Nghiên cứu đa dạng di truyền giống na bở (annona squamosa) tại thái nguyên bằng chỉ thị phân tử rapd

LỜI CÁM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Bùi Văn Thắng, ThS.
Nguyễn Thị Huyền đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và hết lịng giúp đỡ để tơi
hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Xin cám ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, các cán
bộ của Phòng Quản lý tổng hợp đã tạo mọi điều kiện giúp tơi hồn thành khóa
luận.
Tơi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đặc biệt đến cán bộ Bộ môn Công nghệ
gen và Di truyền phân tử đã giúp đỡ về mặt tinh thần cũng nhƣ tạo mọi điều kiện
về mặt vật chất, các trang thiết bị kĩ thuật cho tơi trong suốt q trình thực hiện
đề tài.
Xin chân thành cám ơn các thầy cô, các anh chị và bạn bè đồng nghiệp ở
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho tôi những lời khuyên rất chân
thành và những sự giúp đỡ hết sức quý báu.
Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân, bạn bè, những
ngƣời ln động viện, khuyến khích và giúp đỡ về mọi mặt để tơi có thể hồn
thành khóa luận.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Hà Thị Bích

i


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Na ............................................................................ 3
1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây Na.............................................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học ....................................................................................... 5
1.1.3. Giá trị sử dụng và lợi ích kinh tế của cây Na bở......................................... 7
1.2. Xác định đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử ........................................... 9
1.2.1. Chỉ thị RFLP ( Restriction fragment length polymorphism) ...................... 9
1.2.2. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat – SSR) ......................................... 10
1.2.3.Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymophism) ...................... 11
1.2.4. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .......................... 11
1.3. Ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền
ở cây ăn quả ......................................................................................................... 13
1.3.1. Trên thế giới .............................................................................................. 13
1.3.2. Tại Việt Nam ............................................................................................. 15
CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 18
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 18
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 18
2.3. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 18
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 18
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 19
2.4. Hóa chất và thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ............................................... 19
2.4.1. Hóa chất..................................................................................................... 19
ii


2.4.2. Máy móc, thiết bị ...................................................................................... 19
2.5. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu .............................................................. 19
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 21
2.6.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số....................................................... 21
2.6.2. Phƣơng pháp PCR - RAPD ....................................................................... 22

2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose ....................................................... 23
2.6.4. Xây dựng giản đồ phả hệ .......................................................................... 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 25
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .................................................................. 25
3.2. Kết quả phân tích đa hình các phân đoạn DNA nhận đƣợc từ 21 mồi RAPD
............................................................................................................................. 26
3.3. Xây dựng giản đồ phả hệ.............................................................................. 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 39
1. Kết luận: .......................................................................................................... 39
2. Kiến nghị: ........................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

iii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ

STT

Từ viết tắt

1

DNA

Deoxyribonucleic Acid

2

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

3

EDTA

Ethylenediaminetetra Acetic Acid

4

PCR

5

RAPD

Random Amplyfied Polymorphism DNA

6

RELP

Restriction fragment length polymorphism

7

AFLP

Amplified Fragment Length Polymophism

8

SSR

Simple Sequence Repeat

9

TAE

Tris – Acetic acid - EDTA

10

cs

11

NST

Polymerase Chain Reaction

Cộng sự
Nhiễm sắc thể

iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Kí hiệu các mẫu Na bở sử dụng cho nghiên cứu ................................ 18
Bảng 2.2. Trình tự các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu. ........................... 20
Bảng 2.3: Thành phần dung dịch đệm rửa .......................................................... 22
Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách ......................................................... 22
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên .......................... 22
Bảng 2.6. Chu kì phản ứng PCR ......................................................................... 23
Bảng 3.1. Số liệu mã hóa các băng DNA thu đƣợc khi điện di mồi OPB10 và CP16
............................................................................................................................. 27
Bảng 3.2. Số liệu mã hóa các băng DNA thu đƣợc khi điện di mồi CP02 và CP03
............................................................................................................................. 29
Bảng 3.3. Số liệu mã hóa các băng DNA thu đƣợc khi điện di mồi CP06 và
CP08 .................................................................................................................... 32
Bảng 3.4. Kết quả sử dụng mồi RAPD trong nghiên cứu................................... 33
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng di truyền của các mẫu Na bở nghiên cứu .............. 35

v


DANH MỤC HÌNH
Hình1.1. Na bở tại núi đá Hà Giang [4]. ............................................................... 5
Hình 1.2. Hình thái Na bở [5]. .............................................................................. 6
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số 7 mẫu Na bở nghiên cứu tách chiết từ lá. . 25
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR – RAPD với mồi OPB10 ........................ 26
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP16 ........................... 27
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP02 ........................... 28
Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP03. .......................... 29
Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP08. .......................... 31
Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP06. .......................... 31

Hình 3.8: Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 7 mẫu Na bở. ..... 36

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam nằm trong vành đai nhiệt đới gió mùa ẩm đã tạo nên sự đa dạng
về sinh thái, khí hậu có nhiều nét độc đáo và đa dạng, tài nguyên đất, nƣớc
phong phú. Điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển nghề trồng cây ăn
quả, trong đó có cây na. Hiện nay, cây na không chỉ đƣợc biết đến với việc phủ
xanh đất trống, đồi núi trọc mà còn đƣợc biết đến bởi giá trị mà nó mang lại. Ở
một số tỉnh nhƣ: Lạng Sơn, Tuyên Quang, Hà Giang, Quảng Ninh,v.v, cây na
đƣợc xếp vào là loại cây ăn quả chủ lực, thúc đẩy sự phát triển kinh tế, góp phần
xóa đói giảm nghèo cho bà con nơng dân. Quả na cịn là đặc sản của một số địa
phƣơng, không chỉ đƣợc tiêu thụ trong nƣớc mà cịn đƣợc xuất khẩu ra nƣớc
ngồi. Những năm gần đây, sản phẩm quả na trở thành hàng hóa đƣợc rất nhiều
ngƣời tiêu dùng biết đến với mùi vị ngọt đặc trƣng, quả to và cùi quả na có chứa
nhiều tinh bột, ngồi ra cây na cịn có rất nhiều công dụng nhƣ làm dƣợc liệu
chữa bệnh cho ngƣời, thuốc trừ côn trùng. Cây na sớm cho quả, sản lƣợng lại
cao, dễ dàng tiêu thụ nên cây na đã chiếm vị trí quan trọng trong sản xuất nơng
nghiệp và trong phát triển kinh tế ở nhiều địa phƣơng. Na là loại cây ăn quả dài
ngày thích hợp với các vùng đất trung du và miền núi đặc biệt với núi đá vơi bởi
đó mà cây na khơng chỉ mang lại giá trị kinh tế cao mà cịn góp phần cải thiện
môi trƣờng sinh thái, hạn chế lũ lụt, xói mịn, sạt nở đất. Với những lợi ích đó
cây na cần đƣợc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển giống để mở rộng quy mô sản
xuất, đem lại lợi ích cho ngƣời dân.
Để bảo tồn và phát triển nguồn gen cây na hiệu quả, điều trƣớc tiên cần
biết thông tin về đa dạng di truyền làm cơ sở khoa học. Phƣơng pháp phân tích
đa dạng di truyền là phƣơng pháp phân tích những biến dị trong cấu trúc di
truyền của các cá thể bên trong hoặc giữa các loài, những biến dị bên trong hoặc

giữa các quần thể. Chính nhờ vậy mà sự ra đời của các chỉ thị phân tử trong
nghiên cứu, chọn lọc, phân lập và bảo tồn là hết sức có ý nghĩa. Chỉ thị RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA) cho phép xác định tính đa hình các
1


đoạn DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên đƣợc dùng nhƣ một biện pháp hữu hiệu và
có độ chính xác khá cao đã đƣợc áp dụng thành công trên nhiều đối tƣợng cây trồng
khác nhau nhƣ cây lâm nghiệp, cây dƣợc liệu và đặc biệt là cây ăn quả.
Trên Thế giới đã có một vài cơng bố về việc xác định mức độ đa dạng di
truyền của một số loài trong chi Annona nhƣ: Annona muricata L (Brown và cs,
2003), giống lai A. cherimola và A. Squamosa (Bonning và cs, 1995). Tuy
nhiên, ở Việt Nam chƣa có cơng trình nào cơng bố về việc nghiên cứu đa dạng
di truyền về loài na. Chính vì vậy, vấn đề này cần đƣợc quan tâm và nghiên cứu.
Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền giống Na bở (Annona
squamosa) tại Thái Nguyên bằng chỉ thị phân tử RAPD” đƣợc thực hiện
nhằm đánh giá tiềm năng, tính đa dạng di truyền của các giống Na bở đang đƣợc
canh tác cũng nhƣ tạo điều kiện thuận lợi cho việc quản lý nguồn tài nguyên giống
trong nƣớc. Đồng thời, đề tài cịn góp phần tạo nền cơ sở khoa học cho công tác lai
tạo và chọn giống để cải thiện phẩm chất của các giống Na bở nội địa.

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Na
1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây Na
 Phân loại
Cây Na bở thuộc:

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta).
Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida).
Phân Lớp: Ngọc Lan (Magnoliidae).
Bộ: Na (Annonales).
Họ: Na (Annonaceae).
Chi : Annona.
Tên khoa học: Annona squamosa.
Tên khác: Sa lê, Mãng cầu ta, Mãng cầu dai, Mác kiếp (Tày), Phan lệ chi.
Chi Annona gồm 5 loài:
1. Annona glabra
2. Annona muricata
3. Annona reticulata
4. Annona squamosa
5. Annona montana
Trong đó, giống Na bở thuộc lồi Annona squamosa
Tên thơng thƣờng: tùy theo mỗi quốc gia mà na có tên gọi khác nhau nhƣ:
Anh: sweet sop, sugar apple; Pháp: attire, pomme cannelle (táo quế); Tây Ban
Nha: annona, annona blanca; Haïti: cachiman cannelle; Mã Lai: no-na; Thái
Lan: noi-na; Việt Nam: na, mãng cầu. [19]
 Nguồn gốc và phân bố:
Cây Na bở có nguồn gốc ở vùng châu Mỹ nhiệt đới. Nguồn gốc bản địa
của loại cây này là ở quần đảo Angti, hiện nay cây đƣợc trồng khắp nơi trong đó
có Việt Nam.
- Trên Thế giới:
3


Na đƣợc trồng ở Mexico, Trung Mỹ trƣớc khi lan xuống Nam Mỹ nhiệt
đới. Cây na đƣợc du nhập vào châu Á, châu Phi nhiệt đới và bán nhiệt đới vào
cuối thế kỷ 16 và đầu thế kỷ 17. Ngày nay, Australia là nƣớc sản xuất và xuất

khẩu nhiều na nhất thế giới. [20]
- Ở Việt Nam:
Ở nƣớc ta, cây na đƣợc trồng rộng rãi ở cả miền Bắc và miền Nam, vùng
phân bố của cây na khá rộng. Trừ những nơi mùa đơng lạnh, có sƣơng muối
khơng trồng đƣợc na cịn hầu hết các tỉnh đều có thể trồng na. Na là cây ăn quả
có giá trị tiềm năng kinh tế rất lớn nó góp phần khơng nhỏ trong việc xóa đói,
giảm nghèo đối với một số vùng miền núi đồng thời góp phần phủ xanh đất
trống đồi núi trọc và tạo công ăn việc làm dƣ thừa lớn trong xã hội. Trong những
năm gần đây cây na đã đƣợc chú trọng phát triển, một số vùng trồng na hiện nay
trên nƣớc ta là:
- Vùng đồi gò Hà Tây cũ: một héc ta na giá trị sản phẩm đạt đƣợc khoảng
33 triệu đồng/1 năm, thu nhập thuần đạt 23 triệu.
- Tây Ninh là tỉnh có diện tích trồng na lớn nhất nƣớc. Diện tích trồng na
của tỉnh tập trung ở chân núi Bà Đen (thị xã Tây Ninh). Đến năm 2008, tỉnh Tây
Ninh có khoảng 3,036 héc ta na (xã Thạch Tân có hơn 600 ha) với sản lƣợng đạt
23,136 tấn (Trần Thế Tục ,2008).
- Na Chi Lăng (Lạng Sơn): Cây na đƣợc coi là cây ăn quả đặc sản của
huyện Chi Lăng. Trong những năm gần đây, diện tích trồng na của huyện tăng
dần, từ 789,54 ha năm 2000 lên 936,9 ha năm 2005, 1.025,4 ha năm 2006 và
1.776,0 năm 2009 (Liên giám thống kê tỉnh Lạng Sơn, năm 2008). Vùng na tập
trung nhiều nhất ở xã Chi Lăng, thị trấn Chi Lăng, thị trấn Đồng Mô, xã Mai
Sao, ... [21].
Với hƣơng vị đặc trƣng và giá trị dinh dƣỡng, na xứng đáng đƣợc xếp vào
loại cây ăn quả nhiệt đới có giá trị. Chính nhờ những giá trị quan trọng đó nên
những năm gần đây, diện tích và sản lƣợng na trên thế giới nói chung và nƣớc ta
nói riêng tăng liên tục.

4

Hình1.1. Na bở tại núi đá Hà Giang [22].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
 Đặc điểm hình thái
Cây Na bở là cây gỗ nhỏ cao khoảng 2-8m. Thân non màu nâu bạc, thân
già màu nâu xám, trên thân có nhiều lỗ bì nhỏ và sẹo lá lồi to rõ. Lá Na bở dạng
lá đơn, mép nguyên, lá mọc xen ở hai hàng, phiến lá hình mũi mác, dài 9-13 cm,
rộng 3-5 cm. Lá có màu xanh đậm ở mặt trên và nhạt màu hơn ở mặt dƣới, mặt
dƣới có ít lơng ở gân lá và nhiều đốm vàng ở phần thịt lá. Gân lá hình lơng chim
nổi rõ mặt dƣới, nhiều gân phụ mọc đối hoặc khơng đối nhau ở bìa phiến. Cuống
lá hình trụ gần trịn, đáy phình to và xanh đậm hơn. Cây Na bở khơng có lá kèm.
Na có cụm hoa với nhiều hoa riêng lẻ mọc đối diện với lá hoặc xim ít hoa mọc ở
cành già. Hoa có màu xanh, cánh đều, lƣỡng tính, cuống hoa cũng có màu xanh
và dài từ 0,8-1,1 cm. Hoa có lá bắc dạng vẩy tam giác, màu xanh, tồn tại lâu; đế
hoa lồi. Quả na dạng quả tụ, mỗi lá noãn cho ra 1 quả mọng riêng biệt (múi na)
và tất cả các quả này dính vào nhau tạo thành một khối hình tim hoặc hình cầu
đƣờng kính 7-10 cm. Mặt ngồi quả (vỏ quả) có màu xanh chia nhiều rãnh, thịt
quả màu trắng, mềm và ngọt khi chín. Hạt na hình bầu dục với một đầu thn
trịn, vỏ hạt màu đen nhẵn bóng, dài khoảng 2-3 cm. [23]

5


A

C

B
Hình 1.2. Hình thái Na bở [23].
Ghi chú: A: hình thái cây
B: Hình thái quả

C: Hình thái lá và hoa
 Đặc điểm sinh thái:

Cây na thích hợp khí hậu nhiệt đới, tuy nhiên cây vẫn trồng đƣợc ở cả
vùng nóng, vùng có mùa đơng lạnh và vùng Á nhiệt đới. Cây na mọc giữa trời
nắng hay có mái che đều đƣợc. Gặp thời tiết lạnh hay khô hạn kéo dài cây dễ bị
rụng lá, tuy không chết nhƣng trái sẽ khơng nhiều và khơng lớn. Cây thích hợp
nhất trên loại đất phù sa. Tuy nhiên trồng trên đất nhiều vôi và magiê (Mg) trái
to và ngọt hơn.

6


Cây na đƣợc nhân giống bằng hạt và nhân giống vơ tính bằng biện pháp
ghép cành. Cây trồng từ 4-5 năm mới cho quả. Cây ít sâu bệnh, tuy vậy cần chú
ý phịng trị rệp sáp, đây là lồi rất phổ biến ở các vƣờn ít chăm sóc. [23]
1.1.3. Giá trị sử dụng và lợi ích kinh tế của cây Na bở
 Giá trị sử dụng
Quả na có vị rất ngon và nó có thể đƣợc dùng để làm sinh tố, kem hoặc
thêm vào các món salad trái cây. Tuy nhiên, hạt na lại khơng tốt cho sức khỏe vì
vậy, khi ăn bạn phải bỏ hết hạt đi. Quả na là một nguồn tuyệt vời của vitamin C.
Một quả na trung bình có thể cung cấp 1/5 lƣợng vitamin C mà cơ thể cần hàng
ngày. Chính nhờgiàu vitamin C mà loại quả này đƣợc coi là rất hữu ích trong
việc tăng cƣờng hệ miễn dịch của con ngƣời. Danh sách các chất có trong quả na
bao gồm các chất dinh dƣỡng thiết yếu, chất chống oxy hóa, vitamin và khống
chất. Do đó, loại quả rất có lợi cho sức khỏe của mọi ngƣời. Bên cạnh đó, quả na
cịn có các công dụng sau:
-

Cải thiện chức năng tim: Sự cân bằng giữa natri và kali trong quả na đóng

góp rất nhiều trong việc điều chỉnh mức huyết áp và nhịp tim, hàm lƣợng chất
chống oxy hóa tự nhiên và vitamin C phong phú có thể giúp ngăn ngừa các gốc
tự do tấn cơng các chất béo và do đó ngăn chặn đƣợc các cholesterol có hại cho
cơ thể. Vitamin C cịn giúp cơ thể tăng sức đề kháng, chống lại tác nhân gây
bệnh. Tất cả những yếu tố này đều tác động tích cực đến tim và cải thiện chức
năng tim.
-

Giảm táo bón: Một quả na ngon và lành mạnh sẽ chứa nhiều chất xơ và

chất xơ đã đƣợc chứng minh là rất có lợi cho việc tiêu hóa và bài tiết thức ăn
trong cơ thể…
-

Tốt cho não bộ: Trong quả na có khá nhiều lƣợng vitamin B6. Loại

vitamin này rất có lợi cho hoạt động của não bộ vì nó kiểm sốt mức độ hóa học
thần kinh GABA, loại bỏ sự căng thẳng, làm dịu thần kinh. Chính vì vậy,nếu
muốn tốt cho não bộ bạn hãy ăn na nhiều hơn. Ngồi ra, vitamin B6 thậm chí

7


còn đƣợc coi là để giảm bớt nguy cơ mắc bệnh parkinson, do đó, quả na cịn có
thêm tác dụng phòng bệnh parkinson.
-

Phòng bệnh ung thƣ: Các chất chống oxy hóa trong quả na nhƣ một số

poly-phenol, asimicin và bullatacinare… đƣợc coi là có thể giúp phịng chống
các bệnh ung thƣ, sốt rét và bệnh giun rất hiệu quả. Ngoài ra, quả na cịn có một
số giá trị sức khỏe khác nhƣ bảo vệ chống lại nhiễm trùng nƣớu răng, tăng sự
thèm ăn, cải thiện sức khỏe của da, hỗ trợ vệ sinh răng miệng, cải thiện sức khỏe
răng miệng, làm giảm mệt mỏi, cải thiện sức khỏe của phổi và làm giảm cảm
giác tê ở chân.
Hạt na thƣờng đƣợc dùng diệt côn trùng, trừ chấy rận. Lá na dùng để trị
sốt rét, mụn nhọt sƣng tấy, ghẻ. Rễ và vỏ cây dùng để trị tiêu chảy và trị giun.
Cây na không chỉ là cây ăn quả trong vƣờn nhà mà nó cịn giúp tiểu cảnh sân
vƣờn trở nên đẹp hơn, thôn quê và mộc mạc hơn, gợi nhớ về tuổi thơ của mỗi
ngƣời. Ngồi ra, cây na cịn đƣợc trồng chậu vừa làm cây cảnh trang trí, vừa làm
cây ăn quả, lại thuận tiện cho việc chăm sóc cây và bố trí cây trong vƣờn. [19]
 Lợi ích kinh tế của cây na
Từ một loại cây ăn quả đƣợc ngƣời dân đem về trồng từ những năm 80
của thế kỷ trƣớc, lúc đầu cũng nhƣ bao cây ăn quả khác, cây na chủ yếu để phục
vụ nhu cầu của các hộ gia đình trong các thơn bản. Nhƣng vì cây na thích nghi
rất tốt với điều kiện đất đai, khí hậu của nhiều cùng núi đá vơi ở Việt Nam nên
đến nay, cây na không chỉ là cây ăn quả xóa đói giảm nghèo mà cịn là cây trồng
chủ lực mang lại sự ấm no, giàu có cho đồng bào tại nhiều vùng miền của Tổ
quốc. Riêng với huyện Chi Lăng – Lạng Sơn đến nay đã có gần 1.000 ha na đủ
điều kiện để cấp giấy chứng nhận sản xuất na an tồn theo Thơng tƣ 51/TTBNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Đặc biệt, huyện Chi
Lăng đã xây dựng thành công hơn 100 ha na theo tiêu chuẩn VietGAP và 5 ha
theo tiêu chuẩn GlobalGAP để hƣớng đến xuất khẩu sang các thị trƣờng trên thế
giới nhƣ: Nhật Bản, Hàn Quốc, Australia… Một số xã của tỉnh Tuyên
Quang cũng đang đẩy mạnh việc trồng na và đƣa na vào làm cây trồng chính để

8


phát triển kinh tế, ở xã Lực Hành có khoảng trên 90 ha diện tích trồng na, sản

lƣợng đạt gần 700 tấn, năm 2016 doanh thu từ bán na đạt hơn 8,5 tỷ đồng. Nhờ
trồng và bán na, nhiều hộ dân đã thoát nghèo và trở thành hộ khá, giàu. [24]
1.2. Xác định đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử (molecular markers) hay còn gọi với các tên khác nhau
nhƣ dấu phân tử, dấu chuẩn phân tử là một đoạn DNA liên kết với một vị trí nào
đó trong hệ genome. Chỉ thị phân tử đƣợc sử dụng trong sinh học phân tử và
công nghệ sinh học để nhận biết một đoạn DNA chƣa biết. Ngày nay, chúng
đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền nhờ các đặc tính ƣu việt
và hiệu quả của chúng đem lại.
Chỉ thị phân tử đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực: nghiên cứu đa dạng di
truyền, lập bản đồ liên kết tính trạng, chọn lọc phân tử, nghiên cứu di truyền
quần thể. Có nhiều loại chỉ thị khác nhau: RAPD, RELP, SSR, AFLP, v.v. [25]
1.2.1. Chỉ thị RFLP ( Restriction fragment length polymorphism)
RFLP là chỉ thị DNA đầu tiên đƣợc áp dụng cho lập bản đồ. Kĩ thuật này
dựa trên cơ sở sử dụng các endonuclease hạn chế cắt DNA hệ gen ở trình tự
nhận biết đặc trƣng, tạo ra hàng loạt đoạn có độ dài xác định, số lƣợng của các
đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen. Nếu một trình tự nhận
biết có mặt ở một vị trí trên hệ gen của một cá thể nhƣng khơng có mặt ở các cá
thể khác, enzyme sẽ tạo ra các đoạn hạn chế có kích thƣớc khác nhau ở vị trí
này. Đa hình độ dài này đƣợc phát hiện bởi đánh dấu phóng xạ các mẫu dị DNA
bổ sung tạo ra từ cùng một locut. RFLP địi hỏi phải chuẩn hóa một thƣ viện các
đoạn DNA đƣợc phân lập vào một số vector. Thƣ viện các mẫu dị này có thể
dựa trên hệ gen hoặc cDNA.
RFLP là chỉ thị đồng trội. RFLP là chỉ thị rất đáng tin cậy trong phân tích
liên kết và chọn giống vì chúng có thể xác định đƣợc một tính trạng ở trạng thái
đồng hợp hoặc dị hợp trong một cá thể. Thông tin này rất có ý nghĩa đặc biệt đối
với các tính trạng lặn.
Mặc dù có những ƣu điểm, sự ứng dụng của RFLP là tốn kém và mất thời
gian. Chỉ một chỉ thị cho một đa hình, đây là vấn đề nghiêm trọng đặc biệt trong
9

các cặp lai giữa các dịng có quan hệ gần. Đối với mỗi locut đa hình phải thực
hiện một thí nghiệm và đây là một nhiệm vụ khó vƣợt qua với những bản đồ chi
tiết với hàng trăm chỉ thị. Phƣơng pháp này cũng đòi hỏi một lƣợng lớn DNA
(50 – 200 μg DNA từ một cá thể), vật liệu từ đời F2 dễ bị cạn kiệt và điều này
hạn chế số lƣợng của các chỉ thị có thể đƣợc kiểm tra. Để khắc phục vấn đề này
cần dùng một quần thể ổn định để phân tích RFLP.
1.2.2. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat – SSR)
SSR là kĩ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là
nhận ra sự thay đổi các alen xảy ra ở locut SSR là kết quả của sự thay đổi số lần
lặp lại của các đơn vị. Sự khác nhau về độ dài ở locut SSR đƣợc phát hiện bởi sự
nhân DNA nhờ PCR dùng cặp mồi oligonucleotide có trình tự bổ sung với SSR.
Kích thƣớc của sản phẩm PCR đƣợc xác định một cách chính xác bằng điện di
trên gel polyacrylamide. Sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). SSR thích
hợp cho lập bản đồ, nghiên cứu QTL và in dấu DNA (DNA fingerprinting).
SSR cho thấy mức độ đa hình cao ở hầu hết các lồi thực vật, thậm chí
trong các kiểu gen có quan hệ gần gũi, với số lƣợng lớn các alen tìm thấy ở mỗi
locut và dị hợp tử đƣợc đánh giá thƣờng lớn hơn 0,7. Di truyền đồng trội đƣợc
quan sát ở các alen này ở nhiều lồi khác nhau.
Vì SSR đƣợc phân tích nhờ PCR, chỉ địi hỏi một lƣợng nhỏ DNA mẫu,
phản ứng có thể hồn thành (từ chuẩn bị mẫu đến phân thích kiểu gen) chỉ trong
hai ngày. Mỗi mồi có từ 1 đến 12 locut đƣợc tổ hợp trong một phản ứng PCR
cho phép đồng thời ghi nhận các kiểu gen nhiều locut, điều này tiết kiệm đáng
kể thời gian và hóa chất.
Hạn chế của chỉ thị SSR là địi hỏi cơng sức, là giá thành cao trong việc
xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locut đa hình bao gồm việc tách dịng và
đọc trình tự một số lƣợng lớn các đoạn DNA hệ gen chứa SSR. Điện di sản
phẩm PCR cho phép phân biệt đƣợc sự giống nhau và khác nhau giữa các cá thể
trong cùng loài.

10


1.2.3.Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymophism)
Kĩ thuật AFLP ra đời mang nhiều thuận lợi cho phân tích di truyền và lập
bản đồ. AFLP kết hợp đƣợc chính xác của RFLP và sự tiện lợi của PCR vì vậy
AFLP đã nhanh chóng trở thành một kĩ thuật đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay.
AFLP khơng địi hỏi việc phân lập và đọc trình tự. AFLP hoạt động dựa
trên nhiều nguyên tắc tƣơng tự nhƣ RAPD nhƣng mồi bao gồm một phần cố
định dài hơn (15bp) chứa vị trí nhận biết của các enzyme hạn chế và một phần
thay đổi ngắn (2 – 4 bp). Phần cố định dài tạo ra sự ổn định của sản phẩm đƣợc
nhân lên, phần thay đổi ngắn sẽ tạo ra nhiều locut - có thể trên 100 locut đƣợc
nhân lên với một tổ hợp mồi AFLP. Sản phẩm nhận đƣợc đƣợc phân tích bằng
điện di trên gel polyacrylamide có độ phân giải cao. AFLP phát hiện một cách
có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen đã đƣợc cắt (bởi enzyme hạn chế) và đuwocj
gắn với đoạn tiếp hợp (adapter). Sự đa hình đƣợc xác định bởi sự có mặt hoặc
khơng có mặt của một băng. Vì AFLP phát hiện rất nhiều locut nên rất có ích
trong phân tích di truyền và hiệu quả trong phát hiện đa hình DNA thậm trí
trong các thứ có quan hệ gần gũi.
Mặt hạn chế của AFLP có thể là phát sinh vốn có của số lƣợng lớn thơng
tin, địi hỏi phải có các phƣơng pháp xử lý số liệu tƣ động trong q trình phân
tích. Tuy nhiên, điều này có thể đƣợc giải quyết bằng các chƣơng trình máy tính.
AFLP là kĩ thuật có khả năng lặp lại cao. Khả năng lặp lại cao của AFLP
đƣợc đảm bảo vì sử dụng các đoạn tiếp hợp đặc trƣng vị trí hạn chế và các mồi
có trình tự bổ sung đoạn tiếp hợp với một số lƣợng nucleotide thích hợp và có
các điều kiện nhân đoạn DNA hết sức chặt chẽ.
1.2.4. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Sự ra đời của PCR (Polymerase Chain Reaction) đã làm thay đổi rất lớn
trong lĩnh vực sinh học phân tử, chính sự đơn giản và tiện lợi của PCR đã đƣa

đến sự phát triển hàng loạt các phân tử mới nhƣ RAPD, AFLP, SSR,... Các kĩ
thuật dựa trên PCR đã khắc phục đƣợc phần nào những nhƣợc điểm của RELP:

11


khơng sử dụng phóng xạ và phân tích dựa trên PCR chỉ đòi hỏi khoảng 10%
lƣợng DNA cần dùng trong RELP.
Trong các kĩ thuật dựa trên cơ sở PCR trƣớc hết phải kể đến RAPD, Kĩ
thuật này dựa vào một mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên gồm khoảng 10 base chứa
60% hoặc hơn G+C để đạt đƣợc liên kết chặt hơn với DNA khuôn. Sự nhân lên
của sản phẩm PCR xảy ra khi vị trí gắn mồi ở hai điểm có định hƣớng ngƣợc
nhau, trong khoảng 2000 base dọc theo NST.
RAPD là kĩ thuật khơng địi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát
hiện nhiều locut cùng một lúc. Kĩ thuật này đơn giản, không đắt và nhanh.
RAPD tạo ra các đoạn DNA không mang chức năng mã hóa, có kích
thƣớc từ <100 bp đến nhiều hơn 2 kp. Sự khác nhau của các đoạn nói chung là
do đột biến ở vị trí gắn mồi làm ngăn cản việc bắt cặp mồi. DNA thu đƣợc nhân
lên sau đó đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm với ethidium
bromide và quan sát dƣới đèn tử ngoại. Số liệu thu đƣợc là sự có mặt hoặc vắng
mặt của các đoạn này, chỉ thị RAPD đƣợc xem nhƣ các yếu tố trội trong di
truyền Mendel ở một cơ thể lƣỡng bội.
Ƣu điểm của kĩ thuật PCR mồi ngẫu nhiên là khơng địi hỏi hiểu biết về
trình tự DNA trong cơ thể đƣợc nghiên cứu, đòi hỏi một lƣợng DNA nhỏ, thời
gian từ chuẩn bị mẫu đến đọc kết quả ngắn, kĩ thuật phịng thí nghiệm đơn giản.
Thêm vào đó giá thành cho mỗi hân tích thấp, phân tích dễ dàng cho một số
lƣợng mẫu lớn. Mỗi mẫu phân tích số liệu của nhiều locut trong hệ gen. Vì vậy,
những đa hình hiếm trong các cá thể có quan hệ gần gũi có thể đƣợc phát hiện
nhanh.
Một nhƣợc điểm của RAPD là khơng chắc chắn các đoạn có cùng kích

thƣớc từ hai mẫu DNA khác nhu thực sự đƣợc tạo ra cùng một vị trí trên hệ gen.
Tuy vậy, RAPD vẫn có thể đƣợc sử dụng cùng với các chỉ thị khác trong lập
bản đồ.

12


1.3. Ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di
truyền ở cây ăn quả
Nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng, sản xuất và gia tăng giá trị kinh tế đã có
rất nhiều nghiên cứu tiến tới việc chọn, tạo các giống tự nhiên hay nhân tạo có
đặc tính tốt và ổn định. Các đối tƣợng nghiên cứu không chỉ dừng lại ở các đối
tƣợng là cây rừng, cây cảnh,... mà hiện đang chú ý hơn về vấn đề liên quan đến
phát triển cây ăn quả đem lại lợi ích cao.
1.3.1. Trên thế giới
Trên Thế giới hiện đã có rất nhiều những cơng trình nghiên cứu sử dụng
chỉ thị phân tử các để đánh giá đa dạng di truyền về cây ăn quả, đặc biệt là một
số loài thuộc chi Annona.
Ronning và cs (1995) nghiên cứu đa dạng một số loài ăn đƣợc trong chi
Annona bản địa ở Mỹ cho biết: Phân tích RAPD các giống laiA. cherimola.
'Campa' và 'Jete', A. squamosa 'Lessard', và 'Ubranitzki,' 'Malali,' và 'Kaspi' cho
thấy rằng các chỉ thị RAPD, có thể là một phƣơng pháp hiệu quả trong việc phân
biệt kiểu gen trong loài và giữa các loài Annona với nhau. Tất cả 15 mồi đƣợc
sử dụng trong nghiên cứu thế hệ bố mẹ và thế hệ con lai F1. Quần thể con lai F1
của „Jete‟ x „Lessard‟ đƣợc phân tích để xác định sự giống và khác nhau của các
băngDNA-RAPD đƣợc tạo ra ở thế hệ bố mẹ. Ở quần thể F1 52 locus đa hình
đƣợc tạo ra có sự sai khác so với lý thuyết sự kiến theo định luật Menden.
Brown và cs (2003) nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa chín lồi
Annona muricata L. sử dụng chỉ thị RAPD, trong đó có 7 mẫu đƣợc thu thập ở
Venezuela và 2 mẫu thu ở Brazil. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 17 phân đoạn

DNA đƣợc khuếch đại thì có 14 phân đoạn đa hình, đạt tỷ lệ là 82,35%. Mức độ
tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,2627 đến 1.000, hệ số tƣơng đồng di truyền
trung bình là 0,5333%.
Ahmad và cs (2010) nghiên cứu đánh giá mối quan hệ giữa bốn loài
Annona đƣợc thu thập từ nhiều nơi khác nhau ở miền nam đảo Andaman.
Tổng cộng 30 mồi ISSR và 20 RAPD đã đƣợc sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di
13


truyền giữa bốn loại khác nhau, trong số 30 mồi ISSR đƣợc sử dụng thì tỷ lệ số
phân đoạn đa hình chiếm 58%. Kết quả phân tích cho thấy mức độ tƣơng đồng
di truyền dao động từ 0,35 (35%) đến 0,84 (84%). Với 20 mồi RAPD đƣợc sử
dụng thì thu đƣợc tỷ lệ số phân đoạn đa hình chiếm 52%. Kết quả phân tích với
mồi RAPD cho thấy, mức độ tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,31 (31%) đến
0,83 (83%).
Suratman và cs (2015) nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây mãng
cầu xiêm (Annona muricata L.) thu thập từ các quần thể khác nhau tại Java,
Indonesia bằng cách sử dụng chỉ thị RAPD. Tổng cộng có 70 cá thể thu đƣợc từ
7 quần thể tại các khu vực khác nhau. Với 6 mồi ngẫu nhiên, kết quả tạo ra 151
băng đa hình với tỷ lệ đa hình của mỗi mồi dao động từ 95% đến 100%. Sử
dụng phần mềm POPGENE theo Nei (1978) tìm ra giá trị (h) dao động từ
0,0418 đến 0,0525 với trung bình 0,0458 cho mỗi quần thể. Giá trị h cao nhất
(0,0525) đƣợc tìm thấy trong quần thể KRA trong khi giá trị h thấp nhất đƣợc
quan sát thấy trong quần thể PCT. Giá trị khoảng cách di truyền cao nhất
(0,0410) đƣợc quan sát thấy trong cặp quần thể SKH-GKD trong khi giá trị
khoảng cách di truyền (0.02448) thu đƣợc giữa cặp quần thể KRA-PCT. Dựa
trên biểu đồ, bảy quần thể mãng cầu xiêm đƣợc tách thành 3 cụm chính. Theo
Stansfield (1991), giá trị đa dạng di truyền trong một quần thể sinh vật (h) đƣợc
coi là thấp nếu giá trị của h dƣới điểm hai (<0.2).
Brisibe và cs (2016) nghiên cứu đa dạng di truyền của loài Annona

muricata Linn. cho biết: 42 mẫu đƣợc thu thập để so sánh, đánh giá dựa trên các
đặc điểm thân, lá, hoa và quả để bổ sung thêm thông tin cho các công cụ phân tử
và dữ liệu thu đƣợc cho thấy sự khác biệt giữa các giống có ý nghĩa rất lớn
(p<0,001). Sử dụng kĩ thuật RAPD cho kết quả tạo ra 65 băng DNA, trong đó
có59 băng là đa hình (90,77%), số băng đơn hình trung bình/locus là 6. Dữ liệu
thu đƣợc cung cấp các thơng tin có giá trị cho việc cải thiện giống, sử dụng
nguồn gen Annona muricata Linn. để làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp
thực phẩm và dƣợc phẩm.
14


Hasan và cs (2017) phân tích đa dạng di truyền của loài Annona
muricata L. ở khu vực tây Java của Indonesia bằng chỉ thị RAPD. Sử dụng chỉ
thị RAPD với 9 mẫu thu đƣợc 57 phân đoạn DNA, trong đó có 30 phân đoạn đa
hình, số băng đa hình trung bình/mồi là 6. Khoảng cách di truyền đƣợc tính tốn
dựa trên hệ số tƣơng đồng của Jaccard khi sử dụng phần mềm NTSYS-pc cho
kết quả hệ số tƣơng đồng di truyền của loài dao động từ 0,451 đến 0,902 cho
thấy mối quan hệ giữa các mẫu nghiên cứu là rất chặt chẽ. Hệ số tƣơng đồng cao
0,902 đƣợc đo giữacác mẫu GRT3 với CJR2 và CJR3, trong khi đó 2 mẫu SKB2
và SKB1 có hệ số tƣơng đồng thấp (0,451) chứng tỏ 2 mẫu này có quan hệ xa
nhau về mặt di truyền.
1.3.2. Tại Việt Nam
Các nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền đƣợc tiến hành chủ yếu ở các
loài cây rừng, cây dƣợc liệu. Đối với cây ăn quả thì hiện nay cũng đang đƣợc
đƣa vào nghiên cứu và phát triển. Trong các nghiên cứu cơ bản, đã có một số
lồi cây ăn quả đƣợc phân tích đa dạng di truyền nhƣ: xoài, bƣởi, cam sành,
măng cụt, dứa,...
Nguyễn Bá Phú và cs – Đại học Cần Thơ (2011) “ Nhận diện và xác định
mối quan hệ di truyền của hai cá thể quýt đƣờng không hột đƣợc phát hiện ở
đồng bằng Sông Cửu Long bằng dấu phân tử DNA” , bằng kĩ thuật RAPD với 7

mồi đã ghi nhận có sự sai khác về phổ băng DNA, đây là dấu phân tử để nhận
diện 2 dòng quýt đƣờng khơng hột. Kết quả phân tích đa dạng di truyền cho
phép kết luận 2 cây qt đƣờng khơng hột có mỗi quan hệ gần gũi với nhau
(0,92).
Trần Nhân Dũng và Trần Thị Lê Quyên(2012) nghiên cứu đa dạng di
truyền của các giống, dòng măng cụt dựa trên dấu phân tử ISSR ở tỉnh Bình
Dƣơng cũng cho kết quả rất tốt với 32 giống măng cụt. Với dấu phân tử ISSR
cho thấy có sự khác biệt về mặt di truyền giữa các mẫu măng cụt ở Bình Dƣơng;
mặc dù măng cụt có hình thức sinh sản là vơ tính, cây con ít có sự khác biệt với
cây mẹ. 11 mồi ISSR sử dụng trên 32 mẫu măng cụt, có 10 mồi cho kết quả đa
15


hình. Tổng số băng đƣợc khuếch đại là 87 băng trong đó có 40 băng cho kết quả
đa hình (45,98%), trung bình 3,64 băng cho mỗi mồi. Mồi ISSRED-14 cho đa
hình cao có thể sử dụng cho các nghiên cứu đa dạng và nhận diện các
giống/dòng măng cụt sau này. Giản đồ cho thấy 32 mẫu măng cụt ở Bình Dƣơng
có sự đa dạng về mặt di truyền với mức tƣơng đồng nằm trong khoảng 75100%.
Trần Nhân Dũng và Đỗ Tấn Khang – Đại học Cần Thơ (2012) nghiên
cứu đa dạng di truyền của 36 giống xoài đƣợc thu thập ở các tỉnh của Việt Nam
cũng cho kết quả rất tốt. Theo kết quả nghiên cứu với sự kết hợp tƣơng quan
phân tích AFLP và ITS nhóm nghiên cứu kết luận: hai giống xoài Đá và xoài
Gạo chỉ là một; hai giống xồi Bơm, xồi Úc Kensington Pride chỉ là một. Xồi
Thủy Triều Nha Trang và những dạng xồi có dạng tƣơng tự ở Nha Trang có
cùng nguồn gốc với xoài Thanh Ca ở miền Nam. Xoài Bac-Tam-Bang, một
giống xoài ƣa thích của ngƣời Campuchia, là một dạng của xồi Hịn xanh 19.
Xồi Cát Chu có nhiều kiểu hình và kiểu gen khác nhau. Xoài Thanh Ca là
giống xoài bản địa lâu đời ở ĐBSCL. Giống xồi này có thể là tổ tiên của nhiều
giống xoài phổ biến đƣơng đại nhƣ xoài Tƣợng, Thơm, Cát Chu. Các giống xoài
ăn xanh Thái Lan có kiểu hình, kiểu gen riêng khác với các giống xồi Việt

Nam. Riêng giống xồi Manduongcao có gen nào đó giống xồi Tƣợng. Xồi
n Châu ở miền Tây Bắc Việt Nam lại có cùng nguồn gốc với xồi Úc
Kensington Pride, xồi Bơm, 2 giống xồi đồng dạng có nguồn gốc từ Mã Lai,
Châu Đại Dƣơng. Rất tiếc trong phân tích AFLP khơng có sử dụng các giống
này để so sánh kết quả.
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền 40 mẫu cam sành tại Hà Giang của
Vũ Văn Hiếu và cs (9/2015)tại viện Công nghệ sinh học – Học viện Nông
nghiệp Việt Nam với 25 mồi RAPD và 5 mồi ISSR sử dụng nghiên cứu đa dạng
di truyền 40 mẫu cam đều cho đa hình với số băng đa hình trung bình tƣơng ứng
1,72 và 2,17 băng/mẫu. Thơng qua các phân tích chỉ thị RAPD và ISSR cho thấy
các mẫu cam có sự đa dạng về mặt di truyền cao với hệ số tƣơng đồng di truyền
16


dao động từ 0,62 - 0,98. Trong đó, hai mẫu cam VT31 và VH23 có mức độ
tƣơng đồng cao nhất 98%. Mẫu cam Vinh và hai mẫu cam sành VT31 và VH23
có sự khác biệt di truyền lớn nhất. Ở mức độ tƣơng đồng 70%, 40 mẫu cam
nghiên cứu đƣợc chia thành 5 nhóm chính.
Ở Việt Nam, giống Na bở hiện vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu và phân tích về
đa dạng di truyền. Nhƣng những năm gần đây, na đƣợc đƣa vào sản xuất để phát
triển kinh tế, góp phần xóa đói giảm nghèo, giảm diện tích đất trống đồi trọc rất
lớn cho rất nhiều vùng ở Việt Nam.

17


CHƢƠNG 2.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá đa dạng di truyền giống Na bở trồngtại

các địa điểm khác nhau của tỉnh Thái Nguyên làm cơ sở khoa học cho công tác
bảo tồn nguồn gen và chọn tạo giống.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Thu thập mẫu lá Na bở ở một số địa điểm tại tỉnh Thái Nguyên và tách
chiết DNA tổng số;
- Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu Na bở nghiên cứu bằng kĩ
thuật RAPD;
- Phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu Na bở tại Thái
Nguyên dựa trên giản đồ phả hệ DNA.
2.3. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu gồm 7 mẫu lá Na bở bánh tẻ đƣợc thu thập từ các cây
Na bở đƣợc tuyển chọn (cây cho sai quả, quả to, ngọt) ở những địa điểm khác
nhau của tỉnhThái Nguyên.
Mẫu thu về đƣợc bảo quản ở tủ -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tách
chiết DNA tổng số. Danh sách các địa điểm lấy mẫu nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kí hiệu các mẫu Na bở sử dụng cho nghiên cứu
Địa điểm thu mẫu

TT

Kí hiệu

1

B1

Huyện Phú Bình - tỉnh Thái Nguyên

2

B2

Huyện Phú Bình - tỉnh Thái Nguyên

3

B3

Lâu Thƣợng – huyện Võ Nhai – tỉnh Thái Nguyên

4

B4

Lâu Thƣợng – huyện Võ Nhai – tỉnh Thái Nguyên

5

B5

Lâu Thƣợng – huyện Võ Nhai – tỉnh Thái Nguyên

6

B6

Lâu Thƣợng – huyện Võ Nhai – tỉnh Thái Nguyên

7

B7

Thị trấn huyện Võ Nhai - tỉnh Thái Nguyên

18


2.3.2. Địa điểm nghiên cứu
- Các mẫu Na bở đƣợc thu tại các địa điểm khác nhau của tỉnh Thái Ngun.
- Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Phịng thí nghiệm Bộ môn Công
nghệ gen và Di truyền phân tử, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng
Đại học Lâm nghiệp.
2.4. Hóa chất và thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
2.4.1. Hóa chất
- Hóa chất dử dụng tách chiết DNA tổng số: CTAB, EDTA, H2O deion,
Isopropanol, Ethanol, Phenol, Chloroform, Isomyl alcohol.
- Hóa chất cho phản ứng PCR nhân bản DNA sử dụng mồi RAPD:
Master mix2x của hãng iNtRon Biotechnology, Hàn Quốc.
- Hóa chất cho điện di trên gel agrose: Agrose, DNA marker 100 bp,
Redsafe, TAE 1X, Loading dye.
2.4.2. Máy móc, thiết bị
Máy PCR System 9700 ( Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac
300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA ( Mini- transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ),
máy ly tâm, máy ổn nhiệt, cùng các trang thiết bị khác của Phịng thí nghiệm Bộ
mơn Cơng nghệ gen và Di truyền phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Lâm
nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp.
2.5. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Các mồi ngẫu nhiên (10 nucleotide) sử dụng trong nghiên cứu này gồm
21 mồi RAPD. Trình tự nucleotide của các mồi đƣợc trình bày trong bảng 2.2.

19