thu nhận enzyme papain từ đu đủ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (620.91 KB, 16 trang )
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
THU NHẬN ENZYM PAPAIN
THU NHẬN ENZYM PAPAIN
TỪ ĐU ĐỦ
TỪ ĐU ĐỦ
Nhóm HTV:
Nhóm HTV:
Phan Huy Huy
Phan Huy Huy
Phạm Quốc Trung
Phạm Quốc Trung
Lư Quốc Việt
Lư Quốc Việt
Nhóm: HTV 1
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
I.
I.
TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]:
TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]:
Hình
Hình
I.1: Nguồn nguyên liệu thu nhựa
I.1: Nguồn nguyên liệu thu nhựa
Hình I.2: Hoa đu đủ
Hình I.2: Hoa đu đủ
để sản xuất papain
để sản xuất papain
I.1 Đặc điểm chung:
I.1 Đặc điểm chung:
Enzym papain được tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, thuộc nhóm enzym thuỷ phân
Enzym papain được tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, thuộc nhóm enzym thuỷ phân
có nguốn gốc thực vật được ngun cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động.
có nguốn gốc thực vật được ngun cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động.
Papain là một sulfhydryl protease, lần đầu tiên được tách ra bởi Bals và cộng sự của ơng,
Papain là một sulfhydryl protease, lần đầu tiên được tách ra bởi Bals và cộng sự của ơng,
sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khơ
sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khơ
Theo danh pháp quốc tế, papain mang mã số 3.4.22.2, có hoạt tính xúc tác tương tự
Theo danh pháp quốc tế, papain mang mã số 3.4.22.2, có hoạt tính xúc tác tương tự
như bromelin (trong dứa) và ficin (trong cây sung).
như bromelin (trong dứa) và ficin (trong cây sung).
G.C.Roy là người đầu tiên phát hiện ra nhựa cây đu đủ là một nguồn enzym. Ơng
G.C.Roy là người đầu tiên phát hiện ra nhựa cây đu đủ là một nguồn enzym. Ơng
cơng bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical Journal’’. Đến năm 1879, Wrutz
cơng bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical Journal’’. Đến năm 1879, Wrutz
và Bouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phân
và Bouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phân
huỷ protein của enzym trong nhựa đu đủ. Ngày nay, thuật ngữ “papain” tiếp tục được sử
huỷ protein của enzym trong nhựa đu đủ. Ngày nay, thuật ngữ “papain” tiếp tục được sử
dụng để miêu tả mủ đu đủ khơ được dùng rộng rãi trong cơng nghiệp và cả trong chế phẩm
dụng để miêu tả mủ đu đủ khơ được dùng rộng rãi trong cơng nghiệp và cả trong chế phẩm
enzym thuỷ phân dạng kết tinh từ mủ.
enzym thuỷ phân dạng kết tinh từ mủ.
Nhóm: HTV 2
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trãi rộng khắp tồn bộ cây, ngoại trừ rễ.
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trãi rộng khắp tồn bộ cây, ngoại trừ rễ.
Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất. Nhựa là hỗn hợp enzyme chứa
Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất. Nhựa là hỗn hợp enzyme chứa
các protease sau: papain, chymopapain A (gốc aa cuối là glutamic acid), chymopapain B
các protease sau: papain, chymopapain A (gốc aa cuối là glutamic acid), chymopapain B
(gốc aa cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease. Các tính chất vật lý
(gốc aa cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease. Các tính chất vật lý
của papain gần giống với chymopapain nhưng papain có hoạt tính mạnh hơn gấp nhiều lần
của papain gần giống với chymopapain nhưng papain có hoạt tính mạnh hơn gấp nhiều lần
chymopapain.
chymopapain.
I.2 Tính chất vật lý:
I.2 Tính chất vật lý:
Bảng I.2.1: Tinh chất vật lý của papain:
Bảng I.2.1: Tinh chất vật lý của papain:
Tính chất vật lý Giá trò
Điểm đẳng điện
Điểm đẳng điện
pI = 8,75
pI = 8,75
Hằng số lắng S
Hằng số lắng S
20
20
2,42 ± 0,04
2,42 ± 0,04
Hằng số phân tán D
Hằng số phân tán D
20
20
(10
(10
-7
-7
giây.cm
giây.cm
2
2
)
)
10,27 ± 0,13
10,27 ± 0,13
Phân tử lượng
Phân tử lượng
20700
20700
Độ triền quang [
Độ triền quang [
α
α
]D
]D
-66,7
-66,7
o
o
Độ xoắn
Độ xoắn
17%
17%
Vòng hiệu ứng coton
Vòng hiệu ứng coton
290nm
290nm
Thể tích riêng phần V(mL/g)
Thể tích riêng phần V(mL/g)
0,724
0,724
Trò số ma sát f/f
Trò số ma sát f/f
o
o
1,16
1,16
Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu
Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu
cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine.
cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine.
Bền nhiệt.
Bền nhiệt.
I.3 Tính chất hóa học
I.3 Tính chất hóa học
:
:
Cấu tạo hóa học
Cấu tạo hóa học
:
:
-
-
Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S.
Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S.
-
-
Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212
Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212
amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine,
amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine,
có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vò trí 22-63, 56-95, 153-200
có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vò trí 22-63, 56-95, 153-200
không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và
không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và
một nhóm –SH tự do ở vò trí cysteine 25.
một nhóm –SH tự do ở vò trí cysteine 25.
-
-
Papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine.
Papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine.
Nhóm: HTV 3
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Cấu trúc không gian:
Cấu trúc không gian:
Phân tử papain có dạng cầu, mạch chính bò gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe.
Phân tử papain có dạng cầu, mạch chính bò gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe.
Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhóm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và
Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhóm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và
nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn
nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn
α
α
chiếm 20% toàn bộ các amino acid có
chiếm 20% toàn bộ các amino acid có
trong phân tử.
trong phân tử.
Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai
Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai
nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn
nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn
α
α
. Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội
. Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội
phân tử.
phân tử.
Cấu trúc tâm hoạt động của papain:
Cấu trúc tâm hoạt động của papain:
Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của
Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của
histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên
histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên
kết hydrogen.
kết hydrogen.
Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:
Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:
Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys.
Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys.
Hình I.3.1: Tâm hoạt động của papain
Hình I.3.1: Tâm hoạt động của papain
Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:
Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa
như endopeptidase vừa như exopeptidase.
như endopeptidase vừa như exopeptidase.
Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid:
Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid:
Nhóm: HTV 4
(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)
(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)
n
n
+ HOH (-NH-CH(R)-COOH)
+ HOH (-NH-CH(R)-COOH)
i
i
+ (H
+ (H
2
2
N-CH(R)-CO-)
N-CH(R)-CO-)
k
k
i + k = n
i + k = n
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid
Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid
So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng
So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng
thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu
thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu
hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự
hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự
do. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ
do. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ
ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-
ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-
Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vò trí giữaY và Z, nhưng nếu
Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vò trí giữaY và Z, nhưng nếu
peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vò trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy
peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vò trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy
phân bởi papain.
phân bởi papain.
Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase.
Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase.
Hoạt hoá papain:
Hoạt hoá papain:
Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta
Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta
phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt
phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt
động. Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có
động. Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có
tính khử như cysteine, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các
tính khử như cysteine, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các
chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được
chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được
hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine
hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine
đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion
đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion
kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Bất hoạt:
Bất hoạt:
Papain bò kìm hãm (ức chế bất thuận nghòch) bởi các chất oxi hoá như: O
Papain bò kìm hãm (ức chế bất thuận nghòch) bởi các chất oxi hoá như: O
2
2
, O
, O
3
3
, H
, H
2
2
O
O
2
2
,
,
iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở
iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở
trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
Papain bò bất hoạt thuận nghòch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. Papain tác
Papain bò bất hoạt thuận nghòch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. Papain tác
dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain
dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain
lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như
lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như
không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M).
không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M).
Nhóm: HTV 5
(H
(H
2
2
N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)
N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)
n
n
+ HOH (H
+ HOH (H
2
2
N-CH(R)-COOH)
N-CH(R)-COOH)
n’
n’
+ (H
+ (H
2
2
N-CH(R)-CO-)
N-CH(R)-CO-)
k’
k’
n’ + k’ = n
n’ + k’ = n
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:
Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:
•
•
Nhiệt độ:
Nhiệt độ:
Papain là enzym chòu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bò
Papain là enzym chòu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bò
biến tính trong 3 giờ ở 100
biến tính trong 3 giờ ở 100
o
o
C. Ở dạng dung dòch, papain bò mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5
C. Ở dạng dung dòch, papain bò mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5
o
o
C
C
và nếu tăng nhiệt độ trên 100
và nếu tăng nhiệt độ trên 100
o
o
C thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất
C thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất
hoạt hóa vào dung dòch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bò phá hủy hoàn toàn.
hoạt hóa vào dung dòch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bò phá hủy hoàn toàn.
Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở
Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở
trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain
trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain
trong dung dòch NaCl giữ ở 4
trong dung dòch NaCl giữ ở 4
o
o
C bền trong nhiều tháng. Trong dung dòch dẫn xuất thủy ngân,
C bền trong nhiều tháng. Trong dung dòch dẫn xuất thủy ngân,
papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày
papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày
1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá. Papain dạng ổn đònh (có cấu trúc không gian ổn đònh) ở
1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá. Papain dạng ổn đònh (có cấu trúc không gian ổn đònh) ở
trạng thái khô có thể chòu được nhiệt độ sấy ở 115
trạng thái khô có thể chòu được nhiệt độ sấy ở 115
o
o
C trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được
C trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được
90%.
90%.
•
•
pH:
pH:
Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính
Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính
trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12. Tuỳ thuộc
trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12. Tuỳ thuộc
bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau. Papain dạng ổn đònh có thể chòu
bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau. Papain dạng ổn đònh có thể chòu
được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút.
được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút.
•
•
Dung môi:
Dung môi:
Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không bò giảm hoạt tính
Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không bò giảm hoạt tính
trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dòch TCA
trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dòch TCA
10% papain bò biến đổi bất thuận nghòch.
10% papain bò biến đổi bất thuận nghòch.
Nhóm: HTV 6
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
II.
II.
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]:
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]:
Quy trình công nghệ:
Quy trình công nghệ:
Nguyên liệu
Nghiền
Trích ly
bã
cát sạch
celite
Lọc
Chỉnh pH
Lọc
Kết tủa
bã
tủa
xám
NaOH
(NH
4
)
2
SO
4
phân đoạn 1
Ly tâm 1
Ly tâm 2
Kết tinh
dòch
lỏng
dòch
lỏng
NaCL rắn
Kết tủa
phân đoạn 2
Papain
Tái kết tinh
Sấy chân không
dd NaCl
bão hòa
Nhóm: HTV 7
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
1.
1.
Thu nhận nhựa đu đủ:
Thu nhận nhựa đu đủ:
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ.
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ.
Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối
Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối
là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase
là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase
IV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%.
IV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%.
Điều kiện lấy nhựa:
Điều kiện lấy nhựa:
-
-
Cây đang sinh trưởng tốt, không bò sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa
Cây đang sinh trưởng tốt, không bò sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa
nhiều.
nhiều.
-
-
Quả: lấy ở những quả còn xanh, vỏ mòn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt
Quả: lấy ở những quả còn xanh, vỏ mòn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt
nhất.
nhất.
-
-
Thời gian lấy nhựa: sáng sớm.
Thời gian lấy nhựa: sáng sớm.
Hình II.1.1: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa.
Hình II.1.1: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa.
Cách tiến hành:
Cách tiến hành:
-
-
Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây, dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đường
Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây, dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đường
dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm
dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm
(không rạch sâu quá 2cm để dòch nước và tinh bột từ quả không bò trộn lẫn vào
(không rạch sâu quá 2cm để dòch nước và tinh bột từ quả không bò trộn lẫn vào
nhựa làm giảm chất lượng nhựa).
nhựa làm giảm chất lượng nhựa).
-
-
Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấy
Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấy
nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ
nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ
các công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho
các công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho
nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khi
nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khi
lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào.
lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào.
Nhóm: HTV 8
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Hình II.1.2: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ
Hình II.1.2: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ
•
•
Lưu ý:
Lưu ý:
-
-
Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa.
Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa.
-
-
Quả có thể được rút nhựa trong suốt 4 - 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần một rạch
Quả có thể được rút nhựa trong suốt 4 - 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần một rạch
là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước đó.
là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước đó.
-
-
Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng, không nên
Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng, không nên
để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng… vì sẽ
để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng… vì sẽ
làm biến màu và giảm hoạt tính enzym. Lọ, dao, muỗng… phải được làm bằng
làm biến màu và giảm hoạt tính enzym. Lọ, dao, muỗng… phải được làm bằng
nhựa hoặc thép không rỉ.
nhựa hoặc thép không rỉ.
-
-
Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% ẩm.
Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% ẩm.
2.
2.
Thu nhận papain :
Thu nhận papain :
2.1.
2.1.
Chuẩn bò:
Chuẩn bò:
Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym,
Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym,
protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình tách
protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình tách
và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm
và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm
loại bỏ các tạp chất trên. Cách làm như sau:
loại bỏ các tạp chất trên. Cách làm như sau:
-
-
Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kó trong cối ở
Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kó trong cối ở
nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dòch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein
nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dòch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein
Nhóm: HTV 9
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
hydrochloride trong 1000mL dung dòch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa
hydrochloride trong 1000mL dung dòch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa
pH dòch chiết tới 5,7).
pH dòch chiết tới 5,7).
-
-
Khi dòch nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền
Khi dòch nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền
và trích được lặp lại với 300mL dung dòch cysteine. Rửa cối với dung dòch cysteine
và trích được lặp lại với 300mL dung dòch cysteine. Rửa cối với dung dòch cysteine
để điều chỉnh thể tích dòch chiết lên 1l.
để điều chỉnh thể tích dòch chiết lên 1l.
-
-
Dòch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số
Dòch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số
1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần
1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần
5,7.
5,7.
-
-
Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym được tiến hành trong điều kiện
Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym được tiến hành trong điều kiện
lạnh.
lạnh.
2.2.
2.2.
Loại bỏ các chất không tan ở pH 9:
Loại bỏ các chất không tan ở pH 9:
Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dòch NaOH 1M để điều
Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dòch NaOH 1M để điều
chỉnh pH của dòch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1
chỉnh pH của dòch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1
giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dòch trích trong.
giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dòch trích trong.
2.3.
2.3.
Quá trình phân đoạn bằng (NH
Quá trình phân đoạn bằng (NH
4
4
)
)
2
2
SO
SO
4
4
:
:
Cho (NH4)
Cho (NH4)
2
2
SO4 vào dòch enzym đến 40% độ bão hòa, sau 1 - 2 giờ, ly tâm ở 2500
SO4 vào dòch enzym đến 40% độ bão hòa, sau 1 - 2 giờ, ly tâm ở 2500
vòng/phút. Thu nhận tủa, bỏ dòch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa
vòng/phút. Thu nhận tủa, bỏ dòch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa
lại một lần nữa với 400 - 500mL dung dòch (NH
lại một lần nữa với 400 - 500mL dung dòch (NH
4
4
)
)
2
2
SO
SO
4
4
40% độ bão hòa.
40% độ bão hòa.
2.4.
2.4.
Quá trình phân đoạn bằng NaCl:
Quá trình phân đoạn bằng NaCl:
Hòa tan tủa trong 600mL dung dòch cysteine 0,02M, dung dòch thu được có pH 7-7,5,
Hòa tan tủa trong 600mL dung dòch cysteine 0,02M, dung dòch thu được có pH 7-7,5,
sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa,
sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa,
bỏ dòch lỏng.
bỏ dòch lỏng.
2.5.
2.5.
Kết tinh:
Kết tinh:
Hoà tan tủa với 400mL dung dòch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một
Hoà tan tủa với 400mL dung dòch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một
dung dòch huyền phù có pH = 6,5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành,
dung dòch huyền phù có pH = 6,5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành,
duy trì ở 4
duy trì ở 4
o
o
C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh
C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh
thể.
thể.
Nhóm: HTV 10
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
2.6.
2.6.
Tái kết tinh:
Tái kết tinh:
Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất ở nhiệt độ phòng tạo dung dòch có
Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất ở nhiệt độ phòng tạo dung dòch có
nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dòch NaCl bão
nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dòch NaCl bão
hòa (10mL/300mL dung dòch protein). Khi 75% thể tích dung dòch NaCl đã cho vào, papain
hòa (10mL/300mL dung dòch protein). Khi 75% thể tích dung dòch NaCl đã cho vào, papain
bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dòch huyền phù được giữ ở 4
bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dòch huyền phù được giữ ở 4
o
o
C qua đêm, sau đó ly tâm
C qua đêm, sau đó ly tâm
lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4 - 5 giờ để thu nhận tinh thể. Hoạt độ riêng của enzym có thể
lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4 - 5 giờ để thu nhận tinh thể. Hoạt độ riêng của enzym có thể
tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong
Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong
dung dòch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A
dung dòch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A
o
o
và
và
đem kết tinh dòch lỏng thu được sau siêu lọc.
đem kết tinh dòch lỏng thu được sau siêu lọc.
2.7.
2.7.
Sấy chân không:
Sấy chân không:
Sấy chân không ở nhiệt độ 40
Sấy chân không ở nhiệt độ 40
o
o
C thu nhận papain tinh chế
C thu nhận papain tinh chế
.
.
Hình II.2.1: Trái và nhựa Đu đủ
Hình II.2.1: Trái và nhựa Đu đủ
III.
III.
ỨNG DỤNG
ỨNG DỤNG
Papain là loại protea
Papain là loại protea
se
se
được ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác
được ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác
nhau.
nhau.
•
•
Trong công nghệ thực phẩm:
Trong công nghệ thực phẩm:
Protease, trong đó có papain được sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thòt, cá và đã
Protease, trong đó có papain được sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thòt, cá và đã
mang lại hiệu quả kinh tế cao. Với phương pháp này, người ta có thể biến đổi những loại thòt
mang lại hiệu quả kinh tế cao. Với phương pháp này, người ta có thể biến đổi những loại thòt
cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn.
cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn.
Nhóm: HTV 11
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym VSV thuỷ phân
Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym VSV thuỷ phân
protease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài và ở nhiệt độ thích
protease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài và ở nhiệt độ thích
hợp. Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzym, đặc biệt là papain không những rúùt ngắn thời
hợp. Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzym, đặc biệt là papain không những rúùt ngắn thời
gian thuỷ phân mà còn ngăn ngừa được các vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ hoạt động tối ưu
gian thuỷ phân mà còn ngăn ngừa được các vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ hoạt động tối ưu
của nó là 70
của nó là 70
o
o
C.
C.
Bảng III.1: Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc trạng
Bảng III.1: Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc trạng
thái cơ chất (sống – chín) của papain [3]:
thái cơ chất (sống – chín) của papain [3]:
Tên cơ chất
Tên cơ chất
Trạng thái cơ chất
Trạng thái cơ chất
Sống
Sống
Chín
Chín
Casein
Casein
40,31
40,31
51,15
51,15
Lòng trắng
Lòng trắng
trứng
trứng
0
0
35,42
35,42
Albumin bò
Albumin bò
22,33
22,33
41,86
41,86
Protid cá
Protid cá
28,59
28,59
50,02
50,02
Protid tôm
Protid tôm
38,22
38,22
50
50
Ngoài ra, papain còn ngăn ngừa sự làm đục bia và các loại nước giải khát khi ướp lạnh
Ngoài ra, papain còn ngăn ngừa sự làm đục bia và các loại nước giải khát khi ướp lạnh
do nó phân huỷ các vết protein hoà tan trong bia và các loại nước giải khát khác.
do nó phân huỷ các vết protein hoà tan trong bia và các loại nước giải khát khác.
Hình III.1:
Hình III.1:
Một loại mặt nạ dưỡng da có chứa enzym papain và những dưỡng chất của đu
Một loại mặt nạ dưỡng da có chứa enzym papain và những dưỡng chất của đu
đủ [8].
đủ [8].
Nhóm: HTV 12
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
•
•
Trong y học:
Trong y học:
Chữa bệnh giun kim, giun đũa.
Chữa bệnh giun kim, giun đũa.
Là thành phần chính của các loại thuốc trò bệnh biếng ăn, ăn không tiêu.
Là thành phần chính của các loại thuốc trò bệnh biếng ăn, ăn không tiêu.
Dùng tiêu huỷ các dò vật thừa, các protein chết trong cơ thể. Hỗn hợp papain- bromelin-
Dùng tiêu huỷ các dò vật thừa, các protein chết trong cơ thể. Hỗn hợp papain- bromelin-
celluloza được sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận
celluloza được sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận
.
.
Làm một số vi trùng gram (+) và gram (-) ngừng phát triển, vi trùng thương hàn,
Làm một số vi trùng gram (+) và gram (-) ngừng phát triển, vi trùng thương hàn,
Staphylococus rất nhạy cảm với papain.
Staphylococus rất nhạy cảm với papain.
Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dòch
Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dòch
trung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4
trung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4
liều độc của toxin uốn ván .
liều độc của toxin uốn ván .
Dung dòch papain cysteine salicilate c ó công dụng chữa bỏng.
Dung dòch papain cysteine salicilate c ó công dụng chữa bỏng.
•
•
Trong các ngành công nghệ khác :
Trong các ngành công nghệ khác :
Papain làm mềm da trong công nghệ thuộc da. Len đã qua xử lý papain sẽ tăng độ
Papain làm mềm da trong công nghệ thuộc da. Len đã qua xử lý papain sẽ tăng độ
sạch và nhuộm được những màu sống động. Trong công nghệ sản xuất dầu cá, nếu cho
sạch và nhuộm được những màu sống động. Trong công nghệ sản xuất dầu cá, nếu cho
papain tác dụng trước lên gan thì việc tách dầu sẽ dễ dàng hơn và chất lượng dầu cũng tăng
papain tác dụng trước lên gan thì việc tách dầu sẽ dễ dàng hơn và chất lượng dầu cũng tăng
lên.
lên.
Papain có thể sử dụng kết hợp với một số chất khác để điều chế ra mỹ phẩm chăm sóc
Papain có thể sử dụng kết hợp với một số chất khác để điều chế ra mỹ phẩm chăm sóc
da, giúp làm da mềm mại, tẩy các tế bào chết trên da.
da, giúp làm da mềm mại, tẩy các tế bào chết trên da.
Hình III.2: Xà bông có chứa enzyme papain
Hình III.2: Xà bông có chứa enzyme papain
Nhóm: HTV 13
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Một vài chế phẩm papain thương mại
Một vài chế phẩm papain thương mại
[7], [9], [10], [12]:
[7], [9], [10], [12]:
Hình III.3
Hình III.3
: nhựa đu đủ, hoạt tính 50000u/g
: nhựa đu đủ, hoạt tính 50000u/g
Hình III.4:
Hình III.4:
Chế phẩm papain lỏng,
Chế phẩm papain lỏng,
hoạt tính 80000u/g
hoạt tính 80000u/g
Hình III.5:
Hình III.5:
Chế phẩm enzym thô,
Chế phẩm enzym thô,
hoạt tính 800000u/g
hoạt tính 800000u/g
Hình III.6:
Hình III.6:
Chế phẩm papain tinh khiết,
Chế phẩm papain tinh khiết,
Hoạt tính 2000000 – 2300000u/g
Hoạt tính 2000000 – 2300000u/g
Hình III.7:
Hình III.7:
Bột enzym papain, trong đó
Bột enzym papain, trong đó
thành phần chứa 362,5mg papain và không
thành phần chứa 362,5mg papain và không
chứa nấm men, bột mì, đậu nành, bắp,
chứa nấm men, bột mì, đậu nành, bắp,
đường, chất tạo ngọt tẩng hợp, chất màu,
đường, chất tạo ngọt tẩng hợp, chất màu,
mùi và chất bảo quản
mùi và chất bảo quản
Nhóm: HTV 14
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Hình III.8:
Hình III.8:
Chế phẩm hỗn hợp enzym bromelin , papain và một số chất khác.
Chế phẩm hỗn hợp enzym bromelin , papain và một số chất khác.
Hình III.9
Hình III.9
Chế phẩm super enzym bromelain - papain
Chế phẩm super enzym bromelain - papain
Nhóm: HTV 15
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Lê Ngọc Tú,
[1]. Lê Ngọc Tú,
“Hóa sinh công nghiệp”
“Hóa sinh công nghiệp”
, NXB Khoa học và Kó thuật, 2002.
, NXB Khoa học và Kó thuật, 2002.
[2]. Nguyễn Đức Lượng,
[2]. Nguyễn Đức Lượng,
“Công nghệ enzym”
“Công nghệ enzym”
, NXB Đại học Quốc gia TpHCM.
, NXB Đại học Quốc gia TpHCM.
[3]. Nguyễn Văn Rư – Nguyên Xuân Thắng,
[3]. Nguyễn Văn Rư – Nguyên Xuân Thắng,
“Nghiên cứu sự phân giải protid thực phẩm
“Nghiên cứu sự phân giải protid thực phẩm
của các chế phẩm pancreatin, papain và hỗn hợp của chúng”
của các chế phẩm pancreatin, papain và hỗn hợp của chúng”
, Bộ môn hóa sinh – vi sinh,
, Bộ môn hóa sinh – vi sinh,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
Trường Đại học Dược Hà Nội.
[4]. Rubens Monti, Carmelita A. Basilio, Henrique C. Trevisan and Jonas, “
[4]. Rubens Monti, Carmelita A. Basilio, Henrique C. Trevisan and Jonas, “
Purification
Purification
from fresh latex of Carica papaya”
from fresh latex of Carica papaya”
, Braz. Arch. Biol. Tech., Vol 43, 501-507, 2000.
, Braz. Arch. Biol. Tech., Vol 43, 501-507, 2000.
[5].
[5].
/
/
[6].
[6].
hritist_agriculture.com/
hritist_agriculture.com/
[7]. http://
[7]. http://
www.javely.com/
www.javely.com/
[8].
[8].
[9].
[9].
[10].
[10].
/> />
[11].
[11].
[12].
[12].
adegest
adegest
Mục lục:
Mục lục:
I.TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN tr 2
I.TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN tr 2
I.1 Đặc điểm chung tr2
I.1 Đặc điểm chung tr2
I.2 Tính chất vật ly ù tr3
I.2 Tính chất vật ly ù tr3
I.3 Tính chất hoá học tr3
I.3 Tính chất hoá học tr3
II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN tr7
II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN tr7
II.1 Thu nhận nhựa đu đủ tr8
II.1 Thu nhận nhựa đu đủ tr8
II.2 Thu nhận papain tr9
II.2 Thu nhận papain tr9
III. ỨNG DỤNG tr11
III. ỨNG DỤNG tr11
Nhóm: HTV 16
