Phân tích mức độ biểu hiện đặc thù của các gen mã hóa nhân tố phiên mã ahytpp tại các bộ phận chính của cây lạc (arachis hypogaea)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN ĐẶC THÙ CỦA
CÁC GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ AHYTPP
TẠI CÁC BỘ PHẬN CHÍNH CỦA CÂY LẠC
(Arachis hypogaea)

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN ĐẶC THÙ CỦA
CÁC GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ AHYTPP
TẠI CÁC BỘ PHẬN CHÍNH CỦA CÂY LẠC
(Arachis hypogaea)

Ngƣời thực hiện : Nguyễn Tồn Thắng
Khóa

: 63

Ngành

: Cơng nghệ Sinh học

Ngƣời hƣớng dẫn : Ths. Tống Văn Hải
TS. Chu Đức Hà

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đã thực hiên trực tiếp các nghiên cứu trong khóa luận
này. Mọi kết quả thu được đều là nguyên bản không chỉnh sửa hoặc sao chép từ
những nghiên cứu khác. Các số liệu, kết quả của khóa luận này đều chưa từng
được cơng bố.
Tơi xin hoàn toàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên!
Hà nội, ngày....tháng....năm...
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Toàn Thắng

i


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, ngồi sự cố gắng của bản
th n tơi đã nhận được r t nhiều sự gi p đ và h trợ, nh n dịp này tôi xin t l ng
biết n vô c ng s u sắc tới cô Ths. Tống V n Hải - Bộ môn Sinh học ph n tử và
Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông
Nghiệp Việt Nam và thầy TS. Chu ức Hà - Khoa Công nghệ Nông nghiệp,
học Công nghệ,

i

i học Quốc gia Hà Nội về những hướng d n tận tình, chu đáo

bên c nh những kiến thức xã hội b

ch khác.

Bên c nh đó, tơi cũng xin ch n cảm n sự gi p đ quý báu, nhiệt tình
của tập th cán bộ thuộc bộ môn Sinh học ph n tử - Viện Di truyền Nơng
nghiệp, là n i tơi đã tiến hành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Cuối c ng, tơi xin cảm n sự gi p đ của các thầy cô trong Bộ môn Sinh
học ph n tử và Công nghệ sinh học ứng dụng - Khoa Công nghệ sinh học - Học
viện Nơng Nghiệp Việt Nam.
Hà Nội, ngày....tháng....năm...
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tồn Thắng

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM OAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
TĨM TẮT ........................................................................................................... vii

PHẦN I: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. T nh c p thiết của đề tài ................................................................................. 1
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1 T ng quan về c y l c....................................................................................... 3
2.2. Lịch sử nguồn gốc xu t xứ và ph n bố của c y l c. ...................................... 3
2.3. ặc đi m hình thái ......................................................................................... 4
2.4. Vai tr của l c. ............................................................................................... 5
2.5. Tình hình sản xu t và ph n bố của c y l c. ................................................... 6
2.5.1. Tình hình sản xu t và ph n bố c y l c trên thế giới. .................................. 6
2.5.2. Tình hình sản xu t và ph n bố c y l c t i nước ta. ..................................... 7
2.6. Một vài nét về họ TPP và vai tr của họ TPP trong quá trình sinh trưởng
và phát tri n của thực vật .............................................................................. 8
2.6.1. Một vài nét về họ TPP ................................................................................. 8
2.6.2. Q trình chuy n hố Cacbohydrate ở thưc vật bởi TPP........................... 8
2.6.3. Vai tr của TPP đối với quá trình sinh trưởng và phát tri n của thực
vật. ............................................................................................................... 10
2.7. Tình hình nghiên cứu về TPP ở Việt Nam và trên thế giới ......................... 10
2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................ 10
2.7.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt nam. ............................................................ 11
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ............................................................................................................ 13

iii


2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 13
2.2. Vật liệu nghiên cứu và phư ng pháp ghiên cứu .......................................... 13
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 13
2.2.2. Phư ng pháp nghiên cứu........................................................................... 13
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 18

3.1. Kết quả ph n lo i và định danh các gene thuộc họ AhyTPP ....................... 18
3.2.a. Kết quả ph n t ch đặc t nh lý hóa của AhyTPP ở l c ................................ 20
3.2.b Dự đoán cư tr nội bào của họ AhyTPP ở l c. .......................................... 23
3.3. X y dựng s đồ hình c y của họ AhyTPP ở l c .......................................... 24
3.4 Ph n t ch bi u hiện đặc th của nhóm gen mã hóa AhyTPP ở các bộ
phận ch nh trên c y l c................................................................................ 26
PHẦN IV. KẾT LUẬN ..................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 36

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Kết quả định danh và ch giải họ AhyTPP ở c y l c ............................ 18
Bảng 2. Chỉ số đặc t nh lý hoá của các gen TPP ở l c. ....................................... 21
Bảng 3. Dự đoán vị tr cư tr nội bào của họ AhyTPP ở l c. ............................. 23

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. ặc đi m hình thái ở c y l c .................................................................... 4
Hình 2. Thành phần dinh dư ng có trong 100g l c .............................................. 6
Hình 3. Quá trình sinh t ng hợp TREHALOSE và vai tr của nó trong q
trình chuy n hố CARBOHYDRATE ...................................................... 9
Hình 4. Phư ng pháp ph n lo i và tìm kiếm các thành viên thuộc họ TPP ở
c y l c...................................................................................................... 14
Hình 5. Phư ng pháp định danh và ch giải của họ AhyTPP bằng cơng cụ
BlastP ...................................................................................................... 14
Hình 6. Phư ng pháp ph n t ch đặc t nh lý hố của AhyTPP ở l c.................... 15

Hình 7. Phư ng pháp ph n t ch cư tr nội bào ................................................... 16
Hình 8. Phư ng pháp x y dựng s đồ hình c y của họ AhyTPP ở l c ............... 17
Hình 9. Số lượng các gene TPP ở một số lồi thực vật ...................................... 20
Hình 10. ặc t nh gDNA của họ AhyTPP ở l c ................................................. 22
Hình 11. S đồ hình c y của họ AhyTPP ở l c................................................... 25
Hình 12. Bi u hiện của nhóm gen mã hóa TPP trên các c quan/bộ phận ch nh
của c y l c dựa vào dữ liệu microarray trên PeanutBase và GEO NCBI .... 26

vi


TÓM TẮT
Trehalose-6-phosphate phosphatase (TPP) là enzyme x c tác cho quá
trình sinh t ng hợp trehalose, một d ng disaccharide quan trọng liên quan đến
sinh trưởng và phát tri n của thực vật. Trong nghiên cứu này, thông tin về nhóm
TPP đã được ph n t ch trên đối tượng c y l c (Arachis hypogaea). Cụ th , t ng
số 17 thành viên của nhóm AhyTPP đã được xác định trong hệ tham chiếu của
hệ gen c y l c. Ph n t ch đặc t nh lý hoá của các thành viên nhóm AhyTPP th y
được rằng các gene này có t nh axit và trung t nh, ưa nước. ề tài đã đưa ra vị tr
dự đoán của các thành viên thuộc nhóm gen AhyTPP t i tế bào ch t. Tiếp theo
đề tài đã x y đựng hình c y của họ AhyTPP ở l c. Kết quả cho th y các cặp gen
lặp trong nhóm gen ArahyTPP có xu hướng bi u hiện đặc th ở t nh t 1 c
quan/bộ phận ch nh trong quá trình sinh trưởng và phát tri n của c y l c. Tóm
l i, kết quả của nghiên cứu này đã cung c p những d n luận quan trọng trong
việc đề xu t gen ứng viên phục vụ ph n t ch chức n ng gen

vii


PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1. Tính cấp thiết của đề tài
L c (Arachis hypogaea) là một c y trồng quan trọng của ngành nông
nghiệp, ch ng thường được trồng ở những v ng nhiệt đới và cận nhiệt đới, c y
l c được trồng với nhiều mục đ ch khác nhau như là làm lư ng thực, nguyên
liệu cho ch n nuôi và sản xu t, sản xu t nguồn nhiên liệu sinh học và cải t o
đ t,….Trong tiếng anh l c có r t nhiều tên gọi như peanut, goober, pindar,…tên
khoa học của l c là Arachis hypogaea thuộc chi Arachis, họ đậu (Fabaceae), lớp
Hai lá mầm (Dicotylendonae), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) giới thực vật
(Plantae).
Ở Việt Nam, l c là lo i c y ngắn ngày được trồng khá ph biến ở nhiều
địa phư ng, có vai tr r t t ch cực trong cải t o đ t, t ng thu nhập cho người
d n. L c là c y họ đậu th ch nghi nhiều với môi trường sinh thái, ngắn ngày dễ
trồng, thường được sử dụng với nhiều mục đ ch như: làm thực phẩm, thức n
ch n nuôi, ép dầu. Biện pháp lu n canh và xen canh l c trên đ t canh tác được
xem là giải pháp th n thiện với môi trường, đồng thời cũng mang l i giá trị kinh
tế cho nông hộ. Tuy nhiên, sinh trưởng, phát tri n, n ng su t và ch t lượng của
c y l c ở nước ta hiện nay đang chịu bị ảnh hưởng tiêu cực bởi các yếu tố b t lợi
phi sinh học g y ra bởi tình tr ng biến đ i kh hậu. Do đó, làm rõ c chế đáp ứng
với sự thay đ i của điều kiện ngo i cảnh của c y l c thông qua quá trình điều
h a sự bi u hiện của gen đang được quan t m hiện nay.
Trong quá trình sinh trưởng và phát tri n của thực vật, các nh n tố phiên
mã có vai tr quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình sinh trưởng và phát
tri n chống l i các tác động x u của môi trường. Cho đến nay, hầu hết các gen
thuộc hệ gene AhyTPP đã được xác nhận về mặt chức n ng là từ thực vật.
Ch ng có ảnh hưởng quan trọng đến vệc bi u hiện của các bộ phận của c y l c.
Ch nh vì vậy em đã lựa chọn đề tài: “Phân tích mức độ biểu hiện của các gen
mã hoá nhân tố phiên mã AhyTPP tại các bộ phận chính của cây lạc nhằm

1

mơ tả những đặc t nh c bản của nhóm AhyTPP ở c y l c, dự đoán ch nh xác sự
bi u hiện của các nh n tố phiên mã AhyTPP đến các bộ phận của c y l c thơng
qua cơng cụ tin sinh học.
1. Mục đích của đề tài.
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm hi u mức độ bi u hện của các
gen mã hoá nh n tố phiên mã đến các bộ phận quan trọng của c y l c như th n,
rễ, …
Kết quả của nghiên cứu này có th cung c p những d n liệu khoa học
quan trọng cho việc tìm hi u về sự sinh trưởng của c y l c qua đó có th gi p
ch cho việc chọn t o giống nhằm tang n ng su t của c y l c.
2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định và định danh nhóm gen mã hóa AhyTPP trong hệ gen của l c.
- Ph n t ch c u tr c đặc trưng của nhóm gen mã hóa AhyTPP của c y l c.
- Ph n t ch đặc t nh lý hóa của AhyTPP ở c y l c.
- X y dựng s đồ hình c y của AhyTPP ở c y l c.
- Ph

n t ch bi u hiện đặc th của AhyTPP t i các bộ phận ch nh của c y l c.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây lạc.
C y l c có tên khoa học là Arachis hypogaea, thuộc chi Arachis, họ
(Fabaceae), bộ

ậu

ậu (Fabales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) hay lớp Hai lá

mầm (Dicotylendonae), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) hay c n gọi là ngành
h t k n (Angiospermae), giới thực vật (Plantae).
2.2. Lịch sử nguồn gốc xuất xứ và phân bố của cây lạc.
L c là một trong những lo i c y có lịch sử phát tri n l u đời cho đến nay,
có r t nhiều nghiên cứu về nguồn gốc của c y l c, nhưng đều cho th y ch ng bắt
nguồn từ Nam Mỹ và ph n bố từ ông - Bắc Brazil đến T y Nam Argentina, từ
bờ bi n Nam Uruguay đến T y Bắc Mato Grosso.Tuy nhiên, l i có giả thuyết
cho rằng c y l c có lẽ có nguồn gốc l u đời ở Brazil hoặc Peru, mặc d khơng
có hồ s hóa th ch nào tồn t i đ chứng minh điều này, nhưng người ta đã tìm ra
các đồ vật làm bằng gốm, các lọ có hình d ng hoa v n giống như c y l c d ng
đ trang tr được tìm th y cách đ y 3500 n m hoặc l u h n. Ngoài ra, c y l c
c n được mang đến nước Trung Quốc bởi những người thư ng nh n Bồ

ào

Nha vào thế kỷ XVII và nhiều nhà truyền giáo người Mỹ vào thế kỷ XIX, rồi lan
rộng khắp các quốc gia ch u Á. Tuy nhiên theo các ghi chép cho th y rằng phải
đến đầu những n m 1800, c y l c mới được trồng như một lo i c y thư ng m i
ở Hoa Kỳ. Ch ng được trồng lần đầu tiên ở Virginia và được sử dụng chủ yếu
đ làm dầu, thực phẩm và như một ch t thay thế ca cao. Vào thời đi m này, l c
được coi là thức n cho gia s c và người nghèo và được coi là khó trồng và khó
thu ho ch.
Ở Việt Nam, mặc d hiện nay chưa xác minh được c y l c được trồng bắt
đầu từ bao giờ nhưng có th nó được nhập vào Việt Nam từ Trung Quốc vào
khoảng thế kỷ XVII - XVIII. Hiện nay c y l c càng được nghiên cứu rộng rãi,
có khoảng 1000 giống l c khác nhau được trồng khắp các nước v ng nhiệt đới

3

và á nhiệt đới. Do t m n cảm với thời gian chiếu sáng và có t nh chịu h n tốt
cho nên l c được trồng ở nhiều quốc gia trên thế giới từ 40 vĩ độ Bắc đến 40 vĩ
độ Nam.
2.3. Đặc điểm hình thái
a. Đặc điểm hình thái.
L c là loài c y th n thảo, sống hằng n m. Ch ng thuộc lo i c y 2 lá mầm
có hệ rễ cọc. Bao gồm 6 bộ phận ch nh là th n, lá, hoa, rễ, củ và h t.

Hình 1. Đặc điểm hình thái ở cây lạc
Th n c y l c được chia thành nhiều đốt, cao khoảng 30-100 cm, thường
có màu xanh hoặc đ t m, t y vào từng giống mà có lồi trên th n xu t hiện
lông. Tiếp đến là lá và hoa được mọc ra ở những mắt của đốt. C u t o lá kép và
g n lá l c theo hình lơng chim với k ch thước lá dài từ 1-7 cm, rộng từ 1-3 cm.
C y l c có hoa d ng hoa đậu đi n hình màu vàng có đi m g n đ , gồm
2-4 hoa, cuống hoa dài 2–4 cm. L c ra hoa ở trên mặt đ t, là hoa lư ng t nh, có
nhụy và nhị trong một bơng, tuy nhiên sau khi thụ ph n thì hợp tử t o thành l i
phát tri n trong l ng đ t (Hồ ình Hải, 2014).
Rễ cái của c y n s u vào đ t khoảng từ 1-1,4cm, tuy nhiên trung bình là
từ 40-50 cm, có r t nhiều rễ phụ mọc xung quanh rễ cái. C y l c có một đặc
đi m c u t o n i bật ở rễ (đặc đi m ph biến trong các c y thuộc bộ

4

ậu) đó là


khả n ng cộng sinh của rễ với nhóm vi khuẩn cố định đ m có tên khoa học là
Rhizobium vigna (vi khuẩn nốt sần).

Lá kép mọc đối hình lơng chim với 4 lá chét, k ch thước lá chét dài từ 1 7 cm, rộng từ 1 - 3 cm. Số lá có th lên đến 50 - 80 lá đến khi thu ho ch.
Quả d ng quả đậu (củ) trong đ t dài 3-7cm, m i quả chứa 1-4 h t và
thơng thường là 2 h t, có rãnh dọc. Quả l c có hình trụ thn, khơng chia đơi,
thon l i giữa các h t, có v n m ng.
H t có các hình d ng khác nhau, gồm v lụa bao bọc bên ngồi, hình
d ng của h t có th là hình tr n, bầu dục dài hay ngắn, có rãnh dọc và chứa hàm
lượng dầu lên tới 50%. (Trần Danh Sửu, 2017)
b. Đặc điểm di truyền.
L c là một lồi thực vật có đa d ng về di truyền, (2n=20 với k ch thước
chu i bộ gene của l c hoàn chỉnh bao gồm h n 2,5×109 bp) (Zheng et al., 2018).
2.4. Vai trị của lạc.
C y l c đóng góp r t nhiều vai tr là c y công nghiệp, c y thực phẩm,
xu t hiện l u đời và ch ng có giá trị dinh dư ng cao. L c sử dụng làm thực
phẩm cho con người, ch ng cung c p 30 nhóm ch t dinh dư ng thiết yếu và
dinh dư ng thực vật. H t l c chứa 40-50% ch t béo, 24-27% protein và nhiều
khoáng ch t như Ca, Fe, Mg, P, K, Zn c ng với một lượng vitamin lớn, đặc biệt
là vitamin B.
Giá trị dinh dư ng chủ yếu của h t l c mà con người sử dụng là lipid và
protein. Hàm lượng lipid có trong h t l c (40-60%) so với vừng (45-54%) cao
h n nhiều so với đậu tư ng và đậu xanh. Hàm lượng protein có trong c y l c
(26-34%) chỉ đứng sau c y đậu tư ng (40-50%). C y l c c n được d ng làm
nguyên liệu sản xu t cho thức n ch n nuôi gia s c, th n lá làm thành thức n
xanh và việc vận dụng phế liệu từ l c làm thức n cho gia s c. Bên c nh đó, v
l c c n là nguồn cung c p x trong thức n ch n nuôi, đặc biệt là động vật nhai
l i và th .

5


Hình 2. Thành phần dinh dƣỡng có trong 100g lạc

L c có hệ rễ vơ c ng phát tri n, n s u vào đ t. ặc biệt, với hệ vi khuẩn
Rhizobium cộng sinh trong các nốt sần có trên rễ gi p l c có khả n ng cố định
nit , đ m. Ch nh vì vậy, trồng l c có tác dụng đối với sự cải t o đ t, làm t ng
ch t dinh dư ng cho đ t.

iều này có ý nghĩa đặc biệt đối với đ t b c màu. Do

đó, biện pháp lu n canh c y l c và việc chôn v i rễ th n lá sau khi thu ho ch là
biện pháp làm giàu đ m cho đ t có hiệu quả rõ rệt. Ngồi ra c n có th cải thiện
t nh ch t lý hoá của đ t, làm thay đ i pH trong đ t, làm t ng hàm lượng ch t hữu
c , cải thiện thành phần c giới đ t; làm t ng hàm lượng l n và kali (Nguyễn
ức Cường, 2007).
L c c n là nguồn nguyên liệu quan trọng của đ cung c p diesel sinh học.
Các thành phần có trong l c như Carbohydrate, lipid và protein được cho là những
nguyên liệu c sở quan trọng cho sản xu t kh biogas (Gupta et al., 2017).
2.5. Tình hình sản xuất và phân bố của cây lạc.
2.5.1. Tình hình sản xuất và phân bố cây lạc trên thế giới.
L c là một c y trồng quan trọng ch ng được trồng ở nhiều nước nước
trên thế giới trải dài từ 400 Bắc đến 400 Nam, đã được nhiều quốc gia quan t m,

6


nghiên cứu, lai t o ra các lo i giống cho n ng su t ch t lượng cao, là nguồn
nguyên liệu cho các ngành chế biến và công nghiệp, t ng hiệu quả kinh tế. Ở các
v ng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới l c là loài c y l y dầu được trồng
nhiều nh t. Sản lượng l c trên thế giới n m 2015 là 37.535.000 Tg (triệu t n),
với 52,9% được sử dụng cho tiêu d ng trong nước, 44% được nghiền đ l y dầu,
và sự th t thoát trong quá trình chế biến (FAOSTAT, 2018).
2.5.2. Tình hình sản xuất và phân bố cây lạc tại nƣớc ta.

Ở nước ta c y l c là c y trồng l u n m, là c y l y dầu đứng thứ nh t về
diện t ch, sản lượng và xu t khẩu, hàng n m đóng góp khá lớn vào t ng mức giá
trị kim ng ch xu t khẩu nông sản của nước ta.
Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát tri n nơng thơn (10/2019),
Việt Nam có n m v ng sinh thái có diện t ch gieo trồng l c lớn đó là duyên hải
Nam Trung Bộ (31,018 ha),

ông Nam Bộ (6826 ha), đồng bằng sông Cửu

Long (6732 ha), Bắc Trung Bộ (2293 ha), trung du và miền n i ph a Bắc (1152
ha). Diện t ch c n l i ph n bố nhiều n i trên cả nước và l c được gieo trồng ở
42/64 tỉnh thành. Trong đó, mười tỉnh có diện t ch gieo trồng l c lớn là T y
Nguyên (10,437 ha), Quảng Nam (10,000 ha), Bình
Ngãi (6241 ha),

ịnh (9500 ha), Quảng

ắk Lắk (5100 ha), T y Ninh (4939 ha), Trà Vinh (4500 ha),

Bình Thuận (4307 ha), ắk Nơng (3500 ha), Gia Lai (1600 ha).
Tuy nhiên theo các n m gần đ y diện t ch trồng l c của cả nước có d u
hiệu giảm thế nhưng n ng xu t l i có d u hiệu t ng. Thơng qua sự tiến bộ của
khoa học kỹ thuật các giống l c ở nước ta được cải t o về giống d n đến t ng
n ng xu t, t ng khả n ng chống chịu với các điều kiện b t lợi và s u bệnh h i
nhờ đó làm t ng n ng xu t và sản lượng của c y l c trên cả nước.

7


2.6. Một vài nét về họ TPP và vai trò của họ TPP trong quá trình sinh

trƣởng và phát triển của thực vật
2.6.1. Một vài nét về họ TPP
T6PP (Trehalose-6-photphat phosphatase) là một thành viên thuộc siêu
họ haloacid dehalogenase (HAD) đ y là siêu họ chứa nhiều protein tham gia và
các q trình chuy n hố cũng như là ch t x c tác cho r t nhiều quá trình ở cả
sinh vật nh n s và sinh vật nh n chuẩn. T6PP sở hữu miền lõi có nếp g p α/βhydrolase đã biết, đặc trưng của họ HAD và miền nắp, với nếp g p c p ba bao
gồm một β bốn sợi với hai xoắn ốc α ở một bên. Ion magiê t i vị tr ho t động và
ph n tử glycerol liên kết t i giao diện giữa hai miền cung c p thông tin chi tiết
về phư ng thức liên kết c ch t của T6PP. Trehalose-6-photphat phosphatase
x c tác quá trình khử phospho của trehalose-6-photphat (T6P) thành trehalose và
orthophotphat. Trehalose, một disacarit ph biến của vi khuẩn, n m và động vật
không xư ng sống, r t quan trọng đối với sự sống của sinh vật trong điều kiện
c ng thẳng.
2.6.2. Quá trình chuyển hoá Cacbohydrate ở thƣc vật bởi TPP.
Các lo i đường, bao gồm trehalose và quan trọng h n là T6P đã được đề
xu t ho t động như các ph n tử t n hiệu điều chỉnh nhiều quá trình trao đ i ch t
và phát tri n quan trọng ở thực vật (Paul et al., 2008 ). Cụ th h n, T6P đã được
chứng minh là điều chỉnh việc sử dụng sucrose trong thực vật. Các d ng
Arabidopsis biến đ i gen bi u hiện gen E. coli TPS (otsA) hoặc TPP (otsB) cho
th y sự khác biệt trong t ch lũy T6P và phản ứng khác nhau với sucrose ngo i
sinh. Nhìn chung, khả n ng sử dụng sucrose của những c y này t ng lên khi t ng
nồng độ T6P (Schluepmann et al., 2004). Ngược l i, người ta th y rằng lượng
T6P tư ng ứng m nh mẽ với lượng sucrose có sẵn trong các lo i c y d i
Arabidopsis. Lunn et al. (2006) cho th y rằng việc b sung sucrose nhanh chóng
g y ra T6P trong c y con bị thiếu carbon. Sự gia t ng nhanh chóng của T6P đ
đáp ứng với sucrose ngo i sinh có th là do sự gia t ng lượng glucose-6-

8

phosphate (G6P) và UDP-glucose (UDPG) có sẵn, đã được chứng minh là r t
quan trọng trong việc xác định sự t ng trưởng và sinh khối của thực vật. t ch lũy
(Meyer et al., 2007 ). Do đó, T6P gián tiếp phản ánh nồng độ sucrose và hiện đã
được ch p nhận rộng rãi như một chỉ báo về tình tr ng sucrose trong thực vật.

Hình 3. Quá trình sinh tổng hợp TREHALOSE và vai trị của nó trong q
trình chuyển hố CARBOHYDRATE
Ngồi ra T6P cũng được chỉ ra rằng tham gia điều chỉnh q trình
chuy n hố tinh bột ở thực vật. Ở c y Arabidopsis, kết hợp với trehalose ngo i
sinh g y ra sự t ch tụ tinh bột bằng cách t ng ho t động của ADP-glucose
pyrophosphorylase (AGPase), một lo i enzyme ch nh ki m sốt q trình t ng
hợp tinh bột (Wingler et al., 2000). Người ta cũng chứng minh rằng T6P, được
t ng hợp bởi TPS1, được dự đoán là chủ yếu khu tr trong tế bào ch t, th c đẩy
ho t hóa AGPase trong lục l p thơng qua phản ứng oxy hóa khử qua trung gian
thioredoxin (Kolbe et al., 2005). Nồng độ sucrose t ng, đi kèm với sự gia t ng
nồng độ T6P, cũng d n đến t ng t ng hợp tinh bột thông qua k ch ho t AGPase
(Lunn et al., 2006).

9


2.6.3. Vai trị của TPP đối với q trình sinh trƣởng và phát triển của thực
vật.
Nhóm TPP tồn t i rộng rãi trong nhiều lo i thực vật khác nhau và tham
gia vào quá trình sinh trưởng và phát tri n của thực vật, bao gồm quá trình
truyền t n hiệu, điều chỉnh q trình đồng hóa carbon và tình tr ng đường trong
thực vật, tham gia hình thành hoa, sự ch n quả, quá trình phát tri n h t.

ặc biệt

các gene thuộc nhóm TPP phản ứng với nhiều điều kiện c ng thẳng phi sinh
học/sinh học, v dụ như h n hán, độ mặn cao, nhiệt độ... Qua đó có th th y rằng
TPP có một vai tr vơ c ng to lớntrong q trình sinh trưởng cũng như phát
tri n của c y trồng.
2.7. Tình hình nghiên cứu về TPP ở Việt Nam và trên thế giới
2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
N m 2008 Liang và cộng sự đã tìm ra 1 họ gen TPP lớn có ở c y l a là
OsTPP1 qua xử lý với muối và ABA được xử lý từ từ trong điều kiện l nh thì
OsTPP1 đã có bi u hiện k ch th ch các gen phản ứng chịu l nh ở c y l a. Qua đó
cung c p thông tin về việc sử dụng OsTPP1 trong kỹ thuật ứng xu t phi sinh học
ở c y trồng (Liang et al, 2008)
Julia Krasensky và cộng sự vào n m 2014 đã có nghiên cứu chỉ ra rằng
AtTPPD là một enzym khu tr t i bên trong lục l p. Thực vật thiếu AtTPPD quá
m n cảm, trong khi những c y có bi u hiện quá mức AtTPPD l i chịu được
stress mặn cao h n. Khả n ng chịu stress cao của AtTPPD bi u hiện quá mức
tư ng quan với mức tinh bột cao và t ng t ch tụ đường h a tan, cho th y vai tr
của AtTPPD trong việc điều chỉnh chuy n hóa đường trong điều kiện mặn. Các
ph n t ch sinh hóa chỉ ra rằng AtTPPD là mục tiêu của q trình điều h a oxy
hóa khử sau dịch mã và có th bị b t ho t một cách thuận nghịch bởi các điều
kiện oxy hóa. Hai gốc cysteine được xác định là các vị tr nh y cảm với oxy hóa
khử (Julia K. et al, 2014).

10


Trehalose-6-phosphate phosphatases (TPP), được mã hóa bởi các thành
viên của họ gen TPP ch ng có th cải thiện khả n ng chịu h n của thực vật. Tuy
nhiên c chế ph n tử của của việc này đã được tìm ra bởi nghiên cứu của Lin và
cộng sự vào n m 2019.

Kết luận AtTPPF có chức n ng điều chỉnh mức

trehalose, các lo i phản ứng oxy hoá và đường sucrose trong thời kỳ c y bị c ng
thẳng khô h n, và sự bi u hiện của AtTPPF được k ch ho t bởi DREB1A ở c y
Arabidopsis. Những phát hiện này làm sáng t c chế ph n tử mà AtTPPF điều
chỉnh phản ứng với stress h n hán (Lin et al, 2019).
N m 2021 Yunhan Gao và cộng sự đã có nghiên cứu về TPP trên c y họ
Populus và đã chỉ ra được 13 gen PtTPS và 10 gen PtTPP đã được xác định
trong genome của c y thuộc họ Populus. Ph n t ch phát sinh loài chỉ ra gen
PtTPS và PtTPP đều được chia thành hai ph n họ và các thành viên của 2 ph n
họ thì đều có chung c u tr c intron. Ngoài ra nghiên cứu cũng chỉ ra các gen của
PtTPS và PtTPP có liên quan đến các k ch th ch tố thực vật và phản ứng với
c ng thẳng môi trường (Yuhan G et al., 2021).
Các gen trehalose -6-phosphate phosphatase (TPP) tham gia vào quá
trình chuy n hóa trehalose và cả khả n ng chịu stress cao, Islam và cộng sự đã
có nghiên cứu về các gene của TPP ở c y l a mì (Triticum aestivum L) đã đưa ra
được 31 gene TPP và được ph n thành 5 ph n họ khác nhau. Ngoài ra nghiên
cứu c n chỉ ra sự tham gia của TaTPP trong quá trình phát tri n của l a mì, khả
n ng chống chịu stress và sự già đi của lá (Islam et al, 2021).
2.7.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt nam.
N m 2013 Hoàng Kim Toản và cộng sự đã có nghiên cứu nhằm tìm ra
giống l c có khả n ng giống l c mới cho n ng su t cao, có khả n ng chịu h n và
ph hợp với điều kiện sản xu t ở những v ng không chủ động nước tưới của
tỉnh Thừa Thiên Huế.Kết quả tìm được 2 giống l c có khả n ng chịu h n và cho
n ng su t cao là TQ34 và TQ30

11


N m 2015 Lê V n Trọng và cộng sự đã có nghiên cứu ph n t ch chỉ tiêu

sinh lý của một số giống l c đ tìm ra sự khác biệt giữa ch ng là một trong
những phư ng pháp góp phần vào cơng tác s tuy n giống n ng su t cao, phẩm
ch t tốt, có khả n ng chống chịu tốt với điều kiện b t lợi của mơi trường. Bài
báo trình bày kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý của nhóm giống l c
n ng su t cao và th p trong vụ xu n n m 2013, 2014 và 2015 trồng t i huyện
Triệu S n, tỉnh Thanh Hóa. Kết quả th nghiệm đã chia giống l c theo n ng su t
thực thu thành 3 nhóm, nhóm n ng su t cao: L26 (3,67 t n/ha, giống TB25: 3,50
t n/ha), nhóm n ng su t th p: l c lỳ (n ng su t th p nh t đ t 2,31 t n/ha) và
nhóm n ng su t trung bình: L18, L08, L14, L19, L23. Các giống l c n ng su t
cao th hiện một số chỉ tiêu sinh lý tốt h n so với các giống l c n ng su t th p.
Vào n m 2018 Ph m V n Cường và cộng sự đã có nghiên cứu đánh giá
về khả n ng sinh trưởng và các chỉ tiêu sinh lý khi bị h n ở giai đo n c y con
của 7 giống l c (DM1, DM2, DM3, DM4, HL11, HL22 và LDDL) do Viện Di
truyền Nông nghiệp lai t o và nhập nội. Kết quả cho th y, h n đã ức chế sinh
trưởng và quang hợp, thoát nước và làm giảm m nh khối lượng khô của l c ở
giai đo n c y con. Sự suy giảm các chỉ số này cũng khác nhau ở các giống khác
nhau.

12


CHƢƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
ề tài bao gồm bốn nội dung ch nh đó là:
- Xác định và định danh các thành viên của họ AhyTPP.
- Xác định c u tr c gene và vị tr ph n bố của gene mã hóa AhyTPP.
- Ph n t ch đặc t nh lý hóa và dự đốn vị tr cư tr nội bào của AhyTPP ở l c.
- X y dựng s đồ hình c y và xác định c u tr c khơng gian của nhóm
AhyTPP.
- Ph n t ch bi u hiện đặc th của AhyTPP t i các bộ phận ch nh của c y l c

2.2. Vật liệu nghiên cứu và phƣơng pháp ghiên cứu
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Hệ gene, hệ protein của giống l c mô hình Tifrunner (taxid:3818) trên c sở
dữ liệu NCBI () và phytozome ().
Dữ liệu microarray ph n t ch trên các m u mô c quan/bộ phận ch nh
của giống l c mơ hình Tifrunner (GSE71357) (Clevenger et al., 2016) được thu
thập trên PeanutBase (Cannon et al., 2016) và GEO NCBI.
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp tìm kiếm và định danh các gene thuộc họ gene AhyTPP
ở lạc.
● Phương pháp phân loại và tìm kiếm các gene thuộc họ gene AhyTPP.

xác định t t cả các thành viên thuộc họ TPP ở c y l c, đề tài đã sử
dụng hệ c sở dữ liệu phytozome () nhằm tìm
kiếm các t t cả các trình tự gene và trình tự protein tư ng đồng với v ng bảo thủ
PF02358 từ đó thu được các trình tự protein đầy đủ của của họ AhyTPP các
bước tiến hành được miêu tả cụ th như sau:

13


Hình 4. Phƣơng pháp phân loại và tìm kiếm các thành viên thuộc họ TPP ở
cây lạc
●

Phương pháp định danh và chú giải của họ AhyTPP bằng công cụ BlastP
Các trình tự protein thu được ở phư ng pháp xác định sẽ được đưa qua

công cụ BlastP vào hệ gene của loài l c đ lo i b các gene tư ng đồng và giống
nhau. Các protein được truy v n trên NCBI- National Center for Biotechnology

Information() đ rà soát thơng tin ch giải từ đó ta thu
được các thơng tin như mã định danh, mã protein… đ có th phục vụ những
phư ng pháp tiếp theo.

Hình 5. Phƣơng pháp định danh và chú giải của họ AhyTPP bằng công cụ
BlastP

14


2.2.2.2. Phương pháp phân tích đặc tính lí hố và dự đoán cư trú nội bào của
họ AhyTPP ở lạc.
●

Phương pháp phân tích đặc tính lí hố của họ AhyTPP ở lạc.
Ở protein có một số đặc t nh c bản, bao gồm k ch thước (amino acid),

trọng lượng ph n tử (mW), đi m đẳng điện (pl), độ b t n định (II) và độ ưa
nước (GRAVY) được xác định bằng cách truy v n trình tự protein vào c sở dữ
liệu Expasy Protparam ( (Gasteiger et al.,
2003). Các bước thực hiện được miêu tả cụ th ở hình dưới đ y.

Hình 6. Phƣơng pháp phân tích đặc tính lý hoá của AhyTPP ở lạc
●

Phương pháp dự đoán cư trú nội bào của họ AhyTPP ở lạc
Phư ng pháp dự đoán cư tr nội bào gi p ta dự đoán vị tr của các gene

thuộc họ gene AhyTPP ở l c.

dự đốn ta sử dụng cơng cụ Yloc (https://abi-

services.cs.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi), c ng với đầy đủ trình tự các
chu i protein dưới d ng FASTA của các gene thuộc họ AhyTPP ở l c. Yloc là
công cụ gi p ta dự đốn được vị tr của các gene thơng qua thơng tin từ các
chu i protein được đưa vào từ đó đưa ra vị tr dự đốn. Khơng chỉ vậy Yloc c n
đưa ra lý do t i sao có được dự đoán như vậy. Các chu i protein được định d ng
dưới d ng FASTA sẽ được đưa vào ô cung c p thơng tin, sau đó lựa chọn mơ
hình dự báo Yloc-HighRes, lựa chọn lồi là “Plants sau đó lựa chọn truy v n.
Khi đó ta sẽ thu được kết quả bao gồm vị tr dự đoán, độ tin cậy, xác su t. Các
bước tiến hành được miêu tả dưới hình sau:

15


Hình 7. Phƣơng pháp phân tích cƣ trú nội bào
2.2.2. . Phương pháp ây dựng sơ đ hình cây của họ AhyTPP ở lạc
Các trình tự protein TPP ở c y l c được thu thập đ x y dựng s đồ hình
c y với thuật tốn Neighbor-Joining với giá trị bootstrap=1000, trên công cụ
MEGA11- Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Tamura et al., 2021).
S đồ hình c y của họ AhyTPP ở l c được mô tả bằng cách: Mở phần mềm
MEGA11 chọn Align (Edit/Build Alignment) đ nhập t t cả các trình tự protein
của các gene mã hóa TPP. Chọn “Create a new alignment , tiếp theo chọn “OK ,
trong phần “Datatype for alignment chọn “Protein . Chọn “Alignment (Align by
ClustaIW) sẽ th y bảng gồm các thông số và “OK . Sau đó lưu trình tự đã được
giải mã vào một file. Vào “Data (Open A file/session…) đ mở file protein đã giải
trình tự. Chọn “Phylogeny sau đó chọn “Construct/Test Neighbor-Joining Tree
sẽ ra một bảng thông số và nh n chọn “Compute . Các bước tiến hành được mô tả
như sau:

16