Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri) trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


PHẠM THỊ KIM ANH


PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ
ĐẶC TÍNH PHÂN HỦY PHÂN TỬ TÍN HIỆU ‘‘QUORUM
SENSING
’’ VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH
GAN THẬN MỦ (Edwardsiella ictaluri) TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)

Chuyên ngành: VI SINH
Mã số chuyên ngành: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH






Tp.Hồ Chí Minh, 2012

Mục lục Luận văn Thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh iii
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt viii
Danh mục các bảng ix
Danh mục các hình vẽ x
Danh mục các đồ thị xi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic 4
1.1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới 4
1.1.2 Tình hình nghiên cứu probiotic t
ại Việt Nam 6
1.2 Tình hình dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7
1.2.1 Bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7
1.2.1.1 Lịch sử phát hiện tác nhân gây bệnh 7
1.2.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 8
1.2.1.3 Triệu chứng lâm sàng 8
1.2.1.4 Đường lây truyền 10
1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra
trên cá da trơn 10
1.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn
10
1.2.2.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra
trên cá da trơn 10

1.2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra
trên cá tra 12
1.2.3.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra 12
Mục lục Luận văn Thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh iv
1.2.3.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra
trên cá tra 12
1.3 Giới thiệu về probiotic 13
1.3.1 Định nghĩa probiotic 14
1.3.2 Đặc điểm của probiotic 15
1.3.3 Vai trò của Probiotic 15
1.3.4 Cơ chế tác động của probiotic 16
1.3.4.1 Tác động đối kháng 16
1.3.4.2 Cải thiện chất lượng nước 17
1.3.4.3 Tăng cường hệ miễn dịch 18
1.3.4.4 Ảnh hưởng đến sự sinh tr
ưởng 19
1.3.4.5 Sự hình thành quần thể trong ruột (Gut colonization) 20
1.4 Cơ chế hoạt đông của hệ thống “ Quorum sensing” ở vi khuẩn gây bệnh .
21
1.4.1 Định nghĩa quá trình “Quorum sensing” 22
1.4.2 Hệ thống “Quorum sensing” của Edwardsiella spp. 22
1.4.3 Sự phân hủy sinh học quá trình “Quorum sensing” của vi khuẩn gây
bệnh 23
1.4.3.1 Enzyme AHL lactonase 23
1.4.3.2 Enzyme AHL acylase 24
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Thời gian và địa điể
m nghiên cứu 26

2.2 Địa điểm thu mẫu 26
2.3 Vật liệu nghiên cứu 27
2.3.1 Nguồn vật liệu cho phân lập 27
2.3.2 Chủng vi khuẩn 29
2.3.3 Môi trường và hóa chất 29
2.4 Phương pháp nghiên cứu 30
2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 30
Mục lục Luận văn Thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh v
2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử AHL
(phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở vi khuẩn Edwardsiella ictaluri) 31
2.4.3 Thử khả năng phân hủy phân tử HHL (N-hexanoyl homoserine
lactone) của các chủng vi khuẩn phân lập được ở điều kiện in vitro. 32
2.4.3.1 Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và
đường kính vòng tròn sắc tố violacein 32
2.4.3.2 Khảo sát đặc tính phân hủy HHL của các chủng vi khuẩn
phân lập ở điều ki
ện in vitro 33
2.4.4 Khảo sát đặc tính đối kháng với Edwardsiella ictaluri trong điều kiện
in vitro 34
2.4.4.1 Phương pháp đường vuông góc (Cross Streak) 34
2.4.4.2 Phương pháp thạch khuếch tán (modified agar well-diffusion
method) 35
2.4.4.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (Disc-diffusion method) 36
2.4.4.4 Phương pháp BLIS (Bacteriocin-like inhibitory substance) 36
2.4.5 Thử khả năng gây bệnh cho người và động vật 37
2.4.6 Thử khả năng đối kháng với một số chủng kiểm định 38
2.4.7 Thử
nghiệm các đặc tính sinh học in vitro của các chủng vi khuẩn đã

được tuyển chọn 38
2.4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển

chọn 38
2.4.7.2 Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn
38
2.4.7.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự tăng trưởng c
ủa vi khuẩn
tuyển chọn 39
2.4.7.4 Khả năng chịu pH dạ dày 39
2.4.7.5 Khả năng chịu muối mật 40
Mục lục Luận văn Thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh vi
2.4.8 Định danh vi khuẩn sử dụng phương pháp truyền thống và giải trình
tự gen 16S rRNA 41
2.4.8.1 Định danh vi khuẩn sử dụng phương pháp truyền thống 41
2.4.8.2 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S
rRNA 47
2.4.9 Thử khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn đã được chọn . 48
2.5 Xử lý kết quả . 49
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Phân lập vi khuẩ
n có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu AHL ở vi
khuẩn Edwarsiella ictaluri 50
3.1.1 Số lượng dòng vi khuẩn thu được qua các đợt phân lập 50
3.1.2 Biến động giá trị pH của hỗn dịch vi khuẩn trong quá trình phân lập
51
3.1.3 Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn qua quá trình phân
lập 52

3.1.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc sau quá trình phân lập 52
3.2 Khả năng phân hủy phân tử
HHL bởi các dòng vi khuẩn đã được chọn
lọc 53
3.3 Khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri 54
3.3.1 Phương pháp thạch khuếch tán 54
3.3.2 Các phương pháp khác 56
3.4 Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59
3.5 Kết quả thử khả năng đối kháng với một số chủng vi khuẩn kiểm định 61
3.6 Kết quả thử một số đặc tính sinh h
ọc in vitro của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn 62
3.6.1 Đường cong tăng trưởng 63
3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 64
3.6.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối 65
3.6.4 Ảnh hưởng của pH 65
Mục lục Luận văn Thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh vii
3.6.5 Khả năng chịu pH dạ dày 66
3.6.6 Khả năng chịu muối mật 68
3.7 Kết quả định danh 71
3.7.1 Định danh bằng hình thái và các phản ứng sinh hóa 71
3.7.2 Định danh bằng sinh học phân tử 74
3.8 Kết quả thử khả năng tương thích lẫn nhau 74
3.9 Bàn luận 74
Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận 80
4.2 Kiến ngh
ị 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC















Danh Mục Luận văn Thac sĩ
HVCH: Phạm Thị Kim Anh viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AHL N- Acyl Homoserine Lactone
BA Blood Agar
BHI Brain Heart Infusion
BHIA Brain Heart Infusion Agar
bp base pair
CFU Colony Forming Unit
COD Chemical Oxygen Demand
ctv. Cộng tác viên
ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cữu Long

EM Effective Microorganism
EMB Eosine Methylen Blue Lactase Agar
ESC Enteric Septicaemia of Cashfish
FAO Food and Agriculture Organization
FCR Food Conversion Ratio
HHL N- Hexanoyl- L- Homoserine Lactone
MIC Minimum Inhibitory Concentration
OD Optical Density
Probiotic Chế phẩm sinh học hoặc chế phẩm vi sinh
TSA Trytone Soya Agar
TNHH Trách Nhiệm Hữu Hạn
WHO World Health Organization





Danh Mục Luận văn Thac sĩ
HVCH: Phạm Thị Kim Anh ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic đối kháng vi khuẩn gây
bệnh trong nuôi trồng thủy sản 5
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của probiotic lên sự phát triển của ấu trùng cá biển trong
điều kiện in vitro 19
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic lên sự hình thành quần thể và khả năng bám
dính trong ruột cá 21
Bảng 2.1. Số lượng mẫu thu được qua bố
n đợt 28
Bảng 3.1. Số lượng dòng vi khuẩn thu được sau khi nuôi cấy trong môi trường chứa
hỗn hợp phân tử AHL 50

Bảng 3.2. Khả năng phân hủy HHL của những dòng vi khuẩn đã được phân lập 53
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
bằng phương pháp thạch khuếch tán 54
Bảng 3.4. Tỉ lệ % mẫu có khuẩn lạ
c đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.55
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với Edw. ictaluri bởi các dòng vi
khuẩn khảo sát bằng bốn phương pháp 57
Bảng 3.6. Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59
Bảng 3.7. Tổng hợp các đặc tính của các chủng vi khuẩn được sàng lọc: khả năng
phân hủy HHL, đối kháng Edw. ictaluri và sinh hemolysin 60
Bảng 3.8. Kế
t quả kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp đường vuông
góc. 62
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp thạch khuếch tán
62
Bảng 3.10. Kết quả nhuộm gram 71
Bảng 3.11. Kết quả định danh 4 chủng vi khuẩn gram âm bằng Kit API 20E 72
Bảng 3.12. Kết quả định danh 2 chủng vi khuẩn gram dương bằng Kit API 50 CHL
73
Bảng 3.13. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử 74
Bảng 3.14. Thử khả năng tương thích lẫn nhau giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn
. 74
Danh Mục Luận văn Thac sĩ
HVCH: Phạm Thị Kim Anh x
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella ictaluri 8
Hình 1.2. Cá bệnh ESC cấp tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng (A), Cá bệnh
ESC cấp tính với những đốm xuất huyết màu đỏ ở phần đầu và bụng (B) và Cá bị
bệnh ESC mãn tính (C) 9
Hình 1.3. Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A), cá tra bị bệnh mủ ở gan

thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B) 9
Hình 1.4. Cơ chế phân hủy phân tử AHL của enzyme AHL-lactonase và AHL-
acylase 25
Hình 2.1. Dụng cụ thu mẫu nước hình (a), mẫu bùn (b) 27
Sơ đồ 2.1. Qui trình nghiên cứu của đề tài 30
Sơ đồ 2.2. Qui trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân t
ử AHL 31
Hình 2.2. Các vòng sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện
của phân tử HHL 33
Hình 2.3. Phương pháp đường vuông góc 35
Hình 2. 4. Cách làm chết vi khuẩn bằng chloroform 37
Hình 2.5. Thử khả năng tương thích bằng phương pháp thạch khuếch tán 49
Hình 3.1. Hình thái các khuẩn lạc phân lập từ mẫu nước ở cuối chu kỳ 4 (a) và mẫu
bùn ở cuối chu kỳ 4 (b) trên môi trường BHIA 53
Hình 3.2. Thử
khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn khảo sát bằng phương
pháp đường vuông góc (a), thạch khuếch tán (b), đĩa giấy khuếch tán (c), BLIS (d) .
56
Hình 3.3. Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59
Hình 3.4. Thử khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp
đường vuông góc 61
Hình 3.5. Kết quả nhuộm gram T1DT101
(a), T1DT103(b), G1DT102(c),
G2VL1.2(d), B4TAG19A(e), N4TAG22a1(f) 71


Danh Mục Luận văn Thac sĩ
HVCH: Phạm Thị Kim Anh xi
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1. Biến động giá trị pH của hệ vi sinh từ các mẫu phân lập khác nhau qua

bốn chu kỳ 51
Đồ thị 3.2. Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn trong các hỗn hợp vi
sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước và bùn ao nuôi cá tra qua bốn chu
kỳ 52
Đồ thị 3.3. Đường cong tăng trưởng chủng T1DT101 (a), T1DT103 (b), G1DT102
(c), G2VL1.2 (d), B4TAG19A (e), N4TAG22a1(f) 63
Đồ thị 3.4. Ảnh hưở
ng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn 64
Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn 65
Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển
chọn 66
Đồ thị 3.7. Tỉ l
ệ sống (%) của các chủng vi khuẩn khảo sát theo thời gian ở pH3(a),
pH2(b) 67
Đồ thị 3.8. Tỉ lệ sống (%) của các chủng vi khuẩn khảo sát theo thời gian ở nồng độ
muối mật 0,5% (a), 1% (b), 2% (c) 69










Mở đầu Luận văn Thac sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 1
MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản đang phát triển nhanh và là một trong những
ngành kinh tế mũi nhọn, đóng góp rất lớn cho xuất khẩu. Theo FAO (2008), sản
lượng nuôi trồng thủy sản của Việt Nam đạt gần 1,7 triệu tấn, có giá trị khoảng 3,3
tỉ USD trong năm 2006. Trong đó, sản lượng nuôi trồng thủy sản nước ngọt ước
tính khoảng 1,51 triệu tấn, giá trị khoảng 3,17 t
ỉ USD. Trong các loài cá nuôi nước
ngọt, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) loài cá nuôi nước ngọt truyền thống, là
một đối tượng xuất khẩu với nhiều mặt hàng chế biến được xuất sang hơn 80 nước
trên thế giới. Cá tra được nuôi phổ biến trong ao, lồng bè, đăng quần với mức độ
thâm canh, bán thâm canh và qui mô nông hộ ở hầu hết các tỉnh Nam Bộ, trong đó
tập trung chủ yếu ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cầ
n Thơ Sản lượng cá tra
ước tính đạt khoảng 300.000 tấn (năm 2004), đạt 400.000 tấn (năm 2005), đạt
800.000 tấn (năm 2006), đạt 1.000.000 tấn (năm 2007), 1.128.014 tấn (năm 2008)
và 1,2 triệu tấn (năm 2009), tổng sản lượng năm 2010 là 1,141 triệu tấn, kim ngạch
xuất khuẩu đạt 1,44 tỉ USD [1]. Trong vòng 10 năm phát triển, sản lượng xuất khẩu
của cá tra từ 7.000 tấn, giá trị 20 triệu USD (năm 1997) tăng lên 286.000 tấn, giá tr
ị
737 triệu USD (năm 2006) và 1,2 tỉ USD trong năm 2008. Qua số liệu thống kê cho
thấy rằng cá tra là loài cá xuất khẩu chiến lược của Việt Nam trong những năm tiếp
theo. Kỹ thuật nuôi thâm canh đã giúp cải thiện đáng kể năng suất trong nuôi trồng
thủy sản nói chung và cá tra nói riêng. Tuy nhiên, bên cạnh đó, nó cũng đồng thời
tạo ra sự ô nhiễm môi trường, dịch bệnh ngày càng nhiều và khó điều trị. Bệnh cá
tra ch
ủ yếu do vi khuẩn và ký sinh trùng gây nên và có thể gây chết lên đến 70-80%
[9]. Để phòng ngừa và điều trị bệnh, hầu hết nông dân dùng thuốc kháng sinh để trị
bệnh cá tra. Với sự lạm dụng sử dụng thuốc kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn
kháng thuốc và dư lượng thuốc kháng sinh trong các sản phẩm chế biến từ cá tra.

Để thay thế dần phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng và trị
bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng
cường hệ miễn dịch (immunostimulants), chế phẩm sinh học (probiotic). Nghiên
cứu về vaccine ứng dụng trên cá tra vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm.
Mở đầu Luận văn Thac sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 2
Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây
ra bởi vi khuẩn và virus, nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành
quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc cho cá. Những thành công
đáng chú ý là việc sử dụng các chất tăng cường hệ miễn dịch vừa có phổ phòng
ngừa bệnh rộng vừa thân thiện với môi trường. Hơn thế nữa, phương pháp trị liệ
u
sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) được mong đợi và trở thành công cụ
phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả
năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh vật gây bệnh. Đặc biệt là các vi
sinh vật có lợi có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” của các vi
khuẩn gây bệnh và có khả năng làm giảm độc lực của chúng.
Trong nghiên c
ứu này, cách tiếp cận của đề tài là phân lập, tuyển chọn những
chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra,
có khả năng đối kháng và phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” của vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri. Đây là cách tiếp cận mới hiện nay về nghiên cứu và
ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản nhằm kiểm soát dịch bệnh
do vi khuẩn gây nên. Đề tài thành công là kế
t quả bước đầu chọn ra các dòng vi
khuẩn có những đặc tính ưu việt, làm nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu tạo chế
phẩm sinh học ứng dụng cho các ao nuôi cá tra nhằm giảm thiểu dịch bệnh gây rủi
ro cho người nuôi.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ PHÂN LẬP, TUYỂN

CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ ĐẶC TÍNH PHÂN HỦY PHÂN TỬ
TÍN HIỆU ‘‘QUORUM SENSING” VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY
BỆNH GAN THẬN MỦ (Edwardsiella ictaluri) TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon
hypophthalmus) ”
Mục tiêu:
Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống,
từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu ‘‘Quorum
sensing” và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri)
trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).
Mở đầu Luận văn Thac sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 3
Nội dung nghiên cứu
¾ Sàng lọc những chủng vi khuẩn từ các mẫu hệ tiêu hóa cá tra thịt và cá tra
giống; nước và bùn ở đáy các ao nuôi cá tra ở một vài tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông
Cửu Long có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở Edwardsiella
ictaluri và cũng đối kháng với vi khuẩn này.
¾ Thử khả năng gây bệnh cho người, động vật và khả năng đối kháng với một
s
ố chủng kiểm định.
¾ Khảo sát một số đặc tính sinh học của những chủng vi khuẩn đã được tuyển
chọn và khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn.
¾ Định danh các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn bằng phương pháp
truyền thống và giải trình tự gen 16S rRNA.
¾
Ý nghĩa thưc tiễn
¾ Tạo ra sản phẩm probiotic nội địa giá thành rẻ nhưng hiệu quả cao.
¾ Giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và rủi ro cho người nuôi cá tra do bệnh
gan thận mủ gây nên, đồng thời tăng chất lượng thịt phi lê cá đáp ứng yêu cầu vệ
sinh an toàn thực phẩm của cá tra xuất khẩu.

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ
HVCH: Phạm Thị Kim Anh







CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 4
1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic
1.1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới
Sản lượng nuôi trồng thủy sản trên thế giới chiếm đến 40% tổng sản lượng
thủy sản, với tổng giá trị vào khoảng 78 tỉ USD năm 2006 [58], 102 tỉ USD năm
2008 [57]. Vai trò của nuôi trồng thủy sản ngày càng gia tăng đáng kể, do sản
lượng khai thác thủy sản đã trở nên bão hòa và nhu cầu tiêu thụ thuỷ sản ngày càng
tăng. Tuy nhiên, vấn đề dị
ch bệnh đang gây tổn thất rất lớn cho nghề nuôi thủy sản.
Những bệnh gây ra bởi Vibrio spp., Aeromonas spp., Pseudomonas spp.,
Streptococcus spp., xảy ra rất phổ biến và dẫn đến tỉ lệ chết cao của tôm cá nuôi
[150].
Khi người nuôi gặp phải vấn đề dịch bệnh, thông thường biện pháp đối phó
đầu tiên là sử dụng các hóa chất diệt khuẩn hoặc kháng sinh. Việc sử dụng những
hóa chất này
đã đem lại hiệu quả cao trong việc phòng và trị bệnh trên vật nuôi
[114], [124]. Tuy nhiên, việc lạm dụng hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh trong
nông nghiệp cũng như trong nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến sự xuất hiện các dòng
vi khuẩn kháng thuốc [22], [124]. Nghiêm trọng hơn, những dòng vi khuẩn kháng
thuốc có thể truyền những gen kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh ở người, đe dọa
đến sức khỏe con người [125], [152].
Nh
ận thức được về những mối nguy đó, Hoa Kỳ và nhiều nước Châu Âu,
Châu Á đã ban hành những đạo luật về kiểm soát việc sử dụng kháng sinh trong
chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, đồng thời hiện đang tìm kiếm những biện pháp
thay thế để tiến đến việc ngưng sử dụng kháng sinh. Thức tỉnh trước những mối đe
dọa do việc sử dụng kháng sinh cũ
ng như do vi khuẩn gây bệnh mang đến cho

người nuôi, những biện pháp thay thế đang được tìm kiếm. Trong đó có việc sử
dụng vaccine, các chất kích thích miễn dịch, các peptide kháng khuẩn, hợp chất tiền
sinh học (prebiotic), chế phẩm vi sinh (probiotic). Đặc biệt, việc sử dụng chế phẩm
vi sinh đang ngày càng được quan tâm và ứng dụng rộng rãi.
Dựa trên kết quả một số nghiên cứu về các vi khuẩn probiotic có đặc tính đối
kháng v
ới vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản (Bảng 1.1). Sàng lọc những
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 5
vi khuẩn có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh dựa vào phương pháp xác
định hoạt tính ức chế in vitro [40], [79], [133] là cách tiếp cận được sử dụng chủ
yếu trong việc phân lập vi khuẩn probiotic. Hiện nay, có bốn phương pháp thường
được sử dụng để sàng lọc các chủng vi khuẩn tiết ra các hợp chất ức chế in vitro:
Phương pháp đường vuông góc, phương pháp thạch khuếch tán, phương pháp đĩa
giấy khuếch tán và phươ
ng pháp BLIS (Bacteriocin-like inhibitory substance). Tất
cả các phương pháp trên đều dựa trên một nguyên tắc là khi một chủng vi khuẩn tiết
ra một hợp chất ngoại bào có đặc tính ức chế một chủng vi khuẩn khác, hoạt tính
này sẽ được thể hiện thông qua việc ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn khác trong
môi trường agar.
Trong một số trường hợp, những vi khuẩn ứng cử viên sau khi sàng lọc in vitro
sẽ đượ
c kiểm tra in vivo ở qui mô nhỏ về đặc tính an toàn đối với vật chủ [40], [79]
và khả năng bảo vệ vật chủ khi gây cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh [81], [89].
Một số nghiên cứu khác, những vi khuẩn ứng cử viên sau khi sàng lọc sẽ tiếp tục
được kiểm tra những đặc tính khác như khả năng chịu đựng muối mật [37], khả
năng kích thích hệ miễn dịch [82], sự hình thành quần th
ể [36], khả năng cạnh tranh
chất dinh dưỡng [73]. Trong thực tế, những nghiên cứu này là cần thiết để kiểm tra

các vi khuẩn probiotic ứng viên có thể hiện những cơ chế tác động nào khác hay
không. Ngoài ra, những thử nghiệm in vivo là rất cần thiết, bởi một chủng vi khuẩn
đối kháng với vi khuẩn khác ở điều kiện in vitro, không nhất thiết sẽ thể hiện đặc
tính đối kháng đ
ó khi có sự hiện diện của vật chủ.
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic đối kháng vi khuẩn gây
bệnh trong nuôi trồng thủy sản [150]
Động vật thử nghiệm
Loài vi khuẩn probiotic phân
lập
Đối kháng vi khuẩn gây
bệnh
Cá tuyết Đại Tây Dương
Carnobacterium divergens
V. anguillarum
Lactobacillus plantarum A. salmonicida
Cá hồi Đại Tây Dương
Carnobacterium sp. V. anguillarum
Pseudomonas fluorescens A. salmonicida
Carnobacterium sp. A. salmonicida
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 6
1.1.2 Tình hình nghiên cứu probiotic tại Việt Nam [2], [5], [15]
Hiện nay, ở Việt Nam có khoảng 400 loại chế phẩm vi sinh, trong đó có
khoảng 330 loại dùng để xử lý môi trường và trên 60 loại dùng để trộn vào thức ăn
nhằm mục đích kích thích tăng trưởng, tăng sức đề kháng của tôm cá Đa số các
loại chế phẩm này có nguồn gốc từ nhiều nước: Trung Quốc, Indonesia, Đài Loan,
Anh, Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc, Úc, Đức, Thái Lan Và trong những năm gần đ
ây,

các nhà khoa học Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu tạo những chế phẩm vi sinh được
phân lập trong nước sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, có hiệu quả tương đương
nhưng giá thành rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm vi sinh có nguồn gốc nhập ngoại.
Tiến sĩ Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới, 2003) [5] đã tạo ra chế phẩm
BIO II bằng cách phối trộ
n các chế phẩm vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa tự sản
xuất. Chế phẩm BIO II có tác dụng phân hủy thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao,
ổn định pH và màu nước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh
cho tôm cá và tăng năng suất nuôi trồng.
Chế phẩm EM có nguồn gốc từ Nhật, gồm năm nhóm loài vi sinh có ích (vi
khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm sợi) với khoảng 80 loài
vi sinh vật sống cộng sinh trong một môi trường. Chế phẩmEM đã được Việt Nam
hóa dưới cái tên VEM (Vietnamese effective microorganisms) và được ứng dụng
rộng rãi trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản [15].
PGS.TS. Lê Dụ (2005) [2] đã xây dựng được bảy qui trình kỹ thuật ứng dụng
các loại chế phẩm EM tương ứng với bảy đối tượng nông nghiệp. Sử dụng chế
phẩm EM trong nuôi tôm sú tại Bình Định bước đầu cho thấ
y những kết quả khả
quan trong việc hạn chế ô nhiễm môi trường ao nuôi. Những ao sử dụng chế phẩm
này có màu nước trong, độ kiềm và pH dao động không đáng kể, tôm không bị nhớt
và phát triển ổn định.
Đề tài “Nghiên cứu công nghệ xử lý cặn bùn ao nuôi tôm công nghiệp góp
phần làm sạch nền đáy và sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh” của nhóm nghiên cứu
Viện Công Nghệ Sinh Học và Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Th
ủy Sản I, đã tạo
được chế phẩm từ tổ hợp năm chủng vi sinh vật (trong đó có hai chủng vi khuẩn,
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 7
một chủng xạ khuẩn, hai chủng nấm sợi, một chủng nấm men) [14]. Chế phẩm

probiotic nói trên khi được bổ sung vào ao nuôi tôm đã góp phần cải thiện các chỉ
số thủy lý hóa của bùn và nước ao nuôi. Hàm lượng H
2
S, NH
4
-N, NO
2
-N, NO
3
-N,
COD, chất hữu cơ tổng trong bùn luôn thấp hơn trong ao đối chứng và ổn định. Tỉ
lệ sống của tôm tăng 82%, sản lượng tăng 121% và trọng lượng trung bình tăng
19%.
Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học hoàn thiện chế phẩm Bio-
TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú thâm canh” [13] do
nhóm nghiên cứu của Viện Công Nghệ Sinh Học, Công Nghệ Thực Phẩm và Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồ
ng Thủy Sản III thực hiện. Tiêu chí của đề tài là phân lập các
chủng vi khuẩn có đặc tính đối kháng với hai chủng vi khuẩn gây bệnh trên tôm
(Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus), đồng thời có khả năng cải thiện
môi trường ao nuôi tôm. Đề tài đã tuyển chọn được năm chủng vi khuẩn để tạo chế
phẩm sinh học. Kết quả thử nghiệm trong bể kính và bể composite cho thấy tỉ lệ
sống củ
a tôm tăng 15%, trọng lượng trung bình tăng 13% so với đối chứng.
1.2 Tình hình dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
1.2.1 Bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
1.2.1.1 Lịch sử phát hiện tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh Edwardsiella ictaluri đã được báo cáo lần đầu tiên trên cá
nheo Mỹ, Ictalurus punctatus, vào năm 1979. Đến năm 1999, Austin & Austin cũng

đã xác định Edwardsiella ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá
da trơn, hội chứng này được gọi tắt là ESC và có thể dẫn đến tỉ lệ chết cao ở cá
nheo Mỹ.
Ở Việt Nam bệnh gan thận mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm
1998, tác nhân gây bệnh lúc đầu
được xác định bởi nhóm nghiên cứu của trường
Đại học Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp.[62]. Đến năm
2002 nhóm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá
tra là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [42].

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 8
1.2.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn gram
âm, hình que, kích thước 1 x 2 - 3μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy ý,
phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi
trường glucose. Có 1-3 Plasmid liên kết với Edw. ictaluri [104], [134] . Những
plasmid có thể đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với kháng sinh.
Edwarsiella ictaluri là một trong những loài khó tính nhất của chủng Edwarsiella.
Edwarsiella ictaluri tăng trưởng chậm trên môi trường thạch BHIA khoảng từ 36 –
48 giờ ở 28 – 30
o
C, phát triển thành khuẩn lạc nhỏ và tăng trưởng rất chậm hoặc
không tăng trưởng khi ủ ở 37
o
C. Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan,
thận, tỳ tạng) trên môi trường TSA, EMB sau 48 giờ ở 28
o
C tạo thành khuẩn lạc

màu trắng đục, hoặc trên môi trường thạch máu (BA).






Hình 1.1. Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella ictaluri.
1.2.1.3 Triệu chứng lâm sàng
Đối với cá nheo Mỹ [138]
Triệu chứng lâm sàng của cá bị nhiễm bệnh ESC khác nhau tùy thuộc vào
từng giai đoạn và mức độ trầm trọng của bệnh, chất lượng nước và các yếu tố gây
xáo trộn. Biểu hiện lâm sàng của cá bị nhiễm bệnh ESC có thể chia thành ba dạng:
Bệnh cấp tính, mãn cấp và mãn tính.
Bệnh cấp tính: Bệnh phát triển và tiến triển rất nhanh, hầu như không có biểu
hiện lâm sàng bên ngoài và tỷ lệ chết cao. Cá bị nhiễm bệnh sắp chết phát hiện
trong máu và hầu hết các mô của tế bào đều chứa độc tố do vi khuẩn Edwarsiella
ictaluri tiết ra. Cá bị nhiễm bệnh ESC cấp trở nên biếng ăn, bơi lờ đờ gần bề mặt ao
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 9
hoặc nằm bất động chờ chết. Bụng sưng phòng, mắt lồi. Các đốm xuất huyết màu
đỏ và lan rộng trên da đầu và bụng. Gan có hoặc chưa có dấu hiệu hoại tử nhưng
thận và lách bị sưng tấy.
Bệnh mãn cấp: Bệnh phát triển chậm hơn bệnh cấp tính nhưng mức độ chết
tích lủy tăng nhanh. Triệu chứng lâm sàng bên ngoài biểu hiện rõ hơn như nh
ững
đốm xuất huyết và những vết lở nhỏ đường kính từ 2 – 3mm màu đỏ xen lẫn trắng
hoặc màu trắng xung quanh đỏ. Cá bị nhiễm bệnh có khuynh hướng bỏ ăn từ từ.
Bệnh mãn tính: Bệnh tiến triển chậm và có biểu hiện suy nhược hệ thần kinh

trung ương như quay tròn, nhào lộn. Bệnh xuất hiện sau 30 ngày kể từ khi dịch bệnh
cấp tính bùng phát và tỉ lệ chết b
ắt đầu giảm. Biểu hiện lâm sàng cơ bản là khối u
nhỏ hay vết lở loét xuất hiện trên đầu.

Hình 1.2. Cá bệnh ESC cấp tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng (A), Cá bệnh
ESC cấp tính với những đốm xuất huyết màu đỏ ở phần đầu và bụng (B) và Cá bị
bệnh ESC mãn tính (C).
Đối với cá tra

Hình 1.3. Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A), cá tra bị bệnh mủ ở gan
thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B).
A
B
C
B
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 10
Cá nhiễm bệnh, tỉ lệ chết cao (10-90%), có thể lên đến 100% đồng thời trên
gan, thận và tụy tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3mm bên trong chứa
dịch màu trắng đục [10]. Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ khi nhiệt độ
nước nằm trong khoảng 20 – 29
0
C [137].
1.2.1.4 Đường lây truyền [132]
Edw. ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau:
¾ Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá vào cơ quan khứu giác di
chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não và bệnh lan rộng từ màng não
đến sọ và da.

¾ Edw. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hóa, thức ăn qua
đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột hoặc qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm
trùng máu. Bằng đường này vi khuẩn vào mao mạ
ch trong biểu bì gây họai tử và
mất sắc tố của da.
Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng hai tuần
sau khi nhiễm khuẩn.
1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên
cá da trơn
1.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn
Bệnh nhiễm khuẩn cấp tính đường ruột trên cá da trơn được tìm thấy tại bất cứ
nơi nào nuôi cá nheo tại nước Mỹ. Bệnh xảy ra ở tất cả
các kích cỡ cá nuôi nhưng
tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống [141]. Sự thiệt hại cho nghề nuôi công
nghiệp của cá da trơn do ESC được ước tính hàng năm khoảng 4 – 6 triệu USD từ
năm 1990 và đã tăng nhanh sau đó. Khoảng 70% các hộ nuôi được khảo sát vào
năm 1996 cho thấy nguyên nhân từ ESC đã gây ra thiệt hại cao nhất cho các hộ nuôi
cá da trơn, với 57% số hộ nuôi bị thiệt hại nặng [140].
1.2.2.2 Các nghiên cứu phòng bệ
nh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da
trơn
Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới trong lĩnh vực sản xuất vaccine phòng
bệnh do Edw. ictaluri gây ra trên cá da trơn. Nghiên cứu ảnh hưởng của ba loại
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 11
vaccine sống cải tiến dưới dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2 X+5, Serial 1A)
và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33) [130]. Cá nheo Mỹ (Ictalurus
punctatus) được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm ở các ngày tuổi khác nhau
(từ 7 ngày tuổi đến 31 ngày tuổi). Kết quả cho thấy hiệu lực của vaccine đã thể hiện

được ngay từ khi cá được gây miễn dịch ở giai đoạn 7 ngày tuổi và 10 ngày tuổi. Tỉ
lệ sống của cá 7 ngày tuổ
i được gây miễn dịch dao động trong khoảng 58,4 –
77,5%, đối với cá 10 ngày tuổi thì dao động trong khoảng 64,1 – 78,9%. Ba năm
sau đó, nhóm tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in ovo đối với việc sử
dụng các loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạn trứng của cá
nheo Mỹ, bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút. Kết quả cho thấy
phương pháp gây miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ
lệ bảo hộ khoảng 59,7%
[131].
Shelby và ctv. (2007a,b) bổ sung hai loại chế phẩm sinh học probiotic có chứa
Pediococcus sp. và Enterococcus sp. (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn
của cá nheo Mỹ giống và cho ăn trong vòng 5 – 8 tuần. Sau đó tiến hành đo các chỉ
tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và các thông số miễn dịch như
protein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement. Các số liệu về vi
sinh cho thấy hai chủ
ng vi khuẩn probiotic vẫn tồn tại được trong thức ăn sau khi bổ
sung trong thời gian bốn tuần. Tuy nhiên, các tác giả không tìm thấy sự khác biệt
nào về tăng trọng, đáp ứng miễn dịch cũng như tính kháng bệnh của cá sau thời gian
cho ăn thức ăn có bổ sung chế phẩm sinh học.
Aboagye và ctv. (2008) thử nghiệm ảnh hưởng của chế phẩm sinh học,
Lymnozyme đến tỉ lệ sống củ
a cá nheo Mỹ sau khi được gây nhiễm thực nghiệm
với Edwardsiella ictaluri. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức có bổ sung
Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi
gây nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so với
nghiệm thức đối chứng (80%).


Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 12
1.2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên
cá tra
Sự phát triển ngày càng nhanh của cá tra cùng với thị trường xuất khẩu tiềm
năng, hàng ngàn nông dân đã chạy theo lợi nhuận từ cá tra một cách vô điều kiện,
với năm 2008 là đỉnh điểm của phong trào nuôi cá tra ở ĐBSCL. Người nuôi đã ồ ạt
mở rộng diện tích nuôi, tăng mật độ nuôi một cách tự phát, cung cấp một lượng lớ
n
thức ăn dẫn đến môi trường trong ao nuôi dễ bị ô nhiễm, là điều kiện để bệnh bộc
phát và gây thiệt hại cho người nuôi.
Đặc biệt trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở ĐBSCL
tăng rất nhanh và không theo qui hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra
ngày càng nhiều nhưng việc điều trị lại kém hiệu quả đang là vấn đề quan tâm hàng
đầu c
ủa người nuôi cá và cả các nhà chuyên môn.
1.2.3.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra
Các bệnh thường gặp trên cá tra bao gồm bệnh do vi khuẩn (bệnh gan thận mủ
do Edwardsiella ictaluri, bệnh đốm đỏ do Pseudomonas, bệnh nhiễm trùng máu do
Edwardsiella tarda), nấm (nấm thủy mi, ) và ký sinh trùng (trùng bánh xe, trùng
quả dưa, sán lá đơn chủ, sán song chủ, ). Theo kết quả điều tra của Nguyễn Thanh
Phương (2007) [11] về các bệnh do tác nhân gây vi khuẩn xuất hiện trong các ao
nuôi cá tra thâm canh ở tỉnh An Giang, 68,3% số hộ đ
iều tra nhận thấy bệnh đỏ mỏ
đỏ đuôi, 61% số hộ ghi nhận bệnh gan-thận-mủ, 51,2% số hộ ghi nhận bệnh phù
đầu, 24,4% số hộ ghi nhận bệnh vàng da. Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan
(2008) [10], tần suất xuất hiện bệnh năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL bao gồm bệnh gan
thận mủ: 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70%; vàng da:
21,60%. Trong đó bệnh gan thận mủ (hay bệnh đố
m trắng nội tạng) gây thiệt hại

nhiều nhất cho người nuôi.
1.2.3.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra
Để giải quyết vấn đề vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri kháng sinh,
chúng ta phải tìm các giải pháp thay thế cho việc chữa trị bằng kháng sinh và thuốc
hóa học. Hiện nay biện pháp sử dụng vaccine để phòng bệnh đang được đánh giá là
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 13
có hiệu quả và kinh tế. Từ năm 2005, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã
phối hợp với Công ty Thuốc Thú Y Trung ương II (Navetco) thực hiện đề tài cấp
Bộ “Nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá
giò, cá hồng Mỹ nuôi công nghiệp” [12], trong đó đối tượng được quan tâm đặc biệt
là cá tra. Sau ba năm tiến hành nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá
tra đã đạt được một số kết quả khả
quan.
Tuy nhiên, các loại vaccine nói trên là vaccine bất hoạt (sử dụng kháng
nguyên là tế bào vi khuẩn giết bằng formalin 0,4%), có một số nhược điểm là tỉ lệ
bảo hộ chưa cao, thời gian bảo hộ khá ngắn (hai tháng, trong khi một vụ nuôi cá tra
kéo dài tới 5 – 6 tháng), đòi hỏi phải bổ sung một số chất bổ trợ để làm tăng hiệu
quả của vaccine. Biện pháp phòng bệnh tổng hợp luôn đòi hỏi sự kế
t hợp của nhiều
cách tiếp cận khác nhau: Quản lý môi trường nuôi, quản lý chất lượng con giống,
tăng cường sức khỏe vật nuôi, sử dụng các hợp chất kích thích miễn dịch, vaccine
bất hoạt, vaccine sống nhược độc, các chế phẩm sinh học có nguồn gốc thảo dược,
các chế phẩm vi sinh vật . . .
Hiện nay, một số chế phẩm vi sinh đã được ứng dụng trong sản xuấ
t cá tra
giống và nuôi thương phẩm nhằm thay thế cho việc sử dụng kháng sinh. Các chế
phẩm này được bổ sung vào trong thức ăn dưới dạng men vi sinh, đồng thời được
bổ sung vào nước để xử lý môi trường. Gần đây, chế phẩm probiotic Bokashi được

chiết xuất từ lá trầu của nhóm nghiên cứu Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Nông
Lâm Huế được xem là một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong việ
c phòng
và trị bệnh cho tôm cá. Thành phần hệ vi sinh vật trong chế phẩm này bao gồm vi
khuẩn lactic (50%), vi khuẩn quang hợp (20%), nấm men (20%), xạ khuẩn (5%),
nấm sợi (5%). Qua kết quả thử nghiệm của Công ty TNHH Hải Nông Phát thành
phố Hồ Chí Minh trên một số ao nuôi cá tra, basa từ tháng 4/2006 đến nay đã đạt
được những thành công nhất định trong việc phòng bệnh gan thận [4].
1.3 Giới thiệu về probiotic
Sử dụng probiotic không chỉ là một phương pháp mà còn là một chiến l
ược
phòng bệnh mới về kỹ thuật vi sinh làm giảm tỉ lệ chết của vật chủ đối các bệnh
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

HVCH: Phạm Thị Kim Anh 14
nhiễm trùng [34]. Chế phẩm sinh học góp phần quan trọng tăng cường hoạt động
của cơ chế phòng bệnh không đặc hiệu và cơ chế bảo vệ đặc hiệu chống lại bệnh tật
[84].
1.3.1 Định nghĩa probiotic
Thuật ngữ “probiotic” thường dùng để mô tả một quần thể vi sinh vật có
nhiệm vụ kiểm soát hoặc điều chỉnh quá trình sinh học. Từ probiotis có nguồn gốc
từ tiếng Hy Lạp “ pro” có nghĩa là “dành cho” và “bios” có nghĩa là “ sự sống”.
Định nghĩa gốc “probiotic là những chất tiết ra bởi một vi sinh vật mà nó kích thích
sự phát triển của vi sinh vật khác” [91]. Thực ra thuật ngữ này cũng được giới thiệu
vào những năm 1970 để miêu tả “những sinh vật được bổ sung vào thức ăn của
người và động vật” [30]. Parker (1974) định nghĩa probiotic như “những vi sinh vật
hoặc những ch
ất góp phần cân bằng hệ vi sinh đường ruột”. Sau đó, Fuller (1989)
định nghĩa “probiotic là những vi sinh vật sống được bổ sung vào thức ăn có ảnh
hưởng tốt với ký chủ bằng cách cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ” và

ngày nay vẫn còn được sử dụng rộng rãi.
Những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn probiotic từ môi trường nuôi trồng
thủy sản đã được báo cáo vào nhữ
ng năm 1980 [54].Trong hệ thống nuôi trồng thủy
sản “mối tương tác giữa vi sinh vật và vật chủ không chỉ có giới hạn trong đường
ruột của vật chủ mà vi khuẩn probiotic cũng có thể hoạt động trên mang, da và cả
trong môi trường sống xung quanh của vật chủ”. Liên quan đến điều này,
Verschuere và ctv. (2000) đề nghị một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng
của thuật ngữ
“probiotic” trong nuôi trồng thủy sản. Probiotic được định nghĩa như
là “vi sinh vật sống được bổ sung vào thức ăn để mang lại những ảnh hưởng có lợi
cho vật chủ bởi khả năng tăng cường mối quan hệ đối với vật chủ hoặc mối quan hệ
giữa vật chủ với quần thể vi sinh vật xung quanh, làm tăng giá trị của dinh dưỡng,
tăng khả n
ăng đề kháng của vật chủ đối với bệnh tật, hoặc cải thiện môi trường sống
xung quanh vật chủ”. Việc sử dụng probiotic trong công nghiệp nuôi trồng thủy sản
để thay thế liệu pháp dùng kháng sinh, một liệu pháp mà sau đó gây ra sự đề kháng
ở quần thể vi sinh vật đang làm gia tăng mối quan tâm rất lớn từ các nhà nghiên cứu