Nghiên cứu phân tích đa hình di truyền gen (beta lactoglobulin) của lợn đen định hóa bằng phương pháp pcr rflp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
----------o0o----------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN
(Beta-Lactoglobulin) CỦA LỢN ĐEN ĐỊNH HĨA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Hà Bích Hồng
PGS. TS. Bùi Văn Thắng

Sinh viên thực hiện

: Phạm Huyền Linh

Lớp

: K61 – CNSH

Khóa học

: 2016 - 2020

Hà Nội, 2020


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và rèn luyện tại trƣờng Đại học
Lâm Nghiệp để vƣợt qua những khó khăn, thử thách và đạt đƣợc những thành
cơng trong học tập, ngồi sự cố gắng của bản thân, tơi cịn đƣợc sự giúp đỡ tận
tình của các thầy cơ, gia đình và bạn bè.
Để hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp: “ Nghiên cứu phân tích đa
hình di truyền gen β-LG (Beta-Lactoglobulin) của lợn đen Định Hóa bằng
phương pháp PCR-RFLP”; với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến quý
thầy, cô Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp
đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tơi khơng chỉ trong q trình nghiên cứu khóa
luận tại trƣờng mà cịn trong cả q trình học tập của tơi tại trƣờng. Đặc biệt
cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô bộ môn Công nghệ Gen & Di truyền phân tử
của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp.
Tôi xin trân thành cảm ơn TS. Hà Bích Hồng và PGS.TS. Bùi Văn Thắng
đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tơi trong quá thực hiện đề tài khóa luận tốt
nghiệp tại trƣờng. Với những kiến thức và kỹ năng thầy cô truyền dạy khơng chỉ
giúp tơi có đƣợc nền tảng kiến thức hồn thành khóa luận mà cịn là hành trang
q báu cho sau này khi ra trƣờng.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất,
song cũng vẫn còn rất nhiều hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể
tránh khỏi những thiếu sót. Do vậy, tơi rất mong đƣợc sự góp ý từ các thầy, cơ
và các bạn để khóa luận tốt nghiệp của tơi đƣợc hồn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 7 năm 2020
Sinh viên

Phạm Huyền Linh

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT ............................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU........................................ 2
1.1 Tổng quan về Lợn đen Định Hóa.................................................................. 2
1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm ............................................................................... 2
1.1.2 Tập tính, chế độ ăn và sinh sản của Lợn đen .............................................. 4
1.1.3 Giá trị sử dụng của Lợn đen ........................................................................ 5
1.2 Gen β-LG (Beta-Lactoglobulin).................................................................... 8
1.2.1 Nguồn gốc cấu tạo và chức năng của gen β-LG ......................................... 8
1.2.2 Các nghiên cứu về gen β-LG trên thế giới ................................................ 11
1.3 Cơ sở khoa học của phƣơng pháp PCR-RFLP ........................................... 13
1.3.1 Khái niệm đa hình gen .............................................................................. 13
1.3.2 Kỹ thuật PCR ............................................................................................ 14
1.3.3 Kỹ thuật RFLP .......................................................................................... 17
1.3.4 Kỹ thuật PCR-RFLP ................................................................................. 18
CHƢƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU

VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 20
2.1 Mục tiêu cụ thể ............................................................................................ 20
2.1.1 Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 20

2.1.2 Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 20
2.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 20
2.3 Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 20
2.3.1 Dụng cụ nghiên cứu .................................................................................. 20

ii


2.3.2 Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 21
2.3.3 Hóa chất nghiên cứu.................................................................................. 22
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................. 23
2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số ...................................................... 23
2.4.2 Phƣơng pháp PCR ..................................................................................... 24
2.4.3 Phƣơng pháp cắt bằng enzyme giới hạn ................................................... 25
2.4.4 Phân tích đa hình các gen .......................................................................... 25
2.4.5 Phƣơng pháp điện di kiểm tra ................................................................... 26
2.4.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp thơi gel .............................. 27
2.4.7 Giải trình tự nucleotit ................................................................................ 27
2.4.8 Phƣơng pháp phân tích số liệu .................................................................. 27
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 28
3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu tai ................................................ 28
3.2 Kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi β-LG_F/R ........................... 29
3.3 Kết quả nhân bản đoạn gen β-LG ............................................................... 31
3.4 Kết quả giải trình tự nucleotit đoạn gen β-LG của Lợn đen Định Hóa ...... 33
3.4.1 So sánh trình tự β-LG với các trình tự gen công bố trên ngân hàng gen
quốc tế NCBI ....................................................................................................... 34
3.4.2. Kết quả xây dựng cây quan hệ di truyền dựa trên trình tự đoạn gen β-LG
37
3.5 Kết quả phân tích đa hình di truyền gen β-LG của giống Lợn đen Định Hóa
37

CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ ....................................... 40
4.1 Kết luận ....................................................................................................... 40
4.2 Tồn tại và kiến nghị..................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 41

iii


DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT
Các chữ viết
tắt
ATP
bp
cs
Da
DNA (DNA)
dNTP
EDTA
FA
F-Primer
kb
µl
mRNA
NAD(P)H

Nghĩa tiếng Anh
Adenosin triphosphat
Base pair
Dalton
Deoxyribonucleic acid

Deoxyribonucleotide
triphosphate
Ethylenediaminetetraacetic acid
fatty acids
Foward-Primer
Kilobase (1000 base)
Microlit
Messenger RNA
Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate

NCBI

National Center for
Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP
RNA
rRNA
RT
R-Primer
TAE
tRNA
UV
V/p

Restriction fragment length
polymorphism
Ribonucleic acid
Ribosomal RNA
Room temperature
Reverse primer
Tris-Acetate-EDTA
Transfer RNA
Untraviolet
v/p

iv

Nghĩa tiếng Việt
Adenosin triphosphat
Cặp base
Cộng sự
Axit deoxyribonucleic
Deoxyribonucleotid
triphosphate
axit ethylenediamine
tetraacetic
Axit béo
Mồi xuôi
1000 cặp base
RNA thông tin
Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate
Trung tâm Quốc gia về
Thơng tin Cơng nghệ

sinh học
Phản ứng chuỗi
polymerase
Phân tích đa hình trình
tự DNA
Axit ribonucleic
ARN ribosome
Nhiệt độ phịng
Mồi ngƣợc
Tris-Acetate-EDTA
ARN vận chuyển
Tia cực tím
Vịng / phút


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Hình ảnh Lợn đen Định Hóa ................................................................. 2
Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng số của 03 mẫu tai Lợn đen ....................... 28
Hình 3.2: Kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi β-LG_F/R ................... 30
Hình 3.3: Kết quả nhân bản đoạn gen ở cá thể Lợn đen Định Hóa .................... 32
Hình 3.4: Trình tự đoạn gen β-LG ở Lợn đen Định Hóa .................................... 34
Hình 3.5: So sánh trình tự sai khác nucleotit của gen β-LG ở Lợn đen Định Hóa
với trình tự tƣơng đống trên ngân hàng gen quốc tế ........................................... 36
Hình 3.6: Cây quan hệ di truyền giữa Lợn đen Định Hóa và một số lồi trên
ngân hàng gen quốc tế ......................................................................................... 37
Hình 3.7: Vị trí và trình tự nhận biết của enzyme giới hạn đối với đoạn gen βLG………………………………………………………………………………37

v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài ........................................ 21
Bảng 2.2: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài. ..................................... 22
Bảng 2.3: Trình tự cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR. ................................ 24
Bảng 2.4: Thành phần của một phản ứng PCR ................................................... 24
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt độ phản ứng................................................................... 25
Bảng 3.1: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-LG của Lợn đen Định Hóa với
các trình tự tƣơng đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI ................................ 35

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Lợn là một lồi vật ni có vai trị quan trọng trong ngành cơng nghiệp
chăn ni. Lợn cung cấp nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống con ngƣời và
cung cấp một nguồn phụ phẩm để làm phân bón phục vụ cho sản xuất nơng
nghiệp. Ở Việt Nam có rất nhiều giống Lợn bản địa có đặc điểm tốt nhƣ Lợn
đen ở vùng Định Hóa, Thái Nguyên. Về giá trị thƣơng phẩm, chất lƣợng thịt
Lợn đen tốt, da dày, thịt đỏ, khi chế biến có mùi thơm và dai.
Vấn đề ở đây là số lƣợng lợn đen thuần chủng hiện đang giảm mạnh xuống
mức đáng lo ngại, do vậy cần có những biện pháp để cải thiện khả năng sinh trƣởng,
sinh sản và phát triển của loài lợn này nhằm mục đích bảo tồn cũng nhƣ phát triển
quy mô chăn nuôi để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ của thị trƣờng.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về việc chọn lọc giống vật
nuôi bằng chỉ thị phân tử. Trong đó có các nghiên cứu về gene β-LG đã chỉ
ra tính tƣơng quan mật thiết giữa các gene này với mức độ sinh trƣởng và phát
triển của lồi Lợn đen cũng nhƣ các lồi động vật có vú khác. Cụ thể mã hóa 1
loại protein có nhiều trong sữa động vật là β-lactoglobulin có liên quan tới sản
lƣợng và chất lƣợng sữa.
Việc UBND tỉnh Thái Nguyên ra Quyết định 2150/QĐ-UBND ngày

08/10/2013 là một chủ trƣơng sáng suốt, kịp thời để bảo tồn nguồn gen con
giống trên địa bàn tỉnh trong đó có nhiệm vụ bảo tồn nguồn gen Lợn đen Định
Hóa mà trƣớc hết tiến hành các nghiên cứu bảo tồn, xác minh nguồn gốc giống
để đăng ký nguồn gen, tạo điều kiện đăng ký thƣơng hiệu Lợn đen Định Hóa
sau này. Ngồi ra đây là cơ hội để lƣu giữ nguồn nguyên liệu cho nhu cầu sản
xuất và tiêu dùng trong tƣơng lai, là vật liệu quý cho công tác đào tạo và
nghiên cứu khoa học về lĩnh vực chọn giống, di truyền, miễn dịch…
Để góp phần bảo tồn và phát triển Lợn đen Định Hoá, thực hiện nghiên
cứu về mối tƣơng quan giữa đa hình di truyền với các tính trạng sinh trƣởng,
sinh sản, chúng tơi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu phân tích đa hình di truyền
gene β-LG (Beta-Lactoglobulin) của lợn đen Định Hóa bằng phương pháp
PCR-RFLP”.

1


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1 Tổng quan về Lợn đen Định Hóa

ình 1.1: Hình ảnh Lợn đen Định Hóa
1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm
Định hóa là một huyện miền núi thuộc tỉnh Thái Nguyên của Việt Nam,
đã và đang sở hữu một nguồn gen vật nuôi bản địa quý đó là giống Lợn đen
Định Hóa. Do điều kiện địa lý, đồi núi cao hiểm trở, việc thông thƣơng có nhiều
hạn chế, ngƣời dân ni Lợn ở vùng núi huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên chỉ
giao dịch mua bán Lợn quanh huyện. Chính vì vậy, giống Lợn nội Việt Nam này
dần dần đƣợc nhân dân đặt tên là giống Lợn đen Định Hóa.

2

Lý do giống Lợn đen Định Hóa đến nay vẫn giữ đƣợc độ thuần chủng
nhất định vì chúng đƣợc ni tại một vùng núi cao, nơi mà nền kinh tế cịn kém
phát triển, điều kiện địa lý xa xơi, núi non hiểm trở và đặc biệt là hệ thống giao
thông rất kém nên việc pha tạp với các giống Lợn nhập ngoại và Lợn nội khác
của vùng đồng bằng hầu nhƣ khơng thể thực hiện đƣợc. Vì vậy, giống Lợn đen
Định Hóa vẫn giữ đƣợc mức độ cao về thuần chủng, chƣa bị lai tạp nhiều với
các giống Lợn nội và ngoại khác, song bị cận huyết khá cao.
Phân loại khoa học:
Giới (regnum)

: Animalia

Ngành (phylum)

: Chordata

Lớp (class)

: Mammalia

Bộ (ordo)

: Artiodactyla

Họ (familia)

: Suidae

Chi (genus)

: Sus

Loài (species)

:Sus domesticus

+ Đặc điểm nhận dạng: Lợn đen Định Hóa đa phần có màu lơng đen
tuyền, lƣng hơi võng, bụng sệ, mõm dài, bốn chân trắng. Đặc điểm lơng da của
lợn đen Định Hóa là khá đồng nhất, xƣơng nhỏ, thể trạng rắn chắc, thích nghi
với điều kiện địa hình ni thả rơng trên rừng núi.
+ Sinh học - Sinh thái: Lợn đen Định Hóa có khả năng sinh sản ở mức
trung bình. Lợn có tính chịu đựng kham khổ cao, có khả năng chịu đựng bệnh
tật rất tốt. Thức ăn chủ yếu là tận dụng các phế phụ phẩm nông nghiệp, phù hợp
với phƣơng thức chăn ni ở những vùng kinh tế khó khăn. Năng suất sản xuất
thịt ở mức trung bình.
+ Giá trị: Lợn có ngoại hình nhỏ, hƣớng sản xuất mỡ nạc, thịt nạc có màu
đỏ, thịt mỡ có màu trắng, da dầy và giịn, thịt có mùi thơm ngon.

3


1.1.2 Tập tính, chế độ ăn và sinh sản của Lợn đen
- Tập tính:
Lợn đen có sức đề kháng tốt, tính hung dữ giảm bớt so với lợn rừng thuần
nên dễ chăm sóc hơn, phù hợp với mơi trƣờng, khơng mắc bệnh nguy hiểm nhƣ
lợn rừng. Do đƣợc thuần hóa lâu đời nên có thể tiếp cận để chăm sóc thích nghi
tốt với điều kiện khí hậu khắc nghiệt của các huyện vùng cao, dễ ni, phàm ăn
và có sức đề kháng cao, chống chịu bệnh tốt. So sánh với các giống Lợn Việt

Nam, Lợn đen Định Hóa có tốc độ tăng trọng khá cao, thịt lại thơm ngon.
- Chế độ ăn:
Thức ăn cho lợn đen dễ tìm kiếm trong tự nhiên nhƣ lục bình, mía cây, bẹ
chuối, thân cây ngô non, rau muống, bèo tây, các loại cỏ, các loại quả xanh, thức
ăn tinh (hạt ngũ cốc, củ quả, mầm cây..), muối khống (tro bếp, đất sét). Nhìn
chung, thức ăn gồm có thức ăn xanh tƣơi (cây chuối, bẹ chuối, thân cây ngô non,
rau muống, bèo tây, các loại cỏ, các loại quả xanh v.v..), thức ăn tinh (hạt ngũ
cốc, củ quả, mầm cây, rễ cây các loại), muối khoáng (tro bếp, đất sét, hỗn hợp
đá liếm). Thức ăn cho Lợn đen chủ yếu là sản phẩm nông nghiệp, chuối cây, cỏ
bắp (chiếm khoảng 60 - 70% thành phần thức ăn) và một phần cám gạo.
Lợn ăn thức ăn xanh tƣơi ít uống nƣớc, tuy nhiên cũng cần có đủ nƣớc
sạch và mát cho Lợn uống tự do. Không nên sử dụng nhiều thức ăn tinh mà chủ
yếu sử dụng các loại thức ăn xơ nhƣ các loại rau, quả, củ để tránh hiện tƣợng
Lợn mập. Các loại rau cỏ nói chung (cỏ tự nhiên hoặc cỏ trồng), các thứ rau (rau
lang, rau muống), thân cây mềm (cây chuối), lá cây, cỏ họ đậu gọi chung là thức
ăn xanh. trong thức ăn xanh có nhiều chất dinh dƣỡng (Protein và Vitamine)
giúp Lợn đen mau lớn.
- Sinh sản:
Lợn đen Định Hóa có khả năng sinh sản ở mức trung bình, đẻ ít con và
sinh trƣởng chậm. Chính ngƣời dân địa phƣơng đã để tình trạng giống Lợn đen
Định Hóa, giao phối cận thân dẫn đến tình trạng Lợn đen Định Hóa bị cận huyết

4


rất cao, dần có nguy cơ bị tuyệt chủng. Họ không hề nuôi Lợn đực giống. Tất cả
con nái khi đến kỳ động dục đều đƣợc ngƣời chăn nuôi đi mƣợn những con Lợn
đực nuôi thƣơng phẩm, chƣa bị thiến, kích cỡ khoảng 20 - 25 kg về làm giống.
Chính vì sự thiếu sót này mà hiện tƣợng giao phối cận huyết rất phổ biến nên
chất lƣợng Lợn Định Hóa nhiều khi khơng ổn định, có nguy cơ đi xuống.

1.1.3 Giá trị sử dụng của Lợn đen
Tác dụng của Lợn đen
Thịt Lợn đen loại nuôi thả tự nhiên hay đƣợc gọi là Lợn chạy bộ chủ yếu
là do nuôi tự nhiên trong các gia đình trong một khơng gian rộng. Thông thƣờng
Lợn sẽ hoạt động nhiều hơn so với Lợn trắng ni cơng nghiệp chỉ nằm một
chỗ, vì thế mà miếng thịt Lợn đen thành phẩm sẽ săn chắc hơn, Lợn có sức đề
kháng tốt hơn, sử dụng thuốc tăng trọng ít hơn.
Ngồi ra, cũng do cách ni, nên thịt Lợn đen có tỉ lệ nạc và mỡ hài hịa
hơn, lƣợng mỡ thấp hơn, chất đạm cao hơn.
Hầu hết các chất béo trong thịt Lợn đen là axit béo chƣa no, sử dụng một
lƣợng thích hợp, thƣờng xun có thể có hiệu quả trong việc làm giảm nhẹ bệnh
tim mạch, mạch máu não. Tuy nhiên, thịt Lợn đen chứa axit, chất béo khơng bão
hịa cao hơn thịt Lợn bình thƣờng, vì thế chỉ nên thi thoảng thƣởng thức, khơng
cần thiết phải ăn uống thƣờng xuyên.
Thịt Lợn đen có tỉ lệ nạc cao, có cả chất béo cao trong phần thịt, nấu chín
có hƣơng vị thơm ngon. Nhƣng nếu so sánh với thịt Lợn trắng thơng thƣờng thì
giá trị dinh dƣỡng chung khơng có sự khác biệt lớn, chỉ ngon hơn phần hƣơng vị
và cảm giác khi ăn.
Lợi ích đến sức khỏe con người
Thịt Lợn là loại thịt đỏ, thịt mỡ mãu trắng, da dầy và giịn có mùi vị thơm
ngon phổ biến trên toàn thế giới, đặc biệt là ở miền đông Châu Á. Đây là một
loại thực phẩm giàu protein và chứa nhiều chất béo khác nhau. Chính vì thế, thịt
Lợn có nhiều lợi ích liên quan đến vấn đề sức khỏe.

5


Chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết
Hàm lƣợng protein của thịt Lợn nạc, nấu chín là khoảng 26% trọng lƣợng
tƣơi. Khi khơ, hàm lƣợng protein của thịt Lợn nạc có thể lên tới 89% làm cho nó

trở thành một trong những nguồn protein giàu dinh dƣỡng nhất.
Thực phẩm này cũng chứa tất cả chín axit amin thiết yếu cần thiết cho sự
tăng trƣởng và phát triển cơ thể của bạn.
Vì lý do này, ăn thịt Lợn hoặc các loại thịt khác có thể đặc biệt có lợi cho
ngƣời tập thể hình, vận động viên phục hồi, ngƣời sau phẫu thuật hoặc những
ngƣời khác cần phát triển cơ bắp.
Hơn nữa, thịt Lợn là một nguồn phong phú của nhiều vitamin và khống
chất, bao gồm thiamine. Khơng giống nhƣ các loại thịt đỏ khác, chẳng hạn nhƣ
thịt bò và thịt cừu, thịt Lợn đặc biệt giàu thiamine - một trong những vitamin B
có vai trị thiết yếu trong các chức năng cơ thể khác nhau.
Chứa nhiều vitamin và các khoáng chất
Thịt Lợn là một nguồn phong phú của nhiều vitamin và khoáng chất, bao
gồm:
 Thiamine: Không giống nhƣ các loại thịt đỏ khác, chẳng hạn nhƣ thịt bò và
thịt cừu, thịt Lợn đặc biệt giàu thiamine - một trong những vitamin B có vai
trị thiết yếu trong các chức năng cơ thể khác nhau.
 Kẽm: Một khống chất quan trọng, có nhiều trong thịt Lợn, kẽm rất cần thiết
cho một bộ não khỏe mạnh và hệ miễn dịch.
 Vitamin B12: Hầu nhƣ chỉ đƣợc tìm thấy trong thực phẩm có nguồn gốc
động vật, vitamin B12 rất quan trọng đối với sự hình thành máu và chức
năng não. Thiếu vitamin này có thể gây thiếu máu và tổn thƣơng tế bào thần
kinh.
 Vitamin B6: Vitamin B6 quan trọng đối với sự hình thành của các tế bào
máu đỏ.

6


 Da thịt Lợn đen có chứa vitamin E, collagen và elastin nhiều hơn, nếu ăn
thƣờng xuyên, có thể có vai trị trong việc phịng chống lão hóa.

 Thịt Lợn đen giàu vitamin A, có thể giúp duy trì chức năng bình thƣờng của
thị lực và sức khỏe các tế bào biểu mơ, có lợi cho da.
 Thịt Lợn đen khá giàu chất sắt, protein và vitamin… đều là những chất mà
chế độ ăn của ngƣời hiện đại đang bị thiếu hoặc thấp. Đặc biệt, lƣợng chất
béo và cholesterol thấp hơn thịt Lợn bình thƣờng, giúp cơ thể cân bằng dinh
dƣỡng, bổ sung khống chất, vitamin và protein.
Duy trì cơ bắp
Giống nhƣ hầu hết các loại thực phẩm động vật, thịt Lợn là một nguồn
protein chất lƣợng cao tuyệt vời. Do tác động tuổi tác, duy trì cơ bắp là một cân
nhắc sức khỏe quan trọng.
Không tập thể dục và chế độ ăn uống hợp lý, khối lƣợng cơ bắp bị thối
hóa một cách tự nhiên khi bạn già đi - một thay đổi bất lợi có liên quan đến
nhiều vấn đề sức khỏe liên quan đến tuổi tác.
Trong những trƣờng hợp nghiêm trọng nhất, suy giảm cơ bắp dẫn đến một
tình trạng mức độ khối lƣợng cơ rất thấp và giảm chất lƣợng cuộc sống. Hiện
tƣợng này là phổ biến nhất ở ngƣời lớn tuổi.
Hấp thụ đủ chất lƣợng protein chất lƣợng cao có thể đẩy lùi q trình
thối hóa cơ liên quan đến tuổi tác - làm giảm nguy cơ mắc bệnh sarcop.
Ăn thịt Lợn - hoặc các thực phẩm giàu protein khác - là một cách tuyệt
vời để đảm bảo đủ lƣợng protein chất lƣợng cao có thể giúp duy trì khối lƣợng
cơ bắp.
Cải thiện hiệu suất tập thể dục.
Tiêu thụ thịt khơng chỉ có lợi cho việc duy trì khối lƣợng cơ bắp mà cịn
có thể cải thiện chức năng cơ bắp và hiệu suất thể chất.

7


Bên cạnh việc giàu protein chất lƣợng cao, thịt Lợn chứa nhiều chất dinh
dƣỡng lành mạnh có lợi cho cơ bắp của bạn. Chúng bao gồm taurine, creatin, và

beta-alanine.
Beta-alanine là một axit amin mà cơ thể bạn sử dụng để sản xuất
Carnosine, rất quan trọng đối với chức năng cơ bắp.
Trên thực tế, mức độ cao của Carnosine trong cơ bắp của con ngƣời có
liên quan đến việc giảm mệt mỏi và cải thiện hiệu suất thể chất.
1.2 Gen β-LG (Beta-Lactoglobulin)
1.2.1 Nguồn gốc cấu tạo và chức năng của gen β-LG
Gene β-LG dài 8088bp (Genbank accession: Z33881.1) gồm 7 exon và 6
intron xen kẽ nhau. Ở Lợn, gen β-LG nằm trên nhiễm sắc thể số 1; gen β-LG
đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể 11 ở bộ gen của dê và gia súc, trên nhiễm sắc
thể 3 trong bộ gen cừu (Hayes và Petit, 1993). Trong sữa của động vật nhai lại,
protein β –lactoglobulin tự nhiên đƣợc tìm thấy nhƣ là một dimer với trọng
lƣợng phân tử là 36,4 kDa tƣơng ứng với 162 axit amin [24]. β-LG có trong sữa
của động vật nhai lại và không nhai lại nhƣ lợn, ngựa, chó, mèo, cá heo và thú
có túi (Pérez và cs. 1989 ; Sawyer và Kontopidis 2000 ) [39]. Điều thú vị là nó
khơng có ở ngƣời, sữa lagomor và động vật gặm nhấm (Sawyer và
Kontopidis 2000 ) [32]. Với nồng độ 3,2 g/L trong sữa bò trƣởng thành, β-LG
chiếm khoảng 10% tổng số protein sữa và khoảng 50 - 60% trong tổng số
protein whey. Có một số biến thể di truyền của β-lg, với các biến thể A và B là
phổ biến nhất (Godovac-Zimmermann và cs. 1996) [19]. Cả hai biến thể này đều
chứa 162 axit amin, nhƣng chúng khác nhau bởi hai axit amin ở vị trí 64 và 118.
Biến thể A có dƣ lƣợng axit aspartic ở vị trí 64 và dƣ lƣợng valine ở vị trí 118,
trong khi biến thể B có glycine và alanine ở các vị trí này, tƣơng ứng. Cả hai
biến thể đều chứa năm cysteine (Cys), nằm ở các vị trí 66, 106, 119, 121 và 160.
Các cystein này tạo thành hai liên kết disulfide, giữa Cys66 và Cys160, và giữa
Cys106 và Cys119 (Papiz và cs. 1986) [31]. Cys121 là một thiol tự do đƣợc

8

chôn trong trung tâm cấu trúc β-LG (Qin và cs. 1998 ; Burova và cs. 1998 ) [34]
và tham gia vào sự ổn định của protein tự nhiên (Barbiroli và
cs. 2011; Croguennec và cs. 2004 ; Jayat và cs. 2004 ).
Cấu trúc thứ cấp của β-LG bao gồm 15% α-helix, 50% β-sheet và 15 20 % đảo ngƣợc (Creamer và cs. 1983 ; Sawyer và Kontopidis 2000 )[15]
[39]. Chín chuỗi đƣợc dán nhãn từ A đến I, tạo thành hai tấm và ba vòng xoắn α
đƣợc xoắn để sắp xếp để tạo thành cấu trúc hình cầu β-LG. Cấu trúc cấp ba của
β-LG. Trong dung dịch nƣớc và ở pH trung tính, các tấm tạo thành một thùng
phẳng và hình nón, đƣợc gọi là đài hoa (Papiz và cs. 1986 ; Brownlow và
cs. 1997 ) [29] [13]. Nòng súng này có hai tấm connected đƣợc nối bởi sợi A ở
một bên, trong khi kết nối thứ cấp đƣợc hình thành giữa các sợi D và E. Chuỗi
xoắn đƣợc gắn giữa các sợi A và H và theo sau là sợi thứ chín đƣợc gọi là I
(Sawyer và Kontopidis 2000 ) [36]. Trong protein tự nhiên, các liên kết disulfide
liên kết các chuỗi G với H (Cys106 12 Cys119) và chuỗi D đến đầu C (Cys66
canh Cys160). Nhóm thiol tự do không thể tiếp cận đƣợc với các dung môi trong
cấu trúc protein tự nhiên và do đó khơng có sẵn cho các phản ứng trong điều
kiện sinh lý (Qin và cs. 1998 ; Burova và cs. 1998) [31]. Calyx đƣợc đóng ở một
đầu bởi vịng N-terminal và có thể đƣợc đóng ở đầu kia bằng vịng lặp EF trong
điều kiện pH thấp. β-LG thuộc họ protein lipocalin, thƣờng chứa barrel-thùng,
bên trong có thể tìm thấy các phân tử kỵ nƣớc nhỏ (Hoa 1996 ). Các biến thể A
và B của-lg có cấu trúc bậc ba tƣơng tự nhau ở pH trung tính vì các axit amin
khác nhau giữa hai biến thể nằm trên một vòng bề mặt di động và trong lõi kỵ
nƣớc (Sawyer và Kontopidis 2000 ; Qin và cs. 1999) [39] [34]. Trong điều kiện
sinh lý, β-LG ở trạng thái cân bằng giữa các đơn phân và các chất làm mờ khơng
cộng hóa trị. Nồng độ protein, pH, cƣờng độ ion và nhiệt độ ảnh hƣởng đến
trạng thái cân bằng này và do đó tỷ lệ các monome và các chất làm giảm khơng
cộng hóa trị trong dung dịch (Aymard và cs. 1996 ; Renard và cs. 1998 ;
Verheul và cs. 1999 ; Mercadante và cs. 2012; ) [12].

9

Sản phẩm của gene β-LG sau khi mã hóa là protein β –lactoglobulin, 1
loại protein Whey, loại protein đƣợc nghiên cứu rộng rãi và đƣợc biết là liên kết
các phối tử kỵ nƣớc nhƣ FA hoặc vitamin. Tuy nhiên, ngoài sự đóng góp dinh
dƣỡng của các thành phần riêng lẻ (β-LG và phân tử), các chức năng sinh học
của protein, phân tử phức tạp vẫn cịn mang tính đầu cơ. Vai trò giả định sẽ là
tăng sự hấp thụ FA, điều chỉnh động học của quá trình thủy phân enzyme của
protein (Puyol và cs. 1993 ; Mandalari và cs. 2009 )[32], bảo vệ các phân tử
nhạy cảm chống lại quá trình oxy hóa (Futterman và Heller 1972 ) hoặc các ứng
dụng khác, và sửa đổi khả năng tiếp cận sinh học của các phân tử (Puyol và
cs. 1995 ; Riihimäki-Lampén 2009 )[33]. Ngồi ra, trong các sản phẩm thực
phẩm, tính chất liên kết và do đó tính chất sinh học của phức hợp β-lg phân tử
có thể bị ảnh hƣởng bởi cấu trúc của β-LG hoặc sự hiện diện của các protein
khác có khả năng cạnh tranh với -LG cho liên kết phân tử . Thông tin liên quan
đến sự tƣơng tác của các β-LG không bản địa với các phối tử kỵ nƣớc và sự
cạnh tranh giữa β-LG và các protein khác đối với các phối tử kỵ nƣớc đƣợc mô
tả kém trong tài liệu. Về tác động của sự tƣơng tác giữa các chất dinh dƣỡng
trong các sản phẩm thực phẩm và chức năng sinh học của chúng sẽ giúp thiết kế
các sản phẩm thực phẩm với các đặc tính dinh dƣỡng đƣợc tối ƣu hóa. Nó cũng
sẽ hỗ trợ một bức tranh dinh dƣỡng chi tiết hơn về sữa và các sản phẩm sữa.
Chức năng của β -lactoglobulin chƣa đƣợc xác định một cách chính xác
nhƣng có thể nói protein này có liên quan mật thiết tới sản lƣợng và chất lƣợng
sữa. β- lactoglobulin đƣợc chứng minh là một protein thuộc họ lipocalin. Đây là
một nhóm protein thú vị và đa dạng, tuy nhiên lại chƣa đƣợc hiểu rõ dƣới góc
nhìn của khoa học. Thơng qua q trình nghiên cứu, ngƣời ta thấy đƣợc các
protein thuộc họ lipocalin có tính đặc hiệu liên kết ngoại bào cao đối với các
phân tử kị nƣớc nhỏ nhƣ steroid, bilins, retinoids và lipid. β-lactoglobulin có thể
liên kết với nhiều phân tử kị nƣớc cùng lúc. Qua đó cho thấy vai trị vận chuyển
quan trọng. Bên cạnh đó, β-lactoglobulin cịn đƣợc chứng minh là có khả năng

10


liên kết với ion Fe3+ thông qua Siderophore, thể hiện vai trò trong việc chống
lại các tác nhân gây bệnh [6].
1.2.2 Các nghiên cứu về gen β-LG trên thế giới
Theo nghiên cứu trên thế giới, Gene β-LG có 2 allen là A và B tạo ra 3
kiểu gene AA, AB và BB. Một trong hai allen này đƣợc tạo ra bởi một sự thay
thế nucleotide đơn tại vị trí +4601 (Pena và cộng sự, 2000). Phân tích thống kê
cho thấy xu hƣớng chung là kiểu gene AA cho năng suất sữa cao hơn 2 kiểu
gene AB và BB. Các biến thể khác nhau đã đƣợc xác định cho gene β-LG ở
dê ở mức độ phân tử đã phát hiện sự có mặt của q trình thay thế nucleotide
G thành A tạo nên vị trí nhận biết điểm cắt của enzyme giới hạn SacII. Sau đó,
Kumar và cộng sự năm 2006 đã nghiên cứu đa hình gen β-LG trong tám giống
dê địa phƣơng khác nhau ở Ấn Độ và xác định đƣợc ba kiểu gen khác nhau
của gene β-LG. Rout và cộng sự (2010) cũng quan sát thấy hai biến thể A và
B này trong cùng một giống dê [9].
Amr A. El Hanafy và cộng sự ( 2014) [ 1 0 ] đã tiến hành nghiên cứu
đa hình đoạn gene β-LG trên 100 cá thể của 3 giống dê địa phƣơng ở Ả Rập
là Ardi, Habsi và Harri. Kết quả cho thấy tỉ lệ allele A xuất hiện ở giống Ardi
là 0,28 và allen B là 0,72. Tƣơng tự ở giống Harri allen A xuất hiện với tần
số 0,09 và allen B là 0,74. Giống Habsi xuất hiện allen A với tần số 0,43 và
allen B với tần số 0,57. Trong một nghiên cứu khác của Amr A. El Hanafy và
cộng sự (2010) [10] cho thấy tần số của các kiểu gen AA, AB và BB là
(0,1; 0,8; 0,1); (0,85; 0,1; 0,05); (0,41; 0,51; 0,08) ở giống dê Barki,
Damascus và giống dê lai của chúng. Tần suất allen A ở giống Damascus
cao hơn ở giống Barki và giống lai Damascus x Barki và sản xuất lƣợng sữa
cao hơn đáng kể so với hai giống dê còn lại. Kumar và cộng sự (2006) cũng
nhận thấy rằng kiểu gene β-LG có ảnh hƣởng đáng kể đến năng suất sữa ở
cả hai loài dê Jamunapari và Barbari. Thống kê cho thấy kiểu gene AA có

năng suất sữa cao hơn kiểu gene AB ở cả giống Jamunapari và Barbari [10].

11


Nghiên cứu của Vitomir Vidovic và cs (2014); Là một trong những gen
quan trọng có thể ảnh hƣởng đến các đặc điểm kinh tế quan trọng ở gia súc, locus
β-lactoglobulin (-LG) có đã đƣợc nghiên cứu trƣớc đây. Tính đa hình của gen βLG đƣợc phát hiện sáu thập kỷ trƣớc đây và tổng cộng có 15 alen đƣợc biết đến,
trong đó, có 5 biến thể phổ biến; A B C D, và E đƣợc xác định rõ. Tuy nhiên, các
alen A và B thƣờng xuyên nhất [Elmaci et al. 2006, Matejicek và cộng sự. 2007].
Trong các thí nghiệm nhằm mục đích điều tra ảnh hƣởng của Kiểu gen β-LG
về sản xuất và chất lƣợng sữa đã đƣợc tìm thấy rằng kiểu gen AA của β- LG
có tác động thuận lợi đến năng suất protein và sự liên kết cao hơn đáng kể
Hàm lƣợng chất béo, protein, casein, protein thực sự và tổng chất rắn với biến
thể BB cũng đã đƣợc báo cáo [Matejicek et al. 2007]. Mục đích của nghiên
cứu này là xác định các alen (A và B) và kiểu gen (AA, AB và BB) của βlactoglobulin trong quần thể bò Holstein-Friesian, đánh giá chúng tần số
trong quần thể này và để nghiên cứu ảnh hƣởng của kiểu gen β-lactoglobulin
về năng suất và chất lƣợng sữa. Nghiên cứu bao gồm 765 con bò HolsteinFriesian, con cái của 18 con đực giống (6 con mỗi con nhóm kiểu gen: AA,
AB và BB). Việc cô lập DNA đã đƣợc thực hiện sau Sambrook et al. [1989],
phản ứng PCR đƣợc thực hiện bởi Popovski [1999] và mồi cho PCR bởi
Braunschweig và Leeb [2006]. Phân tích phƣơng sai một chiều (ANOVA)
đƣợc áp dụng để xác định ảnh hƣởng của các biến thể di truyền β- LG (AA,
AB và BB) về hàm lƣợng chất béo và protein và năng suất của sữa từ bò sữa
Holstein-Friesian. Trong số 765 con bò đƣợc nghiên cứu, tần số kiểu gen và
tần số gen của β- Kiểu hình của lactoglobulin là: 172 con bị có kiểu gen AA,
có 450 kiểu gen AB và 145 kiểu gen BB. Tần số của kiểu gen AA, AB và BB
là 0,23, 0,58 và 0,19, tƣơng ứng. Trong 765 con bò Holstein-Friesian, các tỷ
lệ kiểu gen β-lactoglobulin sau đây đã đƣợc tìm thấy: 0,23 Aa, 0,58 AB và
0,19 BB. Những con bò có kiểu gen AA mang lại nhiều sữa và chất béo sữa
hơn những con bò của kiểu gen AB và BB. Có sự khác biệt đáng kể (P <0,01)

12


trong sản lƣợng protein sữa do bò sản xuất của kiểu gen AB, BB và AA. Sữa
từ bị có kiểu gen AA và BB chứa cao hơn một chút tỷ lệ phần trăm chất béo
sữa khi so sánh với sữa của những con bị có kiểu gen Lactoglobulin AB. Tỷ
lệ phần trăm protein sữa cao hơn trong sữa của bò có kiểu gen BB và AB.
Kiểu gen-Lactoglobulin có tác động đáng kể đến năng suất protein sữa (P
<0,01), nhƣng không có ảnh hƣởng đến các tính chất quan sát khác của sữa
[30].
Theo Ajay Kumar và cộng sự (2006) [9], Tính đa hình trong gen β-LG
ở dê Ấn Độ đã đƣợc điều tra bởi SDS-PAGE và phƣơng pháp PCR-RFLP.
SDS-PAGE đƣợc thực hiện trong 1098 mẫu thuộc 8 giống dê Ấn Độ khác
nhau. Kiểu điện di trong locus -LG cho thấy sự hiện diện của kiểu gen AA và
AB với tần số là 0,81 và 0,19; 0,89 và 0,11; 0,50 và 0,50; 0,80 và 0,20; 0,84 và
0,16; 1,00 và 0,00; 0,98 và 0,02 và 0,950 và 0,050 ở dê Jamunapari, Barbari,
Marwari, Sirohi, Jakhrana, Beetal, Local UP và Local MP dê. Tổng cộng có
358 cá thể thuộc 13 nhóm di truyền khác nhau đƣợc phân tích bằng phƣơng
pháp PCR-RFLP. Sản phẩm đƣợc khuếch đại đƣợc quan sát cho thấy ba kiểu
gen, cụ thể là S1S1, S1S2 và S2S2 tại quỹ tích β-LG. Tần số của kiểu gen
S2S2 nằm trong khoảng từ 0,42 đến 1,00 trong dân số. Một phân tích đã đƣợc
thực hiện ở dê Jamunapari và Barbari để quan sát ảnh hƣởng của β-LG kiểu
gen trên sản lƣợng sữa 90 ngày. Phân tích dữ liệu bình phƣơng nhỏ nhất cho
thấy động vật β-LG AA có sữa cao hơn năng suất cao hơn kiểu gen β-LG AB
ở cả hai giống (P <0,01) [8].
1.3 Cơ sở khoa học của phƣơng pháp PCR-RFLP
1.3.1 Khái niệm đa hình gen
Tính đa hình gen do alen quyết định, gen có nhiều alen thì tính đa hình
càng cao. Gregor Mendel (1856) định nghĩa alen nhƣ sau: ―Alen là các dạng

khác nhau của một gen cùng quy định một tính trạng‖. Từ sau năm 1925, sau khi
Mogan thành công trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, thì alen đƣợc

13


định nghĩa lại nhƣ sau: ―Alen là các dạng khác nhau của cùng một gen định vị
trên một locus của cùng một nhiễm sắc thể cùng quy định cùng một tính trạng
nào đó ở cơ thể sinh vật‖.
Sự đa hình DNA là những biến đổi trong trình tự DNA của một cá thể, sự
biến đổi đó có thể hoặc khơng thể ảnh hƣởng lên kiểu hình. Sự biến đổi này
thƣờng đƣợc phát hiện qua nhiều phƣơng pháp sinh học phân tử khác nhau.
Những biến đổi đƣợc phát hiện có ảnh hƣởng lên kiểu hình đƣợc xem nhƣ một
marker đặc hiệu cho biến đổi đó. Điều đó có nghĩa là nếu một cá thể có cùng sự
đa hình đó, có thể sẽ biểu hiện một vài đặc điểm tƣơng tự khác.
1.3.2 Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là phƣơng pháp đƣợc sử dụng
rộng rãi trong xét nghiệm DNA và sinh học phân tử để tạo ra nhiều bản sao của
một trình tự DNA cụ thể.
Thơng qua PCR, một đoạn DNA với lƣợng rất nhỏ (chỉ vài nanogram) có
thể đƣợc khuếch đại theo cấp số nhận để tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn trình
tự DNA đó.
PCR hiện là một kỹ thuật cơ bản quan trọng và thƣờng không thể thiếu
đƣợc trong quy trình nghiên cứu của các phịng thí nghiệm về sinh học phân tử,
y sinh, khoa học hình sự, pháp y và xét nghiệm DNA.
Phƣơng pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1983.
Phƣơng pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo ra số lƣợng bản sao rất lớn của gen
trong một thời gian ngắn, phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi
tính của đoạn DNA và nguyên lý tổ hợp của DNA. Trên cơ sở trình tự của đoạn
DNA khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase có thể

tổng hợp đƣợc đoạn DNA đích mong muốn.
PCR dựa trên việc sử dụng khả năng của enzyme DNA polymerase để
tổng hợp chuỗi DNA mới từ chuỗi DNA ban đầu đƣợc cung cấp. Bởi vì DNA

14


polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide vào nhóm 3′-OH có từ trƣớc, nên
enzyme này cần một đoạn DNA mồi để có thể thêm nucleotide đầu tiên.
Yêu cầu này cho phép phân định một vùng cụ thể của chuỗi mẫu mà nhà
nghiên cứu muốn khuếch đại. Khi kết thúc phản ứng PCR, trình tự cụ thể sẽ
đƣợc tích lũy thành hàng tỷ bản sao của đoạn trình tự DNA ban đầu.
 Thành phần của một phản ứng PCR thƣờng bao gồm:
 Dung dịch DNA mẫu (DNA template) chứa đoạn DNA cụ thể đã đƣợc tinh
sạch để nhân bản.
 Primers: là các đoạn DNA mồi, thƣờng có độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ
định vị điểm bắt đầu và điểm kết thúc của đoạn DNA mẫu.
 DNA polymerase: là enzyme có nhiệm vụ tổng hợp các đoạn DNA mới là
bản sao của trình tự DNA ban đầu. Enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao
và thƣờng sử dụng trong PCR là Taq polymerase.
 Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm 4 loại (A, T,
G, C) –> là các thành phần cơ bản, đƣợc xem nhƣ những ―viên gạch‖ cấu tạo
nên cấu trúc của DNA –> DNA polymerase sử dụng các dNTPs để tổng hợp
nên các trình tự DNA bản sao.
 Dung dịch đệm (buffer solution): cung cấp môi trƣờng hoạt động cho
enzyme DNA polymerase
 Ống PCR (PCR tube): là dụng cụ plastic chuyên dụng dùng để phối trộn
dung dịch phản ứng PCR trƣớc khi cho vào thiết bị thực hiện PCR (Thermal
cycler)
Thông thƣờng, PCR bao gồm một chuỗi khoảng 20 - 40 lần biến đổi nhiệt

độ lặp đi lặp lại, gọi là chu kỳ, mỗi chu kỳ thƣờng gồm 2 - 3 giai đoạn nhiệt độ
riêng biệt, thƣờng là ba. Các chu kỳ thƣờng bắt đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao
(>90°C), và sẽ dừng lại khi sản phẩm cuối cùng đƣợc tổng hợp hoặc dừng lại ở
nhiệt độ thấp để lƣu trữ sản phẩm PCR trong thời ngắn. Nhiệt độ và thời gian
thực hiện của mỗi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Những yếu tố này gồm

15


enzyme tổng hợp DNA, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng trong phản ứng, và
nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi.
Giai đoạn khởi đầu: (Chỉ cần đối với những enzyme DNA polymerase bắt
buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ). Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94 - 96°C
(hay 98°C nếu sử dụng polymerases cực kỳ bền nhiệt) và đƣợc tiến hành trong 1
- 9 phút.
Giai đoạn biến tính: đây là bƣớc đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng
nhiệt độ lên 94 - 98°C trong 20 - 30 giây. DNA đƣợc biến tính bằng cách phá vỡ
liên kết hydro giữa các bazơ, tạo thành phân tử DNA sợi đơn.
Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50 - 65°C trong 20
- 40 giây để mồi gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho
phép mồi bắt cặp với sợi DNA, nhƣng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc
hiệu, nghĩa là, mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch
khn. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu q cao, mồi có
thể khơng gắn. Thơng thƣờng nhiệt độ gắn mồi thƣờng thấp hơn 3 - 5°C so với
Tm của mồi dùng trong phản ứng. Liên kết hydro bền giữa phân tử AND - DNA
chỉ đƣợc hình thành khi mồi bổ sung hồn tồn với khn. Polymerase liên kết
với các phân tử lai DNA mồi - khuôn và bắt đầu tổng hợp DNA.
Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các DNA
polymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ƣu ở 75 - 80°C ,
và nhiệt độ 72°C thƣờng đƣợc sử dụng với enzyme này. Tại giai đoạn này DNA

polymerase tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA khuôn bằng cách thêm
dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùng ngƣng xảy
ra giữa nhóm 5′ - phosphate của dNTP với nhóm 3′ - hydroxyl phía cuối của sợi
DNA vừa mới đƣợc hình thành. Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào
DNA polymerase và độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại. Thông thƣờng, các
DNA polymerase có khả năng khuếch đại đƣợc hàng nghìn bazơ nitơ trên một
phút. Trong điều kiện tối ƣu, tức là, nếu khơng có hạn chế do giới hạn của cơ

16


chất hoặc chất phản ứng thì sau mỗi giai đoạn kéo dài, số lƣợng DNA đƣợc
khuếch đại sau mỗi chu kì tuân theo hàm mũ.
Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn này đôi khi đƣợc thực hiện ở nhiệt
độ 70 - 74°C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ƣu của hầu hết các
enzyme polymerase dùng trong phản ứng PCR), với thời gian 5 - 15 phút sau
chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo rằng tất cả DNA sợi đơn còn lại đều đƣợc
tổng hợp hoàn toàn.
Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4 - 15°C trong
một thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng.
1.3.3 Kỹ thuật RFLP
Trong sinh học phân tử, đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, hay là RFLP
(thƣờng đọc là "rif-lip"), là kỹ thuật khai thác những khác biệt trong trình tự
DNA. Trong phân tích RFLP, DNA mẫu đƣợc cắt thành các đoạn nhỏ bằng cách
sử dụng các enzyme cắt giới hạn, và sau đó các đoạn DNA nhỏ tạo thành đƣợc
phân tách dựa theo kích thƣớc bằng kỹ thuật điện di trên gel. Mặc dù ngày nay
kỹ thuật này đã trở nên lỗi thời do bị thay thế bởi công nghệ giải trình tự, RFLP
là cơng nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên đủ rẻ để có thể đƣợc ứng dụng
một cách rộng rãi. RFLP là công cụ quan trọng trong lập hồ sơ di truyền, lập bản
đồ hệ gen, định vị gen chịu trách nhiệm cho các rối loạn di truyền, xác định

nguy cơ mang bệnh, và xét nghiệm phả hệ.
Kỹ thuật cơ bản trong xác định RFLP bao gồm việc cắt mẫu DNA bằng
enzyme cắt giới hạn, là các enzyme nhận biết và cắt một đoạn DNA ngắn đặc
hiệu. Các mảnh DNA tạo ra sau đó đƣợc phân tách bằng quá trình điện di trên
gel agarose, và đƣợc chuyển lên màng lai thơng qua quy trình lai Southern. Sự
lai (bắt cặp đặc hiệu) của một đoạn DNA trên màng với đoạn mẫu dò (DNA
probe) xảy ra khi trình tự của chúng bổ sung với nhau. Xuất hiện RFLP khi kích
thƣớc của đoạn DNA trên màng bắt cặp với đoạn mẫu dò là khác nhau giữa các
sinh vật.

17


1.3.4 Kỹ thuật PCR-RFLP
Phƣơng pháp PCR-RFLP là một phƣơng pháp nghiên cứu đa hình chiều
dài dựa trên các phân đoạn sản phẩm PCR đƣợc cắt bởi các enzyme giới hạn
thích hợp. Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các loại enzyme khác nhau, tạo ra
các đoạn cắt DNA khác nhau đƣợc phân biệt thơng qua q trình điện di trên
gel. Nhƣ vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR-RFLP gồm các giai đoạn sau:
- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để phân lập đoạn DNA
cần phân tích sự đa hình.
- Tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzyme giới hạn thích hợp.
- Chạy điện di để xác định sự khác nhau của các băng DNA và đƣa ra kết
luận.
Kỹ thuật PCR-RFLP có thể phát hiện một số thay đổi trong trình
tự nucleotide liên quan đến vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phƣơng pháp
này hiện nay đƣợc ƣa thích và sử dụng phổ biến trong nhiều phịng thí nghiệm
trên thế giới do tính đơn giản và chi phí thấp, có khả năng tiến hành phân tích
đồng thời với số lƣợng mẫu lớn, thời gian cho kết quả nhanh.
Ƣu điểm

Không tốn kém.
Dễ thiết kế.
Áp dụng cho phân tích các đa hình đơn nucleotide.
Khơng yêu cầu đối với các công cụ thiết bị đắt tiền.
Không yêu cầu đào tạo chuyên sâu cho nhân viên phịng thí nghiệm.
Nhƣợc điểm
u cầu sinh ra một biến thể hoặc một vị trí thay đổi đƣợc enzyme giới
hạn nhận biết.
Một số enzyme giới hạn đắt tiền.
Không thể đạt đƣợc kiểu gen chính xác trong trƣờng hợp có nhiều hơn
một nucleotide bị thay đổi trong trình tự enzyme giới hạn có thể nhận biết.

18