Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn baccillus subtilis dk8, dk15 phân lập từ đất

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
------------

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NĂM HỌC 2020 - 2021
Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS DK8, DK15 PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

Sinh viên thực hiện:

Phan Anh Tuấn

Lớp:

K60-CNSH

Giáo viên hướng dẫn:

TS. Nguyễn Thị Thu Hằng
ThS. Nguyễn Thị Hồng Nhung

HÀ NỘI – 2021
1


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đƣợc đề tài tốt nghiệp này, với sự biết ơn sâu sắc nhất, em
xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình em trong quá trình

thực hiện khóa luận tại trƣờng, đặc biệt là sự giúp đỡ của các thầy cô bộ môn
Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo TS. Nguyễn Thị Thu Hằng và
ThS. Nguyễn Thị Hồng Nhung vì đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ và đóng góp
những ý kiến q báu để em có thể hồn thành đề tài này.
Đồng thời, em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc bộ
môn Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Thơng qua q trình thực hiện đề tài, em đã học đƣợc nhiều điều và rút ra
đƣợc nhiều bài học kinh nghiệm q báu. Vì kiến thức bản thân cịn hạn chế,
trong q trình thực hiện đề tài này khơng tránh khỏi sai sót, em kính mong nhận
đƣợc những ý kiến đóng góp của thầy cơ.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Sinh viên thực hiện

Phan Anh Tuấn

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... 1
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC KÍ HIỆU TỪ VIẾT TẮT ................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU....................................... 2
1.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................... 2

1.1.1. Phân loại và phân bố ................................................................................... 2
1.1.2 Lịch sử nghiên cứu ....................................................................................... 3
1.1.3 Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 3
1.1.4. Đặc điểm sinh trƣởng .................................................................................. 4
1.1.5. Đặc điểm nuôi cấy ....................................................................................... 5
1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng Bacillus subtilis trong sản xuất các chế
phẩm sinh học chứa vi khuẩn hữu ích ................................................................... 5
1.2.1 Khả năng sinh bào tử.................................................................................... 5
1.2.2 Khả năng sinh enzyme phân hủy chất hữu cơ.............................................. 6
1.2.3 Khả năng đối kháng ..................................................................................... 7
1.2.4. Khả năng chịu đƣợc nồng độ muối cao, chịu acid, chịu kiềm .................... 8
1.3. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus ................................................... 8

ii


1.3.1. Trong nƣớc .................................................................................................. 8
1.3.2. Nƣớc ngoài ................................................................................................ 10
PHẦN 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...... 11
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 11
2.1.1. Mục tiêu chung .......................................................................................... 11
2.2.2. Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 11
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 11
2.3 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 12
2.3.1 Chủng vi sinh vật........................................................................................ 12
2.3.2 Hóa chất...................................................................................................... 12
2.3.3 Thiết bị ....................................................................................................... 12
2.3.4 Môi trƣờng nghiên cứu............................................................................... 12
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 13
2.4.1. Xác định hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn ............................................... 13

2.4.2. Xác định hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhuộm Gram .... 13
2.4.3. Xác định khả năng sinh nội bào tử ............................................................ 14
2.4.4. Xác định khả năng sinh catalase ............................................................... 15
2.4.5. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ................................. 15
2.4.6. Xác định khả năng chịu NaCl ................................................................... 17
2.4.7. Xác định khả năng chịu nhiệt .................................................................... 17
2.4.8. Xác định khả năng cố định nitơ ................................................................ 18
2.4.9. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ................................................................ 19
iii


2.5. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu ......................................................... 19
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 20
3.1. Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý ............................................................ 20
3.2. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào .......................................................... 22
3.3. Xác định khả năng khả năng chịu mặn (NaCl) ............................................ 23
3.4. Xác định khả năng chịu nhiệt ....................................................................... 25
3.5. Xác định khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng không chứa nitơ ............... 27
3.6. Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định ............................................. 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 30
1. Kết luận ........................................................................................................... 30
2. Tồn tại.............................................................................................................. 30
3. Kiến nghị ......................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 31

iv


DANH MỤC KÍ HIỆU TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Từ viết đầy đủ

CMC

Carboxymethyl cellulose

LB

Lysogeny Broth

IAA

Indole-3-Acetic Acid

VK

Vi khuẩn

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Công thức môi trƣờng LB .................................................................. 13
Bảng 2.2. Cơng thức mơi trƣờng xác định hoạt tính enzyme ............................. 13
Bảng 3.1: Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh
học của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc......................................................... 20
Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis DK8 và DK15 ..... 22
Bảng 3.3: Khả năng chịu nhiệt của chủng DK8 và DK15 .................................. 25

Bảng 3.4: Hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus subtilis DK8 và DK15 .............. 28

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của Bacillus subtilis DK8 (A) và DK15 (B) ...... 21
Hình 3.2: Hình dạng tế bào của Bacillus subtilis DK8 (A) và DK15 (B) .......... 21
Hình 3.3: Hoạt tính Catalase của Bacillus subtilis DK8 (A) và DK15 (B) ........ 21
Hình 3.4: Hoạt tính amylase của Bacillus subtilis DK8 và DK15 ...................... 22
Hình 3.5: Hoạt tính cellulase của chủng Bacillus subtilis DK8.......................... 23
Hình 3.6: Hoạt tính protease của Bacillus subtilis DK8 và DK15 ..................... 23
Hình 3.7: Khảo sát khả năng chịu NaCl của Bacillus subtilis DK8 và DK15 .... 24
Hình 3.8: Khảo sát khả năng chịu nhiệt của chủng DK8 .................................... 26
Hình 3.9: Khảo sát khả năng chịu nhiệt của chủng DK15 .................................. 26
Hình 3.10: Khảo sát khả năng cố định nitơ của B. subtilis DK8 và DK15......... 27
Hình 3.11: Hoạt tính kháng B. cereus của B. subtilis DK8 và DK15 ................. 29

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên đƣợc phát hiện và mô tả
trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ
19. Bacillus là một chi lớn với gần 200 lồi vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả
năng sinh nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thƣờng của môi trƣờng
sống. Bacillus phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến
dƣới nƣớc, từ nƣớc ngọt đến nƣớc mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại
Dƣơng. Các loài Bacillus đƣợc nghiên cứu toàn diện nhất là Bacillus subtilis,
Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis.

Trong số các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus, vi khuẩn Bacillus subtilis
ln đƣợc quan tâm do có tiềm năng trong sản xuất các sản phẩm thƣơng mại
ứng dụng trong y học, trong nông nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm. Hiện
nay, Bacillus subtilis đƣợc biết đến nhƣ là một trong các nguồn nguyên liệu
Công nghệ sinh học, đƣợc sử dụng bổ sung vào các chế phẩm sinh học lợi
khuẩn, làm phân bón hữu cơ sinh học, tạo chế phẩm xử lý ô nhiễm môi
trƣờng… Tùy thuộc vào các đặc điểm sinh học của từng chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis, các nhà khoa học có định hƣớng ứng dụng lồi vi khuẩn hữu
ích này trong việc sản xuất các chế phẩm vi sinh.
Phòng thí nghiệm của Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh-Hóa sinh đã phân lập
đƣợc hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ký hiệu DK8 và DK15. Tuy nhiên, các
đặc điểm sinh học của hai chủng vi khuẩn này chƣa đƣợc xác định. Với mục tiêu
xác định một số đặc điểm sinh học, ni cấy và đặc tính sinh hóa của hai chủng
vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 và DK15, trên cơ sở đó đánh giá đƣợc tiềm năng
ứng dụng của hai chủng vi khuẩn quan tâm trong định hƣớng sản xuất chế phẩm
phân bón vi sinh, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus
subtilis DK8, DK15 phân lập từ đất” đã đƣợc thực hiện.

1


PHẦN 1
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis
1.1.1. Phân loại và phân bố
Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus là một chi lớn và đa dạng,
đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc họ Bacillaceae với 5 chi gồm: Bacillus,
Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum. Các vi
khuẩn đặc trƣng của họ Bacillaceae là hình thành nội bào tử [1, 16].
Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất
dài dƣới các điều kiện khác nhau. Chúng rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể
phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ đất, nƣớc, khơng khí, phân, trầm tích
biển, thức ăn, sữa, lớp mùn,...chủ yếu là đất, nơi mà đóng vai trị quan trọng
trong chu kỳ carbon và nitơ [2].
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy
tiện. Bacillus subtilis phân bố hầu hết trong môi trƣờng tự nhiên, phần lớn cƣ trú
trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên đƣợc gọi là ―trực khuẩn cỏ khô‖. Mật độ
Bacillus subtilis trong đất trồng trọt thông thƣờng khoảng 106 – 107 CFU/g, và
hiện diện rất ít trong đất nghèo dinh dƣỡng ở vùng sa mạc, đất hoang. Ngoài ra,
2


Bacillus subtilis cịn có mặt trong các ngun liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột
mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo,
trong các thực phẩm nhƣ mắm, tƣơng, chao… Sự có mặt của Bacillus
subtilis trong thực phẩm đóng vai trị đáng kể về mặt có lợi cũng nhƣ mặt gây
hại trong quá trình biến đổi sinh học [6].
1.1.2 Lịch sử nghiên cứu
Bacillus subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion
Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là Vibrio subtilis ("Subilis"
tiếng Latin có nghĩa là "tốt"). Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài
vi khuẩn này là ―Bacteridium‖. Năm 1872, Ferdimand Cohn phân loại lại và đổi

tên thành Bacillus subtilis [15].
Năm 1941, Bacillus subtilis đƣợc phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng đƣợc dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các
binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách đƣợc
các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis.
Hiện nay, Bacillus subtilis đã đƣợc nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế
giới, nên thuật ngữ ―Liệu pháp Subtilis (Subtilis therapy)‖ ra đời. Bacillus
subtilis đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến và đƣợc xem nhƣ sinh vật phòng và trị
các bệnh về rối loạn đƣờng tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu
chảy… Các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus subtilis rất rộng với
nhiều tiềm năng và hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý mơi trƣờng…
[4, 17].
1.1.3 Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis có chiều dài 1,5 – 10 µm, đƣờng kính 0,25 – 1 µm, hai
đầu trịn, có thể có 8 – 12 lông nhỏ. B. subtilis thƣờng tồn tại đơn lẻ, nhƣng cũng
tạo thành "quần thể" hình chuỗi ngắn, có khả năng di động trong môi trƣờng
nƣớc nhờ hoạt động của các lông giống nhƣ trùng roi. B. subtilis là vi khuẩn
gram dƣơng, hầu hết có catalase dƣơng tính, thƣờng di động nhờ roi [1].
3


Một tế bào Bacillus subtilis chỉ có thể hình thành duy nhất một nội bào tử.
Nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ, kích thƣớc từ 0,8 - 1,8 µm, đƣợc bao bọc
bởi vỏ gồm nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan…
Bào tử có khả năng chịu đƣợc pH thấp, có khả năng chịu nhiệt (ở 100ºC trong
180 phút), chịu ẩm, chịu axit, chịu tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát
trùng, có thể sống vài năm đến vài chục năm. Sự hình thành nội bào tử không bị
ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí. Các lồi thuộc chi Bacillus đặc trƣng cho
trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số
trƣờng hợp chỉ hơi phình to lên một chút. Tùy theo lồi, bào tử có thể nằm giữa,

gần cuối, hoặc ở cuối tế bào sinh dƣỡng [6].
1.1.4. Đặc điểm sinh trưởng
Bacillus subtilis là sinh vật hóa dị dƣỡng, thu năng lƣợng nhờ sự oxi hóa
các hợp chất hữu cơ nhƣ đƣờng, amino acid, acid hữu cơ,...
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên
vẫn phát triển đƣợc trong mơi trƣờng thiếu oxy.
Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng của Bacillus subtilis là 37 - 45ºC. Bên
cạnh đó, nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng chịu nhiệt với nhiệt
độ sinh trƣởng tối ƣu lên tới 65ºC, hoặc ƣa lạnh (nhiệt độ thích hợp cho sinh
trƣởng là 5ºC-25ºC) [7].
Các lồi vi khuẩn thuộc chi Bacillus sinh trƣởng trong khoảng pH rộng từ
2-11, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4. Trong phịng thí nghiệm, dƣới điều kiện
sinh trƣởng tối ƣu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút.
Nhờ có phổ chịu pH, nhiệt độ và muối (NaCl) rộng nên Bacillus subtilis
có thể tồn tại ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài. Khơng những thế, Bacillus
subtilis cịn đƣợc biết đến nhƣ một lồi vi khuẩn có nhiều đặc điểm sinh học q
nhƣ có hoạt tính enzyme ngoại bào, có khả năng sinh kháng sinh, sinh chất kích
thích sinh trƣởng thực vật, có vai trị trong chu trình nitơ và phopho… Do vậy,
lồi vi khuẩn này ln là lựa chọn hàng đầu của các nhà khoa học trong việc sản
4


xuất các chế phẩm sinh học nhƣ sản xuất men tiêu hóa, phân bón kích thích sinh
trƣởng thực vật, là vi khuẩn probiotic tăng cƣờng hệ tiêu hóa của vật nuôi và xử
lý ao nuôi trong nuôi trồng thủy sản…[6].
1.1.5. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis sinh trƣởng và tăng sinh khối trên nhiều loại môi trƣờng
dinh dƣỡng cơ bản. Đặc điểm sinh trƣởng đặc trƣng của Bacillus subtilis trên
một số loại môi trƣờng cơ bản phổ biến nhƣ sau:
- Trên môi trƣờng thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA), khuẩn lạc Bacillus

subtilis dạng trịn, rìa răng cƣa khơng đều, màu vàng xám. Sau 1 – 4 ngày ni cấy
có đƣờng kính khuẩn lạc 3 – 5 mm, bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
- Trong môi trƣờng canh Trypticase Soy Broth (TSB), vi khuẩn phát triển
làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó
tan khi lắc đều.
- Trên mơi trƣờng giá đậu – pepton, khuẩn lạc vi khuẩn dạng trịn lồi,
nhẵn bóng, đơi khi lan rộng, rìa răng cƣa khơng đều, đƣờng kính 3 – 4cm sau 72
giờ nuôi cấy.
Nhu cầu dinh dƣỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số
nguyên tố vi lƣợng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trƣờng cung cấp đủ
nguồn carbon (nhƣ glucose) và nitơ (nhƣ peptone) [12, 16]
1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng Bacillus subtilis trong sản xuất các chế
phẩm sinh học chứa vi khuẩn hữu ích
1.2.1 Khả năng sinh bào tử
Đặc điểm quan trọng của vi khuẩn thuộc chi Bacillus là khả năng sinh bào
tử [12]. Bào tử Bacillus đƣợc mô tả đầu tiên bởi Cohn (1872) khi nghiên cứu về
B. subtilis và sau đó đƣợc Koch (1875) mô tả khi nghiên cứu về B. anthracis.
Bacillus subtilis thƣờng có khả năng hình thành bào tử trong chu trình
phát triển tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi nhƣ: nhiệt độ cao, môi trƣờng
5


nghèo dinh dƣỡng, pH khơng thích hợp, mơi trƣờng tích lũy nhiều sản phẩm trao
đổi chất bất lợi,…Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển
thành một tế bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn. Vì vậy, nội bào tử đƣợc sinh ra
khơng phải để sinh sôi nảy nở mà là cơ chế đảm bảo cho sự sống còn của vi
khuẩn khi trải qua các điều kiện khắc nghiệt [6].
Trong một tế bào Bacillus subtilis chỉ có 1 bào tử, sau khi trƣởng thành
bào tử đƣợc phóng thích ra khỏi tế bào. Bào tử đƣợc xem nhƣ trạng thái tiềm
sinh và không diễn ra quá trình trao đổi chất [12].

Bào tử Bacillus phát triển theo chu kì, trong trạng thái tiềm ẩn, chúng có
thể tồn tại trong thời gian rất dài, đến hàng tỷ năm. Ví dụ nhƣ bào tử của B.
subtilis có thể duy trì khả năng sống đến 200-300 năm.
Khả năng chịu nhiệt và sự khô hạn của bào tử của các lồi thuộc chi
Bacillus có thể khác nhau: Ở nhiệt độ 100ºC, bào tử B. subtilis chịu đƣợc 180
phút, bào tử B. cereus có khả năng chịu đƣợc 2 phút, bào tử B. mesentericus
chịu đƣợc 380 phút.
Khả năng đề kháng với tia phóng xạ của bào tử B. subtilis cũng cao gấp
hàng chục lần so với tế bào dinh dƣỡng của E. coli.
Sự tạo ra bào tử dạng tiềm sinh có thể khẳng định nhƣ là đặc điểm phân loại
nổi bật, là cách xác định đơn giản một loài vi khuẩn thuộc họ Bacillaceae. Có
thể nói, đây là đặc điểm rất quan trọng và có liên quan đến việc sản xuất các chế
phẩm sinh học probiotic từ vi khuẩn Bacillus subtilis [3].
1.2.2 Khả năng sinh enzyme phân hủy chất hữu cơ
Trong quá trình sống Bacillus subtilis thƣờng sản sinh những chất có hoạt
tính sinh học cần thiết để thích ứng với nhiều hồn cảnh và điều kiện mơi trƣờng
sống. Trong đó, khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào nhƣ protease, amylase,
cellulase, alkaline phosohatase, cyclodextran, glucanotransferase, galactosidase,
chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase, urease,...là một đặc tính nổi bật
của các lồi Bacillus [5, 11].
6


Có thể nói Bacillus là một trong số các vi sinh vật có khả năng sinh
protease nhiều nhất, đặc biệt là protease kiềm tính. Protease hay peptide
hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kết peptide (-CO–NH-) trong phân tử
protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thuỷ phân này có thể là các
acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn [6, 10].
So với amylase nguồn gốc từ động vật và vi nấm thì amylase từ Bacillus
bền hơn trong mơi trƣờng acid của dạ dày. Amylase là một trong những enzyme

đƣợc quan tâm nghiên cứu sớm và nhiều nhất, xúc tác sự thủy phân của tinh bột
thành đƣờng.
Bacillus là loài sinh cellulase với hàm lƣợng cao. Cellulase là enzyme xúc
tác sự phân hủy cellulose thành sản phẩm trung gian là cellubiose và sản phẩm
cuối cùng là đƣờng glucose. Có thể nói, những vùng đất chứa nhiều cellulose
trong tự nhiên sẽ có sự phân bố cao của Bacillus, và Bacillus cũng chủ yếu đƣợc
phân lập từ đất vƣờn, nơi có nguồn xác bã hữu cơ (rơm, rạ, mụn dừa,..) dồi dào.
Các lồi Bacillus sinh cellulase điển hình gồm có B. subtilis, B. pumilus
(Christakopoulos), B. licheniformis, B. circulans AB16, B. polymyxa, B. cereus
(Schallmy et al., 2004) [8, 14].
Tóm lại, nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, vi khuẩn Bacillus subtilis có
thể chuyển hóa các chất khó tiêu (cellulose, tinh bột, protein) thành chất dễ tiêu
(acid amin và glucose) góp phần cải thiện dinh dƣỡng, cải thiện nguồn nƣớc, kích
thích tiêu hóa thức ăn và giúp vật nuôi tăng trọng nhanh. Khả năng sinh enzyme
thủy phân các hợp chất hữu cơ là một đặc tính rất cần thiết trong việc nghiên cứu
sử dụng Bacillus subtilis để tạo chế phẩm sinh học nhƣ chế phẩm phân hữu cơ vi
sinh, chế phẩm probiotic trong chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và xử lý ao nuôi…
1.2.3 Khả năng đối kháng
Khả năng đối kháng với vi sinh vật có hại của Bacillus subtilis đã đƣợc
khẳng định và đây chính là ƣu điểm để các nhà khoa học ƣu tiên sử dụng
Bacillus subtilis bổ sung vào các chế phẩm sinh học [17].
7


Vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc sử dụng bổ sung vào chế phẩm probiotic
có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh thơng qua khả năng cạnh tranh vị
trí bám dính và khả năng sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn cao. Cụ thể, Bacillus
subtilis thƣờng cạnh tranh với vi sinh vật gây bệnh về nguồn thức ăn, năng
lƣợng, muối khống, mơi trƣờng sống,...để làm giảm mật độ vi sinh vật gây
bệnh và dần dần đẩy lùi đƣợc dịch bệnh [6].

Nhiều dịng B. subtilis đƣợc xác định là có khả năng chế ngự mầm bào tử
của nấm bệnh bằng cách cạnh tranh dinh dƣỡng và muối khoáng,….
Khả năng sinh kháng sinh của Bacillus subtilis cũng đã đƣợc các nhà khoa
học nghiên cứu từ rất lâu. Hiện nay, có ít nhất 5 loại kháng sinh đƣợc chiết tách
từ B. subtilis nhƣ: Subtilin, bacitracin, bacillin, subtenolin và bacilomycin. Trong
số các chất kháng sinh đƣợc tách chiết từ Bacillus subtilis, bacitracin là chất kháng
sinh thƣờng đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để ức chế vi khuẩn gây bệnh
đƣờng ruột và kích thích tiêu hóa cũng nhƣ tăng trọng của vật nuôi [6, 10].
1.2.4. Khả năng chịu được nồng độ muối cao, chịu acid, chịu kiềm
B. subtilis và B. licheniformis có khả năng phát triển tốt trong mơi trƣờng
có nồng độ muối khá cao, thƣờng tồn tại ở môi trƣờng nƣớc lợ, nƣớc mặn, trong
đƣờng ruột của tôm và đƣợc coi là vi khuẩn có lợi cho tơm.
Đặc biệt, nhờ khả năng sinh bào tử mà Bacillus subtilis có khả năng sinh
trƣởng và sống sót trong mơi trƣờng acid cũng nhƣ trong mơi trƣờng kiềm.
Chính nhờ những đặc tính ƣu việt nêu trên cùng với khả năng dễ bảo quản
ở điều kiện thƣờng, Bacillus subtilis đƣợc đánh giá là một trong những đối tƣợng
giàu tiềm năng khai thác trong lĩnh vực sản xuất chế phẩm sinh học [13].
1.3. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus
1.3.1. Trong nước
Ở Việt Nam các chế phẩm phân vi sinh đa chủng, đa chức năng thƣờng có
thành phần vi sinh vật có ích là vi khuẩn Bacillus. Sự ứng dụng vi khuẩn
8


Bacillus trong phân bón vi sinh có tác dụng tiết kiệm phân hóa học, giảm thiểu
thuốc hóa học bảo vệ thực vật và góp phần tích cực cho việc xây dựng nền nơng
nghiệp bền vững. Ví dụ, nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp và Phan Văn Tùng
(2010) chứng minh khi xử lý hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
hòa tan lân, tổng hợp IAA, vi khuẩn Azospirillum lipoferum cố định đạm và
Bacillus subtilis hòa tan kali, đồng thời bổ sung 25 kg N/ha, 15 kg K2O/ha. Kết

quả đã cho năng suất lúa tƣơng đƣơng bón 100 kg N/ha + 60 kg P2O5/ha + 30 kg
K2O/ha. Bên cạnh đó, cây lúa trong nghiên cứu ít bị đổ ngã, tiết kiệm chi phí sản
xuất lên đến 2.283.875 đồng/ha [2].
Cơng bố của Trịnh Thành Trung và cộng sự (2013) cho thấy đã phân lập
đƣơc chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 có khả năng
sinh trƣởng tốt trong giải nhiệt độ 20oC - 55oC với khoảng nhiệt độ tối ƣu là
35oC - 45oC; pH 5,0 - 9,0 với pH tối ƣu là 7,0; và nồng độ NaCl 1,0 - 7,0%. Trên
môi trƣờng thạch chứa 0,1% cơ chất, chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp.
plantarum SP 1901 có khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào nhƣ amylase,
cellulose, lipase, phytase, protease và xylanase. Không những thế, vi khuẩn
Bacillus SP 1901 cịn có có khả năng sinh chất kháng sinh kháng lại các loại vi
khuẩn Gram (+) và Gram (-) gây bệnh trên ngƣời nhƣ S. aureus, E. coli, P.
aeruginosa và Shigella sp. hoặc nấm gây bệnh cây là F. oxysporum và có khả
năng sinh chất kích thích sinh trƣởng IAA. Nhóm tác giả cũng khẳng định vi
khuẩn Bacillus SP 1901 có rất nhiều tiềm năng ứng dụng: Ứng dụng trong sản
xuất các enzyme thƣơng mại, chế phẩm phịng trừ nấm gây bệnh cây, chế phẩm
làm phân bón hữu cơ vi sinh hoặc chế phẩm probiotics [9].
Năm 2017, Nguyễn Văn Phúc và Phan Thị Phƣợng Trang đã tiến hành
nghiên cứu ―Phân lập, định danh và xác định các đặc tính có lợi của chủng
Bacillus spp. từ ao ni tôm ở tỉnh Bến Tre‖. Kết quả của nghiên cứu là từ các
mẫu đất, mẫu nƣớc, mẫu tơm, nhóm tác giả đã phân lập đƣợc 70 chủng có các đặc
điểm hình thái khuẩn lạc giống với Bacillus. Từ 70 chủng vi khuẩn đã phân lập,
các tác giả đã tuyển chọn đƣợc 17 chủng có khả năng sinh enzyme ngoại bào và
9


khả năng đối kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh chết sớm trên
tôm gây thiệt hại lớn cho ngành ni tơm trong cả nƣớc nói chung và tỉnh Bến
Tre nói riêng. Nhóm tác giả cũng khẳng định các chủng Bacillus đã đƣợc tuyển
chọn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm vi sinh cho tôm [8].

1.3.2. Nước ngoài
Trên thế giới, các nghiên cứu về Bacillus rất đa dạng, với rất nhiều kết
quả nghiên cứu chỉ ra tiềm năng ứng dụng của Bacillus:
Năm 2002, Sundara và cộng sự đã ứng dụng dòng vi khuẩn Bacillus
megaterium var phosphaticum có khả năng phân giải lân (P) trong canh tác mía
đã làm gia tăng lƣợng P cung cấp cho cây đến 10 kg/ha, từ đó làm gia tăng khả
năng sinh trƣởng và tăng năng suất thu hoạch mía đƣờng lên đến 12,6%. Khi kết
hợp việc bón vi khuẩn Bacillus megaterium var phosphaticum với phân lân hóa
học trong canh tác, vi khuẩn phân giải lân đã giúp tiết kiệm đƣợc 25% lƣợng
phân lân [18].
Về khả năng sản sinh enzyme ngoại bào của Bacillus có nhiều nghiên
cứu: Năm 2010, Li-Jung Yin and Zheng đã nghiên cứu tách chiết và tinh sạch
cellulase từ chủng Bacillus subtilis YJ1. Năm 2011, Kubo và cộng sự đã nghiên
cứu ứng dụng Bacillus subtilis có hoạt tính protease cao trong lên men sản xuất
Natto từ đậu…
Năm 2013, Usta nghiên cứu ứng dụng hai lồi vi khuẩn có khả năng sinh
tinh thể độc diệt côn trùng là Bacillus thuringiensis, B. sphaericus để sản xuất
thuốc trừ sâu sinh học an toàn [19].

10


PHẦN 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu chung
Xác định đƣợc đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng
DK8 và DK15 phân lập từ đất.
2.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Bacillus subtilis

chủng DK8 và DK15.
- Xác định hoạt tính sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng DK8 và
DK15: Khả năng sinh enzyme ngoại bào; khả năng chống chịu với điều kiện bất
lợi nhƣ nồng độ NaCl cao, nhiệt độ cao; khả năng sinh nitrogenase, khả năng
kháng vi sinh vật kiểm định.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Bacillus subtilis
chủng DK8 và DK15: Hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, khả năng sinh nội
bào tử, khả năng sinh catalase.
- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng DK8
và DK15:
+ Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase)
+ Xác định khả năng chịu NaCl
+ Xác định khả năng chịu nhiệt
+ Xác định khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn trong môi trƣờng không
chứa nitơ (khả năng cố định nitơ)
+ Xác định khả năng đối kháng với một số vi khuẩn kiểm định.
11


2.3 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Chủng vi sinh vật
- Vi khuẩn Bacillus subtilis chủng DK8 và DK15 đƣợc phân lập từ đất do
phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện Cơng nghệ sinh học lâm
nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp cung cấp
- Chủng vi sinh vật kiểm định: Shigella, E. coli, B. cereus, Samonella
2.3.2 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật nhƣ: Peptone, yeast
extract, NaCl, K2HPO4, (NH4)2SO4, CaCO3, MgSO4.7H2SO4, FeSO4.7H2O,
MnSO4.4H2O, tinh bột,… do Trung Quốc, Việt Nam, Mỹ, Đức,… sản xuất.

2.3.3 Thiết bị
Các máy móc, dụng cụ đƣợc sử dụng gồm: Máy đo pH HANA HI 2211
pH/ORP Meter (Ý), nồi khử trùng HVE 50 (Nhật Bản), máy ly tâm lạnh (Mỹ),
máy lắc ổn nhiệt (Thụy Sĩ), tủ ấm (Memmert, Đức), cân phân tích OHAUS PA
213 (Mỹ), tủ lạnh 4oC/-20oC/-80oC (Nhật Bản), kính hiển vi quang học (Đức), tủ
cấy (Box Laminar PII, Đức).
2.3.4 Môi trường nghiên cứu
 Môi trƣờng LB nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis
Bảng 2.1: Công thức môi trƣờng LB
Thành phần

Hàm lƣợng (g/l)

Peptone

10

Yeast extract

5

NaCl

10
pH = 7

 Môi trƣờng xác định hoạt tính enzyme ngoại bào: Là mơi trƣờng thạch
đĩa có cơng thức cơ bản (KH2PO4 1g/l, (NH4)2SO4 0,5 g/l, NaCl 0,2 g/l,
12

(NH4)2SO4, CaCO3, MgSO4.7H2O 0,1 g/l, KCl 0,2 g/l, FeSO4.7H2O 0,002 g/l,
MnSO4.4H2O 0,002 g/l, agar 1,5%) bổ sung cơ chất của enzyme nhƣ Bảng 3.2.
Bảng 2.2. Công thức môi trƣờng xác định hoạt tính enzyme
Hoạt tính
enzyme

Cơ chất của enzyme

Thuốc thử phát hiện vòng
phân giải cơ chất của enzyme

Amylase

Tinh bột 1%

Lugol 1%

Cellulase

CMC 1%

Congo red 0,2%
Coomassie blue 0,25%

Protease

Casein 1%

(w/v) trong methanol : acid

acetic: nƣớc tỉ lệ 3: 1: 6 (v/v/v)

Ghi chú: Các môi trường đều được hấp khử trùng ở 118°C trong 20 phút.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Xác định hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn
Vi khuẩn Bacillus subtilis chủng DK15 và DK8 đƣợc cấy ria tạo khuẩn
lạc trên môi trƣờng thạch đĩa LB-agar, sau 48h nuôi cấy trong tủ ấm ở 37ºC, lấy
đĩa vi khuẩn ra quan sát bằng mắt thƣờng để nhận diện hình thái khuẩn lạc.
Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên
cạnh), chú ý về kích thƣớc, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày,
có núm hay khơng, độ trong, màu sắc (trên, dƣới, có khuếch tán ra mơi trƣờng
hay khơng).
2.4.2. Xác định hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc: Dựa trên sự nhau về cấu trúc khác của vách tế bào nên trong
quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dƣơng sẽ giữ đƣợc phức hợp tím
gentians-iod khơng bị tẩy màu bởi ancol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ
đƣợc phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dƣơng
vẫn giữ đƣợc màu tím của gentians, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của
safranine.
13


Cách tiến hành: Làm vết bôi vi khuẩn phẩm trên 1 lamen sạch. Để khô tự
nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt Crystal
Violet (tím kết tinh) cho phủ lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vòng 1 phút.
Rửa nhanh bằng nƣớc. Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều lên trên bề mặt vết
nhuộm và để yên trong vòng 1 phút. Rửa nhanh bằng nƣớc. Tẩy màu bằng cách
nghiêng lamen và nhỏ từ từ ancol (cồn) lên vết nhuộm, khi giọt ancol rời khỏi
lamen khơng có màu tím thì ngừng ngay. Rửa nhanh bằng nƣớc. Nhỏ vài giọt
safranine cho phủ đều trên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vịng 1 phút. Rửa

nhanh bằng nƣớc. Thấm khơ vết nhuộm và quan sát dƣới kính hiển vi với vật
kính x100.
Kết quả: vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn Gram dƣơng sẽ bắt
màu tím. Quan sát hình dạng vi khuẩn (cầu khuẩn, trực khuẩn,...) và cách sắp
xếp (chuỗi, chùm, rời rạc,...).
2.4.3. Xác định khả năng sinh nội bào tử
Xác định khả năng hình thành nội bào tử của vi khuẩn theo phƣơng pháp
của Schaeffer–Fulton cải tiến.
Nguyên tắc: Bào tử vi khuẩn là một phƣơng thức sống của vi khuẩn thích
nghi với các điều kiện mơi trƣờng khắc nghiệt, bào tử có 4 lớp, trong đó lớp thứ
hai là áo bào tử chứa lƣợng lớn protein sừng (50-80% lƣợng protein của vi
khuẩn), thẩm thấu kém và lớp thứ ba là vỏ bào tử chứa chủ yếu peptidoglican.
Do đó muốn thấm đƣợc thuốc nhuộm thì cần đun trên lửa đèn cồn trong 5 phút
làm biến tính protein bào tử, giúp thẩm thấu đƣợc xanh methylene vào lớp
protein và peptidoglican, làm bào tử bắt màu xanh. Tế bào chất của vi khuẩn giữ
màu kém nên lần nhuộm đầu bắt màu xanh nhƣng sau đó bị rửa trơi bởi nƣớc,
đồng thời các thành phần tế bào chất có tính kiềm nên sau đó lại bắt màu thuốc
nhuộm bổ sung có tính axit (axit fuchsin) nên có màu hồng.
Cách tiến hành: Lam kính đƣợc vơ trùng bằng cồn 70%, sau đó khuẩn lạc
của vi khuẩn đƣợc trải lên lam kính và đƣợc cố định bằng nhiệt (tạo vết bôi).
14


Phủ lên vết bơi một mảnh giấy lọc, sau đó dùng pipet nhỏ dung dịch xanh
methylene lên trên giấy lọc để nhuộm vết bơi. Mục đích của giấy lọc là lọc cặn
của dung dịch xanh methylene, giúp mẫu vi khuẩn sạch và dễ quan sát sau khi
nhuộm. Vừa nhỏ màu xanh methylene lên giấy lọc vừa đun nhẹ lam kính trên
đèn cồn, liên tục nhỏ thuốc nhuộm trong khi đun để tránh lam kính bị khơ
(nhƣng khơng để thuốc nhuộm sơi trên lam kính). Sau khi nhuộm với xanh
methylene trên ngọn đèn cồn trong 5 phút, để nguội lam kính và rửa lam bằng

nƣớc cất đến khi màu nƣớc rửa ra khơng cịn màu xanh. Hong khơ lam kính sau
khi rửa, tiếp theo lại nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm fuchsin trong một phút
(tƣơng tự nhƣ nhuộm xanh methylene). Tiếp theo rửa vết bôi với nƣớc cất và
quan sát dƣới kính hiển vi quang học với vật kính x100 trong giọt dầu.
Kết quả: Dƣới hiển vi trƣờng, bào tử của vi khuẩn bắt màu xanh của xanh
methylene và tế bào chất của vi khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin
2.4.4. Xác định khả năng sinh catalase
Nguyên tắc: Catalase hiện diện ở các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý.
Catalase thủy phân hydrogen perioxide (H2O2) thành H2O và O2, ngăn cản sự
tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 sẽ giải
phóng O2, đƣợc ghi nhận qua hiện tƣợng sủi bọt khí.
Cách tiến hành: Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 30% lên trên khuẩn lạc
Bacillus, hoặc chuyển một lƣợng vi sinh vật lên lamen rồi thử bằng dung dịch
H2O2 30%. Ghi nhận hiện tƣợng sủi bọt nếu có.
Kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tƣợng sủi bọt khí do O2 đƣợc tạo
ra, ngƣợc lại là (-) khi khơng có sủi bọt khí.
2.4.5. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn
2.4.5.1 Xác định hoạt tính amylase
Cách tiến hành: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trƣờng thạch đĩa có
thành phần khống chất cơ bản (KH2PO4 1g/l, (NH4)2SO4 0,5 g/l, NaCl 0,2 g/l,
(NH4)2SO4, CaCO3, MgSO4.7H2O 0,1 g/l, KCl 0,2 g/l, FeSO4.7H2O 0,002 g/l,
15


MnSO4.4H2O 0,002 g/l) bổ sung cơ chất của amylase là tinh bột 1%. Đặt đĩa cấy
trong tủ ấm ở 37ºC. Sau 48 giờ lấy đĩa cấy nhuộm với thuốc thử lugol 1% (w/v).
Sau khi nhuộm, rửa đĩa cấy với dung dịch NaCl 1M trong 15 phút. Quan sát đĩa cấy:
Nếu vi khuẩn có khả năng sinh amylase sẽ tạo vịng trong suốt quanh khuẩn lạc,
vùng tinh bột chƣa bị phân giải có màu tím đậm.
Kết quả: Đánh giá khả năng sinh amylase bằng cách đo đƣờng kính vịng

phân giải và đƣờng kính khuẩn lạc vi khuẩn. Hoạt tính enzyme đƣợc tính theo
cơng thức D/d. Trong đó D: đƣờng kính vịng phân giải cơ chất (cm), d: đƣờng
kính khuẩn lạc vi khuẩn (cm).
2.4.5.2 Xác định hoạt tính protease
Cách tiến hành: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên mơi trƣờng thạch đĩa có
thành phần khoáng chất cơ bản (KH2PO4 1g/l, (NH4)2SO4 0,5 g/l, NaCl 0,2 g/l,
(NH4)2SO4, CaCO3, MgSO4.7H2O 0,1 g/l, KCl 0,2 g/l, FeSO4.7H2O 0,002 g/l,
MnSO4.4H2O 0,002 g/l) bổ sung cơ chất của protease là casein 1%. Đặt các đĩa
cấy trong tủ ấm ở 37ºC. Sau 48 giờ lấy đĩa cấy nhuộm với thuốc thử Coomassie
blue 0,25% trong methanol : acid acetic : nƣớc tỉ lệ. Sau khi nhuộm, rửa đĩa cấy
với dung dịch NaCl 1M trong 15 phút. Quan sát đĩa cấy: Nếu vi khuẩn có khả năng
sinh protease sẽ tạo vịng trong suốt quanh khuẩn lạc, vùng chứa casein chƣa bị phân
giải có màu trắng xanh.
Kết quả: Đánh giá khả năng sinh protease bằng cách đo đƣờng kính vịng
phân giải và đƣờng kính khuẩn lạc vi khuẩn. Hoạt tính enzyme đƣợc tính theo
cơng thức D/d. Trong đó D: đƣờng kính vịng phân giải cơ chất (cm), d: đƣờng
kính khuẩn lạc vi khuẩn (cm).
2.4.5.3 Xác định hoạt tính cellulase
Cách tiến hành: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên mơi trƣờng thạch đĩa có
thành phần khoáng chất cơ bản (KH2PO4 1g/l, (NH4)2SO4 0,5 g/l, NaCl 0,2 g/l,
(NH4)2SO4, CaCO3, MgSO4.7H2O 0,1 g/l, KCl 0,2 g/l, FeSO4.7H2O 0,002 g/l,
MnSO4.4H2O 0,002 g/l) bổ sung cơ chất của protease là CMC 1%. Đặt các đĩa
16


cấy trong tủ ấm ở 37ºC. Sau 48 giờ lấy đĩa cấy nhuộm với thuốc thử Congo red
0,2%. Sau khi nhuộm, rửa đĩa cấy với dung dịch NaCl 1M trong 15 phút. Quan sát
đĩa cấy: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh khuẩn
lạc, vùng chứa casein chƣa bị phân giải có màu trắng xanh.
Kết quả: Đánh giá khả năng sinh cellulase bằng cách đo đƣờng kính vịng

phân giải và đƣờng kính khuẩn lạc vi khuẩn. Hoạt tính enzyme đƣợc tính theo
cơng thức D/d. Trong đó D: đƣờng kính vịng phân giải cơ chất (cm), d: đƣờng
kính khuẩn lạc vi khuẩn (cm).
2.4.6. Xác định khả năng chịu NaCl
Ƣu điểm của vi khuẩn Bacillus trong sản xuất chế phẩm sinh học là có thể
sinh trƣởng và phát triển trong mơi trƣờng có nồng độ muối cao, đây là đặc điểm
mà nhiều loài vi khuẩn khác khơng có.
Cách tiến hành: Cấy giống vi khuẩn (tỉ lệ 1% v/v) vào các bình tam giác
chứa mơi trƣờng dinh dƣỡng có thành phần gồm peptone 10 g/l, yeast extract
5g/l, bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau (1%, 2,5%, 5%, 7,5% và 10%)
tƣơng ứng với các công thức thí nghiệm khác nhau. Ni cấy vi khuẩn ở 37°C
trong 24 giờ.
Kết quả: Xác định khả năng chịu muối của vi khuẩn dựa trên mức độ sinh
trƣởng của vi khuẩn trong môi trƣờng dựa trên kết quả đo mật độ tế bào vi
khuẩn ở bƣớc sóng OD600nm
2.4.7. Xác định khả năng chịu nhiệt
Các chủng Bacillus có khả năng sinh trƣởng và phát triển ở nhiệt độ cao,
có thể lên đến trên 50°C. Đây là khoảng nhiệt độ mà nhiều loài vi sinh vật không
thể tồn tại, hoặc tồn tại chỉ trong một thời gian ngắn. Nếu chủng vi khuẩn ứng
dụng trong tạo chế phẩm sinh học có khả năng chịu nhiệt thì đó là một đặc tính
ƣu việt: Khi tạo chế phẩm sinh học, sinh khối vi khuẩn có thể đƣợc phối trộn với
chất mang ép thành viên và sấy ở nhiệt độ cao, hoặc nếu chủng vi khuẩn đƣợc

17