THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

ĐỀ TÀI:
THU NHẬN ENZYME PECTINASE
TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Thực hiện:
1. Trương Thu Hồng Nhung 072523S
2. Văn Thị Quế Phương 072529S
3. Nguyễn Thị Thiết 072588S
4. Nguyễn Thị Thanh Trúc 072628S
5. Nguyễn Thị Yến 072667S
TP. HỒ CHÍ MINH – 6/2009
Trang 1
MỤC LỤC
I. TỔNG QUAN…………………………………………2
I.1. Nguyên liệu………………………………………2
I.2. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger……… 2
I.3. Giới thiệu về enzyme pectinase………………….3
 Khái niệm……………………………………… 3
 Phân loại………………………………………….3
 Đặc điểm………………………………………….3
 Cơ chế tác động………………………………… 4
II. THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM
MỐC ASPERGILLUS NIGER ……………………………… 6
II.1. Nguồn thu nhận enzyme pectinase……………….6
II.2. Sơ đồ quy trình……………………………… 11
II.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme
pectinase từ nấm mốc Aspergillus niger…………………….14

III. ỨNG DỤNG………………………………………….15
III.1. Làm trong các loại nước ép trái cây…………….17
III.2. Ứng dụng trong sản xuất rượu vang…………….18
III.3. Ứng dụng trong sản xuất cà phê……………… 20
III.4. Một số ứng dụng khác ……………………… 20
Trang 2
I. TỔNG QUAN
I.1. Nguyên liệu:
Nguyên liệu chính là nấm mốc Aspergillus
niger. Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi sinh
vật để thu nhận enzyme pectinase thường là
cám gạo, hay cám mì bã củ cải, khoai tây, cà
rốt,vỏ bưởi hoặc thóc mầm… Nguồn dinh
dưỡng bổ sung thường là các muối amonium,
phosphric…
I.2. Giới thiệu vê nấm mốc Aspergillus niger


Đại thể của Aspergillus niger Vi thể của Aspergillus niger
Aspergillus niger thuộc giống Aspergillus, giống này rất đặc biệt do
chúng có hệ bào tử đính (conidiophore). Bào tử đính phát triển từ thành tế
bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell). Nó tạo thành
sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là
túi (vesicle). Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là
cuống đính bào tư hay thể bình ( sterigmata). Từ bộ cuống đính bào tử ngoài
cùng, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính (conidia). Giống nấm này phát
triển rất nhiều trong các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Trang 3
Nhóm Aspergillus niger gồm khoảng 10 loài. Chúng có màu đen khi
quan sát bằng mắt thường do chúng tạo bào tử đính màu đen, nhưng lại có

màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại thấp. Đôi khi chúng
sinh ra các giọt lỏng màu vàng sáng trên bề mặt khuẩn lạc. chúng có hai bộ
cuống đính bào tử và tạo bào tử đính màu nâu, hơi đen và có gai. Túi và sợi
cuống thường có màu nâu bóng. Nhóm này không tạo mycotoxin, nhưng
một số loài của nhóm này có khả năng gây bệnh.
I.3. Giới thiệu về enzyme pectinase
 Khái niệm : Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ
các polyme pectin. Dưới tác dụng của enzyme pectinase, pectin bị phân huỷ
tạo thành các sản phẩm như: acid galacturonic, galactose, arabinose,
metanol…
 Phân loại:
- Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng kiểu phản ứng, pH tối ưu
của enzyme. Năm 1966, Koller và Neukom phân loại chia pectinase thành
hai nhóm chính: hydrolase và transeliminase. Cả hai nhóm này đều có đặc
điểm chung là gỉam độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm khối lượng
phân tử của các sản phẩm tạo thành.
- Dựa vào cơ chế tác dụng của chúng gồm các loại như sau:
pectinesterase (PE ), Polymethylgalacturonic ( PMG), polygalacturonase
(PG ), Pectate lyase ( PEL). Ngoài ra còn có: pectin-transelimiase (còn gọi
là poly - α - 1,4 galacturonite- methylesteglucanoliase) là enzyme tác dụng
trên pectin và trên pectinic acid. Polygalacturonate- transelimiase ( còn gọi
là poly - α - 1,4 D- galacturonite- glucanoliase) là enzyme tác động trên
pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL) xúc tác sự phân cách các
đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo – enzyme.
 Đặc điểm: Enzyme thuỷ phân pectinase là sản phẩm trong quá
trình sống của nấm mốc Aspergillus niger và một số nấm mốc khác. Người
ta cấy các chủng nấm mốc này vào trong các môi trường khác nhau, sau đó
Trang 4
đem sấy khô, nghiền thành các sản phẩm khô. Từ qúa trình sống của chủng
nấm mốc này, người ta không những chỉ thu nhận được enzyme thuỷ phân

pectin mà còn thu được nhiều enzyme khác như: cellulase, protease…
Các chế phẩm đều có một phức hệ enzyme pectinase như nhau, chỉ
khác ở mức độ hoạt động và tỉ lệ của các enzyme. Căn cứ vào đặc điểm
này mà ta có thể mà có hướng sử dụng các chế phẩm khác nhau, chẳng
hạn chế phẩm có hoạt độ PE và endo – PMG cao thì dùng để xử lý các
nguyên liệu giàu pectin.
 Cơ chế tác động:
Pectinesterase ( PE ): Enzyme này xúc tác sự thuỷ phân liên kết
ester phức tạp của pectin và protopectin, sản phẩm tạo thành là rượu
methylic và acid pectinic hay acid polygalalacturonic. Người ta nhận thấy
rằng PE chỉ phân cách liên kết ester giữa các nhóm metoxyl và _COOH tự
do.
PE tách gốc methyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhóm carboxyl
rất linh động, dễ kết hợp với các ion kim loại như Ca
2+
để tạo thành các
muối không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng.
PE của nấm mốc sẽ thuỷ phân trước tiên là nhóm methylester nằm giữa
hai nhóm carboxyl tự do. Và enzyme sẽ thuỷ phân lần lượt các liên kết ester
dọc theo phân tử pectin. Và PE của nấm cũng sẽ thuỷ phân pectin và các
ester của acid polygalacturonic sâu sắc hơn PE của thực vật. hoạt độ của PE
phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hoá của pectin và tỉ lệ thuận với mức độ
ester hoá. Chẳng hạn đối với tác dụng của PE từ nấm mốc Asp. Niger cần
thiết có pectin ester hoá ở mức độ cao từ 70 % trở lên.
pH tối ưu của PE từ nấm mốc là 4.5 -5.5, còn của chế phẩm đã loại bỏ
enzymepolygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2.0 – 6.5. Trái lại, pH tối ưu
của PE từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6.0 – 8.0.
Trang 5
Nhiệt độ tối ưu của PE từ nấm mốc là 40 – 45
0

C. Từ 55- 62
0
C thì vô
hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của PE từ thực vật thượng đẳng cao hơn:
từ 55 – 60
0
C
Các ion kim loại đặc biệt là Na
+
và Ca
2+
và các muối clorua của chúng
sẽ hoạt hoá PE từ nấm mốc Asp.niger. Trái lại , các cation hoá trị 3 và 4
( thuỷ phân nitrat, FeCl
2
, Al
2
(SO
4
)
3
) sẽ kìm hãm tác dụng của PE.
Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme PE có thể có liên
quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một chất ức
chế cạnh tranh trong phản ứng thuỷ phân nhờ sự xúc tác của PE. Sự liên kết
của các ion kim loại và các nhóm carboxylate trong trường hợp này có
khuynh trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy
nhiên lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion
kim loại bị bao vây bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết
ester cần thiết cho phản ứng thuỷ phân xảy ra.

Polymethylgalacturonase ( PMG): Là enzyme tác động trên acid
polygalactyronic đã được metoxyl hoá ( tức là pectin). Enzyme này có tên
hệ thống là poly- α - 1,4 galacturonic – methylesterglucanohydrolase
( E.C.3.2.1.41), lại được chia thành hai nhóm nhỏ:
 Endo – glucosidase – polymethylgalacturonase kiểu
1 (Endo PMG I) : Là enzyme dịch hoá, pectin có mức độ metoxyl càng cao
thì bị thuỷ phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả cao. Trong
dung dịch khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này
thường bị giảm. Enzyme này phổ biến ở một số nấm mốc như: Asp.niger,
Asp.awamori,Botrytis cinerea…
 Exo – glucosidase – polymethylesterase kiểu III
( Exo- PMG-III): Là enzyme đường hoá, enzyme này có thể cắt từng acid
galacturonic ra khỏi pectinic hay pectin. Exo – PMG- III có ái lực với các gốc
acid galacturonic đã được metoxyl hoá nghĩa là phân cắt liên kết α - 1,4
Trang 6
glucoside ở đầu mạch nằm giữa hai gốc acid galacturonic có nhóm
_COOCH
3
.
 Polygalacturonase ( PG) : Là enzyme tác dụng trên acid pectinic
hoặc pectic. PG lại được chia thành hai nhóm nhỏ:

Endo – glocosidase – polygalacturonase kiểu II (Endo – PG
II): Là enzyme dịch hoá, enzyme này có thể thuỷ phân acid pectinic hay acid
pectic và chỉ tác dụng khi có mặt nhóm _COOH tự do.
Hoạt độ của Endo-PG II sẽ tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý sơ bộ
bằng pectinesterase. Đa số vi khuẩn và nấm mốc là những vi sinh vật tổng
hợp được enzyme này.

Exo – glucosidase – polygalacturonase kiểu IV ( Exo-PG-

IV): Enzyme này thường có ái lực mạnh đối với các liên kết glucoside ở cuối
mạch phân tử acid pectinic hay acid pectic nhưng bên cạnh đó không có nhóm
methyl.
Có lẽ để tạo được phức enzyme - cơ chất thì trong phân tử cơ chất phải
có nhóm carboxyl tự do liền kề với liên kết bị đứt.
 Pectate lyase ( PEL): Năm 1960, P. Abershim lần đầu tiên đưa ra
thông báo về phân huỷ phân tử pectin không bằng con đường thuỷ phân.
Enzyme tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase. Enzyme này xúc tác
phá vỡ mối liên kết α - 1,4 glucoside, tiến tới làm mất hoạt tính nguyên tử
hydro ở C5, tạo thành mối liên kết đôi giữa C4 và C5.
Dựa trên cơ chế tác dụng của pectate lyase, người ta chia nó thành hai nhóm:
 Endo – pectatelyase: Tham gia thuỷ phân phân tử polygalacturonic
ở chỗ khác nhau của dãy tạo nên acid galacturonic.
 Exo – pectatelyase: Tham gia phân huỷ thành phần mạch vòng của
acid digalacturonic.
Pectate lyase (PEL ) là enzyme vi sinh vật ngoại bào
II. THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC
ASPERGILLUS NIGER
Trang 7
II.1. Nguồn thu nhận enzyme pectinase
Thực vật: Enzyme pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong
chanh, cà chua, trong một số quả khác Thường là có nhiều enzyme
pectinesterase (PE ).
- Đặc điểm của pectinesterase thực vật: Enzyme này thường tồn tại
dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật
nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại
ở nồng độ thấp, như Ca
2+
chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ
hoạt động của enzyme. Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu

làm hình thành các khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch
pectin.
Vi sinh vật: Nhiều vi sinh vật trong đất, trong nước có khả năng phân
giải pectin. Chúng có ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng tuần
hoàn carbon trong tự nhiên mà còn đối với một số ngành sản xuất công
nghiệp (ngâm đay, gai, làm bia, làm giấy…). Một số vi sinh vật có khả năng
phân giải pectin mạnh mẽ: Aspergillus ficcum, Aspergillus niger,
Aspergillus awamori, Clostridium roserum…
- Đặc điểm của E. pectinase ở vi sinh vật: Tất cả các vi sinh vật để thu
nhận enzyme pectinase đều là hiếu khí. Sự phân bố các kiểu enzyme
pectinase ở vi sinh vật không giống nhau: có cơ thể chỉ tạo được một
enzyme song đa số cơ thể khác lại tạo ra được một phức hệ enzyme
pectinase khác nhau, tuỳ theo loài.
Trang 8
Ví dụ: Sac. Fragilis chỉ tạo ra duy nhất một loại enzyme phân giải
pectin là endopolygalaturonase. Còn ở nấm mốc Aspergillus niger thường
tạo được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau.
Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng hoặc
enzyme bản thể. Ngoài ra enzyme pectinase ở vi sinh vật còn khác nhau ở
một số tính chất.
Aspergillus awamori Clostridium
Cơ chất pectin:
• Nguồn gốc và cấu tạo:
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của
các acid galacturonic qua các liên kết 1,4- glucoside. Tuỳ thuộc vào nguồn
pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da. Pectin
không hoà tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác mà hoà tan trong
nước, amoniac, dung dịch kiềm, carbonateNatri và trong glycerin nóng. Độ
hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử
pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.

Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất
khác nhau, trong đó acid pectinic acid là thành phần chủ yếu. các pectin tự
nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide
và protein để tạo thành các protopectin không tan. Có thể phân huỷ để cho
Trang 9
pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid. Vì
thế, các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân huỷ phân tử pectin
không tan và chúng không đồng dạng với nhau.
Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl
“MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl –OCH
3
có trong
phân tử pectin và chỉ số este hóa “DE” thể hiện mức độ este hóa của các phân
tử acid galactoronic trong phân tử pectin.
Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa, trong thương mại chia
pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl
hóa thấp.
Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin – HMP): DE >50 %
hay MI > 7%. Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm. Muốn tạo
đông cần phải có điều kiện pH = 3,1 – 3,4 và nồng độ đường trên 60 %.
Trang 10
Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin – LMP): DE < 50 %
hay MI < 7%. Được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân tử
pectin. Pectin methoxy thấp có thể tạo đông trong môi trường không có
đường. Chúng thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm.
Trong quá trình bảo quản có thể bị tách nước hoặc lão hóa. Quá trình
tạo đông phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nguồn pectin, mức độ methoxy hóa
càng cao thì khả năng tạo đông càng cao. Khi sử dụng cần phải hòa tan pectin
vào nước, khi pectin hút đủ nước thì mới sử dụng ở công đoạn cuối chế biến.
Các pectin đều là những chất keo háo nước nên có khả năng hydrat hóa

cao nhờ sự gắn các phân tử nước vào nhóm hydroxyl của chuỗi polymethyl
galacturonic. Ngoài ra, trong phân tử pectin có mang điện tích âm nên chúng
có khả năng đẩy lẫn nhau có khả năng làm giãn mạch và làm tăng độ nhớt của
dung dịch. Khi làm giảm độ tích điện và hydrat hóa sẽ làm cho sợi pectin xích
lại gần nhau và tương tác với nhau tạo nên một mạng lưới ba chiều rắn chứa
pha lỏng ở bên trong.
• Ứng dụng:
Pectin là chất tạo gel quan trọng nhất được sử dụng để tạo ra cấu trúc
gel cho thực phẩm. Khả năng tạo gel của nó được sử dụng trong những thực
phẩm cần có sự ổn định của nhiều pha. Tác dụng tạo gel của pectin được sử
dụng chủ yếu trong các sản phẩm mứt trái cây và mứt đông.
Tác dụng của pectin là tạo ra cấu trúc mứt đông và mứt trái cây không
bị thay đổi trong quá trình vận chuyển, tạo ra mùi vị thơm ngon cho sản phẩm
và giảm sự phá vở cấu trúc. Trong một số trường hợp, pectin còn được sử
dụng với carageenan để tăng hiệu quả tạo gel.
Trang 11
II.2 Sơ đồ quy trình:
Trang 12
Nguyên liệu
Xử lý nguyên liệu
Aspergillus
niger
Nhân giống
Lọc
Lên men
( t
0
phòng từ 50-56 giờ )
Trích ly
Nghiền

Thu dịch pectinase thô
Tủa protein
Pectinase
bán tinh
khiết
Cấy giống
( C
2
H
5
OH 70 %,
(NH
4
)
2
SO
4
bão hoà
70% )
( pH
opt
= 4.5 )
( T
opt
= 50
0
C )
( Tỉ lệ: 5 nước : 1 khối
lượng canh trường )
Ly tâm

( Độ ẩm 50-60%,thông khí
90-100%, t
0
30-32
0
C)
Nhân giống: giống Asp. Niger sẽ được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
ở độ ẩm 50- 60%, độ thông khí 90- 100% và nhiệt độ 30- 32
0
C.
* Cấy giống: sau khi xử lý nguyên liệu, ta bổ sung lượng nước phù hợp
để đạt độ ẩm 55 %. Ta tiến hành hấp khử trùng ở 1atm, 121
0
C trong 15 phút,
sau đó để ở nhiệt độ phòng và tiến hành cấy giống vào.
*Nghiền:
Chế phẩm enzyme thô từ canh trường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt
được nghiền mịn trong máy nghiền bi. Nếu không có máy nghiền bi có thể dã
bằng cối, chày sứ với sự trợ giúp của cát thạch anh hoặc bột thuỷ tinh. Cát
thạch anh hoặc bột thuỷ tinh được rửa sạch và sấy khô trước khi sử dụng, cho
vào giã cùng với canh trường nuôi cấy bề mặt. Cát hay bột thuỷ tinh làm tăng
khả năng phá vỡ tế bào của vi sinh vật mà không làm thay dổi bản chất
enzyme nên thường sử dụng trong các thí nghiệm thu nhận enzyme từ canh
trường nấm sợi.
* Trích ly:
Thực hiện bằng dung môi thích hợp. Đa số enzyme thuỷ phân tan tốt
trong nước, nên nước là dung môi tốt nhất để chiết rút enzyme. Những tế bào
nấm mốc đã trưởng thành quá trình trao dổi chất gần như ngừng hẳn, độ thẩm
thấu của hệ sợi tăng, enzyme dễ tiết ra môi trường và dễ hoà tan vào nước.
Theo phương pháp khuếch tán bằng nước hiệu suất chiết có thể đạt 90-95%.

Trong nước chiết thường chứa một số lớn các chất phân tử thấp do sự hoà tan
các sản phẩm thuỷ phân của một tinh bột, cellulose, pectin trong quá trình
sinh trưởng của nấm mốc.
Nhiệt độ nước thường dùng 25-28
0
C. Sự hiện diện của một vài chất sát
trùng như formalin có thể ngăn ngừa hiện tượng nhiễm trùng. Dung dịch sau
khi chiết phải được làm lạnh ngay xuống 10-12
0
C để tránh nhiễm trùng và
bảo toàn hoạt tính enzyme.
Sau khi nghiền môi trường nuôi cấy bề mặt, cho vào đó lượng nước gấp
5 lần khối lượng canh trường trên để hoà tan protein – enzyme từ khối canh
Trang 13
trường. tiến hành lọc thô và lọc tinh bằng máy lọc chân không, thu dịch
lọc.Bảo quản dịch lọc trong tủ lạnh 4
0
C .
* Tủa protein:
Tủa enzyme bằng ethanol: có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ hoà tan
của protein trong dung môi, trong đó hằng số điện môi của dung dịch. Những
dung môi có hằng số điện môi lớn như nước hay dimethysulfoxide có thể ổn
định mối tương tác giữa các phân tử của dung môi với các phân tử protein,
giúp cho sự hoà tan của protein trong dung dịch. Các dung môi có hằng số
điện môi nhỏ ( acetone, ethanol…), làm giảm hằng số điện môi của môi
trường. Như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi. Vì
vậy, các enzyme – protein cũng như các chất có phân tử lượng thấp trong hệ
dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ kết tủa và lắng xuống. Độ hoà tan của
enzyme vào dung dịch ethanol – nước phụ thuộc vào nồng độ ethanol, nhiệt
độ, pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme.

Tủa enzyme bằng amonium sulfat: Tủa enzyme bằng muối trung tính
là phương pháp kết tủa khi bổ sung muối trung tính ở nồng độ cao vào dung
dịch protein. Thông thường protein tồn tại trong dung dịch nhờ sự cân bằng
điện giữa các lực tĩnh điện và các tương tác kị nước. Do đó khi bổ sung muối
ở nồng độ cao thì sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ, các phân tử protein sẽ tụ lại
với nhau tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch.
Các phân tử protein trong dung dịch đều ngậm nước, khối lượng nước có
thể lớn hơn rất nhiều lần bản thân protein. Lượng nước này che chắn một cách
hữu hiệu các phân tử kị nước trên bề mặt của protein và cản trở tương tác giữa
các phân tử protein với nhau. Khi xuất hiện nồng độ ion muối cao, lượng
nước ngậm bị giảm đi, mở ra khả năng tương tác lẫn nhau giữa các phân tử
protein, điều này dẫn đến sự lắng tủa protein.
Người ta có thể sử dụng nhiều loại muối trung tính khác nhau nhưng
trong đó tốt nhất là amoni sulfat vì: (NH
4
)
2
SO
4
có mức độ hoà tan rất cao
trong nước ( có thể đạt tới 720 g/l, nhiệt độ 25
0
C ), ít làm mất hoạt tính
Trang 14
enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme. Một ưu điểm nữa cuả
muối (NH
4
)
2
SO

4
là khả năng kết tủa chọn lọc protein. Do đó sẽ loại bỏ được
nhiều enzyme không mong muốn trong dịch. Lưu ý khi sử dụng (NH
4
)
2
SO
4
là
phải bổ sung vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để
tránh khả năng tăng nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất đi tính kết tủa
chọn lọc của nó, thậm chí còn có thể làm biến tính một số enzyme kém bền.
Hạn chế của phương pháp sử dụng (NH
4
)
2
SO
4
chính là mất thời gian, do nồng
độ (NH
4
)
2
SO
4
cao nên tỉ trọng của dung môi lớn, để kết tủa các protein cần
phải li tâm ở tốc độ cao và ở nhiệt độ thấp. sau đó cần phải lọc muối khỏi chế
phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo và không thể thu hồi muối tái
sử dụng.

So sánh khả năng kết tủa enzyme pectinase bằng hai tác nhân trên:
Hoạt lực chung ( UI/ml
chế phẩm )
Hiệu suất thu hồi
(%)
Tủa enzyme bằng ethanol
70%
0. 7751 88. 246
Tủa enzyme bằng
(NH
4
)
2
SO
4
bão hoà 70%
0. 8025 91. 368
*Ly tâm: Sau khi tủa protein ta lấy dịch đem ly tâm bằng máy ly tâm với
tốc độ 7000 vòng/ phút.
II.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme pectinase từ
Aspergillus niger:
 Ảnh hưởng bởi thành phần môi trường:
Thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật, từ
đó ảnh hưởng đến năng suất tổng hợp một enzyme cần thiết nào đó. Không
những vậy, môi trường dinh dưỡng sẽ có tác động đến các enzyme trong chế
Trang 15
phẩm thu được. Với chế phẩm enzyme pectinase thu được khi nuôi cấy
Aspergillus niger trên môi trường dinh dưỡng khác nhau sẽ khác nhau về pH
tối ưu trên cơ chất. Sinh tổng hợp enzyme pectinase có mối quan hệ với sự có

mặt của chất cảm ứng pectin. Ngoài ra các nguồn C, N, P có tác động rất quan
trọng đến sự tạo thành phức hệ enzyme này.
Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy đế khả năng sinh
tổng hợp enzyme pectinase ta thu được kết quả trên môi trường 6 cám gạo / 4
vỏ bưởi thì enzyme có hiệu suất thu nhận là cao nhất, với hoạt lực chung là
0. 9612 UI/ ml chế phẩm.
 Ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy:
Theo một số nghiên cứu, độ ẩm môi trường không nên vượt quá 60 % vì
vi khuẩn dễ phát triển sinh tạp khuẩn và môi trường khó thông khí. Nhưng
nếu độ ẩm chỉ 45 – 50 % thì môi trường sẽ khô nhanh, làm giảm thời gian
sinh trưởng của nấm mốc. Lúc này nấm mốc sẽ sinh bào tử mạnh, sự tạo
enzyme sẽ bị đình trễ, làm giảm hoạt tính của enzyme tạo thành. Trong thời
gian nuôi cấy, nên giữ ẩm môi trường khoảng 50 – 60 % và thông khí ở 90 –
100 %. Nhiệt độ thích hợp để nuối nấm mốc là: 30 – 32
0
C
Đối với Aspergillus niger nuôi phương pháp bề mặt, ngoài các yếu tố ảnh
hưởng trên còn cần phải xét độ tơi xốp ( độ thoáng khí) của môi trường nuôi
cấy.
III. ỨNG DỤNG:
Hiệu quả của việc sử dụng enzyme:
Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả và
rượu vang cho thấy khi sử dụng enzyme pectinase cho hiệu suất nước quả và
chất lượng rượu vang rất cao.
Khi tiến hành ứng dụng enzyme trong sản xuất nước quả và sản xuất
rượu vang, người ta đặc biết quan tâm đến hai yếu tố có tính chất quyết định
đến hiệu quả enzyme: nguyên liệu và khả năng xay nghiền, làm nhỏ nguyên
liệu.
Trang 16
• Nguyên liệu: không phải tất cả các loại quả đều

cho hiệu suất cáo khi xử lý enzyme. Khi sử dụng enzyme trong chế biến nước
quả và sản xuất rượu vang người ta phải đưa ra độ chín kĩ thuật chu phù hợp.
Khái niệm này hoàn toàn khác khái niệm độ chín kĩ thuật khi trong công nghệ
người ta không sử dụng enzyme. Độ chín kĩ thuật để sản xuất nước quả là giai
đoạn chín của quả, đảm bảo tách dịch quả được tốt với sự tích tụ tối đa cá
chất có giá trị dinh dưỡng cao và hương vị thích hợp.
Tuy nhiên, phần lớn nguyên liệu, hiệu suất dịch quả cao không trùng
hợp với sự tích tụ các chất có giá trị dinh dưỡng. Ở nhiều loại quả, khả năng
thoát dịch quả không trùng hợp với mức độ chín. Nhiều khi quả thật chín, khả
năng tích tụ chất dinh dưỡng cao nhưng lại không thuận lợi trong việc tách
nước quả. Vì vậy tuỳ theo loại quả mà người ta phân loại và xác định độ chín
kĩ thuật riêng, sao cho phù hợp với việc sử dụng enzyme và thu hồi dịch quả.
Sau khi phân loại quả, việc thứ nhất phải làm trước khi sử dụng enzyme
là quả phải được làm sạch bằng cách rửa nhiều lần để loại bỏ tạp chất và vi
sinh vật. sau đó là quá trình kĩ thuật như xé nhỏ, nghiền… để tăng năng suất
thu nhận dịch quả.
• Khả năng xay nghiền, làm nhỏ nguyên liệu: làm
nhỏ nguyên lliệu là khâu kĩ thuật rất quan trọng, nó quyết định đến hiệu quả
tác động của enzyme và hiệu suất thu nhận dịch quả cũng như chất lượng dịch
quả.
Tuỳ theo tính chất cơ lý và cấu tạo của từng loại quả, người ta chọn
những phương pháp xử lý quả thích hợp như nghiền, cắt, chà hay xé nhỏ.
Khi thực hiện một trong những phương pháp cơ học trện, một số tế bào
sẽ bị phá huỷ, mất tính chất bán thấm. Do đó việc chọn phương pháp cơ học
làm nhỏ quả phù hợp với từng loại quả rất có ý nghĩa công nghệ. Những đặc
điểm kĩ thuật sử dụng enzyme cho từng loại quả và cho từng loại sản phẩm
phải phù hợp.
Trang 17
Tuy nhiên việc sử dụng enzyme cũng có những nhược điểm như xảy ra những
biến đổi bất lợi về vi sinh vật và vi sinh vật. Nếu xử lý trong thời gian ngắn,

quá trình oxi hoá và sự nhiễm vi sinh vật không thành vấn đề lớn. Nhưng nếu
xử lý enzyme trong thời gian dài sẽ xảy ra quá trình oxy hoá và sự nhiễm vi
sinh vật.
III.1. Làm trong các loại nước trái cây:
Các chế phẩm enzyme thuỷ phân pectin được
sử dụng trong sản xuất nước quả. Chúng được
dùng để làm trong nước quả ép hoặc điều chế nước
quả từ các nguyên liệu quả nghiền.
Cơ chế tác dụng của pectinase là phá vỡ
protopectin, chính nó là liên kết giữa các tế bào,
sau đó enzyme này tiếp tục phá vỡ nguyên sinh
chất tế bào và gây vỡ tế bào quả, giúp nước quả
từ các tế bào chảy ra dễ dàng.
Từ các loại quả, người ta thường chế biến thành các dạng nước quả
trong, nước quả đục và nước quả có thịt quả. Nhưng để được nước quả thành
phẩm, trước tiên phải chiết rút được dịch quả từ mô bì. Do đó hiệu suất chiết
rút dịch quả phụ thuộc vào khả năng thấm của tế bào, độ nhớt của dịch quả,
độ chắc của thịt quả.
Việc sử dụng ezyme pectinase không những làm tăng lượng nước ép quả
mà còn là biện pháp giải quyết một cách hiệu quả vào dịp thu hoạch rộ trái
cây, lúc đem quả về cần chế biến nhanh, phương pháp tốt nhất là nghiền nhỏ
nguyên liệu. Các quả nghiền được đun nóng trong thùng ở nhiệt độ 40 –50
0
C,
chuẩn bị trước chế phẩm bằng cách hoà tan enzyme khô vào nước quả với tỉ
lệ với tỉ lệ 1/5, nhiệt độ nước khoảng 40 – 42
0
C. Tuy nhiên, việc xử lý pectin
bằng enzyme pectinase không nên tiến hành phân giải pectin đến cùng mà cần
phải giữ một lượng pectin nhất định trong sản phẩm nước quả. Chính lượng

pectin này sẽ giúp cho chất lượng quả tốt hơn.
Trang 18
III.2. Ứng dụng trong sản xuất rượu vang
Trong sản xuất rượu vang sử dụng enzyme pectinase không những cho
phép tăng hiệu suất nước quả, tốc độ lọc, quá trình sản xuất rút ngắn mà rượu
còn có mùi thơm hơn, trong hơn, sáng ánh hơn.
Rượu vang được sản xuất từ nước ép nho, táo , dâu… trong giai đoạn thu
hoạch dịch quả đã có sử dụng pectinase làm trong rồi mới cho lên men.
Chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất rượu vang phải có các yêu
cầu:
 Chế phẩm không được làm giảm chất
lượng rượu, không ảnh hưởng đến hương vị và
màu sắc của sản phẩm, nghĩa là sản phẩm phải
sạch tối đa.
 Chế phẩm đưa vào dịch hay bã nghiền
để tăng cường quá trình sơ chế quả, tăng quá
trình ép, làm trong dịch, tăng hiệu suất chung
và hiệu suất phần tự chảy. Muốn vậy thì tương quan hoạt độ các enzyme
chính như endo – PMG là 55102 đơn vị/mg protein chứa trong chế phẩm,
trong trường hợp này không có sự có mặt của PE. Nhưng nếu hoạt độ của
endo – PMG ở trong chế phẩm là 31102 thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4.1
đơn vị/mg protein.
 Chế phẩm pectinase phải tăng độ ổn định của rượu vang nghĩa là phải
chứa protease với hoạt độ thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin.
 Để tránh mất màu của vang đỏ và xuất hiện màu tối trong rượu vang
trắng thì hoạt độ của enzyme oxy hoá trong chế phẩm không vượt quá 0.1 đơn
vị/mg acid ascorbic/ g chế phẩm.
 Chế phẩm pectinase phải được bảo toàn hoạt độ trong điều kiện có
rượu 10 – 12 % và phải có tác dụng hiệu quả trong điều kiện có pH nhất định.
III.3. Ứng dụng trong sản xuất cà phê

Trang 19
Trong quy trình sản xuất cà phê, vỏ cà phê dày có chứa nhiều pectin
gây khó khăn cho quá trình bóc vỏ. Do đó người ta dùng enzyme pectinase để
làm mềm vỏ cà phê, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách vỏ cà phê.
Enzym pectinase có tác dụng thủy phân pectin của thịt quả cà phê thành
oligogalacturonide là một loại oligosaccharide.
Khi được đưa vào hệ tiêu hóa,
oligogalacturonide có vai trò như là prebiotic
là nguồn dinh dưỡng cho các vi sinh vật có lợi
cho đường ruột phát triển. Chế phẩm thịt quả
cà phê lên men do dự án sản xuất có hàm
lượng tannin và caffein dưới mức cho phép và
có hàm lượng protein cao.
III.4. Một số ứng dụng khác
Ngoài các ứng dụng nói trên, enzyme pectinase còn được ứng dụng để làm
giảm kích thước hạt trong quá trình xay nghiền hạt đậu nành, làm tróc các loại
vỏ trái cây thuộc họ cam, quýt…, ngăn chặn hiện tượng lắng cặn trong quá
trình bảo quản, ứng dụng trong trích ly các dược liệu đông y ( thuốc bắc và
thuốc nam)…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 20
1. Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên) cùng cộng sự - Công nghệ
enzym – NXB Đại học quốc gia Tp. HCM – 2004
2. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh
Tuyết – Thí nghiệm công nghệ sinh học_ Tập 2_Thí nghiệm vi
sinh vật học – NXB Đại học quốc gia Tp.HCM – 2003
3. Nguyễn Thị Minh – Luận văn tốt nghiệp Đại học_ Thu nhận
enzyme pectinase từ canh trường Aspergillus niger và sử
dụng trong công nghệ sản xuất nước quả - ĐH Tôn Đức Thắng
– 01/2009

4. Nguyễn Thị Thu Sang – Bài giảng Công nghệ Protein và
Enzyme – ĐH Tôn Đức Thắng – 2009
Tài liệu từ Internet:
1. www.ngoinhachung.net/diendan/sinh-hoc-thuc-pha-m/13109-
pectin.html
2.
%20niger&um=1&ie=UTF-8&sa=N&tab=wi
3.
option=content&task=view&id=2352&catid=148&Itemid=248
Trang 21