phương pháp xử lý vỏ cà phê làm phân bón vi sinh

Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực tập tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng em đã
được các anh chị hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp chúng em hoàn thành nhiệm vụ nhà
trường giao cho. Em xin chân thành cảm ơn trung tâm rất nhiều, đặc biệt là chị Nguyễn
Thị Minh Quyên (người hướng dẫn trực tiếp) và anh Võ Quốc Bảo – Trưởng phòng Công
nghệ tế bào thực vật, cùng với tất cả các anh chị trong Trung tâm.
Trung tâm Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho chúng em có cơ hội làm việc
thực tế qua đó cũng cố lại những kiến thức lý thuyết đã học giúp chúng em hiểu thêm về
ngành học của mình. Trong một tháng thực tập, em không tránh khỏi những sai lầm và
thiếu sót mong các anh chị thông cảm và bỏ qua cho em. Em xin chân thành cảm ơn.

Đà Nẵng, ngày 10 tháng 1 năm 2012.
Sv: Nguyễn Lương Bằng
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 1
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
1.1. Lịch sử, bộ phận chức năng và tình hình hoạt động của Trung tâm
Công nghệ Sinh học Đà Nẵng: 5
1.2. Chức năng, nhiệm vụ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật: 5
1.3. Bố trí tổng mặt bằng trung tâm 6
1.3.1. Phòng rửa, sản xuất nước khử ion, hấp môi trường: 6
1.3.2. Phòng chuẩn bị môi trường: 7
1.3.3. Phòng nuôi mẫu cấy: 9
2.1. Thành phần chính của môi trường 10
2.1.1. Đường 10
2.1.2. Các muối khoáng đa lượng 10
2.1.3. Các muối khoáng vi lượng: 11
2.1.4. Các vitamin 12
2.1.5. Các chất điều khiển sinh trưởng: 12
2.1.6. Các chất hữu cơ khác 13
2.2. Vấn đề lựa chọn môi trường 14

2.3. Chuẩn bị các dung dịch làm việc 15
3.1. Nguồn gốc phân bố. 20
3.2. Phân loại. 20
3.3. Đặc điểm hình thái 20
3.4. Một số tác động ảnh hưởng đến Dendrobium. 21
3.5. Các giai đoạn phát triển của lan. 22
3.5.1. Giai đoạn nảy mầm của hạt. 22
3.5.2. Giai đoạn cây con. 22
3.5.3. Giai đoạn trưởng thành 22
3.5.4. Giai đoạn mang hoa, đậu trái, tạo hột. 23
3.6. Phương pháp nhân giống lan. 23
3.6.1. Phương pháp nhân giống lan cổ truyền 23
3.6.2. Phương pháp nuôi cấy mô. 23
3.7. Quy trình nuôi trồng Lan Dendrobium. 23
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 2
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
3.7.1. Qui trình nuôi trồng 23
3.7.2. Thuyết minh quy trình 24
3.7.3. Môi trường nuôi cấy 25
MỞ ĐẦU
Trên thế giới hiện nay, công nghệ sinh học được coi là một trong những ngành khoa học
mũi nhọn của thế kỷ 21. Công nghệ sinh học đã và đang làm thay đổi dần cuộc sống của
các dân tộc trên thế giới trong các lĩnh vực y tế (nhất là dược phẩm) công nghệ vi sinh,
sinh học, nông nghiệp (giống cây, giống con). Có rất nhiều khám phá và ứng dụng từ các
thành tựu công nghệ sinh học đã dược loài người thừa hưởng.
Năm 2000 thị trường về các sản phẩm mới của công nghệ sinh học đạt khoảng 400 tỷ
USD. Trong đó, các sản phẩm phục vụ y dược 29 tỷ đồng, phục vụ công nghiệp thực
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 3
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
phẩm 12,66 tỷ đồng, phục vụ công nghiệp năng lượng 104,7 tỷ đồng, phục vụ công

nghiệp hóa phẩm 13,53 tỷ đồng, axit amin 4,5 tỷ đồng, sản phẩm phục vụ nông nghiệp
218,7 tỷ đồng. Các sản phẩm phục vụ riêng cho tạo giống cây trồng, vật nuôi là 210 tỷ
đồng, các cây cố định đạm 8,7 tỷ đồng, dịch đường Fructose thay saccharose 5,4 tỷ
đồng [1]
Một trong những thành tựu nổi bật của công nghệ sinh học là lĩnh vực nhân giống và
phục tráng giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, tạo ra công
nghệ nhân nhanh các giống cây lương thực, rau quả, cây hoa cảnh, cây công nghiệp và
cây rừng có năng suất chất lượng tốt và tính chống chịu cao đối với các điều kiện ngoại
cảnh bất lợi cũng như sâu bệnh, phục vụ phát triển nông – lâm nghiệp và phủ xanh đất
trống đồi núi trọc.
Đối với một nước đang phát triển như nước ta hiện nay thì công nghệ sinh học
chỉ bước đầu hình thành và phát triển thì việc đi sâu vào nghiên cứu cũng như ứng dụng
những nghiên cứu đó vào thực tế sản xuất để nâng cao năng suất cây trồng, vật nuôi là
việc làm cần thiết. Vì thế là sinh viên ngành công nghệ sinh học thì việc thực tập thực tế
để hiểu về quá trình sản xuất thực tế ngành nuôi cấy mô và qua đó cũng cố lại những
kiến thức lý thuyết đã học là việc không thể thiếu. Đó cũng là mục đích của việc thực tập
tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng lần này.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 4
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
II. TỔNG QUAN VỀ TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀ NẴNG
1.1. Lịch sử, bộ phận chức năng và tình hình hoạt động của Trung tâm
Công nghệ Sinh học Đà Nẵng:
- Lịch sử Trung tâm:
Được tách ra từ Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học và Ứng Dụng Khoa Học Công
Nghệ Đà Nẵng theo quyết định số 8725/QD-UBND ngày 12 tháng 11 năm 2010 và
chính thức trở thành Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng ngày 01.01.2011.
- Các bộ phận chức năng:
+ Ban giám đốc
+ Phòng Tổng hợp Hành chính
+ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật

+ Phòng Công nghệ Vi sinh
+ Trạm sản xuất
1.2. Chức năng, nhiệm vụ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật:
- Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ tế bào thực vật nhằm sản xuất giống cây
trồng chất lượng cao phục vụ các vùng trồng trọt, các nhà vườn, hộ nông dân trên địa
bàn thành phố Đà Nẵng và các vùng lân cận
- Tham mưu cho Ban lãnh đạo Trung tâm trong sự phát triển ngành Công nghệ Tế
bào Thực vật phục vụ công tác bảo tồn và nhân nhanh các giống cây trồng, nguồn gen
thực vật quý, hiếm.
- Đề xuất, nghiên cứu và triển khai các chương trình ứng dụng khoa học công
nghệ, các đề tài, dự án thuộc các cấp.
- Thực hiện công tác đào tạo, chuyển giao công nghệ tế bào thực vật cho các cá
nhân, tổ chức có nhu cầu.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 5
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
1.3. Bố trí tổng mặt bằng trung tâm
1.3.1. Phòng rửa, sản xuất nước khử ion, hấp môi trường:
- Dụng cụ, chai lọ thuỷ tinh được rửa bằng nước sạch.
- Sau đó được úp trên kệ đựng chai lọ hoặc úp lên rổ để khô.
- Chai lọ thuỷ tinh khô được cất vào thùng giấy.
- Sử dụng nước cất để pha môi trường.
- Môi trường sau khi nấu được rót vào các bình thuỷ tinh, đậy nắp rồi đưa
vào nồi hấp trong 25 phút, ở 120 – 121
o
C, P = 1 – 1,1 at.
Nồi hấp môi trường
Thông số kỹ thuật của nồi hấp môi trường:
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 6
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
- Nhiệt độ: max = 370

o
C.
- Áp suất: max = 4 kpa
- Dung tích 110 lít.
1.3.2. Phòng chuẩn bị môi trường:
Gồm có tủ đựng hoá chất và các máy sau:
pH meter
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 7
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Cân kỹ thuật Cân phân tích
- Độ chính xác 10
-3
g. - Độ chính xác 10
- 4
g.
- max = 320 g. - max = 210 g.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 8
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Phòng cấy vô trùng:
Phòng cấy vô trùng, sàn được lát gạch men, tường được sơn, trên tường có gắn đèn UV
để khử trùng phòng. Cửa phòng cấy là cửa kính. Trong phòng cấy có các kệ thép được
sơn trắng để đựng bình môi trường. Có 2 loại tủ cấy : tủ cấy đơn và tủ cấy đôi. Trong tủ
cấy có đèn trắng để dễ làm việc và đèn UV để khử trùng trước khi làm việc. Ngoài ra,
trong phòng cấy còn có bình chữa lửa để có thể dập tắt lửa kịp thời khi gặp sự cố như
cháy đèn cồn
Tủ cấy đơn
1.3.3. Phòng nuôi mẫu cấy:
- Có 2 phòng nuôi có diện tích 4 x 5 m.
- Tường phòng nuôi được sơn màu trắng. Các giá đèn được lắp đèn huỳnh
quang để chiếu sáng.

- Phòng nuôi có nhiệt độ 15 – 30
o
C tuỳ theo mẫu cấy và mục đích thí
nghiệm.
- Biên độ độ ẩm điều chỉnh được từ 20 – 98
o
C.
- Phòng có gắn các máy kiểm tra chính xác nhiệt độ và độ ẩm.
- Trong phòng có các giá bằng gỗ hoặc bằng thép được sơn trắng để bình
nuôi cấy.
- Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chổ để bình
nuôi cấy từ 2000 – 3000 lux.
- Phòng có máy điều hoà nhiệt độ.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 9
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
III. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Hầu hết tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm năm thành phần chính:
- Đường cung cấp nguồn carbon.
- Các muối khoáng đa lượng.
- Các muối khoáng vi lượng.
- Các vitamin.
- Các chất điều khiển sinh trưởng.
Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần
hóa học xác định (các amino acid, EDTA ) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết
nấm men, dịch chiết cà chua ).
2.1. Thành phần chính của môi trường
2.1.1. Đường
Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose. Nhưng saccharose
được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi
từ 1-12%, thông dụng là 2-3%.

2.1.2. Các muối khoáng đa lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với
cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: N, P,
K, Ca, Mg và S (Bảng 2.1).
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 10
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Bảng 2.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô [2]
Stt
Nguyên tố
đa lượng
Dạng sử dụng
Nồng độ
(mm)
1
N Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, KNO
3
, NaNO
3
,
NH
4
NO
3
,

∑ [NO
3
-
,
NH
4
+
]
(NO
3
-
,
NH
4
+
)
(NH
4
)
2
SO
4
khoảng 20
2 P NaH
2
PO
4
.7H
2
O, KH

2
PO
4
khoảng 1
3 K KNO
3
, KCl.6H
2
O, KH
2
PO
4
khoảng 10
4
Ca Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, CaCl
2
.2H
2
O
hoặc
khoảng 2
CaCl
2
.6H

2
O
5 Mg MgSO
4
.7H
2
O 0,5-3
6 S (NH
4
)
2
SO
4
khoảng 1
2.1.3. Các muối khoáng vi lượng:
Nhu cầu muối khoáng của mô thực vật trong nuôi cấy là lĩnh vực ít được nghiên
cứu. Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với
sự phát triển của mô và tế bào nuôi cấy.
Bảng 2.2. Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô
Stt
Nguyên tố
vi lượng
Dạng sử dụng
Nồng độ
(mg/L)
1 Mn MnSO
4
.4H
2
O 15-100

2 B H
3
BO
3
6-100
3 Zn ZnSO
4
.7H
2
O 15-30
4 Cu CuSO
4
.5H
2
O 0,01-0,08
5 Mo Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,007-1
6 Co CoCl
2
.6H
2
O 0,1-0,4
7 I KI 2,5-20
8 Fe FeSO
4

.7H
2
O 15-27,9
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 11
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
2.1.4. Các vitamin
Các vitamin thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy (chủ yếu là bốn
loại đầu). Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ
trong ngăn đá tủ lạnh.
Bảng 2.3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô [2]
Stt Tên vitamin
Nồng độ
(mg/L)
1 myo-inositol 100
2 Nicotinic acid 0,5-1
3 Pyridoxine.HCl (Vit B
6
) 0,05-0,5
4 Thiamine.HCl (Vit B
1
) 10-50
5
Panthotenate calcium (Vit
B
5
)
1-5
6 Riboflavin (Vit B
2
) 1-5

7 Biotin 0,1-1
8 Folic acid 0,1-1
2.1.5. Các chất điều khiển sinh trưởng:
Một số chất sinh trưởng không tan trong nước, do đó khi pha dung dịch mẹ chất
sinh trưởng cần chú ý:
- Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất và vài giọt HCl 1 N,
lắc cho tan sau đó thêm nước cất đến thể tích cần pha.
- Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1 N trước khi pha đến thể tích cần thiết.
Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA bảo quản trong
lọ màu nâu), cất giữ tủ lạnh. 2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản như vậy trong
một năm. BAP, IBA, KIN, và GA
3
bảo quản được từ 2 đến 3 tháng. IAA cần pha lại hàng
tháng để đảm bảo hoạt tính.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 12
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Bảng 2.4. Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng
Chữ
viết
tắt
Chất kích thích sinh
trưởng
Chữ
viết
tắt
Chất kích thích sinh
trưởng
BA Benzyladenin KIN Kinetin
BAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acid
GA

3
Gibberellic acid 2hZ Dihydrozeatin
IAA Indoleacetic acid TDZ Thidiazuron
IBA Indolebutyric acid Zea Zeatin
2-iP 2-Isopentenyl adenin 2,4-D 2,4-
Dichlorophenoxyacetic
acid
NOA Naphthoxyacetic acid Pic Picloram
Chú ý:
Các chất sinh trưởng có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp (10
-
8).
Cần dùng pipette riêng cho từng loại chất sinh trưởng một. Và chú ý rửa cẩn thận các ly,
cốc, chai lọc đã dùng để đựng và pha các chất sinh trưởng ở nồng độ cao. Ngoại trừ IAA
và GA
3
, các chất sinh trưởng còn lại được coi là bền vững trong quá trình hấp vô trùng.
[2]
IAA sau khi pha dung dịch stock, được lọc qua màng lọc millipore sau đó chứa
trong các tube eppendof được bọc giấy nhôm bên ngoài, bảo quản lạnh sâu. Môi trường
sau khi hấp khử trùng để nhiệt độ giảm xuống còn khoảng 50-60
o
C khi đó mới cho IAA
đã lọc vào (các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
2.1.6. Các chất hữu cơ khác
2.1.6.1. Nước dừa
Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-inositol và
một số amino acid khác. Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá
cao, từ 10-20% thể tích môi trường. Lấy nước dừa già, lọc trong, cho vào các túi nilon và
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 13

Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
bảo quản trong lạnh sâu cho đến khi dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng. Tốt
nhất là nên sử dụng tươi.
2.1.6.2. Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein
Đây là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô và tế bào động
vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ.
Dung dịch thủy phân casein cung cấp một số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L
môi trường.
2.2. Vấn đề lựa chọn môi trường
Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là
chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách
thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối
tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng loại môi trường gì. Bước
đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho
phù hợp qua một số thí nghiệm thăm dò.
Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác
nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau, có thể chia ra làm ba loại:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi trường White, Knop và
Knudson C.
- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg.
- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: Điển hình là môi trường Murashige-Skoog và
Linsmaier-Skoog.
Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài
liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu
thích hợp với loại môi trường nào nhất. Sau đó, cần tìm tỷ lệ NO
3
-
/NH
4
+

thích hợp. Việc
sử dụng mang tính kinh nghiệm đối với một số môi trường đã cản trở khá nhiều sự tiến
bộ trong các nghiên cứu về nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 14
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Hiện nay, môi trường Murashige-Skoog được coi như là một môi trường thích
hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng. Vì vậy, những người
mới tập sự nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra được môi
trường riêng của mình.
2.3. Chuẩn bị các dung dịch làm việc
Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc), người
ta không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đậm đặc
(stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài
ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì sẽ giảm một
số thời gian đáng kể cho công tác nuôi cấy.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 15
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Chuẩn bị môi trường Murashige-Skoog (MS, 1962), Chia làm 5 phần:
Bảng 2.5. Thành phần môi trường MS [2]
Dung dịch stock
Nồng độ
(mg/L)
Nồng độ trong
dung dịch mẹ
(g/200 mL)
Dung tích dùng
cho 1 L môi
trường
MS
1

: KNO
3
1900 19
KH
2
PO
4
170
(× 10) 1,7
20 mL
NH
4
NO
3
1650 16,5
MgSO
4
.7H
2
0 370 3,7
MS
2
: CaCl
2
.2H
2
O 440
(× 20) 8,8
10 mL
MS

3
: H
3
BO
3
6,2 0,124
MnSO
4
.4H
2
O 22,3 0,446
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 0,5
CuSO
4
.5H
2
O 0,025
(× 20) 0,5
10 mL
ZnSO
4
.4H
2
O 8,6 0,172
Na
2

MoO
4
.2H
2
O 0,25 5 mg
KI 0,83 16,6 mg
MS
4
: FeSO
4
.7H
2
O 27, 85
(× 20) 0,556
10 mL
Na
2
-EDTA 37,25 0,746
MS
5
: myo-inositol 100 2
Thiamine.HCl 0,1 2 mg
Pyridoxine.HCl 0,5
(× 20) 10 mg
10 mL
Nicotinic acid 0,5 10 mg
Glycine 2 40 mg
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 16
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Chuẩn bị môi trường Nitsch (Nt, 1956). Chia làm 5 phần:

Bảng 2.6. Thành phần môi trường Nitsch [2]
Dung dịch stock
Nồng
độ
(mg/L)
Nồng độ trong dung
dịch mẹ (g/200 mL)
Dung tích
dùng cho 1 L
môi trường
Nt
1
: KNO
3
950 9,5
KH
2
PO
4
68
(× 10) 0,68
20 mL
NH
4
NO
3
720 7,2
MgSO
4
.7H

2
0 185 1,85
Nt
2
: CaCl
2
.2H
2
O 166
(× 20) 1,66
10 mL
Nt
3
: H
3
BO
3
10 0,2
MnSO
4
.4H
2
O 25 0,5
CuSO
4
.5H
2
O 0,0025
(× 20) 0,05 mg
10 mL

ZnSO
4
.4H
2
O 10 0,2
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 0,5 mg
Nt
4
: FeSO
4
.7H
2
O 27,8
(× 20) 0,556
10 mL
Na
2
-EDTA 37,3 0,746
Nt
5
: myo-inositol 100 2
Thiamine.HCl 0,5 10 mg
Pyridoxine.HCl 0,5 10 mg
Nicotinic acid 5

(× 20) 100 mg
10 mL
Glycine 0,05 40 mg
Biotin 2 1 mg
Acid folic 0,5 10 mg
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 17
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy protoplast
- Môi trường phân lập (Protoplast Isolation medium –PI)
Bảng 2.7. Thành phần môi trường phân lập PI [2]
Stt Thành phần
Nồng độ
(mg/L)
1 CaCl
2
.H
2
O 1480
2 KH
2
PO
4
27,2
3 KNO
3
101
4 MgSO
4
.7H
2

O 246
5 CuSO
4
.5H
2
O 0,025
6 KI 0,16
pH môi trường 5,8
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 18
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
- Môi trường nuôi cấy (Protoplast Culture medium –PC)
Bảng 2.8. Thành phần môi trường PC [2]
Dung dịch stock
Nồng độ
(mg/L)
Nồng độ trong
dung dịch mẹ
(g/200 mL)
Dung tích
dùng cho 1
L môi
trường
PC
1
: Ca(H
2
PO
4
)
2

.2H
2
O 100
(× 20) 2
10 mL
CaCl
2
.2H
2
O 450 9
PC
2
: KNO
3
2500 50
NaH
2
PO
4
.2H
2
O
170
(× 20) 3,4
10 mL
(NH
4
)
2
SO

4
134 1,68
MgSO
4
.7H
2
0 250 5
PC
3
: H
3
BO
3
3 60 mg
MnSO
4
.4H
2
O 13,2 132 mg
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 0,5 mg
CuSO
4
.5H
2
O
0,025

(× 20)0,5 mg
10 mL
ZnSO
4
.7H
2
O 2 40 mg
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 5 mg
KI 0,75 15 mg
PC
4
:
myo-inositol
100
(× 20) 2
10 mL
Nicotinic acid 1 20 mg
Lấy mỗi loại stock PC (PC
1
, PC
2
, PC
3
và PC

4
) 10 ml. Bổ sung thêm:
+ Sequestrene 330 28 mg/lít
+ Sucrose 10 g/lít
+ Glucose 18 g/lít
+ Mannitol 100 g/lít
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 19
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
III. NUÔI CẤY IN VITRO LAN DENDROBIUM
3.1. Nguồn gốc phân bố.
Giống lan này được Olf Swartz đặt tên vào năm 1799. Giống Dendrobium có
khoảng 16000 loài và được tạo thêm nhiều loại mới. Tên Dendrobium có nguồn gốc từ
chữ Hy Lạp “Dendro”- có nghĩa là gỗ, “bios”- có nghĩa là sống. Dendrobium hầu hết là
thực vật biểu sinh, sống bám trên vỏ cây. Ở Việt Nam người ta gọi là Hoàng Lan, hay có
người gọi là Đăng Lan. [3]
Dendrobium chỉ được tìm thấy ở Đông Bán Cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt
nam Thái Bình Dương, Phillipines, Ấn Độ, xuất hiện một ít ở Nhật Bản và xuất hiện
nhiều nhất ở Đông Nam Á.
Do quá đa dạng nên Dendrobium tập trung thành 2 dạng chính:
+ Dạng đứng (Dendrobium Phalanopsis): thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm, rất
siêng ra hoa.
+ Dạng thòng (Dendrobium Nobile): chịu khí hậu mát mẻ ở vùng đồi núi cao như
Đà Lạt, Lâm Đồng…
Ở Việt Nam Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông, được phân biệt bằng
thân (giả hành), lá và hoa.
3.2. Phân loại.
Vị trí phân loại:
+ Lớp một lá mầm : (Monocotyledones)
+ Bộ : Orchidales
+ Họ : Orchidaceae

+ Họ phụ : Epidendroideae
+ Tông : Epidendreae
+ Giống : Dendrobium
3.3. Đặc điểm hình thái
Dendrobium có số lượng khá lớn, phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa
dạng, do đó không có một hình dạng chung nhất định nào về hoa và dạng cây.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 20
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Ở Việt Nam còn gọi là Hoàng Lan hoặc Đăng Lan.Tên Dendrobium có nguồn gốc từ Hi
Lạp “Dendro” có nghĩa là gỗ, còn “bio” có nghĩa là sự sống.
- Rễ: Rễ mập, không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài sẽ chết.
- Thân: Thuộc nhóm đa thân.
- Giả hành: Là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhầy
nhằm làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô
hạn.
- Lá hình kim, mềm mỏng, mọng nước.
- Hoa: Thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá.
Nhìn chung, lan thuộc giống này đều có các bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả
hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái. Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là
nhóm hợp trục), giả hành chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được, rễ của lan
Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát
và cây bị chết. Hạt chín và phát tán nhờ gió khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong
điều kiện phù hợp, hạt sẽ nảy mầm. [4]
3.4. Một số tác động ảnh hưởng đến Dendrobium.
+ Ánh sáng: Rất cần thiết cho sự tăng trưởng và ra hoa. Lượng ánh sáng cần
thiết bằng khoảng 50% ánh sáng mặt trời. Nếu dùng ánh sáng nhân tạo thì cần 4 đèn
neon 40w và 2 đèn tròn 40w chiếu sáng trực tiếp lên phía cây.
+ Nhiệt độ: Dendrobium ưa thích những vùng đất thấp và ấm áp như vùng
khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của
Dendrobium là:

• Ngày: 27 – 32
0
C.
• Đêm: 16 – 18
0
C
Trong điều kiện độ ẩm và thoáng khí tăng thì nhiệt độ 35 – 38
0
C là rất tốt.
Nhiệt độ thấp dưới 10
0
C có thể làm rụng lá.
+ Nước: Giúp duy trì độ ẩm trong giai đoạn tăng trưởng. Nếu giữ khô ráo
giữa các lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng sẽ làm cho cây cứng cáp hơn
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 21
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
+ Độ ẩm : Dendrobium cần độ ẩm trong khoảng 50 – 60%. Nếu trồng trong
nhà kính thì nên dùng máy tạo độ ẩm nếu điều kiện quá khô hanh.
+ Giá thể: Giá thể dùng để trồng lan phải xốp, thoáng khí và không giữ nước
quá lâu.
Có thể sử dụng một loại giá thể hoặc trộn hỗn hợp các giá thể với nhau như vỏ
cây khô, đá núi lửa, xơ dừa hoặc đá bọt. [4]
+ Phân bón: Nên tưới lên cả lá, lên thân, lên rễ và nên có bình phun sương
vào sáng sớm hoặc chiều mát. Cũng nên tưới phân hỗn hợp NPK như thường. Lan con
với công thức 30.10.10 cộng thêm vi lượng, lan trưởng thành với công thức 10.30.10
cộng thêm vi lượng, lan có lưỡi mèo thì theo công thức 10.10.30 cộng vi lượng. [5]
+ Thay chậu: Lan Dendrobium trồng cỡ 2 năm thì giả hành phát triển mọc
nhảy ra ngoài chậu nên phải thay chậu. Đồng thời, lúc đó ta nên tách chiết nhân giống.
+ Sâu bệnh: Việc bón phân hữu cơ hay dùng giá thể xơ dừa (sẽ mục nát sau
thời gian ngắn) là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh hại cho cây như sâu, rệp, nấm, virus…

3.5. Các giai đoạn phát triển của lan.
3.5.1. Giai đoạn nảy mầm của hạt.
Trong thiên nhiên hạt lan chỉ nảy mầm khi có nấm phù hợp do chúng không có
chất dự trữ để sử dụng nên phải lấy thức ăn có sẵn của nấm. Sau khi nảy mầm và chỉ sau
khi thành lập diệp lục tố ở lá cây con mới có khả năng tổng hợp hydratcarbon cho sự
phát triển của nó.
3.5.2. Giai đoạn cây con.
Ở giai đoạn này tất cả các nhu cầu cần thiết cho phản ứng quang hợp ở lan cần
phải được quan tâm. Nước và muối khoáng cần cung cấp trong môi trường nuôi cấy, ánh
sáng của bóng đèn để thay thế ánh sáng mặt trời nhưng không lớn hơn giai đoạn trưởng
thành.
3.5.3. Giai đoạn trưởng thành
Giai đoạn này cây lan ra rễ, nảy chồi, ra lá cho nên nhu cầu ánh sáng, nhiệt độ,
phân bón tăng cao hơn nhiều so với giai đoạn cây con. Đặc biệt giai đoạn này cây chuẩn
bị ra hoa nên phải càng khắt khe hơn.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 22
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
3.5.4. Giai đoạn mang hoa, đậu trái, tạo hột.
Các nhu cầu ở giai đoạn này cũng khác giai đoạn trưởng thành. Ánh sáng và nhiệt độ
phải hạ thấp xuống để hoa lâu tàn. [6]
3.6. Phương pháp nhân giống lan.
3.6.1. Phương pháp nhân giống lan cổ truyền
3.6.1.1. Tách chiết
Đây là phương pháp được nhiều nghệ nhân sử dụng đối với các giống lan đa thân
như Cattleya, Dendrobium, Cymbidium,
3.6.1.2. Chiết cành
Việc chiết cành có thể thực hiện bất kỳ thời gian nào, thường là ở đầu thời kỳ phát
triển, vào cuối mùa khô- đầu mùa mưa. [6]
3.6.2. Phương pháp nuôi cấy mô.
Là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống trên quy mô công nghiệp,

các cây lan con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ quý mới được lai
tạo và được xem là có giá trị sau lần trổ hoa đầu tiên. So với phương pháp chiết tách
thông thường tốc độ phát triển của 1 cây/năm thì phương pháp nhân giống thông qua cấy
mô sẽ sản xuất một lượng cây con gần như không tưởng khoảng 4 triệu cây/năm.
3.7. Quy trình nuôi trồng Lan Dendrobium.
3.7.1. Qui trình nuôi trồng

SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 23
Vô mẫu
Tạo PLBs
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học

3.7.2. Thuyết minh quy trình
3.7.2.1. Vô mẫu
- Chọn chồi còn nhỏ, bỏ lá, cắt thành nhiều đoạn, mỗi đoạn mang một chồi
ngủ cho vào bình tam giác sạch, đem lắc với nước xà phòng trong 5 phút. Rửa dưới vòi
nước chảy.
-Thao tác trong tủ cấy: mẫu lắc với cồn 70
0
trong vòng 30 giây, rửa lại bằng
nước cất vô trùng 2 lần. Tiếp tục khử trùng với nước javel, rửa lại bằng nước cất vô
trùng đến sạch.
- Cắt bỏ nhũng phần trắng do javel, tách bẹ, cắt tách đỉnh sinh trưởng (
khoảng 2- 4mm) rồi cấy vào môi trường vô mẫu, để mẫu trong tối.
3.6.2.2. Tạo protocorm like bodies (PLBs) và nhân PLBs
- Sau 4-6 tuần thì mẫu tạo PLBs.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 24
Nhân PLBs
Hoàn chỉnh cây in vitro
Nhà huấn luyện

Ra vườn ưom
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
- Ta tiếp tục cấy chuyền nhiều lần sang môi trường tương tự để đạt được lượng
theo yêu cầu, mỗi lần cấy chuyền khoảng 20 ngày.
3.7.2.3. Hoàn chỉnh cây in vitro.
- Ta tiếp tục chuyển sang môi trường tăng trưởng, sau 4 tuần thì cây con bắt đầu
phát triển, tiếp tục nuôi dưỡng trong môi trường này them 1 đến 2 tháng thì cấy chuyền
trở lại trên môi trường tăng trưởng.
- Sau 3 –4 lần cấy chuyền khi cây đạt kích thước khoảng 1,5 cm thì cấy chuyền
sang môi trường ra rễ.
- Rễ sẽ phát triển sau 2 tuần nuôi cấy.
3.7.2.4. Huấn luyện.
-Khi cây đạt kích thước yêu cầu ( 3 cm trở lên) thì chuyển ra khỏi phòng lạnh
để cây quen dần với môi trường bên ngoài.
- Sau 1 tuần là có thể chuyển ra vườn ươm.
3.7.2.5. Vườn ươm
- Trồng chung trên giàn: Dùng kẹp gắp cây ra, rửa agar thật sạch, đặt nhẹ nhàng
lên rổ có xơ dừa đã được làm ẩm
- Cho vào chậu nhỏ: Sau 3-5 tháng khi mà cây đã bung rễ mới và mọc chồi mới
thì ta lấy vỏ dừa chặt khúc (đã được ngâm vôi) bao quanh rễ, rồi buộc lại cho vào chậu
nhỏ ( đường kính 12-13 cm). [7]
- Chuyển qua chậu lớn: Sau khi cây đã lớn, ra nhiều lá mới thì tiếp tục chuyển
qua chậu lớn (Đường kình 18 - 20 cm) thêm vỏ dừa và than, khi chuyển chậu một tuần
khi cây đã hồi phục mới tiến hành bón các chất dinh dưỡng.
3.7.3. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường MS:
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 25