Phân lập, tuyển chọn và khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lý hóa lên khả năng kháng neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy xạ khuẩn được phân lập từ đất

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

MÃ THỊ ANH THƯ

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT
ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN LÝ HÓA LÊN
KHẢ NĂNG KHÁNG Neoscytalidium dimidiatum
CỦA DỊCH NUÔI CẤY XẠ KHUẨN
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã ngành: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022


Cơng trình được hồn thành tại Trường Đại học Cơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại
học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 03 tháng 01 năm 2023
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. TS Nguyễn Thị Kim Anh

- Chủ tịch Hội đồng

2. TS Nguyễn Thành Luân

- Phản biện 1

3. TS Bùi Hồng Quân

- Phản biện 2

4. TS Hoàng Quốc Khánh

- Ủy viên

5. TS Nguyễn Thị Lan Hương

- Thư ký

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG VIỆN CNSH&TP


BỘ CƠNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Mã Thị Anh Thư

MSHV: 19630441

Ngày, tháng, năm sinh: 05/04/1989

Nơi sinh: Bà Rịa Vũng Tàu

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã ngành: 8420201

I. TÊN ĐỀ TÀI:
Phân lập, tuyển chọn và khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lý hóa lên khả năng kháng
Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy xạ khuẩn được phân lập từ đất
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Nhiệm vụ: Phân lập, tuyển chọn và khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lý hóa lên khả
năng kháng Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy xạ khuẩn được phân lập từ
đất
Nội dung nghiên cứu của luận văn tốt nghiệp:
- Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với
chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long.
- Khảo sát ảnh hưởng của mợt số điều kiện lý hóa lên khả năng kháng nấm bệnh của
dịch nuôi cấy xạ khuẩn
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 09/05/2022
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 09/11/20222
IV. NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh
Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 …
NGƯỜI HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG VIỆN CNSH&TP
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm;
Quý thầy cô của Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Đào
tạo Quốc tế và Sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh đã luôn đồng hành, tận tâm
chỉ bảo và luôn tạo điều kiện hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Bên cạnh
đó, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Tấn Việt, TS. Nguyễn Ngọc
Ẩn đã luôn cho tôi những lời khun, lời góp ý hữu ích giúp cho tơi tích lũy thêm
nhiều kiến thức, để tơi có cái nhìn sâu sắc hơn về các vấn đề trong nghiên cứu giúp
tôi hồn thành tốt bài khóa luận của mình.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè và các thành viên Lab Vi sinh cùng với gia
đình, đồng nghiệp đã ln đợng viên, khích lệ và tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt
q trình thực hiện để tơi có thể hồn thành khố luận mợt cách tốt nhất.
Mặc dù khóa luận khơng tránh khỏi những thiếu sót, tơi rất mong nhận được những
ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cơ để giúp bài khóa luận hồn thiện hơn.
Học viên thực hiện

Mã Thị Anh Thư

i

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Bệnh đốm nâu trên thanh long do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum đã làm giảm
sản lượng quả cũng như ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế. Việc lạm dụng các loại
thuốc bảo vệ thực vật hóa học để hạn chế bệnh đốm nâu đã gây ảnh hưởng tiêu cực
tới hệ sinh thái, môi trường và sức khỏe con người. Chính vì vậy, để hạn chế tác hại
của bệnh và đảm bảo an toàn cho hệ sinh thái, mơi trường và sức khỏe con người thì
việc tìm ra các chủng xạ khuẩn đối kháng Neoscytalidium dimidiatum là rất cần thiết.
Trong nghiên cứu này, 36/50 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu đất được thu
thập từ các tỉnh khác nhau cho thấy có khả năng đối kháng với nấm mốc N.
dimidiatum. Trong đó, chủng CNXK 121 có khả năng đối kháng mạnh nhất, được
xác định tḥc chi Streptomyces và có mối quan hệ gần gũi với lồi Streptomyces
plicatus NBRC 13071 dựa trên phân tích đại thể, vi thể và 16S-rRNA. Môi trường
Gauze II với pH ban đầu là 7,0, bổ sung 1,5% D-glucose làm nguồn carbon và 1,5%
peptone làm nguồn nitrogen ở nhiệt độ nuôi cấy là 30℃ là điều kiện ni cấy thích
hợp cho chủng CNXK121 sinh tổng hợp hợp chất kháng N. dimidiatum. Streptomyces
CNXK 121 đã thể hiện khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm cũng như sự
phát triển của hệ sợi nấm, có thể là do khả năng sinh tổng hợp chitinase ngoại bào,
protease, cũng như các hợp chất dễ bay hơi. Tác dụng kháng nấm của chủng
CNXK121, mặc dù bị ảnh hưởng nhiều ở nhiệt độ cao hơn 50℃, nhưng vẫn ổn định
trong khoảng pH rợng 1,0-8,0. Ngồi ra, thử nghiệm in vivo đã cho thấy chủng
CNXK121 có khả năng làm giảm mức độ bệnh đốm nâu trên cả mơ hình thân và quả
thanh long. Tóm lại, chủng CNXK121 đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc ứng dụng
sản xuất chế phẩm vi sinh để kiểm soát nấm N. dimidiatum gây bệnh trên thanh long
nhằm phục vụ cho ngành nông nghiệp nước ta.

ii

ABSTRACT
Brown spot disease on dragon fruit is caused by Neoscytalidium dimidiatum. The
misuse of chemical pesticides to limit brown spot disease in recent years has
negatively affected the ecosystem, environment, and human health. In order to both
fight the disease and ensure the safety of the ecosystem, the environment and human
health, it is necessary to search for antagonistic bacterial strains of Neoscytalidium
dimidiatum. In this study, 36/50 actinomycetes strains isolated from soil samples
from Ho Chi Minh city, Ben Tre, Tien Giang, Tay Ninh, Binh Thuan, Ninh Thuan
provinces were shown to have antifungal activity against N. dimidiatum. Among
them, the CNXK 121 strain possesses the strongest antagonistic activity and was
identified to belong to the genus of Streptomyces based on macroscopic, microscopic,
and 16S-rRNA analysis. Gauze II medium supplemented with 1.5% D-glucose as
carbon source, 1.5% peptone as nitrogen source, initial pH 7.0, and 4 days cultivation
at 30℃ in 150 rpm shaking condition were proved to be suitable for antifungal effect
of CNXK121 against N. dimidiatum. Streptomyces CNXK 121 has displayed the
ability to inhibit the germination of fungal spores as well as the growth of mycelia,
probably due to the ability to biosynthesize extracellular chitinase, protease, as well
as volatile compounds. The antifungal effect of CNXK121 culture, although was
highly affected at temperature higher than 50℃, was stable in a wide pH range 1.08.0. Additionally, in vivo test has shown a promising potential of CNXK121 in
controlling brown spot disease as the culture has well-reduced the disease severity on
both the stem and fruit models.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các kết quả nghiên
cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn
nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được
thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.

Học viên

Mã Thị Anh Thư

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ............................................................................ ii
ABSTRACT .............................................................................................................. iii
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ ix
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................... xii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...........................................................................3
4. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu .............................................................3
5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .....................................................................................5
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN ..................................................................................6

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn .......................................................................................6
1.1.1

Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ..................................................................6

1.1.2

Đặc điểm sinh lý - sinh hóa ...........................................................................8

1.1.3

Vai trị và ứng dụng của xạ khuẩn.................................................................9

1.1.4

Tình hình nghiên cứu chất đối kháng từ xạ khuẩn ......................................12

1.1.5

Streptomyces và ứng dụng kháng nấm của Streptomyces spp. ..................15

1.2 Thanh long và các loại bệnh trên thanh long ....................................................17
1.2.1

Một số loại bệnh hại trên thanh long ...........................................................17

1.2.2

Bệnh đốm nâu trên thanh long ....................................................................19

1.2.3

Tình hình bệnh đốm nâu trên thanh long ở Việt Nam và thế giới ..............20

1.3 Tổng quan về nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum .......................................21
1.3.1

Sơ lược về nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ......................................21

1.3.2

Một số nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum ....................................22

v


1.3.2.1 Mợt số nghiên cứu ngồi nước ....................................................................22
1.3.2.2 Mợt số nghiên cứu trong nước ....................................................................23
CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................26

2.1 Vật liệu ..............................................................................................................26
2.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................28
2.2.1

Phương pháp lấy mẫu ..................................................................................28

2.2.2

Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ các mẫu đất .........................................28

2.2.3

Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật ....................................................28

2.2.4

Phương pháp hoạt hóa giống vi sinh vật .....................................................28

2.2.5

Phương pháp quan sát hình thái của các chủng xạ khuẩn ...........................29

2.2.6

Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy xạ khuẩn ..........................................29

2.2.7

Phương pháp khảo sát sự đối kháng Neoscytalidium dimidiatum của dịch
nuôi cấy xạ khuẩn ........................................................................................29

2.2.7.1 Phương pháp khảo sát tác động của các thành phần khác nhau của dịch nuôi
cấy xạ khuẩn lên sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc ......................29
2.2.7.2 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch ..................................................30
2.2.8

Định danh chủng xạ khuẩn nghiên cứu .......................................................30

2.2.9

Các điều kiện ni cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp hợp chất đối kháng
nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của chủng xạ khuẩn CNXK121 .....31

2.2.9.1 Phương pháp khảo sát môi trường nuôi cấy thích hợp cho khả năng kháng
Neoscytalidium dimidiatum của dịch ni cấy xạ khuẩn ...........................31
2.2.9.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên khả
năng kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy xạ khuẩn 31
2.2.9.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ carbon khác nhau lên khả
năng đối kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy xạ
khuẩn ...........................................................................................................31
2.2.9.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên khả
năng đối kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy xạ
khuẩn ...........................................................................................................32
2.2.9.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ nitrogen khác nhau lên
khả năng đối kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy
xạ khuẩn ......................................................................................................32
2.2.9.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH nuôi cấy lên khả năng kháng nấm
Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy xạ khuẩn ...........................32

vi


2.2.9.7 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng kháng
nấm Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy xạ khuẩn ...................32
2.2.10 Phương pháp khảo sát một số đặc tính của dịch ni cấy xạ khuẩn lên khả
năng kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum .....................................33
2.2.10.1 Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt và bền pH của dịch ni cấy xạ
khuẩn có hoạt tính kháng mốc.....................................................................33
2.2.10.2 Phương pháp khảo sát khả năng sinh tổng hợp hợp chất bay hơi có khả năng
kháng mốc của dịch ni cấy xạ khuẩn ......................................................33
2.2.10.3 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào từ chủng xạ khuẩn
nghiên cứu ...................................................................................................34

2.2.11 Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy lên sự nảy mầm của bào tử và hệ sợi
tơ mốc N. dimidiatum gây bệnh trên thanh long.........................................36
2.2.12 Kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc N. dimidiatum của chủng xạ khuẩn
nghiên cứu trong điều kiện in vivo trên quả và cây thanh long ..................36
2.2.13 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu ...........................................................37
CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .........................................................38

3.1 Tuyển chọn và định danh chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với
chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long
...........................................................................................................................38
3.1.1

Phân lập chủng xạ khuẩn .............................................................................38

3.1.2

Khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy xạ khuẩn với nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long ................46

3.1.3

Định danh chủng xạ khuẩn nghiên cứu CNXK 121 ...................................48

3.1.3.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn nghiên cứu CNXK121 .......................48
3.1.3.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử ..........................................48
3.2 Ảnh hưởng của các thành phần khác nhau của dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên hoạt
tính ức chế nấm mốc N. dimidiatum .................................................................50
3.3 Các điều kiện ni cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp hợp chất đối kháng nấm

mốc Neoscytalidium dimidiatum của chủng xạ khuẩn CNXK121 ...................52
3.3.1

Ảnh hưởng của môi trường ni cấy lên hoạt tính kháng mốc của dịch nuôi
cấy xạ khuẩn ................................................................................................52

3.3.2

Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên hoạt tính kháng mốc của
dịch ni cấy xạ khuẩn ................................................................................53

vii


3.3.3

Ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên hoạt tính kháng mốc
Neoscytalidium dimidiatum của dịch ni cấy chủng xạ khuẩn CNXK121
.....................................................................................................................56

3.3.4

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng kháng nấm
Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng CNXK12 ................58

3.4 Kết quả các đặc tính lý hóa của dịch nuôi cấy xạ khuẩn CNXK121 lên khả năng
kháng mốc N. dimidiatum .................................................................................59
3.4.1

Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào ................................................59

3.4.2

Khả năng bền nhiệt và bền pH của dịch nuôi cấy chủng CNXK121 ..........60

3.4.3

Khả năng sinh tổng hợp hợp chất bay hơi có khả năng kháng nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum ........................................................................62

3.5 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn CNXK121 lên sự nảy mầm bào
tử và sự phát triển của hệ sợi tơ nấm Neoscytalidium dimidiatum ...................64
3.6 Khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng
xạ khuẩn CNXK121 trong điều kiện in vivo ....................................................70
KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ .........................................................................................72
1.

Kết luận .............................................................................................................72

2.

Kiến nghị ...........................................................................................................73

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................74
PHỤ LỤC ..................................................................................................................85
LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN .......................................................136

viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn.....................................................................................7
Hình 1.2 Sự phát triển của khuẩn ty ở xạ khuẩn ........................................................8
Hình 1.3 Mợt số ứng dụng của xạ khuẩn ................................................................10
Hình 1.4 Các loại bệnh trên thanh long ...................................................................19
Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển bệnh thối thân do N. dimidiatum gây ra trên thanh
long ...........................................................................................................20
Hình 1.6 Bệnh đốm nâu trên thân cây và quả thanh long ........................................20
Hình 1.7 Đặc điểm hình thái vi nấm N. dimidiatum trên mơi trường PGA.............22
Hình 3.1 Hình thái vi thể của mợt số chủng xạ khuẩn ở đợ phóng đại 1000X ........46
Hình 3.2 Khả năng đối kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của các chủng
xạ khuẩn phân lập được ............................................................................47
Hình 3.3 Kết quả sơ bợ khả năng ức chế sự lan tơ của nấm bệnh N. dimidiatum của
một số chủng xạ khuẩn khảo sát trên môi trường PGA ...........................47
Hình 3.4 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn CNXK 121 ......................................48
Hình 3.5 Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 16S-rRNA) của chủng CNXK121 với
các lồi lân cận .........................................................................................49
Hình 3.6 Cây phát sinh lồi của chủng CNXK121 với các loài lân cận được xây dựng
bằng phần mềm Mega5 với phương pháp Neighbor joining, hệ số bootstrap
1000 lần lặp ..............................................................................................50
Hình 3.7 Khả năng kháng mốc của các thành phần khác nhau trong dịch ni cấy xạ
khuẩn. .......................................................................................................51
Hình 3.8 Hiệu suất kháng nấm N. dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng CNXK121
trên 5 loại môi trường nuôi cấy trong các khoảng thời gian khác nhau ...52
Hình 3.9 Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên khả năng đối kháng nấm
mốc Neoscytalidium dimidiatum của chủng xạ khuẩn CNXK121 theo thời
gian ...........................................................................................................54
Hình 3.10 Ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên khả năng đối kháng
nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của chủng xạ khuẩn CNXK121 theo
thời gian ....................................................................................................56

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng đối kháng nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum của chủng CNXK121 ..................................58
Hình 3.12 Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn
CNXK121. (A): chitinase; (B): protease ..................................................60
Hình 3.13 Khả năng bền nhiệt của hợp chất kháng nấm mốc Neoscytalidium
dimidiatum trong dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn CNXK121 ...................61

ix


Hình 3.14 Khả năng bền pH của hợp chất kháng nấm mốc Neoscytalidium
dimidiatum trong dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn CNXK121 ...................62
Hình 3.15 VOCs của chủng xạ khuẩn CNXK121 ức chế sự phát triển của sợi nấm
Neoscytalidium dimidiatum. .....................................................................63
Hình 3.16 Tác đợng của dịch ni cấy chủng CNXK121 lên hình thái và khả năng
nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum .....................66
Hình 3.17 Tác đợng của dịch ni cấy chủng CNXK121 lên sự sinh trưởng của bào
tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa mơi trường PGA .........67
Hình 3.18 Tác đợng của dịch ni cấy chủng CNXK121 lên hình thái và sự phát
triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ........................69
Hình 3.19 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium
dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn CNXK121 trên quả thanh
long ...........................................................................................................70
Hình 3.20 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra
trên thân cây thanh long của dịch nuôi cấy chủng CNXK121 .................71

x


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Thành phần các môi trường ni cấy VSV ...............................................27
Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn phân lập được ...............38
Bảng 3.2 Tác đợng của dịch ni cấy chủng CNXK121 lên hình thái và khả năng nảy
mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum .............................65
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng CNXK121 đối với sự phát triển của hệ
sợi tơ mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỉ lệ và thời gian khác nhau68

xi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CMC
PGA
PGB
TCA
VOCs
VSV

Carboxymethyl cellulose
Potato Glucose Agar
Potato Glucose Broth
Acid trichloroacetic
các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi
Vi sinh vật

xii


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

Thanh long là loại cây ăn quả tḥc họ Xương rồng (Cactaceae) có trị kinh tế cao
nên diện tích trồng ngày càng được gia tăng nhanh chóng. Tại Việt Nam, tổng diện
tích sản x́t thanh long khoảng 50.000 ha với giống ruột trắng chiếm hơn 95% sản
lượng, tiếp theo là giống ruột đỏ chiếm sản lượng 4,5%. Theo thống kê của Bộ Công
Thương, sản lượng thanh long ở Việt Nam đạt khoảng 1,2 triệu tấn vào năm 2019 và
dự kiến sẽ đạt 1,7 triệu tấn vào năm 2025, dự báo tốc độ tăng trưởng đạt 6,0%. Trong
đó, phần lớn sản lượng được xuất khẩu sang khoảng 40 quốc gia và các vùng lãnh thổ
khác nhau. Thanh long hiện được trồng ở 30 tỉnh thành, nhưng phát triển mạnh thành
các vùng chuyên canh quy mô lớn tập trung ở các tỉnh Bình Thuận (29.000 ha), Long
An (11.000 ha) và Tiền Giang (8.000 ha) chiếm 93,6% diện tích và 95,5 % sản lượng
cả nước. [1]
Bên cạnh sự gia tăng về diện tích trồng trọt và thay đổi thất thường của thời tiết, nhiều
loại dịch bệnh trên cây thanh long như bệnh đốm nâu, bệnh nấm bồ hóng, bệnh thối
nhũn, bệnh thán thư, bệnh nám cành…xuất hiện. Trong đó, một loại bệnh đáng chú
ý là bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Theo ghi nhận
của Viện Cây ăn quả miền Nam, bệnh đốm nâu xuất hiện rải rác vào năm 2008 ở Bình
Thuận và Tiền Giang, bệnh lây lan mạnh kể từ năm 2011 đến nay. Mức đợ bệnh ở
các vườn, địa phương khác nhau, có những vườn thanh long bị mất trắng, không thể
thu hoạch được do quả bị nhiễm bệnh, gây thiệt hại đáng kể cho người nông dân [2].
Hiện nay, bệnh đốm nâu do N. dimidiatum gây ra vẫn chưa có thuốc đặc trị, cùng với
tình trạng bệnh đang diễn biến phức tạp, lây lan nhanh trên diện rộng nên việc sử
dụng các loại thuốc hóa học để hạn chế bệnh hiện nay chỉ là giải pháp tình thế. Tuy
nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học bừa bãi, khơng đúng liều lượng là một trong những
tác nhân gây ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái đất do chúng tác động trực
tiếp đến những vi sinh vật có ích. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc hóa học là mợt

1


trong những nguyên nhân khiến cho thanh long của nước ta khó xâm nhập vào các

thị trường khó tính [3]. Vì vậy, các biện pháp sinh học sử dụng các vi sinh vật đối
kháng được xem là biện pháp hiệu quả, an tồn và thân thiện với mơi trường. Tuy
nhiên, hiện nay chưa có nhiều các nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh
trên thanh long, đặc biệt là các nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong đối kháng với
nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Vì vậy,
việc nghiên cứu sử dụng xạ khuẩn để tạo ra các hợp chất sinh học nhằm kiểm soát
nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long là hướng
đi tích cực, góp phần phát triển nền nơng nghiệp sản x́t an tồn, bền vững, thúc đẩy
tiêu dùng trong nước và xuất khẩu.
Xuất phát từ thực trạng trên, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và khảo sát ảnh hưởng
của các điều kiện lý hóa lên khả năng kháng Neoscytalidium dimidiatum của dịch
ni cấy xạ khuẩn được phân lập từ đất” được thực hiện với mục đích hướng tới
việc sản xuất chế phẩm sinh học, ứng dụng trong ngành trồng trọt thanh long ở nước
ta, đồng thời góp phần vào xu hướng xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền
vững.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài này được thực hiện với mục tiêu:
+ Phân lập và tuyển chọn được chủng xạ khuẩn từ đất có khả năng đối kháng mạnh
với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long
+ Khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường lên khả năng sinh tổng hợp hoạt chất
kháng nấm của xạ khuẩn đang nghiên cứu.
+ Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lý hóa lên hoạt chất kháng nấm của xạ khuẩn
đang nghiên cứu.
+ Xác định khả năng kháng nấm bệnh trong điều kiện in vitro (mơ hình quả thanh
long) và in vivo (mơ hình cây thanh long)
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài có những nợi dung nghiên cứu sau:

2

- Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng xạ khuẩn có khả năng đối
kháng mạnh với chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên
thanh long
- Nội dung 2: Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu
sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc
- Nội dung 3: Khảo sát sơ bợ các đặc tính lý hóa của hợp chất kháng mốc từ dịch nuôi
cấy xạ khuẩn
- Nội dung 4: Kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc của chủng xạ khuẩn nghiên cứu
trong điều kiện in vivo trên mơ hình quả và cây thanh long
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu
Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất nông nghiệp ở các tỉnh và thành phố: Bến
Tre, Tiền Giang, Tây Ninh, Bình Thuận, Ninh Thuận, Long An.
Chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum từ thanh long bị bệnh đốm nâu được
cung cấp bởi Phịng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và
Thực phẩm, Trường Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi nghiên cứu
Ảnh hưởng của các điều kiện lý hóa lên khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium
dimidiatum của chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất
• Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian dự kiến thực hiện đề tài: từ tháng 05 năm 2022 đến tháng 11 năm 2022
Địa điểm nghiên cứu: Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh, Viện Công nghệ Sinh
học và Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM
4. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu
• Cách tiếp cận

3


Tổng hợp thơng tin từ các cơng trình nghiên cứu, các tài liệu, bài báo, báo cáo trong

và ngoài nước về vấn đề liên quan
• Phương pháp nghiên cứu
- Phân lập và tuyển chọn sơ bộ khả năng ức chế sự phát triển nấm mốc gây bệnh đốm
nâu trên thanh long của các chủng xạ khuẩn được cung cấp từ Phịng thí nghiệm Cơng
nghệ Vi sinh, Viện Cơng nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp
Tp. Hồ Chí Minh (Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu đất được thu thập
từ các tỉnh khác nhau: Tp. Hồ Chí Minh, Bến Tre, Tiền Giang, Tây Ninh, Bình Thuận,
Ninh Thuận).
- Chủng xạ khuẩn có khả năng kháng mốc mạnh được quan sát đặc điểm hình thái
đại thể, vi thể và được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.
- Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp hợp chất kháng
mốc từ dịch nuôi cấy xạ khuẩn với các yếu tố thay đổi khác nhau trong môi trường
như:
+ Nguồn nitrogen: hữu cơ (urea, peptone, cao nấm men, cao thịt, tryptone, casein) và
vô cơ (NaNO3, NH4Cl, NH4NO3) với nồng độ 1,0%; Nồng độ nitrogen: 1,0-4,0 % với
bước nhảy 0,5%
+ Nguồn Carbon: Maltodextrin, sucrose, tinh bột tan, bột mỳ, bột bắp, bột gạo, bột
đậu nành với nồng độ 1,0%; Nồng độ Carbon: 1,0-4,0 % với bước nhảy 0,5%
+ pH ban đầu của môi trường nuôi cấy: 3,0-9,0
+ Nhiệt độ: 25-45 ℃
- Khảo sát sơ bợ các đặc tính lý hóa của hợp chất kháng mốc từ dịch nuôi cấy xạ
khuẩn:
+ Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của xạ khuẩn

4


+ Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên bào tử nấm mốc; lên sự phát
triển của hệ sợi tơ nấm.
+ Khảo sát khả năng bền nhiệt, bền pH, hợp chất bay hơi lên hoạt tính kháng mốc của

dịch nuôi cấy xạ khuẩn
- Kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc của chủng xạ khuẩn nghiên cứu trong điều
kiện in vivo trên mơ hình quả và cây thanh long.
5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Nghiên cứu về chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum giúp hiểu rõ hơn về cơ chế đối kháng giữa xạ khuẩn và
nấm bệnh. Từ đó bước đầu khai thác được các chủng xạ khuẩn tiềm năng để ứng dụng
sản xuất chế phẩm vi sinh nhằm kiểm sốt, phịng trừ bệnh đốm nâu trên cây trồng
nói chung và trên thanh long nói riêng mợt cách an tồn và hiệu quả. Mặt khác, giúp
nơng dân có thể giảm bớt chi phí sản xuất, hạn chế sử dụng thuốc hóa học gây ơ
nhiễm mơi trường, tăng năng suất cây trồng, làm giàu dinh dưỡng cho đất góp phần
vào việc phát triển nên nông nghiệp xanh, bền vững.

5


CHƯƠNG 1
1.1

TỔNG QUAN

Tổng quan về xạ khuẩn

1.1.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là mợt nhóm vi khuẩn đặc biệt, phân bố rất rộng rãi trong
tự nhiên. Xạ khuẩn tḥc nhóm vi khuẩn Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo
dạng sợi, phân nhánh (khuẩn ty). Về mặt phân loại, xạ khuẩn được chia thành 5 phân
lớp, 6 bợ. Trong đó, Actinomycetales là bợ được nhắc đến nhiều nhất do có giá trị
trong y học và kinh tế. Riêng bợ Actinomycetales có 13 dưới bợ, 42 họ và khoảng
200 chi [4].

Xạ khuẩn có cách sinh trưởng và phát triển như nấm với các sợi khuẩn ty phân nhánh
thành những sợi nhỏ, dài, khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt thạch có chức năng
chủ yếu là sinh sản, cuống sinh bào tử có nhiều hình dạng khác nhau như dạng thẳng,
uốn cong, xoắn lò xo hoặc xoắn ốc…… [5]. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên,
có thể tìm thấy chúng trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ
chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ
tḥc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Trong mỗi gam
đất thường có trên 1 triệu xạ khuẩn (tính theo số khuẩn lạc mọc trên mơi trường thạch)
[6-8].
Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngồi có dạng sợi bện chặt, lớp
trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn
chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích
thước bào tử. Kích thước khuẩn lạc xạ khuẩn thay đổi tùy lồi và tùy điều kiện ni
cấy. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ, mợt số có dạng những vịng trịn đồng tâm
cách nhau mợt khoảng nhất định. Nguyên nhân của hiện tượng vòng tròn đồng tâm
cách nhau một khoảng nhất định là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng, khi
sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng có chất ức chế chúng
lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng

6


sát với nó khiến khuẩn ty lại phát triển yếu đi. Cứ thế tạo thành khuẩn lạc có dạng các
vịng trịn đồng tâm được thể hiện trong Hình 1.1.

Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn (A: bề mặt khuẩn lạc dạng nhung trên mơi trường
thạch; B: khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm) [4]
Trên bề mặt thạch, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành hai loại, một loại cắm sâu
vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất) làm nhiệm vụ hấp thu dinh
dưỡng; một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợ khí sinh (khuẩn ty khí sinh)

có chức năng chủ yếu là sinh sản và bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh
phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử dài, ngắn
khác nhau tùy tḥc vào lồi xạ khuẩn, có loải chỉ từ 20-30 nm, cũng có lồi dài đến
100-200 nm. Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác nhau: thẳng, lượn uốn cong, xoắn
lò xo hay xoắn ốc, mọc đơn, mọc vịng … (Hình 1.2). Trên mỗi cuống sinh bào tử
mang từ 30-100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ
mang 1-2 bào tử. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn có thể xảy ra do sự kết đoạn hoặc
do sự cắt khúc của cuống sinh bào tử. Bào tử xạ khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau,
thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với kích thc trung bỡnh khong (0,70,9 ì 0,7-1,9) àm. Kớch thc của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong
lồi thậm chí ngay trên cùng mợt chuỗi bào tử [9].

7


Hình 1.2 Sự phát triển của khuẩn ty ở xạ khuẩn (A: Bào tử nảy mầm; B: Hình thành
khuẩn ty cơ chất; C: hình thành khuẩn ty khí sinh) và Các dạng chuỗi sinh bào tử
của xạ khuẩn (A, B, C, D: Chuỗi bào tử xạ khuẩn chi Streptomyces; E: chi
Nocadiopis) [9]
1.1.2 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Xạ khuẩn tḥc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ,
lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon. Bên cạnh đó, chúng
sử dụng các muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, và pepton làm nguồn nitơ. Tuy
nhiên, khả năng hấp thụ các chất này khơng giống nhau ở các lồi hay các chủng khác
nhau. Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, mợt số ít ưa nhiệt, nhiệt đợ thích
hợp cho sự sinh trưởng là 25-30°C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất
kháng sinh thường chỉ nằm trong khoảng 18-28°C. Đợ ẩm thích hợp đối với xạ khuẩn
dao động trong khoảng 40-50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8-7,5 [8].
Xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và
các chất kháng sinh nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các
sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như chất kháng sinh, đợc tố, enzyme… có thể

được tích lũy trong sinh khối tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra môi trường lên men.
Hệ sợi cơ chất có thể tiết vào mơi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím,
hồng, nâu, đen… các sắc tố này tan trong nước hoặc trong các dung môi hữu cơ [10].

8


1.1.3 Vai trò và ứng dụng của xạ khuẩn
Xạ khuẩn được biết đến là vi sinh vật (VSV) có vai trị chống nấm gây hại ở cây
trồng. Do đó, từ lâu các nhà khoa học đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn
có khả năng ức chế nấm bệnh thực vật. Theo Kamada (1974), khi điều tra VSV đối
kháng trong đất ở Nhật Bản cho thấy nơi nào có nhiều xạ khuẩn thì ở đó các lồi
Fusarium biến mất nhanh. Thơng thường mợt lồi xạ khuẩn có thể ức chế nhiều loài
nấm gây bệnh và được sử dụng như tác nhân sinh học chống lại các bệnh trên cây
trồng. Tuy nhiên, quá trình sử dụng các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng rợng
thì cần phải chú ý tránh làm ảnh hưởng tới hệ VSV có lợi trong vùng rễ. Khơng phải
tất cả xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm in vitro đều thể hiện trong đất (khoảng 4-5
%) nhưng chúng có vai trị quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa
khả năng nhiễm bệnh cho cây [11].
Xạ khuẩn ngày càng được quan tâm do khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp có giá
trị ứng dụng cao. Trong các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ VSV đã được cơng bố
sử dụng trên tồn thế giới thì 45% có nguồn gốc từ xạ khuẩn, 38% từ nấm và 17% từ
vi khuẩn đơn bào [12]. Xạ khuẩn là loại sinh vật có khả năng sản xuất các hợp chất
kháng sinh phong phú nhất. Đa số các chất kháng sinh đang dùng trong y học hiện
nay có nguồn gốc từ xạ khuẩn, trong khoảng 5.500 chất kháng sinh đã biết đến hiện
nay có tới hơn 4000 chất có nguồn gốc từ xạ khuẩn [13]. Các chương trình nghiên
cứu để phát hiện ra kháng sinh và các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học cao có
nguồn gốc từ VSV đã và đang mang lại một số lượng hợp chất ấn tượng trong 50 năm
qua, được ứng dụng mạnh mẽ trong y học và nông nghiệp. Hầu hết các kháng sinh
được phát hiện từ q trình sàng lọc các chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ môi trường

đất và nước. Vào thời điểm hiện tại, hàng nghìn chất chuyển hóa của xạ khuẩn đã
được mô tả, chiếm một phần đáng kể các chất chuyển hóa của VSV. Trong số đó,
Streptomyces là chi phổ biến nhất [14, 15]. Một số lượng lớn kháng sinh cũng đã
được tìm thấy bao gồm amino glycoside, chloramphenicol, tetracyclines, macrolide
và gần đây là nhóm β-lactam cephamycin có nguồn gốc từ Streptomyces và
Streptoverticillium [16].

9


Xạ khuẩn được cơng nhận là có khả năng sản xuất các chất chuyển hóa sơ cấp và thứ
cấp có các ứng dụng quan trọng trong các lĩnh vực khác nhau trong nông nghiệp và
y học. Một phần lớn thuốc kháng sinh trên thị trường được lấy từ xạ khuẩn. Chúng
tạo ra các enzyme có khả năng ức chế các tế bào ung thư ứng dụng cho việc điều trị
ung thư và các chất miễn dịch giúp tăng cường phản ứng miễn dịch. Các chất chuyển
hóa sơ cấp và thứ cấp có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, chống
ung thư, chống giun sán, chống sốt rét và chống viêm… [17, 18]. Ngồi ra, chúng
cịn có khả năng phân hủy nhiều loại hydrocacbon, thuốc trừ sâu, và các hợp chất béo.
Bên cạnh đó, mợt số chi xạ khuẩn được sử dụng trong q trình chuyển hóa sinh học
các chất thải nơng nghiệp thành các sản phẩm hóa học có giá trị cao. Hơn nữa, xạ
khuẩn cũng rất quan trọng trong cơng nghệ sinh học thực vật vì các chủng có hoạt
tính đối kháng chống lại mầm bệnh thực vật rất hữu ích trong việc kiểm sốt sinh học
[19]. Các ứng dụng quan trọng của xạ khuẩn được mô tả ngắn gọn trong Hình 1.3
dưới đây.

Hình 1.3 Mợt số ứng dụng của xạ khuẩn [19]

10