽ chứng kiến một đại dịch thực sự tại Việt Nam trong những năm tới,”
ông Jessper Hoiland được Tờ The New York Times trích thuật.
“Ngày nay nhiều người chết vì ăn quá nhiều hơn là vì đói” ( Hoiland ).
Các con số chính thức ở Việt Nam cho thấy bệnh tiểu đường túyp 2 gia tăng với
chỉ 1% người trưởng thành trong dân số vào năm 1991, năm đu tiên có khảo sát toàn
quốc, lên 6% vào năm ngoái, theo trích dẫn của tờ The New York Times.
Trước tình hình đó, dựa trên đường Steviozit có trong cây cỏ ngọt có công thức là
C
38
H
60
O
18
có độ ngọt gấp 300 ln so với đường saccharose, ít năng lượng, ngon,
không lên men, không bị phân huỷ, bởi vậy rất có triển vọng dùng để thay đường
trong chế độ ăn kiêng và h trợ trong căn bệnh tiểu đường.
Hiện nay ở nước ta, Cây cỏ ngọt là một trong những cây trong nhóm được chú ý
phát triển. Cây cỏ ngọt đã đang được nhân giống bằng phương pháp truyền thống
như giâm cành, gieo hạt nên khó đảm bảo được về chất lượng, tính đồng nhất của
giống và có thể gây thoái hóa giống. Vì vậy, chúng tôi thực hiên đề tài: “NHÂN
GIỐNG CÂY CỎ NGỌT IN VITRO (STEVIA REBAUDIANA)”. Nhằm mục đích góp
một phn nhỏ vào việc tạo nguồn cây con đồng nhất cho sản xuất.


Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum

Trang
2



PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt
Tên thường gọi: Cỏ ngọt, Cỏ mật, cỏ
cúc
Tên khoa học: Stevia rebaudiana
2.1.1. Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Bộ: Asterales
Tông: Eupatorieae
Họ: cúc Asteraceae (Compositae)
Chi: Stevia
Loài: Stevia rebaudiana
Cỏ ngọt có khoảng 240 loài có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ,
Mexico và một vài tiểu bang miền namHoa Kỳ.
Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau :
 Stevia eupatoria
 Stevia ovata
 Stevia plummerae
 Stevia rebaudiana
 Stevia salicifolia
 Stevia serrata
Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo sát trên 184 loài cỏ ngọt thì có khoảng 18
loài cho chất ngọt nhưng trong 18 loài này Stevia ribaudiana là loài cho chất ngọt
nhiều nhất.
2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt

Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ.
Vào thế kỉ 16, các thủy thủ người Tây Ban Nha đã từng đề cập đến loại thảo mộc
này rồi nhưng đến năm 1888 các nhà thực vật học người Paraguay là Mises
Santiago Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi nó là Stevia rebaudianoa
Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt
Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia
rebaudiana)
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
3



Bertoni. Từ ngàn năm nay thổ dân Guarani người Paraguay đã dùng loại thảo
mộc này để làm dịu ngọt các loại thức ăn, nước uống có tính đắng và cũng dùng
để trị một số bệnh béo phì, tim mạch, cao huyết áp.
2.1.3. Phân bố
Cỏ ngọt được trồng và sử dụng hu hết các Châu lục, đặc biệt ở các nước Nhật
Bản, Inđônêxia, Braxin, Paraguay, Mỹ, Thái Lan… Ngày nay cỏ ngọt được trồng
khá phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc, Inđônêxia và một số
nước khác. Cỏ ngọt được nhập vào nước ta từ năm 1988 trồng thử nghệm. Hiện
nay cỏ ngọt đã thích ứng với nhiều vùng khí hậu khác nhau ở nước ta như, sinh
trưởng tốt tại Sông Bé, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Vĩnh
Phúc, Yên bái.
2.1.4. Đặc điểm hình thái
a. Thân, cành
Cỏ ngọt là dạng thân bụi thân tròn có nhiều lông, mọc thẳng. Chiều cao thu
hoạch là 50-60 cm, tốt đạt 80-120 cm, thân chính có đường kính đạt 2.5 –8 mm.

Cỏ ngọt phân cành nhiều, khi ra hoa mới phân cành cấp 2, 3. cành cấp 1 thường
xuất hiện từ các đốt lá cách mặt đất 10 cm. Thông thường cây cỏ ngọt cho 25– 30
cành. Tổng số cành trên cây có thể đạt 140. Thân non màu xanh, già màu tím nâu,
có hệ thân mm phát triển mạnh.
b. Lá
Mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có từ 12-16 răng cưa. Lá hình
trứng ngược. Cây con gieo từ hạt có 2 lá mm tròn tới cặp lá thứ tư mới có răng
cưa ở mép lá. Lá trưởng thành dài khoảng 50 – 70mm, rộng 17-20mm có 3 gân
song song, lá màu xanh lục,trên thân có70-90 lá.
c. Hoa
Hoa tự, nhóm họp dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4-7 hoa đơn lưỡng tính.
Mi hoa đơn hình ống có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh
tràng màu trắng khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4-5 dính trên tràng có
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
4



màu vàng sáng, cá chỉ nhị rời còn bao phấn dính mép với nhau. Bu hạ 1 ô, 1
noãn, vòi nhụy mảnh chẻ đôi, các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả
năng tự thụ phấn thấp hoặc không có.
d. Quả và hạt
Quả và hạt của cây cỏ ngọt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu thẫm, 5
cạnh dài từ 2- 2,5mm. Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi, nhưng nội nhũ trn do vậy tỉ lệ
này mm thấp.
e. Rễ
Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm. Hệ rễ chùm lan rộng

ở đường kính 40 cm và có độ sâu từ 20– 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều
kiện đất tơi xốp, đủ ẩm. Là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0–30 cm
tùy thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngm của đất.

Hình 2.3 Các bộ phận của cây cỏ ngọt.
2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng:
Cỏ ngọt là cây lâu năm, nó có thể sống từ 5-10 năm. Tuy nhiên, khi năng suất
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
5



của cỏ ngọt đã xuống thấp thì nên nhổ bỏ và trồng lại cây mới.
Là cây bán nhiệt đới ưa ẩm, ưa sáng nhưng sợ úng và chết khi ngập nước. Sinh
sản hữu tính (gieo hạt) hoặc vô tính (giâm cành).
2.1.6. Điều kiện sinh trưởng
a. Nhiệt độ
Cỏ ngọt là cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng trong điều kiện mát mẻ. Có thể sinh
trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 15-30℃, nhiệt độ thích hợp
nhất là 20-22℃. Nhiệt độ tối thích hợp cho sự nảy mm của hạt là 20℃. Nhiệt độ
cao làm tăng hàm lượng steviozit. Từ 15-30℃ cây sinh trưởng khoẻ, cho năng
suất thu hoạch cao. Nhiệt độ > 35℃. cây sinh trưởng kém.
b. Ẩm độ
Môi trường sống tự nhiên của cây cỏ ngọt thích hợp nhất là khí hậu cận nhiệt
đới, ưa ẩm ướt, với lượng mưa trung bình hàng năm từ 1400-1600mm. Độ ẩm
thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển là 70-85%. Cỏ ngọt thường mọc tự
nhiện trên các đm ly.

c. Ánh sáng
Cỏ ngọt là cây tương đối mẫn cảm với độ chiếu sáng. Cường độ ánh sáng
mạnh làm tăng hàm lượng steviozit.
d. Đất và dinh dưỡng khoáng
Cỏ ngọt có thể sinh trưởng và phát triển trên nhiều loại đất khác nhau, nhưng
thích hợp nhất là đất tơi xốp, thông thoáng, nhiều mùn. Trên những đất như thế
cỏ ngọt cho thu hoạch cao, hàm lượng các chất ngọt tăng. Đất sét không thích
hơp cho sự sinh trưởng của cỏ ngọt. Cỏ ngọt là cây thu hoạch lá do vậy nó yêu
cu chế độ dinh dưỡng cao, vì thế bón phân là biện pháp tích cực để tăng năng
suất cỏ ngọt. Cỏ ngọt ưa đất trung tính, PH trong đất khoảng từ 6,5 đến 7 là tốt
nhất.

Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
6



2.2. Nhân giống cây trồng in vitro
2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cn thiết trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều ln tốc độ
vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di
truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất.
Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng
quý hiếm.
Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đu bằng một mảnh nhỏ

thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo
mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân
giống.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp
nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu
quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White, 1939) và rễ
(Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố
bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980,
1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có
3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu
được sử dụng trong nuôi cấy.
Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương h của
các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình
hình thành chồi và rễ (Brown & Thorpe, 1986).
2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực
vật. Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 - 20 năm trở lại
đây. Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
7



được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học
như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận
định:
Đó là tính toàn thế của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn

chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan
trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được
những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng.
Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cây đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính
sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà khoa học khai
thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt).
Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với
tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây), cây
cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch, ).
Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng
trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm.
Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra
các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo.
Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen.
Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng
ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống.
Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn
chỉnh từ các protoplast lai.
Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa.
Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp
không mất tính toàn thế của tế bào.
Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu
di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật.
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
8

Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phn quan trọng
không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế.
Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới năm 2010
là: Tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực
vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995).
2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm
sau:
Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phn này giống như nhân
giống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phn lớn các
loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể
không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm
hơn nhân giống qua hạt.
So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống
bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá
thể ban đu trong thời gian ngắn.
Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đu
một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đu trở nên sạch bệnh. Không chiếm
nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một
giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao
đổi giống được dễ dàng.
2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro
Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), sự thành công của việc nhân giống in vitro
chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn:
a. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in
vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum

Trang
9



vào nuôi cấy in vitro.
Theo tài liệu của Street (1974) các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô nuôi cấy
như sau:

Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong nhân
giống in vitro
Tác nhân vô
trùng
Nồng độ
(%)
Thời gian xử
lý (phút)
Hiệu quả
Hypochlorit
Calcium
9-10
5-30
Rất tốt
Natri hypochlorit
2
5-3
Rất tốt
Hydroperoxid

10-12
5-15
Tốt
Nước brom
1 -2
2 - 10
Rất tốt
HgCl2
0,1 -1
2 - 10
TB
Chất kháng sinh
4 - 50mg/l
30 - 60
Khá tốt
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay ln đu tiên. Tuy
vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài ln
thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.
b. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô
nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất
auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh
điều kiện đó cũng cn quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non,
chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá
sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh
của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi.
c. Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số
nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum

Trang
10



sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin, ), các chất bổ sung khác như nước
dừa, dịch chiết nấm men,. kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.
Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích
thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát
triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô
tính.
d. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 - 3 tun, từ những chồi riêng lẽ này sẽ
xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ
sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có
chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
e. Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá
trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này
trong thực tiễn sản xuất.
Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh
sáng, ẩm độ, giá thể,.) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm
cũng như ruộng sản xuất.
2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
a. Mẫu nuôi cấy
Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và

chỉ cho thấy hu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng
cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn
lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu.
b. Kiểu gen
Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá được sử
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
11



dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các
genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990)
ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi
cấy hạt phấn cà chua Lycopersycon esculentum Mill.


c. Chọn cơ quan
Murashige (1974) cho rằng hu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử
dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác
nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller
(1976) cho rằng chồi mm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nẩy mm từ hạt.
d. Tuổi và sinh lý
Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho
thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều
nghiên cứu khác nhau vế ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik
(1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già.
e. Mẫu in vitro

Trong những năm gn đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có
khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn
ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al. (1991)
ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây
đồng ruộng.
f. Sức sống của mẫu
Điều cn thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in
vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những
cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cn phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất
là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn
những cây bệnh được nhân lên.
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
12



2.2.6. Điều kiện nuôi cấy
a. Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 - 27℃. Theo Murashige (1974),
nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những
tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan.

b. Cường độ ánh sáng
Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến
khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng hình như có
liên hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng
thấp hay tối (Papachatzi et al., 1981; Miller và Murashige, 1976; Thorpe và

Murashige, 1970). Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điêu kiện ánh sáng 1000
lux (Dương Công Kiên, 2002).
c. Quang kỳ và chất lượng ánh sáng
+ Thời gian chiếu sáng
Ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng.
+ Chất lượng ánh sáng
Ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh
sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh
dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro.
+ Các chất khí
Thành phn chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây in
vitro. O2, CO2 và ethylen là những thành phn chất khí được khảo sát nhiều
trong môi trường nuôi cấy. Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến
quá trình làm khô mẫu nuôi cấy.
2.2.7. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cn thiết. Vì
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
13



mi loại cây trồng khác nhau đều yêu cu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau.
Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ
theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mm hay tái sinh cây
hoàn chỉnh.
Việc lựa chọn môi trường cn dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy
hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp

cho mẫu nuôi cấy.
Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phn chính với nguyên tắc
có sự cân bằng các yếu tố trong môi trường.
Các thành phn chính:
 Đường làm nguồn carbon.
 Các muối khoáng đa lượng.
 Các vitamin.
 Các chất điều hòa sinh trưởng.
Ngoài ra các tác giả còn cho thêm một số chất hữu cơ như: Nước dừa, nước
chiết nấm men.
2.2.8. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)
Chất ĐHSTTV hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản
phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo). Chúng có tác
dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Tuy nhiên, các
chất ĐHSTTV chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực
tiếp vào quá trình trao đổi chất. Nó không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng.
Chất ĐHSTTV gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé lên trao đổi
chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm. Trong
thành phn môi trường nuôi cấy, các chất ĐHSTTV làm việc như chiếc chìa khoá
đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt
chất. Tác dụng của chất ĐHSTTV liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng
tổng hợp enzyme trong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử DNA.
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum


Trang
14

Mi một chất ĐHSTTV đều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của
thực vật, để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường
không phải là một mà là vài chất. Tuỳ mi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát
triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau. Trong phạm vi nghiên
cứu của đề tài chúng tôi sử dụng các chất thuộc nhóm auxin và cytokinin.


a. Auxin
Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự
hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng
quả. Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn
cản sự phân giải chúng. Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì
chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hoá tế bào
cn thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật. Auxin cùng với một số chất
điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành
cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:
Indol acetic acid (IAA)
Naphthyl acetic acid (NAA).
2,4-D Dichlorophenol acetic acid (2,4-D).
Indol butyric acid (IBA).
b. Cytokinin
Bao gồm các nhóm chất: 6-Benzylaaminopurin (BAP), Kinetin (Ki), Zeatin
(Z), Thidiazuron (TDZ).
Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng
tốc độ phân bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng
thời ức chế sự phân hoá rễ của mô cấy.
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum

Trang
15



Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này
cytokinin cn thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong
một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông
thường cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi. Và ngược lại, auxin cao
hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ.
Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp
DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất.

2.2.9. Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam
a. Trên thế giới
Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về việc nhân giống cây cỏ ngọt in vitro trên thế
giới. Một số kết quả nghiên cứu nhân giống cây cỏ ngọt bằng phương pháp in vitro đã
được công bố trên các tạp chí như :
MUHAMMAD RAFIQ và cộng sự thuộc Viện Công nghệ sinh học và kỹ thuật di
truyền, Đại học Sindh, Jamshoro, Pakistan được đăng trên tạp chí Pak. J. Bot., 39(7):
2467-2474 (2007). Họ tiến hành khảo sát khả năng ra rễ của cây cỏ ngọt in vitro trên
môi trường MS với các nồng độ khác nhau của hai CĐHST thực vật là IAA và NAA.
Kết quả thu được là với việc bổ sung 0.5 mg/L NAA việc hình thành rễ của cây cỏ
ngọt là tốt hơn so với các nghiệm thức còn lại.
Maria GENEVA và các cộng sự thuộc Viện Sinh lý thực vật và Di truyền học, Viện
Hàn lâm Khoa học Bulgaria, Sofia 1113, Bulgaria được đăng trên Tạp chí Sinh học
Thổ Nhĩ Kỳ (Turkish Journal of Biology) tháng 1/ 2013. Nghiên cứu cho rằng: Môi
trường MS bổ sung 1.0 mg/l BAP kết hợp với 0.1mg/l là môi trường phù hợp nhất cho
việc nhân nhanh chồi của cây cỏ ngọt in vitro. Và môi trường ½ MS bổ sung 0.1 mg/l
IBA cho kết quả tạo rễ của cây cỏ ngọt in vi tro là tối ưu nhất.

b. Tại việt nam
Cây cỏ ngọt là loại cây mới có mặt ở nước ta khoảng 20 năm nay. Việc nhân
giống cỏ ngọt chủ yếu bằng phương pháp gieo hạt, giâm cành. Việc nghiên cứu