Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Phân Bào Thực Nghiệm Của Một Số Bài Thuốc Cổ Truyền Hoặc Dân Gian Ở Mức Độ Tế Bào Và Phân Tử.pdf

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO THỰC
NGHIỆM CỦA MỘT SỐ BÀI THUỐC CỔ TRUYỀN HOẶC DÂN
GIAN Ở MỨC ĐỘ TẾ BÀO VÀ PHÂN TỬ

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên)

CƠ QUAN QUẢN LÝ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 6/ 2010


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................................. i 
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................................... iv 
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................................... v 
PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1 
TỔNG QUAN............................................................................................................................ 5 
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP ............................................................................................... 13 
2.1. VẬT LIỆU SINH HỌC ................................................................................................ 13 

2.2. PHƯƠNG PHÁP .......................................................................................................... 14 
2.2.1. Phương pháp thu nhận cao nước từ bài thuốc ....................................................... 14 
2.2.2. Phương pháp nuôi tế bào ....................................................................................... 14 
2.2.3. Phương pháp SRB (Sulforhodamin B) .................................................................. 15 
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính caspase ............................................................... 16 
2.2.5. Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang ................................................................ 18 
2.2.6. Phương pháp phân tích DNA bộ gene (“thang DNA”) ......................................... 19 
2.2.7. Phương pháp flow cytometry. ............................................................................... 20 
2.2.8. Phương pháp microarray ....................................................................................... 21  
2.2.9. Phương pháp real-time RT-PCR............................................................................ 22 
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ..................................................................................................... 25 
1. TUYỂN CHỌN CÁC BÀI THUỐC CÓ TÁC ĐỘNG KHÁNG PHÂN BÀO............... 25 
2. THU NHẬN DỊCH CHIẾT TỪ BÀI THUỐC ................................................................ 27 
3. SÀNG LỌC CÁC CAO CHIẾT DỰA VÀO TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO TRÊN BA
DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ NI CẤY IN VITRO ........................................................ 27 
4. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM NGỪNG CHU TRÌNH TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG
APOPTOSIS CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA ............................. 33 
4.1. Khả năng làm ngừng phân bào của bài thuốc BT3 trên dòng tế bào HeLa .............. 33 
4.2. Khả năng cảm ứng apoptosis của bài BT3 trên dòng tế bào HeLa........................... 35 
4.2.1. Kết quả thử nghiệm caspase .................................................................................. 36 
4.2.2. Quan sát sự biến đổi hình thái tế bào apoptosis .................................................... 37 
4.2.3. Phân tích sự phân mảnh của DNA bộ gene ........................................................... 38 
5. NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA
TỪNG VỊ TRONG SỐ 5 VỊ CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA .... 39 
5.1. Kết quả sàng lọc độc tính tế bào của 5 vị trong bài thuốc BT3 ................................ 39 
5.2. Kết quả xác định giá trị IC50 của nước sắc từng vị ................................................... 43 
5.3. Kết quả xác định khả năng cảm ứng apoptosis của các vị có độc tính tế bào cao
trong bài thuốc BT3 ......................................................................................................... 45 
5.3.1. Kết quả xác định hoạt tính caspase-3 .................................................................... 45 
5.3.2. Kết quả thử nghiệm DNA phân mảnh ................................................................... 46 

5.3.3. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang tế bào HeLa xử lí với nước sắc
Hồng liên và Hồng cầm ............................................................................................... 47 


6. KHẢO SÁT BIỂU HIỆN TỔNG THỂ CỦA CÁC GENE Ở TẾ BÀO HELA XỬ LÝ
VỚI BÀI THUỐC - XÁC ĐỊNH CÁC GENE ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC .......................... 49 
7. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO BÀI THUỐC BT3 VÀ CÁC VỊ ................ 53 
7.1. Hoàng liên................................................................................................................. 53 
7.2. Hoàng cầm ................................................................................................................ 57 
7.3. Hoàng bá ................................................................................................................... 60 
7.4. Bạch thược ................................................................................................................ 63 
7.5. Chi tử ........................................................................................................................ 66 
7.6. Xây dựng TCCS cao toàn phần ................................................................................ 69 
8. XÂY DỰNG “DẤU VÂN TAY HÓA HỌC” VÀ “DẤU VÂN TAY SINH HỌC” CỦA
BÀI THUỐC BT3 ............................................................................................................... 75 
8.1. Xây dựng “dấu vân tay hóa học” bằng kỹ thuật HPLC ............................................ 76 
8.2. Xây dựng “dấu vân tay sinh học” ............................................................................. 78 
KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ......................................................................................................... 83 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 100 
PHỤ LỤC .............................................................................................................................. 105 
7.1. CƠ SỞ DỮ LIỆU CỦA 5 BÀI THUỐC .................................................................... 105 
7.2. DỮ LIỆU KHẢO SÁT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DỊCH CHIẾT NƯỚC
BÀI THUỐC TRÊN DỊNG TẾ BÀO NI CẤY. ......................................................... 133 
7.3. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ CÁC GIÁ TRỊ APOPTOSIS........................................... 137 
7.4. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ GIÁ TRỊ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO (IC50) và APOPTOSIS
CỦA CÁC VỊ TRONG BT3. ............................................................................................ 140 
7.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÔ MICROARRAY SỰ BIỂU HIỆN GENE ................ 142 
7.6. KẾT QUẢ REALIME-PCR ĐỊNH LƯỢNG ............................................................. 192 
7.7. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH “dấu vân tay hóa học” BẰNG KỸ THUẬT HPLC ........... 198 

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Thuật ngữ

AIF

Apoptosis-Inducing Factor: nhân tố cảm ứng apoptosis

AO

acridine orange

ATF4

Activating transcription factor 4

BAX

B-cell lymphoma-extra large

BCL-2

B-cell lymphoma 2

BSA

Bovine serum albumin

Cdc2

cell division cycle 2

Cdc25C

cell division cycle 25 homolog C

CEBPB

CCAAT/enhancer-binding protein beta

CHOP

Cyclophosphamide, Hydroxydaunorubicin (doxorubicin), Oncovin
(vincristine), and Prednisone/prednisolone

COPD

Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Bệnh tắt nghẽn phổi mãn
tính

Cpt

Camptothecin

CREB3L2

cAMP responsive element binding protein 3-like 2

CRYAB

crystallin, alpha B

Ct

Cycle Threshold: Chu kỳ ngưỡng

CYP4F11

cytochrome P450, family 4, subfamily F, polypeptide 11

DDIT3

DNA damage-inducible transcript 3:

DEVD

Asp-Glu-Val-Asp

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxiribonucleic acid

E’MEM

môi trường Eagle’s Minimum Essential Medium

EB

ethidium bromide

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EIF2A

Eukaryotic translation initiation factor 2A
i


FAM129A

Family with sequence similarity 129, member A

FBS

Fetal Bovine Serum

FDA

Food and Drug Administration: Cục quản lý Thuốc và Thực phẩm
Hoa Kỳ

GAPDH

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenease:

GDF15

Growth differentiation factor 15

HeLa

tế bào ung thư cổ tử cung

Hep-2

tế bào ung thư thanh quản

HepG2

tế bào ung thư gan

HL-60LNCaP

tế bào ung thư ruột kết

HPLC

High-Performance Liquid Chromatography: sắc ký lỏng cao áp

IC50

Inhibitory concentration of 50% growth: nồng độ ức chế 50% sự tăng

trưởng của tế bào

ISR

Integrated Stress Response:

KB

tế bào ung thư biểu bì

MCF-7

tế bào ung thư vú

mRNA

RNA thơng tin

MTT

3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide

NCCAM

National Center for Complementary and Alternative Medicine:
Trung tâm Y học cổ truyền Quốc gia của Hoa Kỳ

NCI

National Cancer Institute: Viện Ung thư Hoa Kỳ

NCI-H460

tế bào ung thư phổi

NUPR1

nuclear protein, transcriptional regulator, 1

OD

Opticcal density: Mật độ quang

PBS

Phosphate buffered saline

pf

Primer forward: mồi xuôi

PI

propidium iodide

pr

Primer reverse: mồi ngược
ii

RD

tế bào ung thư cơ

Rf

Rate of flow

RNA

ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

SERPINE 2

Serpine peptidase inhibitor, member 2

SRB

Sulforhodamine B

STC2

Stanniocalcin 2

STD

Standard deviation: độ lệch chuẩn

TRIB3

Tribbles homolog 3

WHO

World Health Organization: Tổ chức Y tế Thế giới

YHCT

Y học cổ truyền

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1 - Tác dụng theo Đông y và Tây y của các vị trong 5 bài thuốc .................................. 25 
Bảng 2 - Tỉ lệ (%) ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc ở nồng độ 10% (v/v) trên 3 dòng tế
bào ung thư .............................................................................................................................. 28 
Bảng 3 - Kết quả xác định IC50 của các bài thuốc trên dòng tế bào HeLa ............................ 28 
Bảng 4- Kết quả IC50 của các bài thuốc trên dòng tế bào MCF-7 ........................................ 29 
Bảng 5 - Kết quả IC50 của các bài thuốc trên dòng tế bào NCI-H460 .................................. 31 
Bảng 6 - Tỉ lệ % tế bào ở các pha của chu trình phân bào khi xử lý với BT3......................... 35 
Bảng 7 - Kết quả thử nghiệm caspase trên tế bào HeLa được cảm ứng với bài thuốc BT3 với
các thời gian cảm ứng khác nhau. ........................................................................................... 36 
Bảng 8- Tỉ lệ % ức chế tăng trưởng (I %) của 5 vị bài thuốc ở nồng độ 10% trên dòng tế bào
HeLa ........................................................................................................................................ 40 

Bảng 9 - Giá trị IC50 của nước sắc Hoàng liên, Hồng cầm, Hồng bá, Bạch thược, Chi tử
trên dịng tế bào HeLa ............................................................................................................. 43 
Bảng 10 - Kết quả thử nghiệm caspase-3 trên nước sắc Hoàng liên, Hoàng cầm, Hoàng bá
và Bạch thược .......................................................................................................................... 45 
Bảng 11- Kết quả phân tích microarray một số gene tăng biểu hiện ở tế bào HeLa xử lý với
bài thuốc BT3........................................................................................................................... 52 
Bảng 12 - Kết quả độ ẩm của Hoàng Liên .............................................................................. 55 
Bảng 13 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng Liên .................................................................. 55 
Bảng 14 - Kết quả tro không tan trong HCl của Hoàng Liên ................................................. 55 
Bảng 15 - Kết quả định lượng của Hoàng Liên....................................................................... 57 
Bảng 16- Kết quả độ ẩm của Hoàng cầm ................................................................................ 58 
Bảng 17 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng cầm ................................................................... 58 
Bảng 18 - Kết quả tro khơng tan trong HCl của Hồng cầm .................................................. 58 
Bảng 19 - Kết quả định lượng của hoàng cầm ........................................................................ 59 
Bảng 20- Kết quả độ ẩm của Hoàng bá .................................................................................. 60 
Bảng 21 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng bá ..................................................................... 61 
Bảng 22 - Kết quả tro không tan trong HCl của Hoàng bá .................................................... 61 
Bảng 23 - Kết quả định lượng của Hoàng bá .......................................................................... 63 
Bảng 24 - Kết quả độ ẩm của Bạch thược ............................................................................... 64 
Bảng 25 - Kết quả tro toàn phần của Bạch thược ................................................................... 64 
Bảng 26 - Kết quả tro không tan trong HCl của Bạch thược .................................................. 64 
Bảng 27 - Kết quả định lượng của Bạch thược ....................................................................... 65 
Bảng 28 - Kết quả độ ẩm của Chi tử ....................................................................................... 67 
Bảng 29 - Kết quả tro toàn phần của Chi tử ........................................................................... 67 
Bảng 30 - Kết quả tro không tan trong HCl của Chi tử .......................................................... 67 
Bảng 31- Kết quả định lượng của Chi tử ................................................................................ 68 
Bảng 32 - Kết quả độ ẩm cao toàn phần ................................................................................. 69 
Bảng 33 - kết quả tro toàn phần của cao toàn phần ............................................................... 69 
Bảng 34- Hàm lượng berberin trong cao toàn phần ............................................................... 75 
Bảng 35 - Hàm lượng baicalin trong cao toàn phần............................................................... 75 

Bảng 36 - Thời gian lưu và phần trăm hàm lượng/hàm lượng tổng của các mũi lặp lại trong 3
mẫu nước sắc bài thuốc ứng với 3 lần nấu khác nhau. ........................................................... 77 
Bảng 37 - Các mồi sử dụng trong phản ứng real-time RT-PCR với các gene nghiên cứu ..... 79 
Bảng 38 - Kết quả nhiệt độ nóng chảy sản phẩm PCR của các gene ..................................... 80 
Bảng 39 - Giá trị Ct và sự thay đổi biểu hiện ở mức mRNA của một số gene được phân tích
bằng kỹ thuật realtime-PCR bán định lượng. .......................................................................... 81 
iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1 - Các dịng tế bào sử dụng trong đề tài ....................................................................... 13 
Hình 2: Nguyên lý của phương pháp phân tích DNA bộ gene ................................................ 19 
Hình 3 - Biểu đồ histogram biểu diễn tần số giá trị FL2-H của các tế bào ở giai đoạn subG1, G0/G1, S và G2/M. ........................................................................................................... 21 
Hình 4 - Nguyên lý microarray................................................................................................ 21 
Hình 5 - Nguyên lý phương pháp realtime RT-PCR sử dụng SYBRGreen .............................. 23 
Hình 6 - Tác động ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc trên dòng tế bào HeLa ..................... 29 
Hình 7 - Tác động ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc trên dòng tế bào MCF-7 .................. 30 
Hình 8- Tác động ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc trên dòng tế bào NCI-H460 .............. 32 
Hình 9 - Tỉ lệ tế bào sống ở mẫu xử lý với BT3 phụ thuộc thời gian cảm ứng thuốc.............. 33 
Hình 10 - Biểu đồ histogram của mẫu chứng và mẫu cảm ứng thuốc ở các thời điểm cảm ứng
thuốc khác nhau ....................................................................................................................... 34 
Hình 11 - Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (400 X) tế bào HeLa có và khơng
có xử lý thuốc. .......................................................................................................................... 37 
Hình 12 - Kết quả điện di trên gel agarose của DNA bộ gene ................................................ 38 
Hình 13- Hình thái tế bào HeLa sau 48 giờ nuôi cấy ở các lô chứng (400X)......................... 41 
Hình 14 - Hình thái tế bào HeLa sau 48 giờ nuôi cấy ở các lô thử nghiệm(400X) ................ 42 
Hình 15 - Đồ thị so sánh các giá trị IC50 của từng vị và tồn bài thuốc ............................... 44 
Hình 16 - Kết quả thử nghiệm phân mảnh DNA trên tế bào HeLa sau 40 giờ cảm ứng với
nước sắc Hồng liên và Hồng cầm........................................................................................ 47 
Hình 17 - Hình ảnh tế bào HeLa ở mẫu chứng (A, B) và khi xử lí với Hồng cầm và Hồng

liên (C, D, E, F) sau 15 giờ và 24 giờ dưới KHV huỳnh quang(400X) ................................... 48 
Hình 18 - Mức độ biểu hiện một số gene xác định bằng kỹ thuật real-time RT-PCR ............. 52 
Hình 19 - Kết quả soi bột của Hồng Liên .............................................................................. 54 
Hình 20 - Kết quả sắc ký đồ của Hồng liên ........................................................................... 56 
Hình 21 - Kết quả soi bột của Hồng Cầm ............................................................................. 57 
Hình 22 - Kết quả sắc ký đồ của Hồng cầm .......................................................................... 59 
Hình 23 - Kết quả soi bột của Hồng bá ................................................................................. 60 
Hình 24 - Kết quả sắc ký đồ của Hồng bá ............................................................................. 62 
Hình 25 - Kết quả soi bột của Bạch thược .............................................................................. 63 
Hình 26 - Kết quả sắc ký đồ của Bạch thược .......................................................................... 65 
Hình 27 - Kết quả soi bột của Chi tử ....................................................................................... 66 
Hình 28- Kết quả sắc ký đồ của Chi tử.................................................................................... 68 
Hình 29 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Hoàng liên trong cao toàn phần ............... 70 
Hình 30 - Kiểm tra sự hiện diện của ngun liệu Hồng bá trong cao tồn phần ................. 71 
Hình 31 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Hồng cầm trong cao tồn phần ............... 72 
Hình 32 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Chi tử trong cao tồn phần ....................... 73 
Hình 33 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Bạch thược trong cao tồn phần ............... 74 
Hình 34 - Kết quả HPLC ba lần lặp của bài thuốc BT3 ......................................................... 77 

v


PHẦN MỞ ĐẦU
Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu khả năng kháng phân bào thực nghiệm của một số
bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở mức độ tế bào và phân tử.
Chủ nhiệm đề tài/dự án:PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương
Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Tp.HCM
Thời gian thực hiện: 18 tháng
Kinh phí được duyệt: 565.749.000
Kinh phí đã cấp: theo TB số: 131 TB-SKHCN ngày 27/08/2008

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 80% dân cư ở các nước đang phát triển
được điều trị bằng y học cổ truyền, đặc biệt là với các phương thuốc làm từ chất chiết
thực vật. Khoảng 3/4 thuốc có nguồn gốc thảo mộc sử dụng trên thế giới bắt nguồn từ
các phương thuốc cổ truyền và 25% số thuốc hiện đại có nguồn gốc từ các cây thuốc
đã được dân gian sử dụng từ rất lâu.
Tuy nhiên, theo đánh giá của nhiều tổ chức y tế trên thế giới, YHCT có một số
nhược điểm cần khắc phục. Chính vì vậy mà năm 2002, WHO đã cơng bố kế hoạch
phương hướng đầu tiên về phát triển YHCT, với những điểm chính như : (1) Phát
triển chính sách quốc gia về đánh giá và kiểm định YHCT, (2) Xây dựng cơ sở vững
chắc để chứng minh tính an toàn, hiệu quả và chất lượng của sản phẩm YHCT, (3)
Đảm bảo nguồn cung cấp đầy đủ và ổn định nguyên liệu cho YHCT, (4) Khuyến
khích việc sản xuất và tiêu thụ sản phẩm YHCT, (5) Sưu tầm và bảo quản các kiến
thức và bài thuốc dân gian. Các nước có nền YHCT phát triển như Trung Quốc, Ấn
Độ, .. đầu tư mạnh vào nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong lĩnh vực này. Trong
vòng 5 năm qua, Trung Quốc đã đầu tư 740 triệu nhân dân tệ (92,5 triệu đô la Mỹ)
cho nghiên cứu phát triển YHCT.
Trong số các bệnh có khuynh hướng tăng dần với mức độ phát triển của xã hội
như tiểu đường, béo phì, tim mạch, ..ung thư các dạng cũng ngày càng trở thành vấn
đề lớn của lĩnh vực Sức khỏe cộng đồng. Tỉ lệ mắc và tử vong do ung thư trên thế giới
hiện nay tăng 22% so với năm 1990. Bên cạnh việc tìm kiếm hoạt chất mới, khả năng
sử dụng phối hợp nhiều hoạt chất đã biết nhằm tạo hiệu quả cộng hưởng là cách tiếp
cận thực tế và mang tính khả thi cao. Nguyên lý của YHCT phù hợp với cách nhìn
hiện đại này. Điều đó được chứng tỏ qua số lượng tăng dần của các cơng trình nghiên
cứu về YHCT, đặc biệt là YHCT Trung Quốc, chỉ tính riêng trong lĩnh vực điều trị
1




ung thư, ở nhiều nước tiên tiến. Theo đánh giá của WHO, giống như ở Trung Quốc,

Hàn Quốc và Triều Tiên, YHCT thực sự là một phần của hệ thống Y tế ở Việt Nam,
với khoảng 30% bệnh nhân được điều trị bằng YHCT.
Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu nào được
cơng bố về cơ chế hoạt động của bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian mặc dù có nhiều
bài thuốc đã được truyền miệng, và sử dụng khá rộng rãi. Việc phát triển những công
cụ cho phép đánh giá hiệu quả tác động, chất lượng của các bài thuốc cổ truyền hoặc
dân gian sẽ góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc đánh giá, khai thác vốn quý của
nước ta vào lĩnh vực chăm sóc sức khỏe.
Trong định hướng phát triển về YHCT trên, Đề tài “Nghiên cứu khả năng
kháng phân bào thực nghiệm của một số bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở
mức độ tế bào và phân tử” này được thực hiện nhằm hai mục tiêu chính:
(1) Góp phần ứng dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại đáng tin cậy
để cung cấp một số chứng cứ thực nghiệm ở mức độ tế bào và gene cho khả năng
sử dụng bài thuốc cổ truyền trong điểu trị ung thư.
(2) Góp phần phát triển một phương pháp đánh giá tính ổn định về chất
lượng và hiệu quả của bài thuốc thơng qua các “chỉ thị hóa học và sinh học” bên
cạnh việc chuẩn hóa nguồn nguyên liệu dựa trên các tiêu chuẩn cơ sở Việt Nam

2


NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Thu nhận 5 bài thuốc dựa trên y văn và thông tin lưu truyền
Thu dịch chiết nước từ 5 bài thuốc
Khảo sát khả năng gây độc của 5 bài thuốc trên 3 dòng tế bào ung thư
Chọn bài có khả năng gây độc tế bào cao nhất

Nghiên cứu khả năng cảm ứng apoptosis của bài thuốc đã chọn trên
dịng tế bào HeLa

Xác định độc tính tế bào và khả năng cảm ứng apoptosis của các vị trong
bài thuốc đã chọn trên dòng tế bào HeLa

Khảo sát biểu hiện tổng thể của các gene ở tế bào HeLa xử lý với bài thuốc
Xác định các gene có đáp ứng với thuốc
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho bài thuốc và các vị
Xác định tiêu chí “dấu vân tay hóa học” và “dấu vân tay sinh học” để
kiểm tra tính ổn định và lặp lại của bài thuốc

3


Và những sản phẩm cần đạt được trong đề tài này, như sau:
(1) 05 bài thuốc có cơng dụng kháng phân bào
(2) 05 dịch chiết nước, có độ đậm đặc và trong, đủ chất lượng dùng cho các thử
nghiệm.
(3) 05 cao chiết methanol
(4) 02 bài thuốc có tỉ lệ % ức chế tế bào tăng trưởng cao nhất và >50% cho các nội
dung tiếp theo.
(5) Kết quả so sánh tính gây độc tế bào của dịch/cao chiết toàn phần của các thành
phần riêng lẻ. Chọn 1 trong 2 dịch chiết có số lượng chủ vị ít hơn để nghiên
cứu tiếp.
(6) Kết quả về khả năng và mức độ gây apoptosis của bài thuốc đã chọn và của các
chủ vị trong bài thuốc đó.
(7) Báo cáo kết quả giám định giữa kỳ.
(8) Kết quả phân tích bằng microarray biểu hiện một số gene chủ chốt trong quá
trình phân bào và gây apoptosis trên một dịng tế bào ung thư ni cấy. Chọn
khoảng 06 gene có sự thay đổi biểu hiện quan trọng nhất dùng làm “dấu ấn
sinh học”
(9) 06 quy trình realtime RT-PCR để nghiên cứu biểu hiện của 06 gene đã chọn.

(10)

Quy trình Western blot với một số kháng thể đặc hiệu cho các protein

nghiên cứu.
(11)

Sắc ký đồ của dịch/cao chiết nước hoặc methanol

(12)

Kết quả ΔCt của 06 gene nghiên cứu.

(13)

Kết quả về giá trị sử dụng của “dấu vân tay” hóa học và sinh học trong

việc đánh giá chất lượng và độ ổn định của bài thuốc.
(14)

Kết quả Western blot

(15)

Báo cáo tồn văn, báo cáo tóm tắt, đĩa CD.

4


TỔNG QUAN

Ung thư các dạng ngày càng trở thành vấn đề lớn của lĩnh vực Sức khỏe cộng
đồng. Theo báo cáo của WHO (2003), khoảng 10 triệu ca mắc mới được ghi nhận
hàng năm với trên 6 triệu ca tử vong. Năm 2002, các con số này là 11 triệu và 7 triệu
người chết do ung thư các loại. Tỉ lệ mắc và tử vong do ung thư trên thế giới hiện nay
tăng 22% so với năm 1999.
Hướng nghiên cứu về dược liệu, đặc biệt là dược liệu chống ung thư, đã phát
triển từ khá lâu trên thế giới và đã góp phần cung cấp một số hoạt chất kháng ung thư
hữu hiệu đang được sử dụng cho điều trị như Taxol, Vinblastin, .... Bên cạnh hợp chất
tự nhiên chiết từ cây-con, các bài thuốc cổ truyền ngày càng được nhiều nhóm quan
tâm nghiên cứu bằng nhiều cơng cụ hiện đại như các phương pháp sàng lọc độc tính tế
bào (MTT, SRB), các phương pháp nghiên cứu cơ chế chống ung thư ở mức độ phiên
mã và dịch mã như flow cytometry, real-time RT-PCR, Western blot,.... (Deng & cs,
2001; Kim & cs, 2005; Lin & cs, 2006; Lin & cs, 2007; Yin & cs, 2004). Đặc biệt,
DNA microarray, một công cụ nghiên cứu ở mức độ toàn thể bộ gene (geneomics) bắt
đầu được sử dụng những năm gần đây trong các nghiên cứu dược động học, dược học
phân tử, độc chất học, ... cũng như trong các cơng trình về kiểm định chất lượng dược
liệu. Công cụ này đặc biệt quan trọng trong việc tìm hiểu các tương tác thuốc-tế bào ở
mức độ tổng thể (Chavan & cs, 2006; Calligaris & cs, 2009; Einbond & cs, 2007;
Choi & cs, 2009)
1. Quan điểm của YHCT về ung thư – Tiềm năng – Hạn chế.
Y học cổ truyền (YHCT) cũng có bệnh danh Ung thư nhưng là để gọi loại
bệnh lý chung về mụn nhọt. Chữ Ung là muốn nói đến thứ nhọt đỏ – sưng – đau, nổi
gồ lên khỏi mặt da, làm mủ, khi vỡ mủ rồi thì lành miệng lại dễ dàng, cịn loại nhọt
chìm sâu ở trong, màu da khơng đổi, đau âm ỉ, khó vỡ mủ, khi vỡ ra khó lành miệng
gọi là Thư. Đối với các loại bệnh lý Ung thư theo Y học hiện đại, YHCT thường dùng
danh từ “Thủng Lựu”, và mỗi bệnh lý lại có tên riêng như “Nhũ nham” để chỉ ung thư
vú, “Phế nham” chỉ ung thư phổi, “Thạch thư” để nói về ung thư xương, “Ế cách” chỉ
ung thư thực quản, ...

5

Theo Đông y, sự sinh bệnh ung thư là do: (1) huyết ứ, (2) đàm thấp ngưng kết,
(3) nhiệt (hỏa) độc, (4) tạng phủ bị tổn thương (tỳ hư, tỳ vị khí hư, tỳ thận dương hư,
phế thậm âm hư,...). Do đó, các bài thuốc cổ phương hướng đến việc giải quyết các
nguyên nhân sinh bệnh này. Bài thuốc cổ phương thường được cấu tạo từ nhiều vị bao
gồm: (1) quân dược là vị thuốc chính, (2) thần dược, làm tăng tác dụng của vị chính,
(3) tá dược, điều trị các triệu chứng khác của bệnh hoặc loại bỏ tác dụng phụ khơng
mong muốn của vị chính, (4) sứ dược, có tác dụng dẫn thuốc và điều hịa các vị trong
bài thuốc. Hơn 100 loại dược liệu thường được phối hợp trong các bài thuốc được
phân thành 6 nhóm: thanh nhiệt giải độc (45 %), hành khí hoạt huyết (21 %), hóa đàm
trừ thấp (12 %), nhuyễn kiên tán kết (7 %), dĩ độc trừ độc (8 %), bổ dưỡng (7 %).
Theo báo cáo đánh giá của WHO (2008), YHCT, bao gồm ba nền y học cổ
truyền lớn là YHCT Trung quốc, Ấn độ (Ayurveda) và Hy lạp/Ả rập (Unani), có vai
trị quan trọng khơng chỉ ở khu vực kém phát triển trên thế giới mà cịn có ảnh hưởng
tăng dần ở các nước phương Tây. Tuy nhiên “việc tăng sử dụng các phương pháp và
sản phẩm của YHCT không đi đôi với sự tăng về số lượng cũng như chất lượng của
các chứng cứ khoa học tương ứng”. Ý thức về những hạn chế và nhu cầu cải thiện
tình hình hiện tại của YHCT trên thể hiện rõ ở mức quốc gia và khu vực với sự hình
thành những trung tâm nghiên cứu lớn về YHCT trên toàn thế giới. Ở châu Á, cái nôi
của hai nền YHCT lớn, nhiều trung tâm nghiên cứu quốc gia về YHCT hoạt động
mạnh ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ. Châu Phi thống nhất xây dựng Bản Tuyên bố
Abuja 2000 về vai trò YHCT trong phòng chống và điều trị sốt rét (Abuja Declaration
on Roll back Malaria) với sự tham gia của 53 quốc gia của Lục địa Đen. Nghị viện
châu Âu ra tuyên bố “Cách tiếp cận của châu Âu đối với các nền y học không truyền
thống” (A European Approach to Non-conventional Medicines) năm 1999 nhằm thúc
đẩy sự thừa nhận chính thức YHCT trong các trường đại học y và khuyến khích việc
sử dụng YHCT trong các bệnh viện. Song song đó, cơ quan châu Âu về đánh giá sản
phẩm từ dược liệu (European Agenecy for the Evaluation of Medicinal Products) cũng
bắt đầu phát triển việc xác lập các tiêu chuẩn về an toàn, hiệu quả và chất lượng của

thảo dược từ 1997. Hoa Kỳ có nền nghiên cứu về YHCT phát triển với nhiều trung
tâm nghiên cứu YHCT đặt tại các trường đại học lớn như Maryland, Harvard,
Columbia,... và Trung tâm Quốc gia Hoa Kỳ về YHCT (US National Center for
6


Complementary and Alternative Medicine). Mức đầu tư cho các nghiên cứu YHCT ở
Hoa Kỳ tăng từ 2 triệu USD năm 1992 lên 68, 3 triệu USD năm 2000.
Tuy nhiên cũng theo WHO, YHCT có một số mặt hạn chế khiến khó có thể
phát triển một cách căn cơ. Các hạn chế của YHCT tập trung vào 4 nội dung: (1) các
chính sách quốc gia và hệ thống pháp lý nhằm thúc đẩy sự phát triển của YHCT, (2)
các chứng cứ về tính an tồn, hiệu quả và chất lượng của phương pháp và sản
phẩm YHCT, (3) sự phổ biến YHCT trong nhân dân và khả năng đảm bảo nguồn
nguyên liệu cho phát triển bền vững đi kèm với sự đảm bảo quyền sở hữu trí tuệ của
người dân địa phương đối với kho tàng YHCT, (4) Sự phổ biến thông tin và hình
thành các mối liên kết hợp tác trong nghiên cứu, thực hành YHCT. Riêng đối với hạn
chế thứ hai, sự thiếu các phương pháp nghiên cứu, thiếu chứng cứ khoa học, thiếu các
tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế về tính an tồn, hiệu quả và chất lượng của sản phẩm,
thiếu hệ thống luật lệ rõ ràng, thiếu sự quản lý chặt chẽ các nhà phân phối nguyên liệu
và thiếu sự đầu tư cho nghiên cứu là những ngun nhân chính. Như vậy, việc kiểm
sốt chất lượng các bài thuốc cổ truyền là một trong những vấn đề cốt lõi cho việc
triển khai ứng dụng các bài thuốc này vào thực tiễn. Khâu đầu tiên trong việc kiểm
soát chất lượng là khâu định danh chính xác nguyên liệu. Trong khâu này, bên cạnh
các phương pháp nhận dạng hình thái cổ điển, các “chỉ thị DNA” (DNA marker) dựa
trên những biến động trình tự gene đặc trưng cho lồi ngày càng được sử dụng rộng
rãi, giúp định danh chính xác và phân biệt giữa các lồi có hình thái tương tự nhưng
tính chất dược lý khác biệt. Tuy nhiên, điểm mấu chốt vẫn là tính ổn định và hiệu quả
trong tác động cuối cùng của bài thuốc. Theo WHO, đối với những bài thuốc không
thể xác định được hoạt chất chính thì có thể dùng “dấu vân tay hóa học” (sắc ký) để
đảm bảo chất lượng ổn định của sản phẩm cuối cùng (WHO, 1996). Phương pháp sắc

ký lỏng cao áp (HPLC) đã được nhiều nhóm nghiên cứu ưu tiên sử dụng hơn so với
các phương pháp sắc ký khác như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, và điện di mao quản,...
để xác định “dấu vân tay” hóa học của các bài thuốc (Liang & cs, 2004; Chavan & cs,
2006). Trong phương pháp này, người ta dựa vào một số chất chuẩn có hiện diện
trong hợp chất/bài thuốc để kiểm tra sự lặp lại của phổ sắc ký của hợp chất/bài thuốc
cho mỗi lần tách chiết. Từ đó đánh giá được độ ổn định về thành phần hóa học của sản
phẩm khi sử dụng những nguyên liệu và quy trình thu nhận xác định.
7


Để đánh giá tính ổn định về mặt sinh học của hợp chất tự nhiên/bài thuốc thì gần
đây, phương pháp “dấu vân tay đáp ứng sinh học” (biological response fingerprinting)
được đề xuất dựa trên sự biểu hiện của một tập hợp các gene chỉ thị cho đáp ứng của
tế bào chủ đối với một hợp chất xác định. Một số cơng trình cho thấy có thể sử dụng
“dấu ấn đáp ứng sinh học ở mức độ bộ gene” để kiểm sốt chất lượng của hợp chất có
hoạt tính sinh học, và cả những bài thuốc cổ truyền có thành phần phức tạp (Liang &
cs, 2004; Chavan & cs, 2006). Trước tiên, người ta so sánh biểu hiện các gene trong
toàn bộ bộ gene ở tế bào có xử lý “thuốc” với biểu hiện tương tự ở tế bào không xử lý
dựa trên phương pháp microarray. Từ kết quả phân tích trên microarray, người ta chọn
ra một tập hợp gene có liên quan đến hoạt tính sinh học mong muốn và có biểu hiện
tăng/giảm rõ rệt khi xử lý “thuốc”. Biểu hiện của tập hợp gene này được xem là “dấu
ấn đáp ứng sinh học ở mức độ bộ gene” của một hợp chất hay bài thuốc xác định và sẽ
được định lượng bằng kỹ thuật realtime RT-PCR (để xác định mức độ tăng/giảm biểu
hiện). Mức độ tăng/giảm biểu hiện của các gene “chỉ thị” xác định được chính là chỉ
số dùng để kiểm soát chất lượng của hợp chất/bài thuốc cho những lần thử nghiệm
hay sản xuất sau đó. Do bản chất về mặt hóa học của bài thuốc là vô cùng phức tạp
nên việc sử dụng “dấu vân tay hóa học” khơng thể hiện hết các biến động về thành
phần các hoạt chất hiện diện trong bài thuốc mà chỉ cho thấy vài hoạt chất có hàm
lượng cao (mặc dù chưa chắc có hoạt tính sinh học chủ chốt). Do đó, phương pháp
“dấu vân tay đáp ứng sinh học” là một phương pháp bổ sung hiệu quả, cho phép đánh

giá kết quả thực sự cuối cùng, tức là tác động sinh học, của bài thuốc và được xem là
có tiềm năng ứng dụng vào q trình kiểm sốt chất lượng bên cạnh các tiêu chí về
định danh nguyên liệu và thành phần hóa học của bài thuốc (Liang & cs, 2004;
Chavan & cs, 2006; Rong & cs, 2007).

2. Tình hình nghiên cứu YHCT.
Nhiều cơng trình nghiên cứu liên quan đến các bài thuốc với tác dụng trị liệu
đa dạng, riêng đối với điều trị ung thư, một số công trình nghiên cứu thực nghiệm và
lâm sàng cho thấy có triển vọng ứng dụng tốt.
Chế phẩm PC-SPES bao gồm 8 loại thực vật là Cúc hoa trắng (Chrysanthemum
morifolium R.), nấm Linh chi (Ganoderma lucidum K.), Cam thảo (Glycyrrhiza
8


glabra L.), Thanh đại (Isatis indigotica L.), Tam thất (Panax pseudoginseng W.),
Đơng lăng thảo (Rabdosia rubescens H.), Hồng cầm (Scutellaria baicalensis G.), Cọ
lùn Nam Mỹ (Serenoa repens B.). Hàng loạt các nghiên cứu về cơ chế phân tử của
PC-SPES được tiến hành cho thấy chế phẩm này hoạt hoá con đường tín hiệu JNK/cJun/AP-1 dẫn đến sự ngừng phân bào và cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư
tuyến tiền liệt người (Bonham & cs, 2002). PC–SPES còn ức chế sự phát triển của
nhiều dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt khác như PC-3, DU-145, dòng ung thư vú
MCF-7, dòng T47-D, và ung thư bạch cầu ở người HL-60 LNCaP (Ikezoe & cs,
2003). Về mặt lâm sàng, PC-SPES ức chế sự tăng trưởng của khối u, giảm thời gian
tái phát và kéo dài thời gian sống của các bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt. PC-SPES
còn làm giảm triệu chứng trên các bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn cuối (de
Lemos, 2002). PC-SPES được phát triển thành thuốc dạng viên nén và đã được FDA
chấp nhận cho phép bán rộng rãi trên thế giới từ năm 1998. Tuy nhiên, từ 2001, có
nhiều phản hồi về việc trong chế phẩm có chứa các thành phần tạp nhiễm nguy hiểm
như estrogene diethylstilbestrol (DES – là một dạng thuốc tránh thai, có nguy cơ gây
ung thư tử cung và ung thư vú), warfarin và indomethacin (một dạng thuốc kháng
viêm không thuộc họ steroid). Điều này đã khiến Trung tâm YHCT Quốc gia của Hoa

Kỳ (National Center for Complementary and Alternative Medicine –NCCAM) ngừng
cung cấp kinh phí cho các nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng của PC–SPES. FDA
cũng đã thu hồi tồn bộ sản phẩm PC-SPES có trên thị trường và khuyến cáo người
dân ngừng sử dụng chế phẩm này vào cuối năm 2002 cho đến khi thành phần của bài
thuốc được chuẩn hóa chặt chẽ (Ruan & cs, 2006).
Bài thuốc “Hoàng liên giải độc thang” gồm 4 vị: Hoàng liên (Coptis sinensis
Franch), Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr), Hoàng cầm (Scutellaria
baicalensic Georg), và Chi tử (Gardenia fzorida L) cho thấy khả năng ức chế tăng
sinh dòng tế bào u tủy và cảm ứng apoptosis theo con đường trung gian ti thể (Ma &
cs, 2005). Bài thuốc làm giảm hàm lượng cyclin A, cyclin B1, Cdc2 và Cdc25C, làm
ngừng chu trình tế bào. Nó cũng làm tăng sự biểu hiện của Bax và Bak, giảm sự biểu
hiện của Bcl-2 và Bcl-XL, khởi động con đường apoptosis qua ti thể trên dòng tế bào
HepG2 và PLC/PRF/5. Hiệu quả ức chế của bài thuốc lên sự tăng trưởng khối u cũng

9


đã được chứng minh trong mơ hình chuột nude với khối u dị ghép tế bào ung thư gan
(Hsu & cs, 2008).
Bài thuốc Wikyungtang gồm 4 loại thảo dược là Phragmitis rhizome (từ rễ cây
Pragmites cimmunis T.), Coicis semen (hạt cây Ý dĩ -Coix lachryma-jobi var),
Benincasae semen (hạt cây Benincasa hispida), Persicae semen (hạt cây Đào –Prunus
persica B.) có nguồn gốc từ Trung Quốc. Các nghiên cứu in vitro trên bài thuốc cho
thấy bài thuốc có tính kháng viêm thơng qua sự ức chế biểu hiện cyclooxygenease-2
(COX-2) và ức chế sự tăng sinh và cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư phổi
người A549 (Park & cs, 2004).
Bài thuốc ISF-1, với thành phần Radix Astragali, Radix Angelicae Sinensis,
Radix Paeoniae Rubra, Rhizoma Chuanxiong, Flos Carthami, Semen Persicae,
Pheretima, ức chế sự tăng trưởng dòng tế bào ung thư gan HepG2 (Rong & cs, 2008).
Bài thuốc Je-Chun-Jun bao gồm Radix Angeneliace gegantis, Rhizoma

rehmanniae, Radix achyranthis, Radix linderae, Cortex cinnamomi, Semen Persicae
cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào HeLa (Chae & cs, 2004).
Bài thuốc cổ truyền Hàn Quốc, Gagam-whanglyun-haedoktang, có khả năng
cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư máu người HL-60 thơng qua sự hoạt hóa
caspase-3 (Kim & cs, 2005).
Một số bài thuốc cổ truyền Trung quốc bao gồm Huang-Lian-Tang, Zhi-FuLing-Wan đã được nghiên cứu về tác động kháng phân bào và gây apoptosis trên
dòng tế bào ung thư máu bằng các phương pháp Western blot, flow cytometry và RTPCR (Ma & cs, 2009). Bài thuốc có tên là Yigan ức chế sự tăng trưởng và cảm ứng
apoptosis ở tế bào gan, có tác dụng chống lại sự xơ hóa gan (Yao & cs, 2002).
Một nghiên cứu khác trên 242 bệnh nhân bị ung thư tại Trung Quốc được cho
sử dụng bài thuốc Sheng Xue Tang, gồm các vị Astragalus membranaceus, Angelica
sinensis, Equus asinus, Spatholobi spp., Pyrrosia lingua, Ziziphus jujube, Hordeum
vulgare, Citrus reticulate, Glycyrrhiza uralensis. Các xét nghiệm lâm sàng sau đó trên
các bệnh nhân này cho thấy hoạt động của đại thực bào tăng 16%, số lượng tế bào
lympho T “giúp đỡ” (helper) tăng 50%, đặc biệt, chức năng của các tế bào giết tự
nhiên tăng đến 81% (Rao & cs, 1991).

10


Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều hợp chất tự nhiên và bài
thuốc cổ truyền đã được đánh giá một cách khoa học, thuyết phục và là một kho tàng
cần khai thác cho trị liệu các dạng ung thư.
Cơng trình trong nước liên quan đến các nghiên cứu về dược liệu từ cây thuốc
bắt đầu được công bố nhiều trong thời gian gần đây. Hoạt tính sinh học được quan
tâm khá phong phú và được chiết xuất từ một phổ thực vật rộng bằng các phương
pháp hóa học phù hợp. Các hoạt tính sinh học này bao gồm tính kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng ung thư, chống oxy hóa và nhiều tính năng điều trị khác (Ninh Khắc Bản
& cs, 2004; Nguyễn Quốc Khang & cs, 2004). Riêng đối với hoạt tính kháng ung thư,
các nhóm nghiên cứu chủ yếu sử dụng một số dòng tế bào ung thư người như MCF-7
(ung thư vú), HepG-2 (ung thư gan), RD (ung thư cơ), KB (ung thư biểu bì), Hep-2

(ung thư thanh quản), ... để thử tính gây độc tế bào của hợp chất tự nhiên bằng phương
pháp MTT (cytotoxic assay) (Đỗ Khắc Hiếu & cs, 2004; Lê Mai Hương & cs, 2005;
Lê Minh Hà & cs, 2007; Đỗ Thị Thảo & cs, 2007). Một số ít cơng trình sử dụng mơ
hình chuột gây ung thư in vivo để thử hoạt tính kháng ung thư của hợp chất tổng hợp
hay tự nhiên (Trần Công Yên & cs, 2005). Kết quả cho thấy nhiều cây, và cả nhiều chi
cây bản địa có tác dụng gây độc tế bào rất cao, cần được nghiên cứu sâu hơn, hướng
đến khả năng sử dụng làm thuốc trị ung thư. Trong nước hiện chưa có cơng trình nào
cơng bố về việc nghiên cứu bài thuốc chống ung thư bằng các phương pháp hiện đại.
3. Cơ sở thực hiện hướng nghiên cứu của đề tài.
Trong điều trị ung thư, một trong những mục tiêu quan trọng là nhắm đến việc
khởi phát con đường chết theo chương trình (apoptosis) ở tế bào khối u.
Đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng phân bào thực nghiệm của một số bài
thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở mức độ tế bào và phân tử” là sự tiếp nối các đề tài
của nhóm nghiên cứu từ trước đến nay. Trong giai đoạn 2002-2005, nhóm nghiên cứu
đã xây dựng các phương pháp và quy trình thực nghiệm để: (1) ni cấy các dịng tế
bào ung thư người, (2) sàng lọc tính gây độc tế bào (các phương pháp MTT, SRB,
Trypan blue, clonogeneic), (3) khảo sát hiện tượng apoptosis (chết theo chương trình)
ở mức độ tế bào và gene và thời điểm tác động trên chu trình phân bào (các phương
pháp “thang DNA” (DNA laddering), kính hiển vi huỳnh quang, flow cytometry, thử
11


nghiệm caspase, Western blot). Các phương pháp và quy trình đã xây dựng trên đã
được sử dụng để sàng lọc và đánh giá tác động kháng phân bào của các chất chiết từ
cây thuốc. Ở giai đoạn kế tiếp (2006-2008), chúng tơi đã chuẩn hóa các quy trình đi từ
quy trình thu hái và chế biến cây thuốc, tách chiết hoạt chất cho đến các thử nghiệm
sinh học. Các kết quả về xây dựng và chuẩn hóa phương pháp, quy trình thực nghiệm
của các đề tài trước đều được áp dụng cho nghiên cứu này.

12

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU SINH HỌC
2.1.1. Các dòng tế bào sử dụng trong đề tài bao gồm: dòng tế bào ung thư vú MCF-7,
dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, và dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460. Các
dòng tế bào này do Viện Ung thư Hoa Kỳ (NCI) cung cấp.
MCF-7

HeLa

NCI-H460

Hình 1 - Các dịng tế bào sử dụng trong đề tài
2.1.2. Các bài thuốc sử dụng trong đề tài:
- Song sâm địa thược thang (BT1) gồm: Đảng sâm (Codonopsis pilosula) 15 g,
Sinh địa (Rehmannia glutinosa ) 30 g, Huyền sâm (Scrophularia bucrgeriana ) 30 g,
Bạch hoa xà (Hedyotis diffusa ) 30 g, Bán chi liên (Scutellaria barbata ) 30 g.
- Nhị trần thang gia vị (BT2) gồm: Trần bì (Citrus reticulata) 20 g, sử dụng
phần vỏ (pericarpium citri reticulatae), Bán hạ chế (Typhonium divaricatum) 30 g,
Bạch linh (Poria cocos) 30 g, Cam thảo (Glycyrrhiza spp.) 10 g, Bán chi liên
(Scutellaria barbata) 30 g
- Hoàng liên giải độc thang (BT3) gồm: Hoàng liên (Coptis chinensis) 30 g,
Hoàng bá (Phellodendron chinense) 30 g, Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) 30 g,
Bạch thược (Paeonia lactiflora) 20 g, Chi tử (Gardenia jasminoides) 20 g.
- Tiểu tích nhuyễn kiên phương (BT4): Bán chi liên (Scutellaria barbata) 30 g,
Bạch hoa xà (Hedyotis diffusae) 30 g, Bạch thược (Paeonia lactiflora) 30 g, Mẫu lệ
(Ostrea gigas) 30 g
Bốn bài thuốc trên do PGS TS Nguyễn Thị Bay, khoa Y học cổ truyền, Đại học
Y Dược Tp HCM cung cấp.

- Nam địa long (BT5) gồm: Giun đất (Pheretima aspergillum) 10 g, Đậu xanh
(Vigna radiata) 20 g, Đậu đen (Vigna unguiculata) 20 g, Bù ngót (Sauropus
androgynus L Merr.) 40 g.
13


Bài thuốc do Lương y Nguyễn An Định cung cấp công thức. Dược liệu khô sử
dụng trong đề tài đến từ Công ty cổ phần Dược Trung Ương Mediplantex –Hà Nội.
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Phương pháp thu nhận cao nước từ bài thuốc
- Dược liệu cân theo tỉ lệ khối lượng quy định cho mỗi bài thuốc.
- Ngâm ngập dược liệu trong nước cất 2 lần, 15 phút. Chắt bỏ nước ngâm.
- Thêm nước cất 2 lần sao cho mực nước ngập dược liệu (khoảng 200ml).
- Đun sôi trong 5 phút, đảo đều. Sau đó, nấu thuốc ở 70 – 800C trong 1,5 giờ.
- Thu nước sắc thuốc lần 1
- Thêm nước cất 2 lần sao cho mực nước ngập dược liệu (khoảng 150ml).
- Đun sôi trong 5 phút, đảo đều. Sau đó, nấu thuốc ở 70 – 800C trong 1,5 giờ.
- Thu nước sắc thuốc lần 2.
- Trộn dịch nước sắc của 2 lần nấu. Ly tâm ở 4.000 vòng/phút trong 15 phút để
loại cặn. Nước sắc thuốc sau khi loại cặn được cô qua đêm ở bể ổn nhiệt, nhiệt độ 60
– 700C cho đến khi đạt được thể tích tương ứng với trọng lượng nguyên liệu theo tỉ lệ
1 g : 1 ml.
- Li tâm dịch chiết thuốc ở 4.000 vòng/phút trong 15 phút, loại cặn.
- Dịch chiết thuốc được sử dụng trong các thử nghiệm được pha lỗng đến nồng độ
nhất định trong mơi trường ni cấy tế bào, sau đó, được lọc loại khuẩn bằng màng
lọc vơ trùng 0.22 µm. Nước sắc thuốc được pha lỗng sử dụng trong ngày.
2.2.2. Phương pháp nuôi tế bào
- Giải đơng các dịng tế bào ung thư cần sử dụng, kiểm tra tình trạng nhiễm
dưới kính hiển vi soi ngược.
- Tế bào được cấy chuyền khi đã đạt độ phủ 70-80% diện tích bình ni cấy:

loại bỏ mơi trường cũ, cho 2 ml dung dịch PBS (-)1X để rửa một cách nhẹ nhàng (lặp
lại 3 lần).
- Cho 2 ml dung dịch Trypsin/EDTA vào để tách tế bào (khoảng 3 phút).
- Loại bỏ nhanh Trypsin/EDTA, vỗ nhẹ hai thành bình. Thêm 1 ml môi trường
nuôi cấy. Dùng pipette huyền phù nhẹ tế bào. Chuyển dịch tế bào vào bình Roux. Bổ
sung 5 ml mơi trường ni cấy vào bình.
14


- Ủ trong tủ ấm 5% CO2, 370C.
- Thay môi trường mới sau 2 ngày nuôi cấy.
2.2.3. Phương pháp SRB (Sulforhodamin B)
Chúng tơi sử dụng có biến đổi quy trình do Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ
(NCI) công bố (In Vitro Cancer Cell Line Screen – Manual of Operations (08/2005)).
Nguyên lý của phương pháp dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm màu SRB với
protein hiện diện trong mẫu nhờ liên kết tĩnh điện, từ đó đo lượng protein tổng. Lượng
SRB đo được sẽ tỉ lệ thuận với lượng protein và phản ánh tình trạng sống/chết của tế
bào.
Thiết kế thí nghiệm: mỗi đĩa bao gồm 1 mẫu chứng dương (Camptothecin 0.01
µg/ml), 1 mẫu chứng âm (mơi trường) và 1 mẫu chứng dung môi pha thuốc. Mỗi mẫu
thử gồm một giếng trắng (blank) và 3 giếng tế bào lặp lại.
Quy trình như sau:
- Các dịng tế bào ung thư (từ thế hệ 4 đến 20) được nuôi trong môi trường
E’MEM có bổ sung 10 % FBS (Fetal Bovine Serum) ở 370 C và 5 % CO2 đạt độ phủ
khoảng 70-80 %.
- Tách tế bào bằng trypsin/EDTA: loại môi trường; rửa lớp đơn tế bào bằng 2 ml
PBS (-) (NaCl 10 g, KCl 0.25 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4 0.25 g, nước cất đủ 1l);
loại PBS và thêm 1 ml trypsin/EDTA vào bình cho ngập lớp đơn tế bào trong 1-2
phút; loại trypsin/EDTA và thêm 1 ml mơi trường vào bình; nhẹ nhàng huyền phù tế
bào bằng pipette và chuyển 1 ml dịch huyền phù tế bào vào eppendorf 1,5 ml.

- Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu với phương pháp Trypan blue: chuyển
dịch tế bào đã huyền phù trong Trypan blue 0,4 % vào cạnh buồng đếm đã phủ
lamelle; để tế bào cố định vài phút trước khi đếm dưới kính hiển vi, vật kính 10X. Các
tế bào sống sẽ sáng rõ, tế bào chết sẽ bị nhuộm xanh. Xác định tổng số tế bào trong
một ml:
(Tổng số tế bào đếm được/5) x 2 x 104 = số tế bào/ml
Lưu ý: 104 là thể tích buồng đếm (mỗi ơ là 1x1 mm và dày 0.1 mm)
Từ đó suy ra thể tích dịch huyền phù tế bào cần để có mật độ tế bào cần đạt:
(Mật độ cần x 10 x thể tích (ml) dịch tế bào cần)/số tế bào/ml (ở bước trên)

15