bài giảng công nghệ tế bào chương 5 công nghệ tế bào thực vật

BÀI GIẢNG: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
Khoa: Công nghệ sinh học – môi trường
Th.s Vưu Ngọc Dung
CHƯƠNG 5. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT
Mở đầu
Các loại nuôi cấy tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy
Sản xuất các chất thứ cấp
Sản xuất protein tái tổ hợp
Chọn dòng biến dị soma
Dung hợp protoplast
Chuyển gen ở thực vật bậc cao
Một số hình ảnh về CNTBTV
TLTK: Công nghệ sinh học (tập 2, Công nghệ sinh học tế
bào), Vũ Văn Vụ.
MỞ ĐẦU
 Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất hóa học khác
nhau rất có giá trị: dược liệu, mùi, gia vị, các sắc tố và các
hóa chất dùng trong nông nghiệp.
 Sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật và các mô
ngoại sinh có thể được sử dụng để nuôi cấy tế bào dịch
huyền phù (cell suspension culture) trong điều kiện vô
trùng.
BẢNG 1. CÁC SẢN PHẨM TIỀM NĂNG CỦA THỰC
VẬT ĐANG ĐƯỢC QUAN TÂM.
Thực phẩm
Chất màu Anthocyanin, betacyanin, saffron
Chất mùi
Chuối, mơ, táo, đào, nho, lê, dứa, quả mâm xôi, nho,
măng tây, capsicum, cà chua, cần tây, vanilla, cocoa.
Chất ngọt Miraculin, monellin, stevioside, thaumatin

Gia vị
Bạch đậu khấu, long não, cây hương thảo, nghệ, ngải
đắng
Tinh dầu
Tỏi, hoa nhài, chanh, hành tây, bạc hà, hoắc hương,
hoa hồng, vetiver
Dược liệu
Các alkaloid
Ajmalacine, atropine, berberine, codein,
hyoscyamine, morphine, scopolamine, vinblastine,
vincristine , camptothecin, quinine, serpentine
Các steroid Digitoxin, digoxin, diosgenin
Các chất khác
Ginsengoside, shikonin, ubiquinone-10, rosmarinic
acid, diosgenin, L-Dopa, saponin
Các protein tái tổ hợp
Kháng thể đơn dòng, các interleukin,
GM-CSF, các enzyme khác
Nông nghiệp Hóa chất
Pyrethrin, rotenone, neriifolin, salannin,
azadirachtin, các hóa chất alleopathic
Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản
xuất các chất thứ cấp có một số ưu điểm sau:
- Không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cần thiết để
vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu
thô.
- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm.
- Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất từ nuôi cấy
dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn
chỉnh.

CÁC LOẠI NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT
1. Sinh trưởng không phân hóa (undifferentiated growth)
 1.1. Nuôi cấy callus
 1.2. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào
 1.3. Nuôi cấy tế bào trần
2. Sinh trưởng có phân hóa (differentiated growth)
 2.1. Nuôi cấy rễ tơ
 2.2. Nuôi cấy phôi
NUÔI CẤY CALLUS
 Nuôi cấy callus các khối tế bào không có hình dạng nhất
định tăng lên từ sinh trưởng không phân hóa của mẫu vật
trên môi trường dinh dưỡng rắn vô trùng.
 Mẫu vật thường là các cơ quan tử nhỏ hoặc các mẫu mô.
 Các khối tế bào này không tương ứng với mọi cấu trúc mô
đặc trưng của cây hoàn chỉnh.
 Thuật ngữ nuôi cấy callus được sử dụng do cảm ứng bởi
các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant growth
regulators) trong môi trường dinh dưỡng rắn.
NUÔI CẤY DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa các tế bào và các
khối tế bào, sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng.
 Khởi đầu bằng các khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi
trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy).
 Nuôi cấy dịch huyền phù vì thế là sự tiến triển từ thực vật
đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới dịch huyền phù.
 Nuôi cấy dịch huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất
sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy callus (tương
tự lên men vi sinh vật trong môi trường lỏng).

NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN
 Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) sinh trưởng trên môi
trường đặc hoặc lỏng.
 Protoplast có thể được chuẩn bị bằng phương pháp cơ
học hoặc enzyme để loại bỏ thành tế bào.
 Các protoplast được phân lập có thể được sử dụng để:
- (1) biến đổi thông tin di truyền của tế bào thực vật,
- (2) tạo ra cây lai vô tính thông qua dung hợp protoplast
(protoplast fusion),
- (3) nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus ở thực vật và
những vấn đề khác.
 Một ứng dụng đầy triển vọng khác của nuôi cấy
protoplast là vi nhân giống thực vật.
SINH TRƯỞNG CÓ PHÂN HÓA
(DIFFERENTIATED GROWTH)
 Sinh trưởng có phân hóa là chúng có thể tiếp tục sinh
trưởng với cấu trúc đã được duy trì từ trước.
 Các cơ quan thực vật được phân hóa có thể sinh trưởng
trong quá trình nuôi cấy mà không bị mất sự toàn vẹn của
mình còn gọi là nuôi cấy cơ quan (organ culture).
NUÔI CẤY RỄ TƠ
 Nuôi cấy rễ tơ có thể được thiết lập từ đầu rễ
 Nuôi cấy rễ sinh trưởng nhanh có thể thu được từ các loài
cây hai lá mầm bằng cách gây nhiễm chúng với vi khuẩn
đất Agrobacteriumrhizogenes.
 Các dòng rễ tơ (hairy root) được hình thành có thể dùng
trong nuôi cấy để sản xuất các chất thứ cấp
NUÔI CẤY PHÔI
 Nuôi cấy phôi (embryo) tách ra từ các hạt vô trùng, các

noãn hoặc quả.
 Các phôi được sản xuất gọi là phôi vô tính (somatic
embryo).
 Nuôi cấy phôi có thể được ứng dụng để sản xuất nhanh
cây giống từ các hạt có thời gian ngủ nghĩ dài.
 Ưu điểm: là quá trình đồng nhất di truyền, sản xuất sinh
khối và nhân giống các cây trồng sạch bệnh.
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
 Các nguyên tố đa lượng: nitrogen, potassium, calcium,
phosphorus, magnesium và sulfur (sáu nguyên tố cho sinh
trưởng của thực vật bậc cao).
 Các nguyên tố vi lượng: sắt, kẽm, mangan, boron, copper,
molybdenum và cobalt ở dạng vết.
 Vitamin :myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine,
riboflavin…
 Amino acid
 Các chất khác: malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân
casein, nước dừa…
 Các chất kích thích sinh trưởng: Các auxin (IAA, 2,4-D,
NAA, IBA, NOA…), và các cytokinin (zeatin, 2i-P, kinetin,
BA…).
 Nguồn carbon: sucrose, glucose và fructose.
 Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường: agaralginate,
phytagel, methacel và gel-rite.
 Murasghige và Skoog (1962) đã xây dựng môi trường dinh
dưỡng cơ bản (gọi là môi trường MS) thích hợp cho hầu
hết các thí nghiệm nuôi cấy tế bào thực vật.
THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MURASHIGE VÀ SKOOG
(1962).
Thành phần Nồng độ (mg/l) Thành phần Nồng độ (mg/l)

1. Các nguyên tố đa lượng
MgSO
4
.7H
2
O
KH
2
PO
4
KNO
3
NH
4
NO
3
CaCl
2
.2H
2
O
2. Các nguyên tố vi lượng
H
3
BO
3
MnSO
4
.4H
2

O
ZnSO
4
.7H
2
O
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
CuSO
4
.5H
2
O
CoCl
2
.6H
2
O
KI
370
170
1900
1650
440
6,2

22,3
8,6
0,25
0,025
0,025
0,83
FeSO
4
.7H
2
O
Na
2
EDTA.2H
2
O
3. Nguồn carbon
Sucrose
4. Các phụ gia hữu cơ
-Các vitamin
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Nicotinic acid
Myo-inositol
- Các chất khác
Glycine
27,8
37,3
30000
0,5

0,5
0,5
100
2
Môi trường nuôi
cấy
Thành phần môi
trường
Thành phần vô
cơ
Thành phần hữu
cơ
Các chất điều
hòa sinh trưởng
Nguồn cacbon
và các thành
phần khác
Tính chất môi
trường
pH và tính thẩm
thấu
SẢN XUẤT CÁC CHẤT THỨ CẤP
 Các chất trao đổi thứ cấp : alkaloid, tinh dầu và glycoside.
- Alkaloid (tinh thể) là các hợp chất chứa nitrogen, sử dụng
trong công nghiệp dược, gồm: codein, nicotine, caffeine và
morphine.
- Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid và được sử dụng
như là chất mùi, chất thơm và dung môi.
- Glycoside: phenolic, tanin và flavonoid, saponin và các
cyanogenic glycoside, sử dụng làm chất nhuộm, các chất

mùi thực phẩm và dược phẩm.
 Nhiều chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình
phân hóa tế bào.
 Các mô có tính đặc trưng cao như là rễ, lá và hoa.
4.1. Các chất thứ cấp dùng trong thực phẩm
4.1.1. Các chất màu
4.1.2. Các chất mùi
4.1.3. Các chất ngọt
4.2. Các chất thứ cấp dùng trong dược phẩm
4.2.1. Các alkaloid
ANTHOCYANIN
 Các anthocyanin là các sắc tố tiêu biểu có trong các loài
thực vật hạt kín (angiosperms) và các loài thực vật có hoa
(flowering plants) của các họ Poaceae, Fabaceae,
Rosaceae, Cruciferae, Vitaceae và Solanaceae.
 Các bộ phận: rễ, lá, hoa và quả.
 Anthocyanin tách chiết từ nho là nguồn tiềm tàng nhất trên
thế giới. Ngoài ra, các loài Vitis vinifera, Daucus carota và
Euphorbia millii sản xuất anthocyanin.
 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào sản xuất anthocyanin cao từ 10-
20% trọng lượng khô.
 Sản xuất anthocyanin đạt cực đại trong suốt pha tĩnh.
BETALAINE
 Các betalaine là các sắc tố màu đỏ có trong các loài thực
vật hạt kín và các loài thực vật có hoa thuộc các họ
Chenopodiaceae, Amaranthaceae và Phytolacaceae.
 Một số loài nấm ăn thuộc bộ Agaricinales cũng sản xuất
betalaine.
 Betalaine đạt nồng độ cực đại trong pha tĩnh của sinh
trưởng tế bào.

 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù của Phytolacca americana
(sâm voi, thương lục Mỹ) đạt nồng độ cao nhất ở pha sinh
trưởng hàm mũ (pha log).
 Tế bào cây Chenopodium rubrum nuôi cấy 15 ngày tuổi có
thể sản xuất được 35-45 mg betalaine/L môi trường.
 Nuôi cấy tế bào và nuôi cấy rễ tơ của cây Beta vulgaris (củ
cải đường) để sản xuất betalaine
CROCIN VÀ CROCETIN
 Crocus sativus (cây nghệ tây) là nguồn cung cấp crocin
chủ yếu, một loại sắc tố màu đỏ tươi được tìm thấy trong
đầu nhụy của nó.
 Đầu nhụy cây nghệ tây (saffron) cũng sản xuất các
crocetin. Crocin là một digentiobiocide ester của crocetin.
 Muốn thu hoạch 1 kg đầu nhụy nghệ tây (một loại gia vị có
giá trị) cần phải có khoảng 150.000 hoa.
 Nuôi cấy tế bào của đầu nhụy cây nghệ tây để sản xuất
các gốc cơ bản của saffron.
 Mô nuôi cấy để sản xuất các callus có màu chứa crocin và
các crocetin và cũng là safrana (gốc cơ bản của chất
màu) của saffron.
CAPSAICIN VÀ CÁC CAPSAICINOID
 Capsaicin là gốc cay chủ yếu của ớt, các capsaicinoid
chịu trách nhiệm cho vị cay là dihydrocapsaicin,
nordihydrocapsaicin, homocapsaicin và
homodihydrocapsaicin.
 Capsaicinoid được sử dụng như một phụ gia thực phẩm.
 Capsaicin tinh khiết để bào chế dược phẩm điều trị chứng
viêm khớp và làm thuốc giảm đau.
 Capsaicin được sản xuất bằng nuôi cấy bất động tế bào
của Capsicum frutescens.

 Các tế bào Capsicum bất động sẽ sản xuất cao gấp vài
lần so với tế bào dịch huyền phù tự do.
 Mô giá noãn (placenta) của Capsicum được bất động sẽ
sản xuất lượng capsaicin cao hơn các tế bào bất động.