Thiết lập phản ứng multiplex pcr chẩn đoán một số mầm bệnh ký sinh trùng đường máu trên chó, mèo

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
THIẾT LẬP PHẢN ỨNG MULTIPLEX – PCR CHẨN
ĐOÁN MỘT SỐ MẦM BỆNH KÝ SINH TRÙNG
ĐƢỜNG MÁU TRÊN CHÓ, MÈO

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
THIẾT LẬP PHẢN ỨNG MULTIPLEX – PCR CHẨN
ĐOÁN MỘT SỐ MẦM BỆNH KÝ SINH TRÙNG
ĐƢỜNG MÁU TRÊN CHĨ, MÈO

Ngƣời thực hiện

: TRỊNH THỊ LINH CHI

Khóa

: 62

Ngành

: CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn

: PGS. TS. Đồng Huy Giới
PGS. TS. Bùi Khánh Linh

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn này là cơng trình nghiên cứu thực sự của tơi,
đƣợc thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức chuyên ngành và dƣới
sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS. Đồng Huy Giới, PGS. TS Bùi Khánh Linh và TS.
Dƣơng Đức Hiếu.
Các số liệu đƣợc sử dụng, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
hồn tồn trung thực, chƣa từng đƣợc sử dụng và cơng bố trong các cơng trình nghiên
cứu khoa học nào trƣớc đây.
Khóa luận tốt nghiệp có tham khảo các tài liệu, thơng tin trích dẫn đã đƣợc chỉ
rõ ở phần tài liệu tham khảo. Mọi sự giúp đỡ đã đƣợc cảm ơn.
Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trƣớc Học viện và Hội
đồng.
Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Trịnh Thị Linh Chi

i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS.
Đồng Huy Giới, Trƣởng bộ môn Sinh học – khoa Công nghệ Sinh học PGS. TS. Bùi
Khánh Linh, Trƣởng bộ môn Ký sinh trùng, Khoa Thú y và TS. Dƣơng Đức Hiếu –
Giảng viên bộ môn Ký sinh trùng - Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam đã hƣớng dẫn,
tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt q trình học tập và hồn
thành khóa luận.
Tơi cũng muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thế cán bộ của phòng nghiên
cứu - Nghiên Cứu Bảo Tồn Đa Dạng Sinh Học Và Bệnh Nhiệt Đới (BIOD) đã ln tận
tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời
gian thực hiện khóa luận này. Tơi cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến
Ban lãnh đạo và tập thể Viện BIOD và Bệnh viện Thú y Gaia, các đơn vị đã hỗ trợ cho
tơi thực hiện khóa luận này.
Tiếp theo, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô trong Khoa Công nghệ
sinh học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã luôn tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tơi
trong suốt bốn năm đại học.
Cuối cùng, tơi xin đƣợc bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, những ngƣời
thân trong gia đình và tồn thể bạn bè của tơi đã ln giúp đỡ, động viên và đồng hành
cùng tôi trong những năm tháng trên giảng đƣờng đại học.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Trịnh Thị Linh Chi

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ .................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................... viii
TĨM TẮT ............................................................................................................ ix
CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ...................................................................... 2
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN .................................................................................. 3
2.1. Bệnh do đơn bào lê dạng trùng lớn (Babesia vogeli)..................................... 3
2.1.1. Đặc điểm hình thái và phân loại.................................................................. 3
2.1.2. Vòng đời ...................................................................................................... 4
2.1.3. Con đƣờng truyền lây .................................................................................. 6
2.1.4. Dịch tễ học .................................................................................................. 7
2.2. Bệnh do vi khuẩn Anaplasma (Anaplasma phagocytophylum) ..................... 8
2.2.1. Đặc điểm hình thái và phân loại.................................................................. 8
2.2.2. Vòng đời .................................................................................................... 10
2.2.3. Con đƣờng truyền lây ................................................................................ 11
2.3.4. Dịch tễ học ................................................................................................ 11
2.3. Bệnh do vi khuẩn Mycoplasma haemofelis.................................................. 13
2.3.1. Đặc điểm hình thái và phân loại................................................................ 13
2.3.2. Vòng đời .................................................................................................... 15
2.3.3. Con đƣờng truyền lây ................................................................................ 16
2.3.4. Dịch tễ học ................................................................................................ 16
2.4. Bệnh do vi khuẩn Erhlichia canis ................................................................ 17

iii

2.4.1. Đặc điểm hình thái và phân loại................................................................ 17
2.4.2. Vịng đời .................................................................................................... 18
2.4.3. Con đƣờng truyền lây ................................................................................ 18
2.4.4. Dịch tễ học ................................................................................................ 18
2.5. Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction (PCR) ................... 19
2.5.1. Kỹ thuật chiết tách DNA ........................................................................... 19
2.5.2. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR – Polymerase chain reation ................... 19
2.5.3. Các chỉ tiêu ảnh hƣởng đến phản ứng PCR .............................................. 20
2.5.4. Một số kỹ thuật PCR cải tiến khác ............................................................ 22
CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 24
3.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 24
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................ 24
3.1.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................... 24
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 24
3.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu.................................................................... 24
3.2.1. Hóa chất..................................................................................................... 24
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 24
3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 25
3.4. Phƣơng pháp tiến hành ................................................................................. 25
3.4.1. Tách chiết DNA ....................................................................................... 25
3.4.2. Xây dựng và tối ƣu phản ứng Multiplex PCR .......................................... 25
3.4.3. Phƣơng pháp điện di DNA ........................................................................ 28
3.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu......................................................................... 28
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 29
4.1. Xây dựng và tối ƣu phản ứng multiplex PCR phát hiện đồng thời 04 mầm
bệnh ký sinh trùng đƣờng máu ............................................................................ 29
4.1.1.Kết quả xác định nhiệt độ gắn mồi tối ƣu cho từng mầm bệnh đơn lẻ ...... 29
4.1.2. Kết quả xác định nhiệt độ gắn mồi tối ƣu cho phản ứng m-PCR ............. 31
4.1.3.Kết quả xác định nồng độ mồi tối ƣu cho phản ứng m-PCR ..................... 32
iv

4.1.4.Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng m-PCR ....................................... 33
4.1.5.Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng m-PCR ................................. 35
4.2. Đánh giá khả năng nhiễm 04 mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu trên mẫu
thực địa bằng phƣơng pháp multiplex PCR ........................................................ 37
4.2.1. Kết quả sàng lọc mầm bệnh bằng phƣơng pháp s-PCR............................ 37
4.2.2. Kết quả sàng lọc mầm bệnh bằng phƣơng pháp m-PCR .......................... 38
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 45
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 45
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 46

v


DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ
Bảng 2.1. phân loại của các chi Ehrlichia và Anaplasma trƣớc và sau năm
2001. Các chữ cái A, B, B2, B3, B4, B5, B6, B7, C chỉ ra sự thay
đổi vị trí hệ thống .................................................................................. 9
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng m-PCR ............................................................ 26
Bảng 3.2. Danh sách các cặp mồi cho phản ứng PCR trong nghiên cứu............ 26
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng s-PCR .............................................................. 27
Bảng 3.4. Nhiệt độ gắn mồi cho các cặp mồi trong phản ứng s-PCR so với
quy trình tham khảo ............................................................................ 27
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng s-PCR .................................................. 27
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của phản ứng s-PCR ................... 30
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của phản ứng m-PCR ................. 32
Bảng 4.3. Pha loãng hàm lƣợng DNA ................................................................ 34
Bảng 4.4. Kết quả s-PCR mẫu máu chó, mèo cho từng mầm bệnh ký sinh

trùng .................................................................................................... 38
Bảng 4.4. Sự đồng nhất về kết quả sàng lọc mầm bệnh của phƣơng pháp mPCR với s-PCR ................................................................................... 39
Bảng 4.5. Kết quả sàng lọc mầm bệnh 65 mẫu thực địa tại địa bàn Hà Nội và
tp.HCM ............................................................................................... 40

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Babesia dạng lớn ................................................................................... 4
Hình 1.2. Babesia dạng nhỏ .................................................................................. 4
Hình 1.3. Vịng đời Lê dạng trùng ........................................................................ 6
Hình 2.1. Các mũi tên chỉ bạch cầu trung tính bị nhiễm bởi Anaplasma
phagocytophilum. Mẫu máu chó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp
nhuộm Giemsa. ................................................................................... 10
Hình 2.2. Vịng đời của Anaplasma phagocytophilum ....................................... 10
Hình 2.3. Bọ ve truyền bệnh giữa các vật chủ .................................................... 11
Hình 2.4. Các tế bào hồng cầu bị nhiễm Mycoplasma haemofelis (nhuộm
Wright). Các mũi tên chỉ ra các haemoplasma riêng lẻ ...................... 14
Hình 3.1. Ảnh chụp vi khuẩn Ehrlichia (E.) canis đƣợc phân lập từ bạch cầu
của một con chó ở Uberlândia, Brazil. ............................................... 18
Hình 4.1. Hình ảnh điện di cho phản ứng s-PCR ................................................ 29
Hình 4.2. Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi ................................ 31
Hình 4.3. Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi ....................................... 33
Hình 4.4. Kết quả độ nhạy của phản ứng m-PCR ............................................... 35
Hình 4.5. Hình ảnh kết quả điện di của m-PCR với các mầm bệnh ................... 35

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Giải nghĩa

Chữ viết tắt
DNA

Deoxyribonucleic acid

PCR

Polymerase chain reaction

s-PCR

Singleplex PCR

m-PCR

Multiplex PCR

µl

Microlit

µm

Micromet

ng

Nanogram

pM

Picomole

MeSH

The US National library of Medicine
Medical Subject Headings

A. centrale

Anaplasma centrale

A. phago

Anaplasma phago

A. platys

Anaplasma platys

A.marginale

Anaplasma marginale

CCT

Canine Cyclic Thrombocytopenia

HGA

Human Granulotic Anaplasmosis

Hflg

Haemoplasma felis large

Hfsm

Haemoplasma felis small

IFA

Indirect Fluorescent Antibody (IFA)
Assay

Tm

Time melting

viii


TÓM TẮT
Ký sinh trùng đƣờng máu là một căn bệnh do nhiều loại vi khuẩn và đơn
bào ký sinh đƣờng máu. Đây cũng là căn bệnh chó mèo dễ mắc nhất và cũng là
căn bệnh bác sĩ thú y dễ chẩn đốn nhầm do chƣa có phƣơng pháp chẩn đốn
với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đề tài này thực hiện nhằm chẩn đoán sớm cùng

lúc sàng lọc đƣợc nhiều và đúng mầm bệnh giúp bác sĩ thú y có thể điều trị kịp
thời và tiết kiệm thời gian cũng nhƣ tối ƣu kinh tế cho chủ nuôi. Kết quả cho
thấy: (i) Thiết lập thành công phản ứng Multiplex – PCR chẩn đoán sớm đƣợc
04 mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia
canis, Mycoplasma haemofelis, Babaesia vogeli với nhiệt độ gắn mồi 58°C; 35
cycles; nồng độ mồi 10pmol và các thí nghiệm chứng minh độ nhạy và độ đặc
hiệu của phản ứng. (ii) Tiến hành thử nghiệm trên 65 mẫu máu thực địa và so
sánh với phƣơng pháp singleplex PCR cho kết quả sàng lọc đồng nhất. Kết luận
có thể sử dụng phƣơng pháp Multiplex – PCR để sàng lọc sớm 04 mầm bệnh ký
sinh trùng đƣờng máu trên thay thế cho phƣơng pháp truyền thống và độ nhaỵ
thấp nhƣ soi kính hay sử dụng kit test nhanh.

ix


CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Ký sinh trùng đƣờng máu không chỉ là một căn bệnh mà là một nhóm các căn
bệnh gây ra bởi nhiều loại ký sinh trùng đƣờng máu khác nhau. Với mỗi một căn
ngun thì có một phác đồ điều trị khác nhau, do vậy việc chẩn đốn chính xác tác
nhân gây bệnh là quan trọng.Việc chẩn đốn khơng chính xác và sử dụng thuốc trị ký
sinh đƣờng máu và kháng sinh cho thú cƣng bừa bãi sẽ dẫn đến rất nhiều hệ luỵ. Bởi
lẽ, các loại thuốc trị ký sinh trùng đƣờng máu hiện nay đều có độc tính và phác đồ điều
trị thƣờng kéo dài. Nếu không bị mắc ký sinh trùng đƣờng máu mà vẫn sử dụng những
loại thuốc trên trong một thời gian dài sẽ phá hủy chức năng gan, thận, sử dụng quá
liều thú cƣng sẽ bị co giật, biếng ăn, tiêu chảy và khó thở. Nếu khơng xác định đƣợc
căn ngun, điều trị đúng loại thuốc sẽ dẫn đến lãng phí tiền bạc, thời gian của chủ
nuôi cũng nhƣ gây tử vong cho thú cƣng do điều trị không đúng cách. Bên cạnh đó cịn
có một số mầm bệnh nguy hiểm có thể truyền lây từ thú cƣng sang ngƣời gây bệnh
nhƣ sƣng hạch bạch huyết (do vi khuẩn Ehrlichia), bệnh bạch cầu hạt (do vi khuẩn
Anaplasma), bệnh thiếu máu truyền nhiễm (do vi khuẩn Haemoplasma).

Hiện nay, các bác sĩ thú y có xu hƣớng chẩn đốn những mầm bệnh ký sinh
trùng đƣờng máu bằng phƣơng pháp nhuộm Giem-sa, Diff-quick để phát hiện vì cho
kết quả nhanh, giá thành rẻ, thao tác đơn giản. Tuy nhiên, đó là những phƣơng pháp
cho độ nhạy rất thấp, phụ thuộc vào tay nghề, trình độ và kinh nghiệm của kỹ thuật
viên. Việc đánh giá bằng hình thái học rất dễ nhầm lẫn do kích thƣớc của những lồi
ký sinh trùng nhỏ (1,5-4µm), hoặc chỉ có thể quan sát khi mầm bệnh đã nhân lên nhiều
trong hồng cầu đồng nghĩa với tiên lƣợng bệnh nặng, tỷ lệ tử vong rất cao ảnh hƣởng
nhiều đến việc xác định tác nhân gây bệnh. Thậm chí, với sự phát triển của nhiều công
ty thuốc và thiết bị thú y hiện nay đã thổi phồng thái quá về độ hiệu quả của các kit
test nhanh xét nghiệm chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng đƣờng máu gây ra. Điều này
đã dẫn đến hậu quả là quan niệm sai lệch của các bác sĩ trong việc lựa chọn chẩn đoán
đúng về những căn bệnh nguy hiểm này.
Những phƣơng pháp sinh học phân tử cho kết quả chính xác hơn với độ đặc
hiệu, độ nhạy cao nhƣ phản ứng chuỗi trùng hợp PCR đã lần lƣợt ra đời, dần thay thế
cho những kỹ thuật nhƣ nhuộm (Giem-sa, Diffquick) soi kính với độ nhạy rất thấp.

1


PCR có thể giúp phát hiện sớm mầm bệnh từ đó có thể chữa trị kịp thời, về thời gian
điều trị có thể nói là rút ngắn hơn rất nhiều so với phƣơng pháp nhuộm truyền thống
chỉ phát hiện ra đƣợc mầm bệnh khi tiên lƣợng bệnh đã rất nặng, nguy cơ tử vong cao.
Bƣớc tiến này của nền công nghệ hiện đại đã giúp việc chẩn đoán mầm bệnh ký sinh
trùng đƣờng máu trở nên dễ dàng hơn, giảm thiếu tối đa hiện tƣợng âm tính giả chẩn
đốn sai do yếu tố khách quan (kinh nghiệm kỹ thuật viên, hóa chất nhuộm, …) gây
nguy hiểm cho sức khỏe của cả vật nuôi và con ngƣời. Để phát hiện nhanh chóng mầm
bệnh và chữa trị kịp thời, phƣơng pháp PCR là phƣơng pháp tối ƣu nhất trong việc
chẩn đoán các mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu ở thú cƣng. Mặt khác, với ƣu điểm
có độ nhạy và độ đặc cao, phƣơng pháp PCR giúp tránh tình trạng bác sĩ thú y sử dụng
sai phác đồ điều trị dẫn đến việc điều trị tốn thời gian và không hiệu quả. Chính vì vậy,

đề tài “Thiết lập phản ứng MULTIPLEX – PCR trong chẩn đoán mầm bệnh ký
sinh trùng đƣờng máu trên chó, mèo” cần đƣợc triển khai để hỗ trợ trong q trình
chẩn đốn và điều trị.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Thiết lập đƣợc phản ứng MULTIPLEX – PCR phục vụ chẩn đoán 04 mầm bệnh
mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu phổ biến (Babaesia vogeli, Ehrlichia canis,
Anaplasma phagocyphilum, Mycoplasma haemofelis) ở chó, mèo.

2


CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
2.1. Bệnh do đơn bào lê dạng trùng lớn (Babesia vogeli)
2.1.1. Đặc điểm hình thái và phân loại
2.1.1.1. Vị trí của Babesia vogeli
Về mặt phân loại Babesia thuộc ngành Apicomplexa, lớp Aconoidasida, bộ
Piroplasmorida, họ Babesiidae (Taylor & cs., 2016). Trƣớc đây, Bệnh lê dạng trùng
đƣợc phân loại dựa trên hình thái của tế bào chất trong tế bào hồng cầu là dạng lớn (ví
dụ: Babesia canis) hoặc dạng nhỏ (ví dụ: Babesia gibsoni) (Gallego & cs., 2016). Sau
đó, một số lồi Babesia đã đƣợc xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Babesia canis
trƣớc đây đƣợc coi là dạng lớn của Babesia đã đƣợc đƣa vào thành một loài riêng biệt là
Babaesia canis, Babaesia rossi và Babaesia vogeli (Carret & cs., 1999).
2.1.1.2. Hình thái
Nhiều thập kỷ trƣớc, đánh giá hình thái (giai đoạn merozoite trong hồng cầu)
qua tiêu bản máu đƣợc xem là phƣơng thức truyền thống để xác định Babesia spp. trên
chó. Thời kỳ đầu, tất cả các chủng Babesia lớn (2,5-5,0 µm) đều đƣợc biết đến với cái
tên chung là Babesia canis, các chủng nhỏ (1,0-2,5 µm) đƣợc coi là Babesia gibsoni
(Boozer & Macintire, 2003). Tuy nhiên phân tích phân tử và giải trình tự DNA đã phát
hiện ra rằng có nhiều lồi piroplasmid lây nhiễm sang chó hơn, cụ thể là Babesia
gibsoni, Babesia conradae và Babesia vulpes (Poonam & cs., 2019); Babesia microti

hay còn đƣợc gọi là Theileria annae (Zahler & cs., 2000); Theileria spp. ( Matjila &
cs., 2008) và Babesia spp. dạng lớn chƣa đƣợc đặt tên (Birkenheuer & cs., 2004);
Babesia rossi, Babesia canis và Babesia vogeli trƣớc đây đƣợc coi là phân loài của
Babesia canis. Chúng giống hệt nhau về mặt hình thái nhƣng trên cơ sở miễn dịch chéo,
xét nghiệm huyết thanh học, tính đặc hiệu của vector và phát sinh lồi phân tử và do đó
hiện đƣợc coi là riêng biệt loài (Carret & cs., 1999; Zahler, 1998). Mới đây, một lồi
babesia mới trên chó – Babesia negevi đƣợc phát hiện ở Isarel (Gad Baneth & cs., 2020).
Hình thái của các lồi babesia trên chó đƣợc phân biệt dựa trên kích thƣớc của
chúng. Babesia dạng lớn (dài 4-5 µm) dạng hình quả lê, nhọn ở một đầu và làm trịn ở
đầu kia. Các dạng Amip đã đƣợc mơ tả có đƣờng kính 2–4 μm và thƣờng là chứa một
khơng bào.

3


Hình 1.1. Babesia dạng lớn
Nguồn: Troccap
Babesia dạng nhỏ ( 1,5 – 2,5 µm) thiếu hình dạng hình quả lê thơng thƣờng, các
thể dinh dƣỡng có hình vịng hoặc hình bầu dục, hoặc hình vịng nhẫn có thể xảy ra.
Kích thƣớc của babesia dạng nhỏ khơng lớn hơn 1/8 đƣờng kính của hồng cầu chủ.

Hình 1.2. Babesia dạng nhỏ
Nguồn: Troccap
2.1.2. Vịng đời
Theo Jalovecka M. & cs. (2019), Babesia spp. là một lồi đơn bào kí sinh trong
hồng cầu, đƣợc truyền qua ve. Vòng đời của Babesia spp. là sự kết hợp của hai chu kì
sinh sản vơ tính và một chu kì sinh sản hữu tính, ln phiên giữa vật chủ là động vật có

4

xƣơng sống và vector truyền bệnh là ve. Vòng đời của Babesia gồm 3 giai đoạn kế
tiếp: merogony, gamogony và sporogony.
Vòng đời của Babesia đƣợc diễn giải nhƣ sau:
 Sinh sản vơ tính
(1) Vật chủ là động vật có xƣơng sống bị nhiễm tử bào tử (sporozoite) từ nƣớc
bọt của ve trong quá trình hút máu.
(2) Sporozoite xâm nhập vào các tế bào hồng cầu (RBCs) của vật chủ - nơi
chúng phát triển thành các thể sinh dƣỡng (trophozoites).
(3) Trophozoite phân chia thành mảnh trùng (merozoite) thơng qua q trình
sinh sản vơ tính (merogony) bằng hình thức trực phân, sau đó thốt ra ngồi và tái
nhiễm các hồng cầu vật chủ khác.
 Sinh sản hữu tính
Sinh sản hữu tính (Gamogony) đƣợc bắt đầu bởi sự quy kết giới tính của
merozoite thành các tế bào giao tử nội bào, giai đoạn ngắn ngủi lây nhiễm cho ve
vector (vật chủ chính thức).
(1) Các tế bào giao tử (gametocytes) đƣợc đƣa vào lòng ruột bọ chét trong quá
trình ăn máu sẽ phát triển thành tế bào giao tử trƣởng thành (gametes).
(2) Các gametes, đƣợc gọi là thể tia (ray bodies) hoặc Strahlenkörper, hợp nhất
và tạo ra một hợp tử di động đƣợc gọi là ookinete.
(3) Ookinete thâm nhập vào các tế bào ruột của ve. Khi đã ở bên trong biểu mô,
hợp tử trải qua quá trình phân chia giảm phân (meiotic), dẫn đến việc sản sinh ra các
kinetes.
(4) Kinetes phát tán qua chất dịch cơ thể ve (haemolymph) đến các mô ngoại vi
của ve, bao gồm cả các tế bào trứng. Sự xâm nhập vào buồng trứng của ve dẫn đến
nhiễm trùng trứng và lây truyền Babesia từ mẹ sang con cái (transovarial
transmission). Song song đó, kinetes sơ cấp xâm nhập vào các cơ quan khác của bọ ve
và thông qua sự phân liệt (đa phân hạch), nhân lên để tạo ra các kinetes thứ cấp xâm
nhập vào các tuyến nƣớc bọt của ve.
(5) Bên trong các tế bào tuyến nƣớc bọt, các kinetes phát triển thành một hợp

bào đa nhân (nguyên bào bào tử - sporoblast), nằm im trong quá trình lột xác của ve,

5


đảm bảo sự lây truyền ký sinh trùng qua các giai đoạn phát triển của ve (transtadial
transmission).
(6) Một khi ve bị nhiễm Babesia bắt đầu hút máu vật chủ khác, sporoblast sẽ
đƣợc kích hoạt và nhiều sporozoites lây nhiễm liên tục đƣợc tạo ra bởi quá trình sinh
bào tử (sporogony) và đƣợc giải phóng vào máu vật chủ. (Jalovecka M. & cs., 2019).

Nguồn: Trends in Parasitology
Hình 1.3. Vịng đời Lê dạng trùng
2.1.3. Con đƣờng truyền lây
Ở hầu hết mọi nơi trên thế giới, ve là vật trung gian truyền bệnh chính cho bệnh
lê dạng trùng. Các lồi nhƣ Rhipicephalus sanguineus, Dermacentor spp. và
Haemaphysalis ellipticum có thể truyền bệnh Babesia lớn của chó, trong khi Babesia
gibsoni đƣợc truyền bởi Haemaphysalis bispinosa và Haemaphysalis longicornis.
Babesia annae đƣợc cho là do Ixodes hexagonus truyền. Cả hai loại lây truyền là
truyền qua các giai đoạn trong vòng đời của ve (trans-stadial transmissions) và truyền
từ mẹ sang con (transovarial transmissions) đảm bảo duy trì sự lây truyền Babesia
trong vài thế hệ của ve (Poonam Vishwakarma & M.K. Nandini, 2019). Ở Đông Nam
Á, vết cắn của ve dƣờng nhƣ là phƣơng thức lây truyền phổ biến nhất (Konishi K. &
cs., 2008).

6


2.1.4. Dịch tễ học
Đối với bệnh do lê dạng trùng (Babesiosis) là một bệnh đơn bào do ve truyền,

ký sinh trong hồng cầu của nhiều loài động vật bao gồm động vật hoang dã và vật
ni, trong đó có chó. Bệnh do nhiều loài Babesia gây ra, đáng chú ý là một số lồi có
thể lây truyền cả cho ngƣời. Babesia vogeli, Babesia canis, và Babesia gibsoni là
những loài chủ yếu gây bệnh trên ở châu Á (Leonhard Schnittger, 2012).
Babesia vogeli là lồi đƣợc tìm thấy ở rất nhiều nơi trên thế giới: Pháp, Úc,
Nhật Bản, Brazil, Nam Phi và Mỹ và thƣờng gây bệnh nhẹ ở chó trƣởng thành nhƣng
bệnh nặng ở một số chó nhỏ (Matjila P.T. & cs., 2004). Ngoài ra, các trƣờng hợp
nhiễm Babesia vogeli ở chó đã đƣợc báo cáo ở Thổ Nhĩ Kỳ (Gülanber A. & cs., 2006)
và là lồi đƣợc chẩn đốn thƣờng xuyên nhất ở Châu Đại Dƣơng (Birkenheuer A.J. &
cs., 2020). Tại học viện cảnh sát K9 ở Cairo, Ấn Độ, tổng cộng 242 mẫu máu đã đƣợc
thu thập từ những chú chó cảnh, kết quả cho thấy có 62 trƣờng hợp dƣơng tính với
Babesia vogeli, chiếm 25,62%. Tỷ lệ nhiễm ở chó đực (26,6%) cao hơn ở chó cái
(20,51%); kết quả sinh hóa cho thấy có sự tổn thƣơng ở gan (với các triệu chứng vàng
da và phù) và tổn thƣơng thận (với các triệu chứng gầy và nƣớc tiểu có máu) (Zaki
A.A. & cs., 2021). Tại Abija, Nigeria, trong tổng số 480 con chó đƣợc lấy mẫu, 52 con
(10,8%) có kết quả dƣơng tính với Babesia canis vogeli. Cũng trong nghiên cứu này
chỉ ra rằng chó đực dễ bị nhiễm Babesia gấp 1,24 lần so với chó cái; những con chó ở
nhóm tuổi từ 12 tới 36 tháng dễ bị nhiễm Babesia hơn 2 lần so với những con ở các
nhóm tuổi khác; tỷ lệ nhiễm của các giống ngoại lai (12.9%) cũng đƣợc báo cáo là cao
hơn so với các giống địa phƣơng (11,3%) và con lai (9,4%); tỷ lệ nhiễm ở mùa mƣa
cao hơn đáng kể vào mùa khô (Obeta S.S & cs., 2020).
Tại Campuchia, trong số 101 con chó đƣợc lấy mẫu thì có 33 con (32.7%)
dƣơng tính với Babesia vogeli. Tất cả những con chó đƣợc lấy mẫu kiểm tra là những
con chó thả rơng, bán thuần dƣỡng, không đƣợc tiếp cận với các dịch vụ chăm sóc thú
y (Inpankaew T. & cs., 2016). Ngồi ra ở Đơng Nam Á, Babesia vogeli cịn đƣợc báo
cáo ở Thái Lan (6.3%) (Piratae S. & cs., 2015). Tại Philippines, lần đầu tiên có sự báo
cáo về Babesia vogeli vào năm 2017 với 9 con chó tại 3 phịng khám khác nhau tại
thành phố Cebu (Galay R.L & cs., 2018).

7

Hiện cịn ít các nghiên cứu về bệnh do đơn bào ký sinh trên chó tại Việt Nam.
Các bệnh do đơn bào ký sinh trong máu chó thƣờng gặp nhƣ là Babesiosis,
Anaplasmosis, Ehrlichiosis. Gần đây có những phát hiện gián tiếp cho biết có sự xuất
hiện các bệnh về ký sinh trùng đƣờng máu trên chó thơng qua nghiên cứu bọ ve và các
mầm bệnh liên quan đến chó ở Việt Nam. Theo Nguyễn Việt Linh & cs. (2019) cho
biết trong tổng số 302 bọ ve đã đƣợc sàng lọc phân tử để phát hiện các mầm bệnh do
ve gây ra cho chó ở miền bắc Việt Nam, có ba con ve dƣơng tính với Hepatozoon
canis, một cho Ehrlichia canis và một cho Babesia vogeli.
2.2. Bệnh do vi khuẩn Anaplasma (Anaplasma phagocytophylum)
2.2.1. Đặc điểm hình thái và phân loại
2.2.1.1. Vị trí của Anaplasma phagocytophilum
Theo Thƣ viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ (the US National Library of Medicine
Medical Subject Headings) (MeSH), Anaplasma phagocytophilum là vi khuẩn gram
âm thuộc chi Anaplasma, họ Anaplasmataceae, trƣớc đây đƣợc gọi là Ehrlichia
phagocytophila hoặc Ehrlichia equi.
Năm 2001, những thay đổi tổ chức lại đáng kể đã đƣợc thực hiện theo lệnh
Rickettsiales. Kết quả của việc tái tổ chức này, họ Ehrlichiaceae đã đƣợc thay thế bằng
họ Anaplasmataceae, và một số thay đổi đã đƣợc thực hiện trong phân loại vi khuẩn
trong chi (Bảng 1) (Dumler & cs., 2001). Các chi Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia
và Wolbachia bao gồm vi khuẩn nội bào bắt buộc, ký sinh trong không bào của tế bào
ở vật chủ nhân thực. Việc phân loại có hệ thống đƣợc thực hiện trên cơ sở xác định
hình thái, sinh thái, dịch tễ học và đặc điểm lâm sàng. Tuy nhiên, sự phát triển của các
phƣơng pháp phân tử trong những năm gần đây đã cho phép nhận biết một phần bộ
gen của những vi khuẩn này và do đó làm thay đổi một phần vị trí hệ thống của chúng.
Một phép so sánh đã đƣợc thực hiện đối với tất cả các trình tự của gen bảo tồn
16S rDNA (gen mã hóa 16S rRNA cho tiểu đơn vị nhỏ của ribosome) và groESL (gen
mã hóa protein sốc nhiệt), đối với những gen đƣợc gửi trong Ngân hàng gen năm 2000
( Dumler & cs., 2001). Phân tích phát sinh lồi đƣợc thực hiện để phân tích so sánh

độc lập về trình tự của cả hai gen cho kết quả tƣơng tự. Biểu đồ trình tự của các gen
16S rRNA và groESL có trình tự tƣơng tự, và vi khuẩn đƣợc định vị trong các cụm
tƣơng tự nhau trên cả hai cây phát sinh loài độc lập, một công bố khác khẳng định độ

8


chính xác của nghiên cứu đƣợc thực hiện. Độ chính xác của chúng cũng đƣợc thể hiện
qua bootstrap thu đƣợc trong cả hai trƣờng hợp. Hơn nữa, sự phân chia có hệ thống
mới đƣợc xác nhận bởi đặc tính sinh học và kháng nguyên của mỗi loài (Dumler & cs.,
2001). Chi tiết liên quan đến sự thay đổi phân loại trong các nhóm vi khuẩn này đƣợc
trình bày trong Bảng 2.1. Các tác nhân gây bệnh cho động vật đƣợc cho là do chi
Anaplasma, chẳng hạn nhƣ Anaplasma centrale, Anaplasma marginale, Anaplasma
platys, Anaplasma ovis và Anaplasma bovis, và cũng là yếu tố căn nguyên của bệnh
Anaplasmosis trên ngƣời, Anaplasma phagocytophilum (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. phân loại của các chi Ehrlichia và Anaplasma trƣớc và sau
năm 2001. Các chữ cái A, B, B2, B3, B4, B5, B6, B7, C chỉ ra sự thay đổi vị
trí hệ thống

2.2.1.2. Hình thái
Các lồi Anaplasma ban đầu đƣợc coi là các ký sinh trùng thuộc động vật
nguyên sinh, nhƣng các nghiên cứu sau này cho thấy chúng khơng có đặc tính rõ rệt
theo mơ tả này. Từ tái bản cuối cùng đƣợc chấp nhận vào năm 2001, họ
Anaplasmataceae (bộ Rickettsiales). Bệnh biên trùng do nhiễm với loài Anaplasma
marginale. Loài thứ hai, A. centrale, cũng đã đƣợc ghi nhận từ trƣớc. Hình thái của A.
phagocytophilum có hình dạng giống "phôi dâu", là sự kết hợp của các khuẩn lạc kiểu

9

dâu tằm đƣợc hình thành trong bạch cầu trung tính và bạch cầu ái toan của các sinh vật
bị nhiễm bệnh.

Hình 2.1. Các mũi tên chỉ bạch cầu trung tính bị nhiễm bởi Anaplasma
phagocytophilum. Mẫu máu chó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm Giemsa.
(Yousefi & cs., 2019))
2.2.2. Vịng đời

Hình 2.2. Vòng đời của Anaplasma phagocytophilum

Nguồn: Molecular epidemiology of bovine anaplasmosis with a particular focus
in Mexico
Vòng đời của tất cả các loài Anaplasma vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ. Hầu
hết các nghiên cứu đã đƣợc thực hiện trên A. marginale ở gia súc kết hợp với loài ve
R. microplus. Vòng đời bắt đầu bằng việc các vector trung gian ve ăn hút máu của
động vật nhiễm Anaplasma. A. phagocytophilum xâm nhập vào bạch cầu hạt, gây giảm

10


bạch cầu và giảm tiểu cầu. Điều này thay đổi hệ thống miễn dịch của vật chủ và làm
tăng cholesterol tế bào và một số gen của bọ chét.
2.2.3. Con đƣờng truyền lây
Bọ ve là vector trung gian sinh học và đóng một vai trị thiết yếu trong việc phát
tán và lan truyền Anaplasma trong các giai đoạn khác nhau của vịng đời của nó. Tuy
nhiên, sự lây truyền qua nhau thai cũng đã đƣợc báo cáo đối với nhiễm A. platys ở chó
cái trong thời kỳ mang thai sớm (25–35 ngày) và lây truyền trong tử cung đối với A.
phagocytophilum. Động vật có xƣơng sống là vật chủ cuối cùng và cũng là vật chủ ký
sinh của ve Rhipicephalus (R.) sanguineus và I. ricinus lần lƣợt là vector chính của A.
Platys và A. phagocytophilum.

Hình 2.3. Bọ ve truyền bệnh giữa các vật chủ
Nguồn: FECAVA
2.3.4. Dịch tễ học
Anaplasmosis lây truyền qua bọ ve Ixodes và gây bệnh trên động vật. Ở ngƣời,
nó gây ra bệnh bạch cầu hạt ở ngƣời Ehrlichiosis.
Nhiễm trùng Anaplasmosis có phân bố trên tồn thế giới và có khả năng lƣu
hành ở bốn mƣơi ba quốc gia trên thế giới. Mặc dù, tỷ lệ lƣu hành khác nhau giữa các
khu vực, loài, giống, do sự hiện diện của các loại bọ ve khác nhau và các xét nghiệm
chẩn đoán liên quan. Anaplasma phagocytophilum và A. platys đã đƣợc xác định có

11


mặt trên tất cả các lục địa. A. phagocytophilum có thể lây nhiễm sang nhiều loại động
vật hoang dã / vật ni và con ngƣời; trong đó, A. Platys thƣờng lây nhiễm cho chó và
hiếm khi lây nhiễm cho mèo. Anaplasma phagocytophilum là vi khuẩn Gram âm ký
sinh trong bạch cầu và tiểu cầu, cũng lây truyền vector bọ ve cứng và gây hiện tƣợng u
hạt ở ngƣời, xuất hiện ở vùng Đông Bắc, Trung Đại Tây Dƣơng, vùng trên Trung Tây
và Bờ Tây Hoa Kỳ.
Lần đầu tiên (1978), A. Platys đƣợc phát hiện ở Hoa Kỳ (Florida; Harvey & cs.,
1978). Nó cũng đƣợc phát hiện ở Trung Mỹ (Venezuela), châu Á (Hàn Quốc, Nhật
Bản, Trung Quốc, Đài Loan và Thái Lan), Australia và châu Phi. Ở châu Âu, sự hiện
diện của A. Platys đã đƣợc xác nhận xung quanh lƣu vực Địa Trung Hải, ở Pháp, Hy
Lạp, Tây Ban Nha và Ý (Sainz & cs., 1999; Suksawat & cs., 2001; Sparagano & cs.,
2003; de la Fuente & cs., 2006. A. Platys chủ yếu gây bệnh trên chó, sống trong các tế
bào máu, gây ra chứng giảm tiểu cầu theo chu kỳ ở chó (Canine Cyclic
Thrombocytopenia - CCT). Các triệu chứng lâm sàng của bệnh này khác nhau tùy
thuộc vào lồi chó, nhƣng về cơ bản CCT làm cho con vật suy yếu, hôn mê, biếng ăn,
suy hô hấp, sốt, tăng tiết chất nhầy, chảy mủ mắt, lách to và tăng sừng ở mõm (Sainz

& cs., 1999). Những vi khuẩn này không gây chết ngƣời và điều trị bằng kháng sinh
thích hợp thƣờng khỏi sau bốn tuần.
Số lƣợng các trƣờng hợp nhiễm Anaplasma đƣợc báo cáo cho CDC Mỹ đã tăng
đều đặn kể từ khi căn bệnh này đƣợc báo cáo, từ 348 trƣờng hợp vào năm 2000, lên
mức cao nhất là 5762 vào năm 2017. Các trƣờng hợp đƣợc báo cáo vào năm 2018 thấp
hơn đáng kể, nhƣng đã tăng lên gần con số 2017 vào năm 2019 với 5655 trƣờng hợp.
Tỷ lệ tử vong theo ca bệnh (tức là tỷ lệ bệnh nhân anaplasmosis đƣợc báo cáo tử vong
do nhiễm mầm bệnh này) vẫn ở mức thấp, dƣới 1%.
A. phagocytophilum là một loại vi khuẩn thƣờng đƣợc mô tả từ chi
Anaplasma. Nó đã đƣợc phát hiện ở động vật nuôi, chủ yếu là động vật nhai lại nhỏ,
nhƣng cũng có thể ở ngƣời. Những vi khuẩn này là một yếu tố căn nguyên gây ra bệnh
tƣơng đồng bạch cầu hạt ở ngƣời – HGA (Human Granulocytic Anaplasmosis)
(Human Anaplasmosis - HA). Anaplasmosis ở ngƣời là một bệnh khó chẩn đốn do
các triệu chứng khơng đặc hiệu giống với bệnh cúm thơng thƣờng. Nó có thể có các
triệu chứng nhẹ hoặc nặng, tùy thuộc vào tình trạng của bệnh nhân. Một ƣớc tính cho

12


biết khoảng 40% những ngƣời bị nhiễm phải nhập viện. HGA đƣợc phát hiện sớm có
thể chữa đƣợc. Ở châu Âu khơng có trƣờng hợp chết ngƣời đã đƣợc báo cáo, và ở Hoa
Kỳ tỷ lệ tử vong là 7-10% (Fishbein & cs., 1994; Dumler và Bakken, 1998).
Có lẽ khơng phải là một bệnh nguy hiểm đến tính mạng, nhƣng có thể có các
biến chứng nhƣ suy thận, đơng máu nội mạch, tim to, co giật hoặc hôn mê, tất cả đều
có thể gây tử vong. Những ngƣời này chủ yếu liên quan đến ngƣời già, những ngƣời bị
bệnh sau khi dùng thuốc ức chế miễn dịch và trẻ em (Fishbein & cs., 1994; Dumler và
Bakken, 1998).
Hiện tại ở Việt Nam, các bác sĩ thú y hiện tại chỉ dùng các kit test chẩn đoán
nhanh để xác định thú cƣng bị nhiễm Anaplasma hay không. Tuy nhiên, phƣơng pháp
này không có độ tin cậy. Chƣa có cơng bố nào về tình trạng nhiễm Anaplasma trên thú

cƣng ở Việt Nam.
2.3. Bệnh do vi khuẩn Mycoplasma haemofelis
2.3.1. Đặc điểm hình thái và phân loại
2.3.1.1. Vị trí của Mycoplasma haemofelis
Ban đầu, dựa vào đặc điểm và hình thái (thiếu màng ngồi tế bào),
Mycoplasma haemofelis ban đầu đƣợc xếp vào chi Haemobartonella, họ
Anaplasmataceae, bộ Rickettsiales. Tuy nhiên, những tiến bộ gần đây trong kỹ thuật
sinh học phân tử đã chứng minh, dựa trên trình tự nucleotide của gen 16S rRNA, rằng
có 2 lồi có quan hệ họ hàng gần với nhau phát sinh quần thể với các sinh vật thuộc
chi Mycoplasma. Do đó, Haemoplasma felis ―chủng Ohio/Florida,‖ ―dạng lớn,‖ hoặc
―Hflg‖ đã đƣợc đổi tên thành Mycoplasma haemofelis và H. felis ―chủng California,‖
―dạng nhỏ,‖ hoặc ―Hfsm‖ đã đƣợc đổi tên thành Mycoplasma haemominutum. Ngoài
ra, thuật ngữ ―hemoplasma‖ hiện đƣợc sử dụng để mô tả mycoplasma lây nhiễm hồng
cầu. Tuy nhiên, việc đổi tên và phân loại lại các sinh vật vẫn chƣa dẫn đến việc đổi tên
trạng thái bệnh. Do đó, thuật ngữ truyền thống ―hemobartonellosis‖ sẽ đƣợc sử dụng ở
đây để chỉ hội chứng lâm sàng thiếu máu tái tạo do hemoplasmas ở mèo.
Haemoplasmosis, trƣớc đây đƣợc gọi là haemobartonellosis, là một bệnh do
nhóm vi khuẩn Haemoplasma ký sinh trong tế bào hồng cầu, truyền lây qua mèo
(Clark, 1942; Flint và Moss, 1953; Foley & cs., 1998; Willi & cs., 2005) và chó
(Benjamin và Lumb, 1959; Donovan và Loeb, 1960) bằng vector là ve, bọ chét. Bên

13


cạnh hai lồi bị ảnh hƣởng này, các cơng bố phát hiện lây lan ở một số lồi động vật
có vú khác.
3.3.1.2. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Mycoplasma haemofelis có đặc điểm là nhỏ (0,3–0,8 mm), không thể
nuôi cấy, vi khuẩn biểu sinh có khả năng gây bệnh thiếu máu tan máu nặng (Sykes,
2010).

Hình 2.4. Các tế bào hồng cầu bị nhiễm Mycoplasma haemofelis (nhuộm Wright).
Các mũi tên chỉ ra các haemoplasma riêng lẻ
Nguồn: S. Tasker, University of Bristol, UK
Các Haemoptrophic mycoplasmas (hemotropic), trƣớc đây đƣợc gọi là
Haemobartonella và Eperythrozoon, là những vi khuẩn đa hình dạng nhỏ (<1 mm), ký
sinh vào các tế bào hồng cầu của các loài động vật có vú khác nhau (Willi & cs.,
2007). Ban đầu, Chúng đƣợc phân loại là sinh vật lớp Rickettsial, dựa trên kích thƣớc
nhỏ, Gram âm, ký sinh hồng cầu và lây truyền bởi bọ ve, bọ chét hút máu (Kreier và
Ristic, 1984). Trong khi đó, dựa trên đặc điểm phân tử cho thấy có mối quan hệ gần hơn
với các lồi của lớp Mollicutes đã đƣợc mơ tả (Neimark & cs., 2001; Rikihisa & cs.,
1997). Mối quan hệ nhìn dƣới góc độ sinh học phân tử và một số đặc điểm kiểu hình khác
đã dẫn đến việc phân loại lại các chi Haemobartonella và Eperythrozoon trong chi
Mycoplasma (họ Mycoplasmataceae) là mycoplasmas haemoptropic/hemotropic

14