Phân lập, tuyển chọn và khảo sát đặc điểm sinh hóa, điều kiện nuôi cấy của một số chủng vi khuẩn sinh protease kiềm

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Phân lập, tuyển chọn và khảo sát
đặc điểm sinh hóa, điều kiện ni cấy của
một số chủng vi khuẩn sinh protease kiềm

HÀ NỘI - 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Phân lập, tuyển chọn và khảo sát
đặc điểm sinh hóa, điều kiện ni cấy của
một số chủng vi khuẩn sinh protease kiềm

Sinh viên thực hiện

: ĐÀM VĂN DUY

Lớp

: K64CNSHA

MSV

: 645730

Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS. NGUYỄN VĂN GIANG
Bộ mơn

: CƠNG NGHỆ VI SINH

Hà Nội - 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện
trong thời gian từ 09/2022 – 02/2023 dưới sự hướng dẫn PGS.TS. Nguyễn Văn
Giang – giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và
chưa được cơng bố ở bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào ở trong và ngồi nước.
Các tài liệu đã trích dẫn được nêu ở mục tài liệu tham khảo.
Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2023
Sinh viên
ĐÀM VĂN DUY

i


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Học viện
Nông nghiệp Việt Nam, đội ngũ giảng viên, cán bộ đang giảng dạy và công tác
tại Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. Tôi vô cùng biết ơn các thầy, cô khoa Công
nghệ sinh học đã giảng dạy, hướng dẫn và tạo điều kiện để tơi hồn thành chương
trình học, thực tập nghề nghiệp và khố luận tốt nghiệp.
Tơi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn nhất đến PGS.TS Nguyễn Văn
Giang đã định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ dạy, giúp đỡ, hỗ trợ tơi trong suốt
q trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin cảm ơn đến thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, cô Th.S Trần Thị
Đào, cô Th.S Nguyễn Thanh Huyền, cô Th.S Trần Thị Hồng Hạnh, nghiên cứu
viên Dương Văn Hoàn, Nguyễn Thị Thu đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện
khố luận.
Cuối cùng tơi muốn gửi lời cảm ơn đến Bố, Mẹ, gia đình và bạn bè đang
thực hiện khố luận tại bộ mơn Cơng nghệ vi sinh đã khuyến khích, động viên,
hỗ trợ, tạo điều kiện tốt nhất để tơi có thể hồn thành tốt khố luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2023
Sinh viên
ĐÀM VĂN DUY

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ............................................................................................... i
Lời cảm ơn ................................................................................................. ii
Danh mục bảng.......................................................................................... vi
Danh mục hình.......................................................................................... vii
Danh mục từ viết tắt ................................................................................. viii
Tóm tắt ...................................................................................................... ix

PHẦN I: MỞ ĐẦU ..................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ....................................................................................... 1

1.2.

Mục đích, đối tượng và nội dung nghiên cứu .................................... 2

1.2.1. Mục đích nghiên cứu ....................................................................... 2
1.2.2. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 2
1.2.3. Nội dung nghiên cứu........................................................................ 2
1.3.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ............................... 3

1.3.1. Ý nghĩa khoa học............................................................................. 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................. 3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
2.1.

Đại cương về enzyme ...................................................................... 4

2.1.1. Đặc điểm chung............................................................................... 4
2.1.2. Lịch sử nghiên cứu về enzyme ......................................................... 5
2.1.3. Cấu trúc chung của enzyme.............................................................. 5
2.1.4. Chức năng của enzyme .................................................................... 7
2.1.5. Các yếu tố ức chế enzyme ................................................................ 7
2.1.6. Quy ước đặt tên enzyme................................................................... 9
2.2.

Enzyme protease............................................................................ 10

2.2.1. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................ 10
2.2.2. Sự phân giải protein (quá trình thối rữa) ......................................... 12

iii


2.2.3. Các phâm nhóm của protease ......................................................... 13
2.2.4. Các nguồn cung cấp protease hiện nay............................................ 14
2.3.

Protease kiềm ................................................................................ 15

2.3.1. Khái quát....................................................................................... 15
2.3.2. Ứng dụng của protease kiềm .......................................................... 16
2.3.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của protease kiềm trong Việt Nam
và trên thế giới............................................................................... 19
PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 21
3.1.

Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ....................................................... 21

3.1.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ...................................................... 21
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu .................................................................... 21
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ....................................................... 21
3.1.4. Hóa chất ........................................................................................ 21
3.2.

Phương pháp nghiên cứu................................................................ 22

3.2.1. Phân lập vi khuẩn từ nước thải của các lò mổ.................................. 22
3.2.2. Phương pháp nhuộm gram ............................................................. 22
3.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính protease ........................................ 23
3.2.4. Phương pháp dựng đồ thị đường chuẩn tyrosine .............................. 24
3.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ protease từ dịch nuôi vi khuẩn ......... 24
3.2.6. Khảo sát đặc điểm sinh học và phản ứng hóa sinh của các chủng vi
khuẩn sinh protease kiềm ............................................................... 25
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 30
4.1.

Phân lập vi khuẩn sinh protease kiềm ............................................. 30

4.2.

Hoạt tính phân giải protein của các chủng vi khuẩn sinh protease
kiềm.............................................................................................. 31

4.3.

Đồ thị đường chuẩn L-Tyrosine...................................................... 32

4.4.

Khảo sát điều kiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh ..... 33

4.4.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease kiềm ................................ 33

iv

4.4.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt độ protease kiềm ................ 34
4.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ protease kiềm..................... 36
4.4.4. Ảnh hưởng của các nguyên tố kim loại đến hoạt độ protease ........... 37
4.4.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease kiềm .......... 38
4.5.

Khảo sát các đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của các chủng
vi khuẩn tuyển chọn sinh protease kiềm.......................................... 40

4.5.1. Đặc điểm hình thái......................................................................... 40
4.5.2. Khả năng di động........................................................................... 41
4.5.3. Phản ứng catalase .......................................................................... 42
4.5.4. Phản ứng MR (Methyl Red) ........................................................... 42
4.5.5. Phản ứng VP (Voges-Proskauer) .................................................... 43
4.5.6. Khả năng biến dưỡng citrate........................................................... 44
4.5.7. Khả thủy phân tinh bột ................................................................... 44
4.5.8. Khả năng thủy phân Urê ................................................................ 45
4.5.9. Khả năng thủy phân gelatin ............................................................ 46
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 47
5.2.

Kết luận ........................................................................................ 47

5.3.

Kiến nghị ...................................................................................... 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 48

PHỤ LỤC................................................................................................. 59

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Một số cơng trình thu protease từ vi sinh vật .................................. 11
Bảng 3.1. Thành phần và dung lượng các chất trong dung dịch gốc Tyrosine ..... 24
Bảng 4.1. Đường kính vịng phân giải protein................................................ 31
Bảng 4.2. Số đo OD660 của đường chuẩn Tyrosine ......................................... 32
Bảng 4.3. Hoạt độ protease dưới sự ảnh hưởng của pH .................................. 34
Bảng 4.4. Hoạt độ protease dưới sự ảnh hưởng của nguồn cacbon .................. 35
Bảng 4.5. Hoạt độ protease dưới sự ảnh hưởng của các nguồn nitơ................. 36
Bảng 4.6. Hoạt độ protease dưới sự ảnh hưởng của các nguyên tố kim loại..... 37
Bảng 4.7. Hoạt độ protease dưới sự ảnh hường của thời gian ni cấy............ 39
Bảng 4.8. Đặc điểm hình dạng tế bào, khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn .................................................................................. 41

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Q trình thủy phân ure ............................................................... 28
Hình 4.1. Phân lập vi khuẩn sinh protease kiềm trên mơi trường skim
milk agar .................................................................................... 30
Hình 4.2. Năm chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh protease kiềm ..................... 31
Hình 4.3. Hoạt tính các chủng vi khuẩn sinh protease kiềm.......................... 32
Hình 4.4. Đồ thị đường chuẩn Tyrosine....................................................... 32
Hình 4.5. Biểu đồ hoạt độ protease theo pH................................................. 34

Hình 4.6. Biểu đồ hoạt độ protease theo nguồn cacbon ................................ 35
Hình 4.7. Biểu đồ hoạt độ protease theo nguồn nitơ ..................................... 36
Hình 4.8. Biểu đồ hoạt độ protease theo nguyên tố vi lượng kim loại............ 38
Hình 4.9. Đồ thị hoạt độ protease theo thời gian .......................................... 39
Hình 4.10. Khả năng di động của các chủng vi khuẩn tuyển chọn................... 41
Hình 4.11. Phản ứng catalase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn .................. 42
Hình 4.12. Phản ứng MR của các chủng vị khuẩn tuyển chọn ........................ 43
Hình 4.13. Phản ứng VP của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.......................... 43
Hình 4.14. Khả năng biễn dướng citrate của các chủng vi khuẩn tuyển chọn... 44
Hình 4.15. Khả năng thủy phân tinh bột của các chủng vi khuẩn tuyển chọn... 45
Hình 4.16. Khả năng thủy phân ure của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ......... 45
Hình 4.17. Khả năng thủy phân gelatine ........................................................ 46

vii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Giải nghĩa

ml

Milliter

MR

Methyl Red

RNA

Acid ribonucleic

pH

Power of hydrogen/potential of hydrogen

ATP

Adenosine triphosphate

P

Proteolysis

viii


TĨM TẮT
Từ mẫu nước thải của các lị mổ khu vực Hà Nội: lị mổ gà thơn Xn Dục,
lị mổ lợn thơn Đình Vỹ, và 3 lị mổ gà vịt tại thị trấn Trâu Quỳ; phân lập tuyển
chọn được được 24 chủng vi khuẩn sinh protease kiềm. Trong đó có 5 chủng có
vong phân giải protein trong sữa gầy cao nhất chính là P3, P7, P11, P17, P21 khi
có hiệu số D-d lần lượt là: 1,85 1,78 1,91 1,85 1,80 (cm). Có 4 chủng vi khuẩn
gram âm, 1 chủng vi khuẩn dương. Cả 5 chủng đều có khả năng di động, đều
dương tính trong các phản ứng với catalase, MR, VP. Chủng P7 và P11 biểu hiện
khả năng biến dưỡng citrate. Năm chủng vi khuẩn tuyển chọn này đều có khả
năng sinh enzyme amylase, urease, gelatinase. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn
thích hợp nhất ở điều kiện pH 9-11; nguồn cacbon thích hợp nhất là lactose và

glucose; nguồn nitơ thích hợp nhất là cao nấm men. Các nguyên tố vi lượng kim
loại ảnh hưởng không lớn đến hoạt độ protease kiềm của các chủng vi khuẩn này
khi sự chênh lệch hoạt độ protease không cao. Về thời gian nuôi cấy thì các chủng
vị khuẩn này đạt hoạt độ protease mạnh nhất vào 2-4 ngày nuôi cấy, và sau khoảng
thời gian này thì hoạt độ protease của các chủng suy giảm rất nhanh.

ix


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Quá trình sinh trưởng của sinh vật sống trên trái đất này luôn xảy ra các
phản ứng hóa sinh để chuyển hóa vật chất thành năng lượng. Các phản ứng này
luôn gắn với sự xuất hiện của enzyme có tính đặc hiệu và hiệu suất lớn hơn rất
nhiều các chất vô cơ, hữu cơ khác nếu xét trên cùng cơng dụng và chi phí. Chính
vì nhưng đặc điểm này mà các chế phẩm enzyme được sử dụng rất phổ biến trong
các linh vực khác nhau như y học, nông nghiệp, công nghiệp để phục vụ mục đích
của con người. Điều này ngày càng làm thay đổi suy nghĩ của con người về sản
xuất enzyme chất lượng cao bằng các phương pháp công nghiệp mang tính
thương mại và hiệu quả về chi phí.
Một số enzyme đã được sử dụng có nguồn gốc thực vật (Pappain được sử
dụng làm chất làm mềm thịt) hoặc nguồn gốc động vật (Remin được sử dụng để
làm đông sữa trong q trình sản xuất phơ mai). Tuy nhiên nó khá khó để triết
xuất ra trong mục đích phục vụ cho nhiều ngành cơng nghiệp. Vì vậy, đối với các
ứng dụng lớn, enzyme từ vi sinh vật là thứ rất được ưu chuộng, chúng có thế được
sản xuất trong các đơn vị lên men công nghiệp quy mô lớn (Balasubramanian et
al, 1996).
Trong tổng số enzyme cơng nghiệp trên tồn cầu thì có đến 75% là enzyme
thủy phân, protease đại diện cho một trong ba nhóm enzyme cơng nghiệp lớn nhất
và chiến 60% tổng doanh số bán enzyme trên toàn thế giới (Godfrey Mest et al,

1996) và dự kiến sẽ đạt giá trị doanh số ước tính 2 tỷ USD. Protease kiềm đã được
sử dụng trong thực phẩm, trong ngành công nghiệp chất tẩy rửa, công nghiệp da
thuộc từ trước đây rất lâu; protease kiềm cũng là một công cụ quan trọng trong
việc nghiên cứu cấu trúc của protein và peptit. Bên cạnh đó, chúng cịn được sử
dụng trong ngành dược phẩm, trong phim công nghiệp và xử lý chất thải (Gupta

1


et al, 2002; Patel et al, 2005; Tari et al, 2006; Haq và Mukhtar, 2007; Mukhtar et
Haq, 2008).
Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là trung tính và kiềm được sản
xuất bởi các sinh vật thuộc giống Bacillus. (Ferrero et al, 1996; Ellaiiah et al,
2002). Mặc dù nhiều vi khuẩn như Lactococci, Pseudomonas, Vibrio, E.coli,
Streptomyces đều có nhưng Bacillus được ưa chuộng hơn các loại khác vì nó là
giống vi khuẩn dị dưỡng, dễ nuôi cấy trên nhiều loại cơ và có năng suất cao.
Protease được thu từ các chủng Bacillus được gọi là bacillopeptidase. Được biết
đến nhiều nhất là protease Subtilisin Carlsberg từ Bacillus licheniformis;
Subtilisin BPN, Subtilisin từ Bacillus amyloliquifaciens.
Xuất phát từ tất cả các thực tại trên, để tài “Phân lập, tuyển chọn, xác
định đặc điểm hình thái, sinh hố và tối ưu hóa điều kiện ni cấy của một
số chủng vi khuẩn sinh protease kiềm” được tiến hành nghiên cứu.
1.2. Mục đích, đối tượng và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục đích nghiên cứu
• Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease kiềm
• Khảo sát các đặc đính hóa sinh của một số chủng vi khuẩn có năng suất
tốt nhất và tối ưu hóa điều kiện ni cấy của chúng.
1.2.2. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn sinh protease kiềm được phân lập từ nước thải các lò mổ gà vịt
lợn trong khu vực Hà Nội.

1.2.3. Nội dung nghiên cứu
• Khảo sát định tính sự sản xuất protease của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
• Khảo sát các đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
• Khảo sát các hoạt tính của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
• Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất cho các chủng vi khuẩn tuyển chọn.

2


1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái, hóa sinh và các điều kiện
nuôi cấy, các yếu tố môi trường và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến việc
thu thu enzyme protease của vi khuẩn.
Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể được sử dụng như tài liệu tham khảo cho
những nghiên cứu và giảng dạy về vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phân giải
protein.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của nghiên cứu này giúp xác định được một số mơi trường dinh
dưỡng phù hợp có thể ứng dụng vào qui mô sản xuất lớn hơn để thu sinh khối
hoặc thu chế phẩm enzyme protease có hoạt tính cao.

3


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cương về enzyme
2.1.1. Đặc điểm chung
Enzyme có thể được định nghĩa là các polyme sinh học xúc tác cho các
phản ứng sinh hóa.

Phần lớn các enzyme là các protein có khả năng xúc tác quan trọng để thực
hiện các quá trình khác nhau. Các quá trình trao đổi chất và các phản ứng hóa học
khác trong tế bào được thực hiện bởi một tập hợp các enzyme cần thiết để duy trì
sự sống.
Giai đoạn đầu của quá trình trao đổi chất phụ thuộc vào các enzyme phản
ứng với một phân tử được gọi là cơ chất. Enzyme chuyển đổi cơ chất thành các
phân tử riêng biệt khác, được gọi là sản phẩm (Charles Molnar et al, 2015).
Việc điều chỉnh các enzyme là một yếu tố chính trong chẩn đốn lâm sàng
vì vai trị của chúng trong việc duy trì các quá trình sống. Các thành phần đại
phân tử của tất cả các enzyme đều bao gồm protein, ngoại trừ loại chất xúc tác
RNA được gọi là ribozyme. Từ ribozyme có nguồn gốc từ enzyme axit
ribonucleic. Nhiều ribozyme là các phân tử axit ribonucleic, xúc tác cho các phản
ứng ở một trong các liên kết của chính chúng hoặc giữa các RNA khác (Purves,
W. K et al., 2003).
Enzyme được tìm thấy trong tất cả các mô và chất lỏng của cơ thể. Xúc tác
của tất cả các phản ứng diễn ra trong quá trình trao đổi chất được thực hiện bởi
các enzyme nội bào. Các enzyme trong màng sinh chất chi phối quá trình xúc tác
trong tế bào như một phản ứng với các tín hiệu của tế bào và các enzyme trong hệ
thống tuần hồn điều chỉnh q trình đơng máu. Hầu hết các quá trình sống quan
trọng được thiết lập trên các chức năng của enzyme (Worthington Biochemical
Corporation, 2015).

4


2.1.2. Lịch sử nghiên cứu về enzyme
Louis Pasteur là một trong những người đầu tiên nghiên cứu hoạt động của
enzyme. Ơng đã đưa ra giả thuyết khơng chính xác rằng q trình chuyển hóa đường
thành rượu của men được xúc tác bởi các "men" không thể tách rời khỏi tế bào
sống. Năm 1897, nhà hóa sinh người Đức Eduard Buchner (1860-1917) đã phân lập

được các enzyme xúc tác quá trình lên men rượu từ các tế bào nấm men sống.
Đầu thế kỷ 20 chứng kiến sự tiến bộ vượt bậc trong các nghiên cứu về
enzyme. Emil Fischer (1852-1919) đã nhận ra tầm quan trọng của hình dạng cơ
chất đối với sự liên kết của enzyme. Leonor Michaelis (1875-1949) và Maud
Menten đã giới thiệu một phương pháp toán học để định lượng các phản ứng xúc
tác bởi enzyme. James Sumner (1887-1955) và John Northrop (1891-1987) là
một trong những người đầu tiên tạo ra các tinh thể enzyme có trật tự cao và thiết
lập vững chắc bản chất protein của các chất xúc tác sinh học này. Năm 1937,
Hans Krebs (1900-1981) đã đưa ra giả thuyết về cách một loạt các phản ứng
enzyme được phối hợp trong chu trình axit xitric để sản xuất ATP từ các chất
chuyển hóa glucose. Ngày nay, enzyme học là một phần trung tâm của nghiên
cứu sinh hóa.
2.1.3. Cấu trúc chung của enzyme
Enzyme là một chuỗi axit amin tuyến tính, tạo ra cấu trúc ba chiều. Trình
tự các axit amin quy định cấu trúc, từ đó quy định hoạt tính xúc tác của enzim. Khi
đun nóng, cấu trúc của enzyme bị biến tính, dẫn đến mất hoạt tính của enzyme,
thường liên quan đến nhiệt độ.
So với các cơ chất của nó, các enzyme thường lớn với các kích thước khác
nhau, từ 62 gốc axit amin đến trung bình 2500 gốc được tìm thấy trong enzyme
tổng hợp axit béo. Chỉ một phần nhỏ của cấu trúc có liên quan đến xúc tác và nằm
bên cạnh các vị trí liên kết. Vị trí xúc tác và vị trí liên kết cùng nhau tạo thành vị
trí hoạt động của enzyme. Một số lượng nhỏ ribozyme tồn tại đóng vai trị là chất

5


xúc tác sinh học dựa trên RNA. Nó phản ứng phức tạp với protein (Dagmar R,
Gregory A (2008)).
Enzyme cũng có thể bao gồm nhiều hơn một chuỗi polypeptide đơn lẻ. Mỗi
chuỗi polypeptide được gọi là tiểu đơn vị và có thể có chức năng xúc tác riêng

biệt. Một số enzyme có các nhóm phi protein cần thiết cho hoạt động của
enzyme. Các ion kim loại và các phân tử hữu cơ được gọi là coenzyme là thành
phần của nhiều enzyme. Các coenzyme được gắn chặt hoặc cộng hóa trị với các
enzyme được gọi là các nhóm giả. Các nhóm giả chứa các nhóm hóa học quan
trọng cho phép xảy ra sự kiện xúc tác tổng thể.
Các enzyme liên kết các chất phản ứng của chúng (cơ chất) tại các nếp gấp
và khe hở đặc biệt trong cấu trúc của chúng được gọi là vị trí hoạt động "acitve
site". Bởi vì các vị trí hoạt động có các nhóm hóa học được định vị và định hướng
chính xác để liên kết với chất nền, nên chúng thường thể hiện tính đặc hiệu của
chất nền ở mức độ cao. Vị trí hoạt động của một enzyme bao gồm hai vùng
chính. Vị trí xúc tác, tương tác với cơ chất trong quá trình phản ứng và vị trí liên
kết, các nhóm hóa học của enzyme liên kết với cơ chất để cho phép tương tác hóa
học tại vị trí xúc tác (Bugg TD, 2004).
Mặc dù chi tiết về các vị trí hoạt động của enzyme khác nhau giữa các
enzyme khác nhau, nhưng vẫn có những điểm chung. Vị trí hoạt động chỉ
chiếm một phần nhỏ trong tổng khối lượng protein. Lý do enzyme quá lớn là
cần nhiều tương tác cho phản ứng. Các kẽ hở của vị trí hoạt động tạo ra một
mơi trường vi mơ rất quan trọng cho q trình xúc tác. Các yếu tố mơi trường
bao gồm tính phân cực, tính kỵ nước và sự sắp xếp chính xác của các nguyên
tử và nhóm hóa học. Năm 1890 Emil Fischer đã so sánh mối quan hệ enzymecơ chất như khóa-chìa khóa "lockand-key". Fischer cho rằng vị trí hoạt động
và enzyme có hình dạng ba chiều bổ sung cho nhau. Mơ hình này đã được mở
rộng bởi Daniel Koshland Jr. Vào năm 1958 bằng mơ hình "induced fit" của

6


ông, lý do là các vị trí hoạt động chỉ phù hợp với hình dạng của chất nền sau
khi chất nền được liên kết.
2.1.4. Chức năng của enzyme
Xét chất phản ứng hóa học đơn giản, chất phản ứng khơng xúc tác là A,

sản phẩm là B.
Khi tăng nồng độ chất phản ứng A thì tốc độ tạo thành sản phẩm B tăng. Tốc độ
phản ứng được định nghĩa là số phân tử B được tạo thành trong một đơn vị thời
gian. Với sự có mặt của chất xúc tác, tốc độ phản ứng được tăng tốc. Để chất phản
ứng được chuyển đổi thành sản phẩm, phải vượt qua hàng rào năng lượng nhiệt
động lực học. Hàng rào năng lượng này được gọi là năng lượng hoạt
hóa “activation energy” (Ea). Chất xúc tác tăng tốc q trình hóa học bằng cách
giảm Ea mà chất phản ứng phải đạt được trước khi được chuyển đổi thành sản
phẩm. Nó thực hiện điều này bằng cách cho phép một cơ chế hoặc con đường hóa
học khác có năng lượng kích hoạt thấp hơn.
Enzyme có khả năng xúc tác cao, tính đặc hiệu cơ chất cao và thường hoạt động
mạnh nhất trong dung môi nước ở nhiệt độ nhẹ và pH sinh lý. Có hàng ngàn
enzyme đã biết, nhưng gần như tất cả đều có thể được phân loại theo hoạt động
sinh học của chúng thành sáu loại chính: oxyoreductase, transferase, hydrolase,
lyase, isomerase và ligase. Hầu hết các enzyme xúc tác cho việc chuyển electron,
nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử và được đặt tên tùy theo loại phản ứng (theo Liên
minh Hóa sinh và Sinh học Quốc tế).
2.1.5. Các yếu tố ức chế enzyme
Các enzyme không bị tiêu hao trong các phản ứng mà chúng xúc tác và có
thể được sử dụng nhiều lần, nên chỉ cần một lượng rất nhỏ enzyme để xúc tác một
phản ứng. Một phân tử enzyme điển hình có thể chuyển đổi 1.000 phân tử cơ chất
mỗi giây. Tốc độ của một phản ứng enzyme tăng lên khi tăng nồng độ cơ chất,
đạt tốc độ cực đại khi tất cả các vị trí hoạt động của các phân tử enzyme được

7


tham gia. Sau đó, enzyme được cho là đã bão hòa, tốc độ của phản ứng được xác
định bởi tốc độ mà các vị trí hoạt động có thể chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm.
Hoạt động của enzyme có thể bị ức chế theo nhiều cách khác nhau:

• Ức chế cạnh tranh: xảy ra khi các phân tử rất giống với các phân tử cơ
chất liên kết với vị trí hoạt động và ngăn chặn sự liên kết của cơ chất thực tế.
Ví dụ: penicillin là một chất ức chế cạnh tranh ngăn chặn vị trí hoạt động của một
loại enzyme mà nhiều vi khuẩn sử dụng để xây dựng thành tế bào của chúng .
• Ức chế khơng cạnh tranh: xảy ra khi chất ức chế liên kết với enzyme
tại một vị trí khác với vị trí hoạt động. Trong một số trường hợp ức chế không
cạnh tranh được cho là liên kết với enzyme theo cách ngăn chặn vật lý vị trí hoạt
động bình thường. Trong những trường hợp khác, sự liên kết của chất ức chế
được cho là làm thay đổi hình dạng của phân tử enzyme, do đó làm biến dạng
trung tâm hoạt động của nó và ngăn khơng cho nó phản ứng với cơ chất của
nó. Loại ức chế khơng cạnh tranh sau này được gọi làức chế allosteric; nơi chất
ức chế liên kết với enzyme được gọi là vị trí dị lập thể.
Ngồi ra các điều kiện của phản ứng có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của các
enzyme. Enzyme đặc biệt quan tâm đến các điều kiện tối ưu được cung cấp cho
các phản ứng như nhiệt độ, pH, sự thay đổi nồng độ cơ chất, v.v …
Thông thường, các hoạt động của enzyme được tăng tốc khi tăng nhiệt độ. Vì các
enzyme hoạt động trong tế bào nên điều kiện khả thi đối với gần như tất cả các
enzyme là nhiệt độ vừa phải. Ở nhiệt độ cao hơn, với một điểm cụ thể, hoạt tính
giảm mạnh cùng với sự biến tính của enzyme. Trong dung dịch pha lỗng,
enzyme tinh khiết biến tính nhanh chóng so với enzyme trong dịch chiết thơ. Sự
biến tính của enzyme cũng có thể xảy ra khi ủ enzyme trong thời gian dài. Thích
hợp hơn là sử dụng khoảng thời gian ngắn hơn khi nói đến thời gian ủ để đánh
giá vận tốc bắt đầu của các phản ứng enzyme như vậy.

8


Liên minh Hóa sinh và Sinh học Quốc tế (IUBMB) đề xuất nhiệt độ xét nghiệm
tiêu chuẩn là 30 °C. Hầu như tất cả các enzyme đều cực kỳ nhạy cảm với sự thay
đổi pH. Chỉ một số enzyme hoạt động khả thi với độ pH trên 9 và dưới 5. Hầu hết

các enzyme có độ pH – tối ưu gần với mức trung tính. Bất kỳ sự thay đổi nào về
độ pH đều làm thay đổi trạng thái ion của dư lượng axit amin trong toàn bộ protein
và ở vị trí hoạt động. Các sửa đổi ở trạng thái ion có thể sửa đổi xúc tác và liên
kết cơ chất. Việc ưu tiên nồng độ cơ chất là rất quan trọng vì ở nồng độ thấp hơn,
tốc độ được điều khiển bởi nồng độ, tuy nhiên, ở nồng độ cao, tốc độ không phụ
thuộc vào bất kỳ sự gia tăng nào về nồng độ của chất nền.
2.1.6. Quy ước đặt tên enzyme
Enzyme được biết đến với tính đặc hiệu của chúng; nghĩa là chúng thường
chỉ tương tác với một cơ chất để xúc tác cho một phản ứng cụ thể. Do đó, các
enzyme thường được đặt tên bằng cách thêm hậu tố -ase vào tên của cơ chất (ví
dụ: lactase là enzyme xúc tác quá trình phân hủy đường sữa). Không phải tất cả
các enzyme đều được đặt tên theo cách này, vì vậy một phương pháp đặt tên chính
thức hơn đã được phát triển để phân loại enzyme.
Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử Quốc tế đã phát triển một danh
pháp cho các enzyme, được gọi là số EC. Số EC mô tả từng enzyme bằng cách
sử dụng một chuỗi gồm bốn số, trước "EC". Số đầu tiên phân loại rộng rãi enzyme
dựa trên cách thức hoạt động của nó để xúc tác phản ứng.
Theo hệ thống này, các enzyme được tổ chức rộng rãi thành sáu loại chính,
dựa trên các loại phản ứng mà chúng xúc tác:
• EC

1: Oxidoreductase xúc tác các phản ứng oxy hóa /khử, liên quan đến

chuyển điện tử.
• EC 2: Transferase chuyển một nhóm hóa học được gọi là nhóm chức năng

(ví dụ: nhóm methyl hoặc nhóm phốt phát) từ chất này sang chất khác.
• EC 3:

Hydrolases xúc tác sự phân cắt các liên kết hóa học thơng qua việc

bổ sung quá trình thủy phân phân tử nước.

9


• EC 4: Lyase tách các liên kết khác nhau bằng các phương pháp khác ngồi

q trình thủy phân và oxy hóa.
• EC

5: Isomerases transfer chuyển một nhóm trong một phân tử để tạo

thành một đồng phân.
• EC

6: Ligases nối hai phân tử bằng liên kết cộng hóa trị.

2.2. Enzyme protease
2.2.1. Lịch sử nghiên cứu
Từ trước thế kỉ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các qui trình enzim
trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia, rượu...tuy nhiên, việc ứng dụng
enzim trong giai đoạn này hoàn tồn có tính chất kinh nghiệm thuần túy. Từ thế
kỉ 17 đến thế kỉ 19, người ta đã đề ra được khái niệm lên men. Vanhelmont, người
Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được sự tạo thành các chất khí khác với khơng
khí trong q trình lên men. Năm 1659, Silvius lần đầu tiên đã chỉ ra rằng tất cả
các q trình sống đều là những q trình hóa học. Năm 1787, Pabroni cho rằng
bản chất quá trình lên men và sự phân giải một chất này bởi một chất khác là
“ferment”. Năm 1876, Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học
là enzim. Trong số tất cả các enzim của hệ tiêu hóa thì protease là enzim được

nghiên cứu sớm hơn tất cả. Các protease ở động vật được nghiên cứu sớm nhất.
Từ thế kỉ 18, nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát
hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1836,
Schwann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị. Tuy nhiên, 30
năm sau mới tách được enzim này. Năm 1857, Corvisar đã tách được tripsin từ dịch
tụy, đây là protease đầu tiên nhận được dưới dạng chế phẩm, những chế phẩm này
vẫn còn lẩn nhiều enzim và protein khác. Năm 1861, Brucke đã tách được pepsin từ
dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết. Năm 1862, Danilevxki dùng phương
pháp hấp phụ trên colodion đã tách được tripsin với amylase tụy tạng. Năm 1872,
Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin (renin).

10


Ngồi ra cũng có một số nghiên cứu về protease trong máu. Schmidt (18691872) đã nêu giả thuyết rằng trong máu có enzim fibrin tham gia vào q trình
làm đơng máu. Tác giả cũng đã tách enzim này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm
thu được có tác dụng làm fibrinogen đơng lại nhanh chóng.
Năm 1874, Group Besanez cơng bố đã thu nhận được protease từ hạt của
một số loại hạt đậu đều có hoạt tính phân giải protein. Năm 1879, Wurtz được
xem là người đầu tiên tách được protease ở thực vật. Ông thấy rằng các phần khác
nhau của cây đu đủ có protease, khi dùng cồn kết tủa sẽ nhận được chế phẩm
không tinh khiết (100g/cây) gọi là papain. Đến nữa đầu thế kỉ 20, người ta mới
phát hiện thêm các peptid hydrolase khác như: Bromelin protease có trong các
phần khác nhau của cây dứa (Willstatter, Grassmanm, Ambros 1926), Fixin
protease có trong các cây thuộc giống Ficus (Walti, 1938).
Bảng 2.1. Một số cơng trình thu protease từ vi sinh vật
Tên enzyme & nguồn vật liệu

Tác giả

Năm

Subtilizin A (Bacillus subtilis)

Guntelberg và Ottensen

1950

Peptidase A (Streptococus)

Elliot

1950

Protease kiềm (Aspergillus oryzae)

Crewther và Lennox

1950

Aspergilopeptidase A (Aspergillus satoi)

Yoshida

1956

Protease kiềm (Pseudomonas aeruginosa)

Morihara

1957

Subtilopeptidase C

Hagihara và et al

1958

Keratinase (Streptomyces fradiae)

Nickerson, Durand

1963

Elastase (Pseudomonas aeruginosa)

Morihara Tsuzuki

1965

Protease (Arthrobacter)

Hofsten và et al

1965

Protease trung tính II (Bacillus

Tsuru và et al

1966

( Bacillus amyloliquefaciens )

amylosacchariticus)

11


Trong khi đó các protease của vi sinh vật chỉ được chú ý nghiên cứu từ
năm 1950, mặc dù từ năm 1918-1919, Waksman đã phát hiện được khả năng phân
giải protein của xạ khuẩn. Trong vài chục năm sau đó, số cơng trình nghiên cứu
protease của vi sinh vật đã phát triển nhanh chóng. Một số cơng trình thu protease
từ vi sinh vật đã được lược giản trong bảng trên:
Nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease với số lượng lớn. Các
enzim này có thể ở trong tế bào (nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy
(ngoại bào). Vi sinh vật là nguồn sản xuất protease tương đối l y tưởng vì nó có
khá nhiều ưu điểm so với các nguồn khác như động vật và thực vật.
2.2.2. Sự phân giải protein (quá trình thối rữa)
Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là thành
phần quan trọng của xác động thực vật và vi sinh vật. Protein thường chứa khoảng
15 – 17 % nitơ (tính theo chất khơ). Nếu như tổng lượng cacbon trong cơ thể sinh
vật sống trên mặt đất là khoảng 7 tỷ tấn thì tổng lượng nitơ sinh ra cũng tới 10 –
25 tỷ tấn. Trong lớp đất sâu 30cm bao quanh trái đất và người ta cịn thấy thường
xun có khoảng 3 – 7,5 tỷ tấn nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu
cơ chứa nitơ. Sự phân giải các hợp chất chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nơng
nghiệp và đối với vịng tuần hồn vật chất trong tự nhiên. Người ta gọi quá trình
này là quá trình amon hóa.
Muốn phân giải protein cũng như đối với các hợp chất cao phân tử khác, đầu tiên
vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hóa

protein thành các hợp chất có phân tử lượng nhỏ hơn (các polypeptid và các
olygopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục được phân hủy thành axitamin nhờ các
peptidase ngoại bào, hoặc được xâm nhập 12 ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó
mới chuyển hóa thành axit amin. Một phần các axit amin này được các vi sinh
vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp
tục phân giải theo những con đường khác để sinh ra NH3, CO2 và những sản phẩm
trung gian khác (Thomas E Creighton (1993).

12


Những vi sinh vật khơng có khả năng sinh ra những enzyme phân giải protease
ngoại bào rõ ràng là không có khả năng đồng hóa được các loại protein thiên
nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng các sản phẩm thủy phân của protease
(polypeptide, oligopeptid, axit amin). Các loài thuộc giống Bacillus (B.subtilis,
B.mesentericus, B.megaterium, …) có khả năng amon các hợp chất hữu cơ có
chứa nitơ. Chúng là những vi sinh vật đầu tiên tham gia vào quá trình phân cắt
các protein để tạo thành những chất có phân tử lượng thấp hơn cho các vi sinh vật
khác dễ sử dụng (Yu-Zhong Zhang et al., 2020).
2.2.3. Các phâm nhóm của protease
❖ Theo phân loại quốc tế: protease có 4 nhóm phụ:
• Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptid ở đầu Nitơ
của mạch polypeptid.
• Cacboxypeptidase: xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon
của mạch polypeptid.
• Dipeptihydrolase: xúc tác cho việc thuỷ phân các liên kết dipeptid.
• Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
❖ Phân loại dựa vào trung tâm hoạt động của enzyme (Barrett-1984):
Theo Barrett, protease được chia thành 4 nhóm nhỏ, tên của các nhóm này gồm
tên của các axit amin quan trọng nhấtcó vai trị xúc tác trong trung tâm hoạt động

của enzim.
•

Protease serine: là những protease có nhóm (-OH) của serine trong

trung tâm hoạt động. Các protein serine này thường hoạt động ở vùng pH kiềm
và có tính đặc hiệu tương đối rộng.
•

Protease cystein: là các protein có nhóm thiol (-SH) của axit amin

cystein ở trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm
hoạt động của enzim, vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gia nhiều
biến đổi hoá học.

13


•

Protease aspartic: là những protease chứa nhóm (- COOH) trong trung

tâm hoạt động. Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng pH là axit, bị ức chế
bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các
axit amin có vịng thơm hoặc axit amin kị nước ở cả hai phía của liên kết peptit
bị thủy phân.
•

Protease kim loại: Là những protease mà trong trung tâm hoạt động

của chúng có những ion kim loại. Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng pH
trung tính.
❖ Phân loại dựa theo pH tối ưu cho q trình hoạt hóa:
• Protease acid: hoạt động trong khoảng 2-4. Chúng được sử dụng trong y
học, trong q trình tiêu hóa protein đậu nành cho sản xuất nước tương và phá vỡ
gluten lúa mì trong ngành làm bánh. Trong đó rennin là một protease từ nấm được
sử dụng chủ yếu trong sản xuất pho mát.
• Protease base: hoạt động trong khoảng 8-9. Những enzyme này chứa
serine tại vị trí hoạt động của chúng. Chúng được sử dụng trong chất tẩy rửa. Các
protease loại này có nhiều tính năng hấp dẫn ứng dụng trong cơng nghiệp tẩy rửa.
• Protease trung tính pH 7. Chúng khơng ổn định và canxi, natri, clorua
phải được thêm vào để có độ ổn định tối đa. Phạm vi hoạt động của pH khá hẹp.
Các protease trung tính cũng bị bất hoạt bởi các protease kiềm. Vì những điều
này hạn chế, họ đã hạn chế ứng dụng cơng nghiệp, nhưng tìm thấy một số ứng
dụng trong da công nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm.
2.2.4. Các nguồn cung cấp protease hiện nay
❖ Protease từ thực vật
Việc sử dụng thực vật như một nguồn protease bị chi phối bởi một số yếu tố như
sự sẵn có của đất đai để canh tác và sự phù hợp của điều kiện khí hậu cho sự phát
triển. Hơn nữa, sản xuất protease từ thực vật là một quá trình tốn nhiều thời gian.
Pappain, bromelain, keratinase và ficin đại diện cho một số protease nổi tiếng của

14