chương 5 các vecto và sự tạo dòng

Caực vector & sửù taùo doứng
CHệễNG 5
rDNA không phải là nhân bản động vật
Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp là
công cụ tìm hiểu cấu trúc, chức
năng, và sự điều hòa của các
gene và sản phẩm của gene.
•
Các mục đích của kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp gồm:
–
Nhận dạng các gene
–
Tách các gene
–
Điều chỉnh các gene
–
Tái biểu hiện các gene ở sinh vật hoặc cơ thể
chủ khác
•
Cho phép các nhà khoa học:
–
Xác định các gene mã hóa và sản phẩm của
chúng (breast cancer, retino-blastoma, và neurofibromatosis)
–
Điều trị các bệnh do gene (cystic fibrosis, rheumatoid arthritis,
vascular disease, và certain cancers)
–
Sản xuất lượng lớn hormones, vaccines, và các
hợp chất sinh học khác mà Y học quan tâm (Insulin,
growth hormone, follicle-stimulating hormone)
Vector Plasmid

Vector tạo dòng là 1 phân tử DNA mang DNA ngoại lai vào tế bào
chủ, sao chép trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men để tạo ra nhiều
bản sao hoặc tao ra sản phẩm protein của DNA ngoại lai.
Đặc trưng chính của các vector tạo dòng:
•
Có trình tự cho phép sự tự sao chép trong vi khuẩn hay nấm men
•
Có vị trí để chèn DNA ngoại lai. Hầu hết các vector có trình tự cắt
duy nhất của nhiều enzyme cắt giới hạn (MCS)
•
Một phương pháp để nhận biết tế bào có chứa vector, thường là
các marker chọn lọc tính kháng kháng sinh.
Các loại vector
•
Plasmid – DNA dạng vòng tự sao chép nhân đôi trong tế bào vi
khuẩn. Khả năng dòng hóa: 0.1-10 kilobases (kb)
•
Phage – dẫn xuất của bacteriophage lambda; phân tử DNA thẳng có
thể được thay thế bằng DNA ngoại lai mà không làm gián đoạn vòng
đời của nó. Khả năng dòng hóa: 8-20 Kb
•
Cosmids – DNA dạng vòng kết hợp các tính năng của plasmid và
phage. Khả năng dòng hóa: 35-50 Kb
•
Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC) – dựa trên mini-plasmid F
của vi khuẩn. Khả năng dòng hóa: 75-300 Kb
•
Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC) – một nhiễm sắc thể nhân
tạo có chứa telomeres, nguồn gốc của sao chép (ori), centromere của
nấm men, và marker để lựa chọn xác định các tế bào nấm men. Khả

năng dòng hóa: 100-1000 Kb
Plasmid Vectors
Điện di trên gel agarose plasmid tự nhiên
Plasmid nhân tạo đầu tiên pBR322
(High-Copy-Number)
Plasmid tự nhiên ColE1
Plasmid tự nhiên (low copy number) pSC101
The pUC 18 or 19 Cloning Vector
(Very high copy number)
RE Sites in blue occur only once in the plasmid
Lac Z α
Origin of
Replication
Multiple
Cloning
Site
Promotor
Site
Antibiotic
Resistance
Gene
MCS – Multi Cloning Site

Các vị trí cắt duy nhất

Chèn/cắt đoạn DNA ngoại lai dễ dàng

Subcloning dễ dàng hơn
Chức năng sao chép không được mã hóa trên
plasmid. Nó sử dụng chức năng từ các

DNA polymerase I và III, DNA-RNA polymerase
của tế bào chủ.
Có thể ức chế sự tổng hợp protein với thuốc
kháng sinh (chloramphenicol, spectinomycin). Vậy
sự sao chép của plasmid có xảy ra không khi
chloramphenicol hiện diện trong tế bào?
Replicons kiểm soát khả năng
tương thích của plasmid
•
Khả năng tương thích của plasmid: khả năng
của hai plasmid khác nhau cùng tồn tại trong
cùng một TB chủ
•
Plasmid sử dụng các hệ thống sao chép giong
nhau không thể cùng tồn tại trong cùng một tế
bào vi khuẩn
•
Các plasmid mang cùng replicon thuộc nhóm
không tương thích
Sự không tương thích của plasmids
Khi 2 plasmid cùng chia sẽ các yếu tố cùa cùng 1
bộ máy sao chép
Sẽ có sự cạnh tranh
Không thể cùng tồn tại khi không có sự chọn lọc
trong môi trường nuôi vi khuẩn
☞ Cùng replicon  nhóm không tương thích 
không thể duy trì trong cùng 1 vi khuẩn
Hơn 30 nhóm không tương thích được biết
Plasmid Replicon Copy Number
pBR 322 and its derivatives pMB1 15-20

pUC vectors pMB1 500-700
pACYC and its derivatives p15A 10-12
pSC101 and its derivatives pSC101 ~5
ColE1 ColE1 15-20
Sự an toàn của plasmid
Một số plasmid tự nhiên có thể được chuyển
giao cho TB khác bằng conjugation
Conjugation đòi hỏi ba yếu tố:
–
Một gen linh động trans-acting (mob)
–
Một yếu tố cis-acting (bom)
–
Một vị trí cụ thể bị đứt mạch (nicked) bởi mob
(nic)
Một số plasmid cũ như pBR322 bị thiếu mob
Một số vector mới hơn như pUC thiếu nic /
bom và không thể linh động
Người ta tin rằng "an toàn" của các chủng vi khuẩn, vi
rút và vectơ có thể được thực hiện trong một vài tuần
NIH thành lập Ban tư vấn về DNA tái tổ hợp (RAC)
Phải mất năm 1 (1976) trước khi dòng "an toàn" E.coli
đầu tiên (loại EK2) đã được tạo ra.
Năm đó, RAC phát hành một bộ nguyên tắc đòi hỏi
việc sử dụng các vi khuẩn an toàn
Asilomar Conference
NIH Guidelines

Self Regulation in Science Milestone


Contents

Specified handling and construction processes

Microorganisms containing recombinant DNA were
prohibited outside of the laboratory

Vectors that sexually move to “unsafe” bacteria was
prohibited

Subsequent modifications

1986 expanded to include animals and plants, and 4 biosafety
levels

1994 officially relinquished control of GMO plants in the
environment to EPA and APHIS
Xu hướng tiếp theo là phát triển plasmid nhỏ
Ưu điểm
•
Tăng hiệu quả của biến nạp
•
Dễ dàng hơn tạo bản đồ enzyme cắt giới hạn
•
Số lượng plasmid cao hơn
Giới hạn chính của tạo dòng sử
dụng plasmid
•
Giới hạn tối đa của kích thước DNA tạo dòng là 10
kb

•
Cần chuẩn bị các tế bào chủ khả nạp
•
Không hiệu quả khi tạo genomic libraries vì các
vùng trùng lặp cần thiết để tạo ra trình tự thích hợp
•
Thích số lượng clone nhỏ để biến nạp
•
Tạo ra các vùng gene lớn nhưng rời rạc
•
Nếu bộ gene của E. coli chứa 4,639,221 bp, cần
bao nhiêu clone để tạo dòng cả bộ genome?
•
Nếu là vector biểu hiện thì các giới hạn liên quan
đến biểu hiện protein của eukaryote
Bacteriophage lambda (λ)
In 1971 Alan
Campbell showed
that the central third
of the genome was
not required for lytic
growth. People
started to replace it
with E. coli DNA
/>Các vector tạo dòng là phage
•
Vector phage có thể chứa đoạn DNA ngoại lai lên đến 23 KB
•
Phage Lambda là phổ biến nhất
•

60% của bộ gen cần thiết cho con đường lytic. Các đoạn của
DNA Lambda bị loại bỏ và một mảnh stuffer được giữ lại
•
Đoạn stuffer này giữ cho kích thước vector đúng và có mang
gen marker. Khi DNA ngoại lai được chèn vào vector,
marker bị bất hoạt.
•
Ví dụ: Charon 4A Lambda Khi Charon 4A Lambda là còn
nguyên vẹn, beta-galactosidase phản ứng với X-gal và các
khuẩn lạc có màu xanh lam. Khi các đoạn DNA ngoại lai
chèn vào khu vực stuffer, gen lac mã hóa cho beta-
galactosidase bị bất hoạt, và các khuẩn lạc có màu trắng.
Lambda genome is
approximately 49
kb in length.
Only 30 kb is
required for lytic
growth.
Thus, one could
clone 19 kb of
“foreign” DNA.
Packaging
efficiency 78%-
100% of the
lambda genome.
A complete animation of the lytic cycle:
/>Bacteriophage lambda
COS site: Cohesive “sticky”
ends
Lysis

Lysogeny
Head
Tail
Replication
Circularized
lambda
ori
Không phải Bacteriophage lambda

Loại các phần DNA ko cần thiết

Có thể chèn đoạn DNA lớn (~ 20 kb)
COS
Lysis
Head
Tail
Replication
ori