PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NẤM MỐC MYCOTOXIN TRONG THỨC ĂN GIA SÚC

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
Ngành công nghệ sinh học

Môn: CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH HIỆN ĐẠI
ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ
NẤM MỐC MYCOTOXIN TRONG THỨC ĂN GIA SÚC
GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng
Lớp: 07SH1D
MSSV Họ và tên
072379
S
072375
S
072408
S
072492
S
Trần Hòang Đạt
Võ Hùynh Hồng Ân
Chu Ngọc Thùy Dung
Nguyễn Mai Thảo Ly
Tháng 12/2010
MỤC LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực thực phẩm (Ban hành kèm theo
quyết định số 867/1999/QĐ-BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế ngày 4/4/1998).
2. Official Methods of Analysis of AOAC International 1997, Volume 2, chapter 49, P
2 – 34.
3. Tiêu chuẩn Việt Nam: Ngũ cốc – Phương pháp xác định aflatoxin – TCVN 5617 –

1991.
4. Tài liệu tập huấn kiểm nghiệm vệ sinh thực phẩm Khoa Hóa – Vệ sinh thực phẩm
– Viện Dinh Dưỡng – Hà Nội 3/1995.
2
ĐỀ TÀI:
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ
NẤM MỐC MYCOTOXIN TRONG THỨC ĂN GIA
SÚC
I. TỔNG QUAN VỀ MYCOTOXIN:
1. Giới thiệu
− Mycotoxin là sản phẩm chuyển hóa từ nấm mốc và nó gây ngộ độc cho
người và động vật.Ước lượng trong thực tế có khoảng 300 loại độc tố nấm mốc có
hại cho người và động vật . Với sự cải thiện về các phương pháp phân tích, trong
tương lai danh sách các loại độc tố nấm mốc sẽ ngày càng tăng.
− Là nguyên nhân gây ra bệnh nhiễm độc tố nấm. Độc tính của độc tố nấm
mốc phụ thuộc vào lượng ăn vào của thú, khoảng thời gian tiếp xúc, loài, giống, tuổi,
giới tính, tình trạng sức khỏe và ngoài ra còn có 1 vài thông số khác như mật độ
nuôi, dịch bệnh, nhiệt độ, v.v
− Có hơn 10.000 lòai nấm được biết đến,hầu hết chúng đều có lợi cho con
người như trong việc sản xuất bánh mì, pho mát,kháng sinh ,men…nhưng có
khỏang 50 lòai nấm mốc gây hại cho vật nuôi và con người vì chúng sản sinh ra độc
tố, các lọai này có thể chia thành hai nhóm: Nhóm gây bệnh dịch và nhóm gây ngộ
độc.
-Nhóm đầu tiên thuộc lĩnh vực của khoa y tế.
-Nhóm thứ hai gây ra vấn đề lớn cho các nhà sản xuất TĂCN bởi vì
chúng sinh ra ngộ độc với gia súc và gia cầm
2. Nguồn gốc
− Nấm mốc là nguyên nhân chính trong việc xuất hiện mycotoxin trên cây
trồng và nguyên liệu thức ăn. Mycotoxin có thể xuất hiện trước khi thu hoạch (hay
còn được gọi là nấm trên đồng) hoặc trong thời gian lưu trữ (nấm trong thời gian lưu

trữ). Mycotoxin cũng xuất hiện trong thức ăn hoàn chỉnh khi không được bảo quản
trong điều kiện thích hợp. Nấm mốc không chỉ sản xuất mycotoxin mà chúng còn phá
hoại mùa màng. Tổ chức lương thực và nông nghiệp thế giới (FAO) ước lượng rằng
có khoảng 25% cây trồng trên toàn thế giới có chứa mycotoxin.
3
− Độc tố nấm mốc được sản sinh trong quá trình chuyển hóa chất dinh
dưỡng trong thức ăn gia súc-mycotoxin được sản sinh ra từ Aspergilus,Furasium
,Penicilla và Elaviceps. Mycotoxin do nấm sinh ra như sản phẩm phụ của quá trình
trao đổi chất trong quá trình tiêu hóa và đồng hóa dinh dưỡng từ ngũ cốc và các
nguyên liệu TĂCN khác. Trong số này, lọai nguy hiểm nhất là aflatoxin (được tiết ra
từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus).Aflatoxin bao gồm 6 lọai khác
nhau(B1,B2,G1,G2,M1 VÀ M3). Aflatoxin B1 là lọai cực độc. Một lượng 0,03 ppm
aflatoxin B1 từ khô lạc gây ra u gan.
− Aflatoxin được sản xuất trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và môi
trường thuận lợi cho sự phát triển (khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới,điều kiên lưu
trữ ẩm ướt). Aflatoxin thường hiện diện trong các lạoi hạt ngũ cốc (lúa mạch, bắp,
kê,yến mạch, gạo, lúa miến,lúa mì),hạt bông vải ,đậu phộng,cây đậu và đậu nành.
Aflatoxin xuất hiện trước khi thu họach, nhưng cũng xuất hiện trong thời gian lưu trữ
nếu các hạt ngũ cốc không được lưu trữ đúng cách (Tangendjaja, 2002).
− Nói chung,khi aflatoxin sinh ra,khó có thể làm gì để lọai bỏ chúng khỏi ngũ
cốc hay TĂCN. Các lọai độc tố này có cấu tạo hóa học rất ổn định và không dễ bị
phá hủy bởi nhiệt, ánh sáng, a-xit, kiềm,hay kéo dài thời gian lưu trữ.
− Những lọai nấm mốc này có thể phát triển trong lúc canh tác, lúc thu
họach, lúc dự trữ, lúc sản xuất chế biến thức ăn và trong qúa trình cho ăn khi điều
kiện thuận lợi.Trên tòan thế giới không có khu vực nào tránh khỏi vận nạn do
mycotoxn gây ra, ảnh hướng của chúng lên mức sản xuất của vật nuôi và sức khỏe
của con người. Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) thì khỏang
25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxin.
− Nhiều năm trước, người ta cho rằng, độc tố nấm mọc ở mỗi nơi thì khác
nhau do điều kiện địa lý của từng khu vực. Chẳng hạn như: Aflatoxin thì thường

được tìm thấy ở khu vực nhiệt đới , trong khi đó thì Zearalenon thường tìm thấy ở xứ
ôn đới. Tuy vậy,ngày nay nguyên liệu thức ăn (khô dầu đậu tương, ngô, dầu
cọ…)được mua bán, chuyên chở từ khu vực này đến khu vực khác. Vì thế, cộng
hưởng của các lọai mycotoxin là điều dễ hiểu, tác hại của chúng lên năng suất vật
nuôi và sức khỏe của con người, ngay cả ở nồng độ rất thấp, dưới mức phát hiện
phản ứng dương tính khi phân tích mẫu.
3. Mức độ ảnh hưởng của Mycotoxin
 Sự chuyển hóa aflatoxin trong cơ thể
− Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt,
không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 120
0
C,phải đun 30 phút
mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có
mặt của nấm mốc tương ứng, đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên
nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngọai nên việc khử độc thực phẩm
sẽ có nhiều biện pháp hơn. Có 17 lọai aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp và
độc nhất là aflatoxin B1.
4
− Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được
hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hòan tòan. Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ được
nhanh chóng hấp thu vào máu tĩnh mạch mạc treo, sự hấp thu ở ruột non và tá tràng
là nhiều nhất. Niêm mạc ống tiêu hóa có khả năng chuyên dạng sinh học aflatoxin
B1 nhờ sự gắn kết với protein-đây là con đường chính để giải độc aflatoxin B1 cho
gan. Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạc cửa, aflatoxin được tập trung vào gan nhiều
nhất (chiếm khỏang 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận ,cơ , mô mỡ,
tụy lách…Trong vòng 24 giờ có khỏang 80% bị đào thải qua theo đường tiêu hóa
qua mật, đường tiết niêu qua thận và đáng chú ý nó còn bài tiết qua cả sữa.
 Đối với gia súc: Độc tố này có trong hạt có dầu nói riêng, nhất là lạc và trong
các bột dinh dưỡng và thức ăn có nguồn gốc ngũ cốc nói chung,rất độc cho
cơ thể vì nó là các tác nhân ảnh hưởng tới sức khỏe của con người và súc

vật.
− Nấm mốc và độc tố nấm gây bệnh nấm (viêm giác mạc, viêm màng trong
tim…)còn gây bệnh dị ứng do tiếp xúc bào tử nấm, gây bệnh độc tố nấm do ăn, uống
(dẫn đến ngộ độc,nhiễm độc, tổn thương gan, ung thư gan).Những lọai độc tố trong
nấm như trên không bị diệt ở nhiệt độ cao (160-170
0
c),do đó, trong trườn hợp nấu
chin thì độc tố aflatoxin vẫn tồn tại mà không bị phân hủy.
− Aflatoxin đặc biệt ảnh hưởng đến gan. Khi ăn vào 1 lượng lớn có thể gây
ung thư gan, viêm gan mãn tính,vàng da và xơ gan. Tiếp xúc với liều thấp trong 1
thời gian dài thì cũng có thể mang lại 1 số rủi ro.
− Ở heo nhiễm độc tố aflatoxin được quan sát trên các giai đoạn: heo theo
mẹ, heo choai, heo vỗ béo và đàn heo giống. Một vài triệu chứng điển hình như là
giảm lượng ăn vào, tăng FCR, giảm tăng trọng, viêm gan do độc tố, hoại tử và cơ
thể bị xuất huyết. Aflatoxin có thể truyền từ tử cung của heo nái qua heo con và làm
ảnh hưởng đến heo con mới sinh.
− Aflatoxin cũng làm tăng sự nhạy cảm của heo đối với bệnh lỵ (Joens và
cộng sự, 1981). Trong thí nghiệm này, những heo không bị bệnh được thí nghiệm
cho tiếp xúc với heo bị mắc lị sau đó cho ăn thức ăn có mức aflatoxin B1 (0.07 đến
0.14 mg/kg). Thời kì ủ bệnh thì ở heo vừa nhiễm aflatoxin và Serpulina
hyodysenteriae thì ngắn hơn heo chỉ nhiễm Serpulina hyodysenteriae. Thêm vào đó,
số ngày mà heo bị nhiễm bệnh và độc tố có dấu hiệu tiêu chảy và bệnh lị dài hơn ở
nhóm heo chỉ bị Serpulina hyodysenteriae. Tỷ lệ chết ở nhóm thứ nhất nhiều hơn
nhóm thứ hai.
− Trong những điều kiện nhất định, nấm mốc sẽ sinh ra aflatoxin. Tuy
nhiên, số lượng aflatoxin tạo ra không đủ để gây ngộ độc nặng. Các triệu chứng
kéo dài như tốc độ tăng trưởng chậm, tiêu tốn thức ăn, khả năng chống bệnh ,
dịch giảm. Nhìn chung, aflatoxin làm giảm khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng và
do đó ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và các quá trình sử dụng dinh dưỡng
của gia súc. Aflatoxin ảnh hưởng quá trình trao đổi chất béo và sinh ra mỡ trong

gan và giảm mỡ quầy thịt.
 Đối với động vật thí nghiệm
− Cysewski và cộng sự (1978) làm thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ độc
tố thú ăn vào trên sự đáp ứng miễn dịch của heo bị bệnh đóng dấu son. Thí
nghiệm có 24 heo được chia thành 4 nhóm. Hai nhóm cho ăn khẩu phần bình
thường và hai nhóm cho ăn khẩu phần có nồng độ độc tố như nhau. Ở hai nhóm
trên, trong mỗi nhóm có 1 lô được tiêm vaccin ngừa bệnh đóng dấu son, và 3 tuần
sau tất cả các heo cho tiếp xúc với chủng virus Erysipelothrix rhusiopathiae. Dựa
trên sự đáp ứng miễn dịch của thú, heo sẽ xuất hiện đáp ứng miễn dịch, một phần
miễn dịch, hoặc không đáp ứng miễn dịch. Kết quả như sau:
5
1
10
100
1,000
10,000
100,000
1,000,000
10,000,000
Hồi tràng
Manh tràng Kết tràng
ĐốI chứng
+ FB1
Thức ăn Lô đối chứng Có chứa độc tố
Tiêm phòng
vaccin
Có Không Có Không
Kết quả 3 heo có miễn dịch
2 heo miễn dịch 1
phần

1 heo không đáp
ứng miễn dịch
2 heo miễn dịch 1
phần
4 heo không đáp
ứng miễn dịch
5 heo không đáp
ứng miễn dịch
1 heo miễn dịch 1
phần
6 heo không đáp
ứng miễn dịch
− Ảnh hưởng của Aflatoxin B1 (khi thí nghiệm trên thú) đến đáp ứng miễn
dịch của heo heo con đã được chủng ngừa với erysipelas bacterin và cho nhiễm sau
21 ngày với dòng virus Erysipelothrix rhusiopathiae (theo Cysewski và cộng sự,
1978).
 Độc tính trên động vật thí nghiệm:
Nhiễm độc các aflatoxin gây ra một lọat các triệu chứng cấp và mãn tính.
Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các
triệu chứng thường gặp là họai tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận
cấp. Nhiễm độc mãn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ
máu, chảy máu và họai tử nhu mô. Lọai mãn tính tác động tới yếu tố di truyền tương
ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến.
Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận lên khả năng tác động lên tế bào gan của
aflatoxin qua 5 giai đọan:
− Tác động qua lại với ADN và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm
tổng hợp ADN và ARN.
− Ngừng tổng hợp ADN.
− Giảm tổng hợp ADN và ức chế tổng hợp ARN truyền tin.
− Biến đổi hình thái nhân tế bào.

− Giảm tổng hợp protein.
Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư
biếu mô tế bào gan.
Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mãn ở các loài động vật
và con người. Độc tính có nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan
nguyên phát. Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực
6
nghiệm bằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin. Một lọat các nghiên cứu
cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung
thư gan nguyên phát trên người. Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an
tòan lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc
là một vấn đề hết sức quan trong có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện
bệnh ung thư gan.
 Cụ thể aflatoxin gây ra các tác hại sau :
1. Phá hủy tế bào gan ,thận và các bộ phận sống còn khác.
2. Ảnh hưởng lên hệ miễn dịch.
3. Ăn mòn thành ruột và dạ dày.
4. Suy dinh dưỡng ,chậm lớn, chết.
5. Gây ra ung thư cho gia súc, gia cầm. Và nếu con người ăn thịt chứa
aflatoxin thì có thể bị ung thư gan. Chính vì vậy, Cục quản lý Thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ đã cấm tất cả các lọai thực phẩm và TĂCN có chứa aflatoxin. Trên
thực tế, tỷ lệ mắc bệnh cao tại các nước châu Á là do thực phẩm bị nhiễm aflatoxin.
− Ngoài aflatoxin, nhiều lọai mycotoxin khác cũng hết sức nguy hiểm như
ocharatoxin, T2 (trichothecenes).
Mycotoxin bằng đơn chất hay kết hợp gây ra hiện tượng sau( đôi khi thể hiện
nhiều hiện tượng trên 1 cá thể).
• Giảm lượng thức ăn vào, giảm năng suất.
• Suy yếu hệ thống miễn nhiễm (giảm lượng kháng thể trong cơ
thể)
• Gia tăng mức độ nhạy cảm đối với bệnh tật.

• Hư hại các cơ quan nội tạng (gan, thận, bộ phận sinh dục)
• Năng suất sản xuất kém (giảm tỷ lệ thụ thai, sẩy thai, âm hộ
sưng to,động dục giả)
• Mối nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng khi thực phẩm có
nhiễm mycotoxin.
 Một số lọai mycotoxin và tác hại cụ thể:
Mycotoxin Triệu chứng
T2 and Diacetoxycripenol Lở loét miêng, mất tính ngon miệng, da
và ruột bị bong tróc,sưng tấy.
Zearaleuone Rối lọan sinh sản
Vomitoxin and Fusarie acid Bỏ ăn ,da hay bị nhiễm nấm
Fumoni and Momlifosumin Gây rối lọan thần kinh, gan bị hư nát
Aflatoxin and Cyclopiazonic acid Gan bị nhiễm độc tố, suy yếu hệ thống
miễn nhiễm
Dehratoxin and Citrinin Thận nhiễm độc , bệnh Gout
4. Cách quản lý mycotoxin:
Cách quản lý mycotoxin hữu hiệu là trung hòa (bằng cách hấp phụ) khi chúng
được hấp thu qua đường ruột. Các nhà sản xuất thức ăn gia súc đặt ra câu hỏi
là:”Chất hấp phụ nào có hiệu quả cao nhất cho mycotoxin?”.Đặc điểm “lý tưởng” mà
chất hấp phụ cần có là :
− Có kết quả hấp phụ nhiều lọai mycotoxin.
− Liều dùng thấp.
− Phân tán nhanh ra đồng đều khi trộn.
− Bền với nhiệt trong suốt quá trình viên ép, ép đùn và dự trữ.
7
− Không hấp phụ các lọai vitamin, khóang và các dưỡng chất khác.
− Độ pH không thay đổi.
− Có khả năng phân hủy sinh học khi lọai thải ( theo phân vật nuôi).
5. Chế phẩm có tác dụng hấp phụ độc tố nấm mốc trong thức ăn
chăn nuôi - Condition ADE 200 HPC

5.1.Tác dụng lọai bỏ độc tố nấm mốc (Mycotoxin) của chế phẩm Condition Ade
200 HPC.
− Chế phẩm Condition Ade 200 HPC do công ty OIL.DRI- Mỹ nghiên cứu và
sản xuất bằng công nghệ hấp thụ hiện đại. Nó là chất hấp thụ độc tố Mycotoxin do
các lọai nấm mốc khác nhau tạo ra trong thức ăn chăn nuôi tốt nhất cũng như giá
thành rẻ so với các chất hấp thụ khác (Silicát tổng hợp, chất kết dính sét và những
sản phẩm lên men).
− Tác dụng lọai bỏ nấm mốc Mycotoxin của chế phẩm Condition Ade 200
HPC đem lại hiệu quả như sau:
• Hiệu lực đặc hiệu đối với nhiều lọai độc tố nấm mốc.
• Không gây ảnh hưởng (phá hủy) từ các lọai vitamin, acid amin hoặc là
dược phẩm.
• Có thể pha trộn dễ dàng vào các lọai thức ăn khác nhau.
• Chi phí thấp. Tỷ lệ pha trộn thấp: 2,5 kg chế phẩm này /1 tấn thức ăn.
• Chế phẩm Condition Ade 200 HPC được sản xuất dựa trên quy trình
kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt.
• Nguyên liệu là từ khóang chất nhất quán có chất lượng cao của thiên
nhiên.
5.2.Tính chất hấp phụ và sự liên kết của Condition Ade 200 HPC
− Những đặc tính hấp phụ
Những hạt nhỏ Condition Ade 200 HPC rất xốp, trọng lượng tăng lên 1,3 lần khi
tiếp xúc với chất lỏng tạo cho chúng sức hấp thụ cực độ. Mỗi kg chế phẩm có trên
700 triệu hạt và mỗi hạt có diện tích bề mặt trong rất lớn, nhờ đó cung cấp một
lượng lớn các vòng liên kết giúp lọai bỏ nhiều lọai độc tố.
− Sự hút bám trên diện tích bề mặt
Mỗi gam Condition Ade 200 HPC có 115 mét vuông diện tích bề mặt. Diện tích bề
mặt này làm tăng cường mức độ tiếp xúc bề mặt và độc tố nấm mốc Mycotoxin và
giúp hấp thụ nhiều độc tố nấm mốc hiệu quả hơn.
− Sự hấp thụ của thể tích thẩm thấu
Diện tích bề mặt bên trong của những hạt nhỏ Condition Ade 200 HPC chiếm 98

% tổng diện tích bề mặt. Thể tích thẩm thấu này cho phép hạt nhỏ Condition Ade
200 HPC hút nước như là một miếng xốp.
− Tốc độ hút bám của độc tố Aflatoxin của Condition Ade 200 HPC
Condition Ade sẽ kết dính nhanh độc tố Aflatoxin trong bộ máy tiêu hóa của vật
nuôi khi thức ăn nhiễm nấm mốc. Khi trộn Condition Ade 200 HPC vào thức ăn
nhiễm nấm mốc nó làm vô họat tác hại của độc tố nấm mốc có trong đó.
II. THỪƠNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ VI
NẤM AFLATOXIN
1. Nguyên lý của phương pháp:
Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết này được lọc
và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen. Làm bay hơi dung dịch rửa
giải và hòa cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzene-axetonitril. Sau đó chấm một
phần xác định mẫu thử lên bản mỏng, chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc
ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngọai có bước sóng
8
365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ hùynh
quang.
2. Đối tượng áp dụng của phương pháp:
Xác định hàm lượng Aflatoxin B1, B2, G1 , G2 trong các sản phẩm ngũ cốc
đậu đỗ, hạt có dầu.
3. Dụng cụ , hóa chất, thuốc thử:
 Dụng cụ:
− Máy xay nghiền mẫu
− Máy lắc hoặc máy khuấy từ
− Cân phân tích
− Máy cất quay chân không
− Bếp cách thủy
− Đèn tử ngọai có bước sóng 365nm.
− Quang phổ kế UV-VIS.
− Máy đo mật độ hùynh quang.

− Các trang bị của sắc kí lớp mỏng.
− Cột sắc ký thủy tinh, đường kính trong 22mm, dài 300mm, có khóa nút
mài thủy tinh hoặc Teflon và bình đựng dung môi phía trên, dung lượng 250ml.
− Bình nón nút mài 250ml, 500ml.
− Ống đong 50ml,100ml.
− Phễu lọc, đường kính 8-10 cm.
− Micropipet Hamilton: 20 ml,50 ml
− Bản mỏng kích thước 20x20 cm tráng sẵn lớp mỏng Sillicagen 60-G.
 Hóa chất, thuốc thử:
Tất cả các hóa chất đều là lọai tinh khiết phân tích (TKPT) nếu không có các chỉ
dẫn riêng nào khác.
1. Axêtôn
2. Clorofoc.
3. n- Hexan
4. Ete êtylic khan
5. Metanol
6. Axetonnitril
7. Toluen
8. Natri sunfat khan
9. Celite 545, đất điatomit
10.Axit sunfuric 50% (v/v)
11.Axit trifluoraxectic
12.Khí nitơ
13.Bông hút nước (được lọai béo bằng clorofoc ) hoặc bong thủy tinh.
14.Các hê dung môi khải triển sắc ký.
− Clorofoc /axeton:9/1 (v/v) (theo tỷ lệ thể tích)
− Ete êtylic/ methanol/ nước :94/4,5/1, 5/1 (v/v/v/v)
− Clorofoc/ axeton/ isopropanol/ nước :88/12/1, 5/1 (v/v/v/v)
− Toluen/ êtyl axetat/ axit fomic: 6/3/1 (v/v/v)
15.Silicagen G-60 dùng cho sắc ký cột cỡ hạt 0,063 , 0,2 mm. Họat hóa bằng

cách sấy khô ở 105
0
C trong 1 giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám,
thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 1gam silicagen, đậy nút, lắc đến khi trộn
hòan tòan đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín.
9
16.Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát,
tránh ánh sáng):
16a. Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A):
− Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi lọai aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt
cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hơp toluene-
axetonitril 98:2 (v/v) ( nồng độ dung cịch aflatoxin chuẩn là 10mg/ml).
16.b .Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dịch B):
− Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml
aflatoxin G1; 0,1ml aflatoxin B2; 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên ), định
mức đến 10 ml bằng hỗn hợp toluene-axetonitril 98:2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5
mg/ml đối với B1, G1, và 0,1 mg/ml đối với B2,G2.
16.c.Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn ( dung dịch A mg/ml)
bằng quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350 nm, tính kết quả theo
công thức:
C (mg/ml)=1000.m.A/e
Trong đó:
− m- Khối lượng phân tử Aflatoxin
− A- Mật độ quang ở bước sóng hấp thụ.
− E-Độ hấp thụ phân tử của aflatoxin
Aflatoxin m Dung môi
Benzene-axetonitril (v/v)
l max
(nm)
e

B1 312 98:2 350 19800
B2 314 98:2 350 20900
G1 328 98:2 350 17100
G2 330 98:2 350 18200
Bảo quản:
Bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 0
0
C, dung dịch A để được 6 tháng và dung dịch
B để được 2 tuần trước khi dung họat hóa ở 110
0
C trong 1 giờ.
4. Phương pháp tiến hành:
(Điều kiện tiến hành : ở phòng mát, tránh ánh nắng)
 Chuẩn bị mẫu:
Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm.
Chú thích: Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%,cần loại chất béo
bằng cách chiết với dung môi ete dầu hỏa(độ sôi 40-60 0C) sau khi đã hoàn thành
công đoạn nghiền mẫu.
 Tiến hành xét nghiệm:
a. Chiết suất:
Cân 50g mẫu đã nghiền nhỏ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiếp 25ml
nước, 25g celite 545. 250ml clorofoc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc
quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kĩ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ
10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10g mẫu thử).
10
Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phễu Bucher có chứa 1 lớp celite 545
dày 5mm trên giấy lọc và lọc hút chân không.
b. Làm sạch mẫu bằng cột sắc kí:
 Chuẩn bị cột sắc ký :
− Cho một ít bông vào đáy cột sắc kí, thêm 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc

đến 2/3 cột. Sau đó cho 10g silicagel dùng cho sắc kí cột (3-15) ,vừa cho vừa gõ nhẹ
vào thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí.
Mở khóa cho clorofoc chảy xuống từ từ. khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết
clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ từ 15g natri sunfat
khan, sau khi rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu
được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat
khan trên.
− Trộn 50ml dịch lọc trên (5-3) với 150ml n-hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc kí
đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ete etylic khan,loại
bỏ dung dich chảy ra.Chú ý không để cột bị khô,lưu lượng dòng chảy khoảng 8-12
ml/phút.
− Dung dịch rửa giải aflatoxin trên bằng 150ml hỗn hợp metanol-clorofoc(3 :
97). Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết. Lưu
lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân
không ở nhiệt độ thấp hơn 50
o
C cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml. Chuyển sang ống
nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thủy
ở nhiệt độ thấp hơn 50
o
C, tốt nhất dưới luồng khí nitow nhẹ cặn còn lại trong ống
nghiệm là mẫu phân tích. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc kí lớp mỏng.
c. Sắc kí lớp mỏng một chiều:
Chuẩn bị:
Hòa cặn thu được ở trên bằng 0,5 ml hỗn hợp benzen-axetonitril (98:2) và lấy
dịch này để chấm lên bản sắc ký.
Với bản mỏng tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở
hai cạnh bên tấm sắc kí với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2cm, dùng mao
quản hay micropipet chấm các vết dung dich chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử
như sau:

1. Lấy 2;5;10;20ml dung dịch chuẩn B(3.17.2).
2. Lấy 10ml dịch chiết với 10ml dung dịch chuẩn B(3.17.2).
3. Lấy 10,20ml dich chiết.
− Với từng thể tích như trên,4 dung dịch aflatoxin B1.B2,G1,G2 chuẩn có thể
được chấm chồng lên nhau.
− Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc – axeton (9:1).
Sau khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10 cm (khoảng 30 phút), lấy bản sắc ký
ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó soi dưới đèn tử
ngoại với bước sóng 365nm. Các vết aflatoxin B1,B2 có huỳnh quang màu xanh da
trời; G1,G2 có huỳnh quang màu xanh lá cây. Nếu mẫu thử có aflatoxin sẽ xuất hiện
các vết cùng giá trị Rf với các vết aflatoxin chuẩn.
Rf của các vết aflatoxincuar hệ dung môi clorofoc-axeton(9-1) có trị số trung bình
như sau:
Aflatoxin B1 : 0,72
Aflatoxin B2 : 0,67
Aflatoxin G1 : 0,59
Aflatoxin G2 : 0,54
d. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin:
11
- Phun dung dịch axit sunfuric 50% (v/v) lên bản sắc ký, huỳnh quang của các
vết aflatoxin sẽ chuyển sang màu vàng dưới tia tử ngoại có bước sóng 365nm.
- Rót dung dịch lốt 5 – 10% trong ête lên một tấm thủy tinh 20 x 20cm, dàn
đều ở khu vực giữa, để cho ête bay hơi hết còn lại một lớp iốt mỏng. Đặt úp tấm thủy
tinh này lên bản sắc ký đã triển khai, cách khoảng 1 cm trong thời gian 20 – 30 giây.
Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và
dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin.
- Chia bản mỏng silicagel 20 x 20 cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở
giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thử và dung dịch aflatoxin chuẩn như sau:
Phần 1: Bên trái, chấm 4 vết như sau:
1. 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)

2. 10ml dịch chiết
3. 10ml dịch chiết với 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
4. 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
Phần 2: Bên phải, chấm 4 vết như sau:
5. 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
6. 10ml dịch chiết
7. 10ml dịch chiết với 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
8. 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
− Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở
phần 1 bên trái, mỗi vết một giọt axit trifluoraxetic. Che phần 1 (bên trái) bằng một
tấm thủy tinh khác, phun lên phần 2 (bên phải) dung dịch axit sunfuric 50% (v/v).
Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển.
Dung môi khai triển: Nước/metanol/ ete etylic - 1/3/96 (v/v).
− Khi dung môi lên khoảng 13cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ
phòng, tránh ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm, cách đèn 10cm.
 Đánh giá kết quả:
- Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn
và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf ngắn hơn bình thường, vẫn giữ
nguyên màu huỳnh quang xanh.
- Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn
và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf bình thường, và màu huỳnh quang
xanh chuyển sang màu vàng.
 Định lượng
a. Bằng mắt:
−
Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh mật độ
huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn.
Vết huỳnh quang của vết chấm dung dịch aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch chiết
phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10ml dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu mật độ
huỳnh quang của vết 10ml dịch chiết đậm hơn mật độ huỳnh quang của vết 20ml

dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết và tiến hành làm sắc ký lớp mỏng lại.
− Tính kết quả
Hàm lượng aflatoxin (C) tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu được tính theo
công thức:
C = S * Y * V / W *X
12
Trong đó:
S – Nồng độ aflatoxin của dung dịch chuẩn microgam/ml (dung dịch B)
V – Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, ml.
W – Khối lượng của mẫu thử, (tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm
sạch qua cột) g.
X – Thể tích dịch chiết có mật độ huỳnh quang giống thể tích Y của dung dịch chuẩn
chấm trên bản mỏng, ml.
Y – Thể tích dung dịch chuẩn có mật độ huỳnh quang giống thể tích X của dịch chiết
chấm trên bản mỏng, ml.
b. Bằng máy đo mật độ huỳnh quang.
− Bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 443nm. Định
lượng aflatoxin trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang
của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn.
− Tính kết quả.
Hàm lượng aflatoxin (C), tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu thử tính như
sau:
C = A m * S * V * Y / A s * W * X
Trong đó:
A m – Mật độ huỳnh quang của vết mẫu.
A s – Mật độ huỳnh quang của vết chuẩn.
X – Thể tích của dịch chiết chấm lên bản mỏng (ml).
Y – Thể tích của dịch chuẩn chấm lên bản mỏng (ml).
S – Hàm lượng aflatoxin của dung dịch chuẩn, (ng).
V – Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, (ml).

W – Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm
sạch qua cột, (g).
 Độ nhạy của phương pháp: 5mg/kg (5ppm)
- Hệ số thu hồi của phương pháp: 90 ±

5%.
- Sai số trung bình của phương pháp: ±

10%.
III. GIỚI THIỆU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NẤM MỐC MỚI
− Trong phân tích độc tố nấm mốc hiện nay thì các phương pháp dựa trên
nguyên tắc sắc ký khí vẫn chiếm giữ vị trí chủ yếu. Tuy nhiên, người ta cũng bắt đầu
nghiên cứu sử dụng thêm một số phương pháp khác như phương pháp phân tích
nhanh đa độc tố hay sử dụng một số kỹ thuật mới như cảm biến sinh học
(Rudofkrska và Elivira Welzig). Các phương pháp phân tích để xác định các độc tố
nấm mốc trong thực phẩm đã được phát triển và hoàn thiện từ những năm 1960.
Độc tố nấm mốc là những hợp chất có cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa khác
nhau nên cần những phương pháp kiểm tra đặc trưng riêng. Chính vì vậy đã xuất
hiện nhiều phương pháp xác định như các phương pháp dựa trên cơ sở sắc ký lỏng
(LC) hoặc sắc ký khí (GS) với detector thích hợp như detector huỳnh quang (FLD),
detector bắt điện tử UV, detector ion (FID), detector bắt điện tử (ECD), detector khối
phổ (MS). Các phương pháp này thường cho kết quả tối ưu với từng loại độc tố nấm
mốc nhất định hoặc một nhóm các độc tố nấm mốc có liên hệ gần gũi với nhau về
cấu trúc, ví dụ như nhóm trichothecenne B.
− Phương pháp phân tích độc tố nấm mốc bằng sắc ký vẫn thường gặp áp
dụng rộng rãi trong các quy trình vì chi phí đầu tư không cao. Các cột sắc ký, các
phương pháp làm sạch mẫu vẫn luôn có những cải tiến và đã đạt được những phát
triển đáng kể. Hiện nay, trên thị trường đã có các cột ái lực miễn dịch, vật liệu SPE
trong các ống nhựa sử dụng một lần và các cột Mycosep cho các loại độc tố nấm
mốc chính.

1. Phương pháp sắc ký lỏng với hai lớp khối phổ (LC – MS/MS)
13
Người ta luôn mong muốn có được các phương pháp phân tích đa độc tố. Hiện
nay, đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng với hai lớp khối phổ (LC – MS/MS) có
thể cùng lúc xác định tới 40 loại độc tố nấm mốc khác nhau. Thiết bị LC – MS/MS
này không đòi hỏi mẫu phải được làm sạch, đặc biệt trong máy có sử dụng các mẫu
chuẩn có gắn đồng vị. Tuy nhiên, LC – MS/MS cũng không hoàn toàn tránh khỏi
những ảnh hưởng tiêu cực của các vấn đề trong quá trình chuẩn bị mẫu và có thể
dẫn tới việc tín hiệu bị nhiễu hay bị triệt tiêu. Có chi phí đầu tư cao nên phải mất một
thời gian nữa LC – MS/MS mới được áp dụng rộng rãi trong các quy trình phân tích.
2. Phương pháp Elisa và que thử
− Trong số các phương pháp phân tích nhanh, dựa trên kỹ thuật hóa miễn
dịch, không đòi hỏi phải làm sạch mẫu hay phải làm giàu tác nhân cần phân tích thì
phương pháp xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) là một trong những
công cụ hữu ích nhất để kiểm tra nhanh độc tố nấm mốc, đặc biệt trong kiểm tra
nguyên liệu thô.
− Phương pháp ELISA sử dụng các đĩa nhỏ có ưu điểm lớn về tốc độ, độ
nhạy tính đặc hữu, dễ sử dụng và số lượng mẫu lớn do việc tự động hóa hoàn toàn
với các Robot. Hệ thống nhận biết độc tố nấm mốc Châu Âu (European Mycotoxin
awareness Network – EMAN) cũng đã biên soạn một danh mục các bộ thử thương
mại (chi tiết kỹ thuật) cho phân tích độc tố nấm mốc. Tuy nhiên phương pháp LISA
có thể bị ảnh hưởng bởi cấu trúc thành phẫn của mẫu.
− Trong những năm gần đây, các bộ thử dựa trên nguyên tắc cạnh tranh
gián tiếp cho sử dụng tại thực địa đã xuất hiện. Đầu tiên, người ta phát triển các que
nhúng nhưng việc nhúng một que nhỏ liên quan vào nhiều dung dịch khác nhau đã
nhanh chóng trở nên không thực tế. Sau đó những bộ thử này được thay thế bởi các
thiết bị này thường được gọi nhầm là que thử nhưng chúng dựa trên nguyên lý kiểm
tra cạnh tranh có sử dụng kháng thể đánh dấu với các hạt latex hoặc với keo vàng.
Hiện nay đã có các bộ LFD cho aflatoxin và deoxynivaleno (DON)
3. Một số kỹ thuật mới

− Để góp phần làm giảm hơn chi phí và thời gian phân tích độc tố nấm mốc,
những kỹ thuật phân tích mới đang được nghiên cứu và áp dụng. Tất nhiên việc đưa
kỹ thuật từ phòng thí nghiệm trở thành sản phẩm thương mại hóa phương pháp
phân tích độc tố nấm mốc dựa trên cảm biến sinh học như: phương pháp xét nghiệm
miễn dịch huỳnh quang phân cực (FPI) và phương pháp cộng hưởng gen nguyên
sinh bề mặt (SPR).
− Phương pháp xác định độc tố gián tiếp khác rất đáng chú ý đang được
nghiên cứu là phương pháp sử dụng quang phổ trung hồng ngoại chuyển đổi chuỗi
Fourier với mức phản xạ toàn phần yếu (ATR) hay quang phổ cận hồng ngoại. Các
phương pháp này giảm việc chuẩn bị mẫu xuống mức tối thiểu. Tuy nhiên các kỹ
thuật quang phổ có những hạn chế lớn là mức độ phụ thuộc cao vào cấu trúc thành
phần mẫu và thiếu vật liệu kiểm chuẩn.
− Có thể thấy việc thiếu bộ mẫu tham khảo – vật liệu kiểm chuẩn hiện nay là
khó khăn lớn để các phòng thí nghiệm đảm bảo chất lượng phân tích độc tố nấm
mốc. Một số giải pháp hiện thời có thể áp dụng là:
Thường xuyên tham dự những kỳ kiểm tra độ thành thục tổ chức bởi những
cơ quan như FAPAS (www.fapas.com).
Sử dụng bộ các mẫu tham khảo (đã được chứng nhận) RM hoặc CRM. Cả
tập hợp mẫu RM lẫn mẫu CRM sử dụng cho việc phân tích độc tố aflatoxin và
Fusarium dù còn chưa hoàn chỉnh của các mẫu CRM đã có thể tìm thấy ở COMAR
(www.comar.bam.de), cho phép truy việc truy nguyên nguồn gốc và so sánh các kết
quả phân tích độc tố nấm mốc.
14
15