KIỂM TRA AN TOÀN - HIỆU LỰC VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VACXIN XUẤT HUYẾT THỎ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
KIỂM TRA AN TOÀN - HIỆU LỰC VÀ THỜI GIAN BẢO
QUẢN CỦA VACXIN XUẤT HUYẾT THỎ

Họ và tên sinh viên : NGUYỄN LÊ HỒNG THÀNH
Ngành

: Thú Y

Lớp

: Tại chức 19

Niên khóa

: 2002-2007

Tháng 11/2007


KIỂM TRA AN TOÀN - HIỆU LỰC VÀ THỜI GIAN BẢO
QUẢN CỦA VACXIN XUẤT HUYẾT THỎ

Tác giả

NGUYỄN LÊ HỒNG THÀNH

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ ngành Thú y

Giáo viên hướng dẫn:
Th.S TRẦN THỊ BÍCH LIÊN
TS. TRẦN XN HẠNH
BSTY. TƠ THỊ PHẤN

Tháng 11 năm 2007

i


LỜI CẢM TẠ

Lịng biết ơn sâu sắc đến
Cơng ơn sinh thành và dưỡng dục của cha mẹ, đã hy sinh suốt đời cho con có
được như ngày hơm nay.
Th.s Trần Thị Bích Liên
TS. Trần Xn Hạnh
BSTY. Tơ Thị Phấn
BSTY. Nguyễn Thị Thu Lan
BSTY. Ngơ Đức
Đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn động viên và truyền đạt những kiến thức, kinh
nghiệm q báu cho tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn tất khóa luận tốt nghiệp.
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
Ban Chủ Nhiệm cùng tồn thể q thầy cơ khoa Chăn Ni – Thú Y trường Đại
học Nơng Lâm Tp. HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong
quá trình học tập tại trường.
Ban Giám Đốc Cơng Ty Thuốc Thú Y Trung Ương TP. Hồ Chí Minh.
Đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập.

Cảm ơn bạn bè và toàn thể lớp TY 19 đã cùng chung sức và giúp đỡ tơi trong
suốt q trình học tập.

ii


TĨM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài “Kiểm tra an tồn - hiệu lực và thời gian bảo quản của vacxin xuất huyết
thỏ” đã được thực hiện tại phòng nghiên cứu vi trùng - trung tâm nghiên cứu Thú Y và
trại chăn nuôi thuộc ban kiểm nghiệm của Công Ty Thuốc Thú y Trung Ương. Thời
gian thực hiện từ ngày 10/02/2007 đến ngày 31/10/2007.
Vacxin được kiểm tra do Công Ty Thuốc Thú y Trung Ương cung cấp.
Với các chỉ tiêu theo dõi: kiểm tra vơ trùng, an tồn, hiệu lực và thời gian bảo
quản của vacxin sau 3, 6 tháng và tiến hành như sau:
- Kiểm tra vô trùng của vacxin trên môi trường thạch máu, thạch nấm, nước thịt
dinh dưỡng và mơi trường yếm khí.
- Kiểm tra an tồn của vacxin trên thỏ với liều tiêm gấp đôi liều quy định.
- Kiểm tra hiệu lực của vacxin trên thỏ bằng phương pháp công cường độc.
- Kiểm tra vacxin sau 3 tháng, 6 tháng bảo quản ở 2-80 C.
Kết quả thí nghiệm:
- Kiểm tra vô trùng: vacxin đạt tiêu chuẩn về mặt vơ trùng vì khơng có bất cứ
loại vi sinh vật nào mọc trên các môi trường trong thời gian theo dõi.
- Kiểm tra an tồn: Thỏ thí nghiệm được tiêm vacxin theo dõi trong 7 ngày, thỏ
khơng có biểu hiện bất thường nào, tất cả vẫn khỏe mạnh và phát triển bình thường.
- Kiểm tra hiệu lực:
Kết quả ghi nhận các thỏ được gây miễn dịch đều sống khỏe mạnh khơng có biểu
hiện bất thường nào với tỉ lệ bảo hộ 100% ở 3 lơ vacxin và có hiệu giá kháng thể HI ≥
1/40. Các thỏ ở 3 lô đối chứng đều chết 100% ở thể cấp tính, thời gian thỏ chết dao động
từ 17 - 26 giờ với triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh xuất huyết thỏ.
- Kết quả kiểm tra thời gian bảo quản vacxin sau 3 tháng, 6 tháng.
Vacxin xuất huyết thỏ sau khi bảo quản 3 tháng và 6 tháng vẫn có khả năng bảo
hộ tốt trên thỏ. Tỷ lệ bảo hộ đạt 80% - 100% ở 3 lô vacxin và các thỏ ở lơ vacxin này

có hiệu giá kháng thể HI ≥ 1/40.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa...........................................................................................................................i
Lời cảm tạ ....................................................................................................................... ii
Tóm tắt luận văn ............................................................................................................ iii
Mục lục ...........................................................................................................................iv
Các từ viết tắt................................................................................................................ vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình ....................................................................................................... iix
Danh sách các biểu đồ .....................................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1.ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................1
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU.....................................................................................2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................2
1.2.2. u cầu ..................................................................................................................2
Chương 2 TỒNG QUAN.................................................................................................3
2.1. LỊCH SỬ VỀ BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN THỎ ................................................3
2.1.1. Khái niệm ..............................................................................................................3
2.1.2 Lịch sử bệnh ...........................................................................................................3
2.2. CÁC ĐẶC ĐIỂM VỀ RHD .....................................................................................3
2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh ..........................................................................................3
2.2.2. Tình hình nhiễm bệnh trên thế giới .......................................................................4
2.2.3. Tình hình nhiễm bệnh ở Việt Nam........................................................................5
2.2.4. Đặc tính ni cấy và phân lập ...............................................................................5
2.3. DỊCH TỄ HỌC .........................................................................................................5

2.3.1. Loài mắc bệnh, mùa vụ mắc bệnh .........................................................................5
2.3.2. Chất chứa mầm bệnh .............................................................................................5
2.3.3. Cách thức lan truyền..............................................................................................5
2.3.4. Triệu chứng............................................................................................................5
2.3.4.1. Thể quá cấp.........................................................................................................6
2.3.4.2. Thể cấp và á cấp tính ..........................................................................................6
iv


2.3.4.3. Thể mãn tính.......................................................................................................6
2.3.5. Bệnh tích................................................................................................................6
2.3.6. Các phương pháp chẩn đoán bệnh xuất huyết thỏ.................................................6
2.3.6.1. Chẩn đoán dịch tễ lâm sàng................................................................................6
2.3.6.2. Chẩn đốn cận lâm sàng .....................................................................................6
2.3.7. Phịng bệnh ............................................................................................................7
2.3.7.1. Phương pháp phòng bệnh ...................................................................................7
2.3.7.2. Phương pháp ngăn chặn dịch bệnh.....................................................................7
2.4. QUÁ TRÌNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ..................................................................8
2.4.1. Kháng nguyên........................................................................................................8
2.4.1.1. Định nghĩa ..........................................................................................................8
2.4.1.2. Những đặc tính của kháng nguyên .....................................................................8
2.4.2. Kháng thể...............................................................................................................9
2.4.2.1. Định nghĩa ..........................................................................................................9
2.4.2.2. Cấu trúc và phân loại kháng thể .........................................................................9
2.4.3. Miễn dịch thu được..............................................................................................11
2.4.3.1. Định nghĩa ........................................................................................................11
2.4.3.2. Các giai đoạn miễn dịch thu được ....................................................................11
2.5. VACXIN VÀ NGUYÊN LÝ TÁC DỤNG............................................................12
2.6. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VACXIN RHD ....................................................14
2.7. TIÊU CHUẨN CỦA VACXIN..............................................................................14

2.7.1. Những điều cần chú ý khi sử dụng vacxin ..........................................................15
2.8. NHỮNG CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VACXIN RHD .............................16
Chương 3 NỘI DUNG,VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................17
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .................................................................................17
3.1.1. Thời gian..............................................................................................................17
3.1.2. Địa điểm ..............................................................................................................17
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................17
3.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................17
3.3.1. Vật liệu thí nghiệm ..............................................................................................17
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................18
v


3.3.2.1. Kiểm tra vơ trùng, an tồn và hiệu lực của vacxin xuất huyết thỏ..................18
3.3.2.2. Kiểm tra vacxin xuất huyết thỏ sau bảo quản 3 tháng, 6 tháng........................20
3.3.2.3. Kỹ thuật HI .......................................................................................................21
3.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU.....................................................................................................22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................23
4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA VƠ TRÙNG AN TỒN VÀ HIỆU LỰC VACXIN.......23
4.1.1. Kết quả kiểm tra vô trùng....................................................................................23
4.1.2. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin ...................................................................23
4.1.3. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin.........................................................................24
4.2. KIỂM TRA VACXIN XUẤT HUYẾT THỎ SAU THỜI GIAN BẢO QUẢN....28
4.2.1. Kết quả kiểm tra vacxin xuất huyết thỏ khi đã bảo quản 3 tháng .......................28
4.2.2. Kết quả kiểm tra vacxin xuất huyết thỏ khi đã bảo quản 6 tháng .......................31
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................35
5.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................35
5.2. ĐỀ NGHỊ................................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................36

vi


CÁC TỪ VIẾT TẮT
RHD (Rabbit Haemorrhagic Diease): Bệnh xuất huyết ở thỏ.
RHDV : Virus gây bệnh xuất huyết thỏ.
HA (Haemagglutination): Test phản ứng ngưng kết hồng cầu.
HI (Haemagglutination Inhibition): Test phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
KN

: Kháng nguyên.

KT

: Kháng thể.

HGKT : Hiệu giá kháng thể.
PBS (Phosphate buffer saline): Muối đệm phosphate.
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): Kỹ thuật miễn dịch liên kết
enzyme.
MD

: Miễn dịch.

ĐC

: Đối chứng.

XHT

: Xuất huyết thỏ.

BSA (bovine serum albumin): Albumin huyết thanh bò.
OD (Optical densities): Mật độ quang học.
100 LD50 (lethal dose): 100 lần liều gây chết 50%.

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm kiểm tra an toàn ................................................................19
Bảng 3.2: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau khi công cường độc .........................................20
Bảng 3.3: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau khi công cường độc cho 1 đợt kiểm tra...........21
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra an toàn vacxin ...................................................................23
Bảng 4.2: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau khi công cường độc .........................................24
Bảng 4.3: Tỷ lệ các mức hiệu giá kháng thể sau khi tiêm vacxin 21 ngày ...................27
Bảng 4.4: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau 3 tháng bảo quản ở 2 - 80 C .............................29
Bảng 4.5: Tỷ lệ các mức hiệu giá kháng thể sau khi tiêm 21 ngày trên vacxin đã bảo
quản 3 tháng..................................................................................................30
Bảng 4.6: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau 6 tháng bảo quản ở 2 - 80 C .............................32
Bảng 4.7: Tỷ lệ các mức hiệu giá kháng thể sau khi tiêm 21 ngày trên vacxin đã bảo
quản 6 tháng..................................................................................................33

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang

Hình 2.1: Hình thái RHDV..............................................................................................4
Hình2.2: Cấu trúc kháng thể antibody.............................................................................9
Hình 4.1: Triệu chứng thỏ chết bệnh RHD ...................................................................25
Hình 4.2: Xuất huyết ở mũi ...........................................................................................26
Hình 4.3: Bệnh tích xuất huyết trên phổi ......................................................................26
Hình 4.4: Bệnh tích xuất trên gan thỏ............................................................................27

ix


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau khi công cường độc.....................................24
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ các mức hiệu giá kháng thể sau khi tiêm vacxin 21 ngày ...............28
Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau 3 tháng bảo quản ở 2 - 80C..........................29
Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ các mức hiệu giá kháng thể sau khi tiêm 21 ngày trên vacxin đã bảo
quản 3 tháng ...............................................................................................31
Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau 6 tháng bảo quản ở 2 - 80C..........................32
Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ các mức hiệu giá kháng thể sau khi tiêm 21 ngày trên vacxin đã bảo
quản 6 tháng ...............................................................................................34

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở nước ta vào khoảng những năm 1995, chăn ni thỏ đã có những bước đầu
khởi sắc, từ qui mô nhỏ chuyển sang qui mô lớn hơn. Tại miền Nam, một số tỉnh thành
đã mạnh dạn đầu tư cho nền chăn ni cịn mới mẻ nhưng đầy triển vọng này, cụ thể ở

các tỉnh: Đồng Nai, Thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương, Long An, Tiền Giang…
Hiện nay chăn nuôi thỏ đã và đang phát triển mạnh ở qui mơ gia đình và qui mơ cơng
nghiệp với vài chục ngàn con.
Năm 2000 trong nước xuất hiện một bệnh lạ trên thỏ và đã được Trung tâm
chẩn đoán quốc gia xác định là bệnh xuất huyết do Calicivirus (Phạm Thành Long và
Phương Song Liên, 2004). Đặc biệt vào tháng 4/2003 bệnh xuất hiện trên thỏ nuôi tại
Thành phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Long An và
Tiền Giang. Hàng chục ngàn thỏ chết trong một thời gian rất ngắn gây thiệt hại kinh tế
lớn và hoang mang cho người chăn nuôi thỏ. Đây là một bệnh truyền nhiễm cấp tính
trên đối tượng là thỏ với đặc điểm lây lan nhanh, tỷ lệ bệnh thường 100%, tỷ lệ chết từ
40% - 90% (Teifke.J.P cùng cộng sự, 2002). Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc
vào năm 1984 (Cooke.B.D, 2002) và sau đó xuất hiện ở các Châu lục.
Xuất phát từ tình hình thực tế trên cùng với yêu cầu cấp bách của người chăn nuôi
việc nghiên cứu một vacxin và một qui trình phịng bệnh hiệu quả bảo vệ đàn thỏ là điều
rất cần thiết.
Được sự đồng ý của Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm thuộc Khoa Chăn nuôi
Thú Y Trường Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, trung tâm nghiên cứu
Thú Y - Công ty Thuốc Thú y Trung Ương dưới sự hướng dẫn của Th.S Trần Thị Bích
Liên, TS. Trần Xn Hạnh và BSTY Tơ Thị Phấn chúng tơi thực hiên đề tài:
“Kiểm tra an tồn - hiệu lực và thời gian bảo quản của vacxin xuất huyết thỏ”.

1


1.2. MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU
1.2.1. Mục đích
Xác định tính an toàn - hiệu lực và thời gian bảo quản của vacxin xuất huyết thỏ
nhằm đạt được một vacxin có hiệu quả cao trong phịng bệnh góp phần nâng cao năng
suất trong chăn nuôi thỏ.
1.2.2. Yêu cầu

- Kiểm tra an toàn - hiệu lực của vacxin xuất huyết thỏ.
- Kiểm tra vaxcin xuất huyết thỏ sau khi được bảo quản trong 3 tháng và 6
tháng ở 2 - 80C.

2


Chương 2
TỒNG QUAN
2.1. LỊCH SỬ VỀ BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN THỎ (RHD)
2.1.1. Khái niệm
Bệnh xuất huyết trên thỏ (RHD) là một bệnh truyền nhiễm gây chết cao cho thỏ
ở thể cấp tính, tác nhân gây bệnh là Calicivirus. Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ nhiễm và
tỷ lệ chết cao (40% - 90%) (Teifke.J.P et al., 2002).
Bệnh lây lan rất nhanh qua đường lây truyền trực tiếp hoặc gián tiếp bằng
đường mũi, tiêm chích, miệng, thời gian nung bệnh từ 1 - 3 ngày, thỏ chết từ 1,5 - 2,5
ngày sau khi có biểu hiện sốt. Triệu chứng lâm sàng ở thể cấp tính là các dấu hiệu về
thần kinh, hô hấp.
2.1.2 Lịch sử bệnh
Vào năm 1984 (Cooke. B. D, 2002) RHD đã được đề cập lần đầu tiên tại Trung
Quốc, bệnh xảy ra nhanh chóng, lây lan mạnh gây chết cao ở thỏ ni: sau đó RHD đã
xuất hiện ở một số nước Châu Á và Châu Âu như: CH Séc, Đức, Pháp, Ý, Hàn Quốc,
Tây Ban Nha… với các triệu chứng bên ngoài rất giống nhau, người ta cho rằng bệnh
được lây lan qua con đường vận chuyển thỏ hay các sản phẩm từ thỏ nhiễm RHD từ
Trung Quốc.
2.2. CÁC ĐẶC ĐIỂM VỀ RHD
2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh
Virus xuất huyết thuộc họ Caliciviridae, giống Lagovirus (Teifke và ctv, 2002).
Virus gây bệnh xuất huyết thỏ có đường kính 32 - 35 nm. Bộ gen là một chuỗi
dương RNA, vỏ capsid cả bên trong và bên ngoài dạng cấu trúc vịm, có đặc tính

kháng ngun, chỉ có một serotype (Berninger and House, 1995).
Có thể phát hiện virus gây bệnh bằng nhiều kỹ thuật như phản ứng HA, ELISA
(Berninger and House, 1995; OIE, 2000). Theo Berninger (1995) các chủng virus gây
bệnh (RHD) nhận được từ các vùng khác nhau đều đồng nhất về tính kháng nguyên.

3


Virus RHD đề kháng cao, chúng có thể sống sót 225 ngày trong huyễn dịch tổ
chức ở 40C, trên quần áo 105 ngày ở nhiệt độ phòng, 2 ngày ở 600C (OIE, 2000). Tuy
nhiên, virus nhanh chóng bị vơ hoạt bởi pH = 3 - 5, mơi trường có hàm lượng Mg++ và
trypsin cao. Virus RHD có khả năng ngưng kết hồng cầu người nhóm máu O.

Hình 2.1: Hình thái RHDV ( />2.2.2. Tình hình nhiễm bệnh trên thế giới
Theo tổ chức Lương Nông thế giới, hiện nay bệnh RHD đã xuất hiện hầu hết ở
các Châu lục đã gây thiệt hại rất lớn đến ngành chăn nuôi thỏ trên thế giới.
Tháng 2/1989, chính phủ Mexicơ đã triển khai chương trình kiểm soát và tiêu
diệt căn bệnh này bao gồm việc cách ly kiểm dịch những nông trại đã bị nhiễm bệnh,
ngăn chặn việc vận chuyển hay buôn bán thỏ, chủ động tiêu hủy những con thỏ bị
bệnh, vệ sinh chuồng trại thường xuyên trên thỏ khỏe mạnh trong 2 tháng. Chương
trình đã đạt được sự thành cơng, khơng có trường hợp nhiễm bệnh nào được ghi nhận
vào năm 1992 đến nay. Mêxico là quốc gia duy nhất thành công trong việc khống chế
RHD.

4


2.2.3. Tình hình nhiễm bệnh ở Việt Nam
Năm 2000, tại Việt Nam một bệnh lạ trên thỏ được phát hiện và được xác định
là bệnh xuất huyết do virus RHD (RHDV). Theo thống kê vào thời điểm tháng 4/2003

dịch bệnh này đã làm cho hàng chục ngàn thỏ chết trong một thời gian rất ngắn, gây
thiệt hại và hoang mang cho người chăn ni thỏ tại Thành phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa Vũng Tàu, Tiền Giang và nhiều tỉnh khác.
2.2.4. Đặc tính ni cấy và phân lập
Virus RHD khơng thể nhân lên trên phôi trứng hay môi trường tế bào. Do vậy,
hiện nay sử dụng phủ tạng làm nguyên liệu để sản xuất vacxin là biện pháp tốt nhất
(Berninger, 1995; OIE, 2000).
2.3. DỊCH TỄ HỌC
2.3.1. Loài mắc bệnh, mùa vụ mắc bệnh
- Loài mắc bệnh: thỏ và thỏ rừng là vật chủ tự nhiên của virus RHD.
- Lứa tuổi mắc bệnh: bệnh xảy ra ở thỏ > 50 ngày tuổi (OIE, 2004). Đặc biệt,
thỏ lớn và thỏ sinh sản mẫn cảm mạnh với virus.
- Mùa vụ mắc bệnh: bệnh xuất huyết thỏ xảy ra quanh năm.
2.3.2. Chất chứa mầm bệnh
Các phủ tạng như phổi, khí quản, tim, thận, dạ dày, ruột, bàng quang, chất tiết
và thai sẩy đều có thể chứa virus. Tuy nhiên, khi xét nghiệm bằng kỹ thuật HA thì gan,
lách là bệnh phẩm cho hiệu giá kháng thể cao (Trần Xuân Hạnh và ctv, 2003).
2.3.3. Cách thức lan truyền
Cách thức lan truyền của RHD có thể là do tiếp xúc giữa thỏ khỏe mạnh với thỏ
đã nhiễm bệnh, hoặc do sản phẩm từ thỏ bệnh hoặc qua: chuồng trại, người chăn nuôi,
thức ăn, nước uống…
Trong môi trường khơng khí ẩm, virus có khả năng lây lan nhanh hơn, nguy cơ
lan truyền RHD sẽ cao hơn nếu thỏ được nuôi với mật độ dày. Những thỏ đã nhiễm
bệnh nhưng được phục hồi vẫn có thể trở thành những thể mang mầm virus có thể phát
tán virus ít nhất 4 tuần.
2.3.4. Triệu chứng
Tùy độc lực, số lượng của virus RHD và sức đề kháng của thỏ mà bệnh RHD
có 4 dạng: q cấp, cấp tính, á cấp tính và mãn tính.
5

Thời gian ủ bệnh ngắn, bệnh thường diễn biến cấp tính, thỏ mắc bệnh thường
chết nhanh trong vịng 24 - 36 giờ.
2.3.4.1. Thể quá cấp
Bệnh xuất hiện đột ngột, thỏ chết nhanh trong vòng 6 - 24 giờ khi chưa xuất
hiện triệu chứng nào.
2.3.4.2. Thể cấp và á cấp tính
Thỏ bệnh có triệu chứng thần kinh, biểu hiện rối loạn vận động, phân sệt đen
kéo thành sợi và có dịch nhầy ở hậu mơn. Trước khi thỏ chết, thường có biểu hiện co
giật, nhảy không định hướng và máu lẫn bọt trào ra lỗ mũi.
2.3.4.3. Thể mãn tính
Thỏ bệnh chậm lớn, vàng ở vùng tai và dưới da, trong máu xuất hiện kháng thể
nhưng hiệu giá không cao. Ở dạng này, thỏ trở thành thể mang trùng và có thể phát tán
virus ít nhất 4 tuần.
2.3.5. Bệnh tích
Virus RHD gây tổn thương nghiêm trọng ở gan, phổi, khí quản. Do vậy bệnh
tích đặc trưng của bệnh là gan, phổi, khí quản xuất huyết nặng, tim, lách tụ huyết và
xuất huyết.
2.3.6. Các phương pháp chẩn đoán bệnh xuất huyết thỏ
2.3.6.1. Chẩn đoán dịch tễ lâm sàng
- Dựa vào lứa tuổi, bệnh RHD thường chỉ xảy ra trên thỏ lớn hơn 50 ngày tuổi.
- Thời gian chết nhanh trong vòng 6 - 24 giờ, trước khi chết có dấu hiệu rối loạn
vận động như mất thăng bằng, co giật, một số thỏ kêu, rên, la rồi chết và một biểu hiện
đặc trưng là đầu ngẫng về phía sau, 4 chân duỗi thẳng.
- Phân biệt với bệnh tụ huyết trùng, cầu trùng và ngộ độc.
2.3.6.2. Chẩn đốn cận lâm sàng
• Phương pháp ELISA
- Mục đích: dùng để phát hiện kháng thể kháng virus RHD.
- Nguyên tắc: là phản ứng màu của conjugate với cơ chất TMB (tetramethyl
benzidine) thơng qua phản ứng oxi hóa. Nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme peroxidase
làm giải phóng oxi ngun tử {O} từ H2O2, {O} này có tính oxi hóa mạnh sẽ oxi hóa

6


chất hiện màu làm chuyển sang màu vàng. Sự kết hợp kháng nguyên kháng thể sẽ
được đo qua sự thể hiện màu bằng cách đo OD ở bước sóng 450 nm.
• Phương pháp HI (Haemagglutination inhibition test)
Mục đích: dùng để xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh thỏ thí
nghiệm và giám định lại virus gây chết thỏ bằng huyết thanh chuẩn.
• Chẩn đốn phân lập: virus RHD khơng thể nhân lên trên phôi trứng hay trên
môi trường tế bào, vì vậy khơng thể phân lập hay ni cấy trong phịng thí
nghiệm.
• Gây bệnh động vật thí nghiệm, thỏ lớn hơn 2 tháng tuổi.
2.3.7. Phòng bệnh
2.3.7.1. Phương pháp phòng bệnh
- Thực hiện vệ sinh chăm sóc tốt. Định kỳ tiêu độc, sát trùng dụng cụ chăn nuôi,
thức ăn và nước uống, bố trí chuồng trại, ni dưỡng thỏ phù hợp cho từng lứa tuổi.
- Vacxin hiện sản xuất tại Việt Nam
+ Vacxin Hà Nội (Trung tâm chuẩn đoán thú y trung ương): vacxin vô hoạt
dạng keo phèn, tiêm cho thỏ trên 2 tháng tuổi, tiêm dưới da cổ 1 ml/con. Miễn dịch 6 12 tháng.
+ Vacxin của Công Ty Thuốc Thú y Trung Ương dạng keo phèn, tiêm dưới da
cổ 1 ml/con. Miễn dịch 6 - 12 tháng.
2.3.7.2. Phương pháp ngăn chặn dịch bệnh
- Hạn chế khách tham quan.
- Phun thuốc sát trùng ít nhất 2 ngày/lần.
- Tuyệt đối khơng đưa thỏ bệnh, thỏ chết ra ngồi trại để tránh làm lây lan mầm
bệnh sang khu vực khác. Những thỏ bệnh, thỏ chết phải đốt xác hoặc chôn sâu giữa 2
lớp vơi bột.
- Tồn bộ chuồng trại, dụng cụ và chất thải chăn nuôi được phun tiêu độc bằng
dung dịch thuốc sát trùng.

- Công nhân chăn nuôi phải thay trang phục bảo hộ và tắm rửa sạch sẽ trước khi
ra khỏi trại.
- Báo cáo ngay cho ngành thú y để được hỗ trợ và tư vấn kỹ thuật.

7


2.4. QUÁ TRÌNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
2.4.1. Kháng nguyên
2.4.1.1. Định nghĩa
Kháng nguyên là chất mà được hệ thống miễn dịch nhận biết một cách đặc hiệu.
Nói một cách đầy đủ hơn, kháng nguyên là một chất gây ra đáp ứng miễn dịch (tính
sinh kháng thể hay tính gây mẫn cảm).
2.4.1.2. Những đặc tính của kháng ngun
• Tính đặc hiệu miễn dịch
Tính đặc hiệu là đặc tính mà kháng nguyên ấy chỉ được nhận biết bởi đáp ứng
miễn dịch do nó gây ra, chứ không phải những đáp ứng miễn dịch do các kháng
nguyên khác. Như thế một kháng thể chống A chỉ phản ứng với kháng nguyên A.
Ngược lại một kháng nguyên A chỉ được nhận biết bởi một kháng thể chống A. Mọi
kỹ thuật miễn dịch đều dựa trên đặc tính cơ bản này là tính đặc hiệu của phản ứng
miễn dịch.
Tính sinh kháng thể
Tính sinh kháng thể là khả năng của một kháng nguyên tạo ra một đáp ứng miễn
dịch. Đáp ứng này có thể là tế bào hay dịch thể, dương tính là gây mẫn cảm để sinh
kháng thể hay âm tính chỉ gây dung nạp và khơng sinh kháng thể. Tính sinh kháng thể
là đặc tính đầu tiên của kháng ngun.
• Những đặc tính khác
Đó là những đặc tính phụ và khơng thường xun nhưng đã mang lại những thay
đổi về chất lượng và số lượng trong đáp ứng miễn dịch.
- Tính gây dị ứng.

- Tính gây dung nạp.
- Tính gây phân bào.
Trong sản xuất vacxin phòng bệnh cho người và gia súc, người ta thường dùng
các loại vi sinh vật gây bệnh đã được giảm độc lực hay giết chết để chế vacxin.
Các kháng nguyên này khơng cịn hoặc rất ít có khả năng gây bệnh nhưng khi
đưa chúng vào cơ thể, chúng sẽ kích thích cơ thể sản sinh kháng thể đặc hiệu.

8


2.4.2. Kháng thể
2.4.2.1. Định nghĩa
Là những gamma - globulin miễn dịch (Immunoglobulin – Ig) có trong huyết
thanh và dịch chiết tại chỗ. Chúng là một loại protein mang thêm một glucid nên còn
gọi là glycoprotein.
2.4.2.2. Cấu trúc và phân loại kháng thể

Cấu trúc
Phân tử kháng thể gồm 4 chuỗi protein trong đó gồm 2 chuỗi nặng (gọi là chuỗi
H - Heavy) và 2 chuỗi nhẹ (gọi là chuỗi L - Light). Trọng lượng phân tử của kháng thể
từ 15.000 trở lên.
Các chuỗi H và L được nối với nhau bởi cầu nối disulfide (- S - S -). Chuỗi nặng
gồm 4 đoạn polypeptit và chuỗi nhẹ gồm 2 đoạn polypeptit mỗi đoạn có 110 - 120 acid
amin. Trên chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có vùng Fab và Fv kết hợp được với kháng
nguyên, vùng Fc mang tính kết hợp bổ thể. Sự khác nhau giữa các loại kháng thể là
vùng siêu biến V (variable), còn vùng hằng định C (constant) thì giống nhau. Nhiều
kháng ngun có nhiều yếu tố xác định và do đó phải có một bộ kháng thể tương ứng
mới tương tác được với kháng nguyên ấy. Vì vậy số loại kháng thể hết sức lớn.
Người đầu tiên đưa ra sơ đồ cấu trúc G là R. R. Porter (1959), cho đến nay đã có
vài chi tiết được bổ sung bởi một số tác giả khác.

Hình2.2: Cấu trúc kháng thể antibody
(hhtp://biology.arizona.edu/immunology/tutorial/structure.html)
9



Phân loại kháng thể
Tất cả các kháng thể được xếp vào 5 lớp Ig (Vũ Triệu An, 1997).
-

Ig G: có chuỗi nặng là gamma, IgG là kháng thể duy nhất truyền từ mẹ sang
nhau thai (kháng thể tự nhiên). Khi trẻ lớn lên lượng kháng thể này giảm dần.
Khi trưởng thành IgG lại gia tăng và đặc biệt tăng cao khi cơ thể bị nhiễm
khuẩn.

- Ig A: có chuỗi nặng là alfa, có hai dạng IgA là IgA1 (90%) và Ig A2 (10%). Ig A
có trong nuớc bọt, sữa non, dịch ruột, đặt biệt là trong huyết thanh và dịch xuất tại chỗ.
Ig A giữ vai trò chủ yếu trong miễn dịch tại chỗ, chống các bệnh đường tiêu hóa hay
hơ hấp.
-

Ig M: có chuỗi nặng là muy là lớp miễn dịch chính được tổng hợp ở bào thai,
bảo vệ bào thai khỏi bị nhiễm khuẩn. Trong máu số lượng IgG có số lượng
thấp. Khi cơ thể bị nhiễm khuẩn IgM gia tăng nhanh hơn IgG.

-

Ig D: có chuỗi nặng là delta, IgD có số lượng đáng kể trong tổ chức hạnh nhân,
có vai trị trong miễn dịch tại chỗ, thường xuất hiện nhiều trong bệnh nhân có
bệnh mãn tính.

-

Ig E: có chuỗi nặng là epsilon, IgE có khả năng hoạt hóa đại thực bào và bạch
cầu ái toan, tăng cường thực bào hay tăng cường độc tính của bạch cầu trung
tính đối với giun sán. Ig E có ít trong huyết thanh và dễ bị phân hủy.


Sự hình thành kháng thể
Nhờ phương pháp đánh dấu kháng nguyên bằng đồng vị phóng xạ hay chất huỳnh
quang, người ta thấy các kháng thể được tổng hợp ở tủy đỏ và các nang của lách, ở các
nang và dây tủy của hạch bạch huyết, ở tủy xương, mảng Peyer và những tổ chức
lympho khắp cơ thể (phổi, gan, …). Một trong những tổ chức quan trọng nhất tham gia
vào việc tổng hợp kháng thể là “trung tâm mầm” của lách và hạch bạch huyết. Trung
tâm mầm xuất phát từ những “clon” ở trạng thái “ngủ”, khi tiếp xúc với kháng ngun,
“clon” bị kích thích và hoạt hóa để tạo ra những tế bào đáp ứng miễn dịch (các lympho
bào T và B). Lympho bào B sẽ sản sinh ra dòng lympho B nhớ và tương bào. Tương
bào trực tiếp tham gia tạo kháng thể. Như vậy tế bào B và “con cháu” của chúng hoạt
động theo từng “clon”: chúng biến hóa, tăng sinh và trưởng thành theo sự đáp ứng
miễn dịch.
10


Trong các tình thế khác nhau, mức độ khác nhau, sự tổng hợp kháng thể phụ
thuộc vào tế bào T: như sự tổng hợp Ig E, Ig G phụ thuộc rất nhiều vào tế bào T. Còn
các kháng thể Ig M, Ig A ít hoặc khơng phụ thuộc vào tế bào T.
Kháng thể được tổng hợp trong các polyribosome ở trong tương bào. Các chuỗi
nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể được tổng hợp riêng sau đó chúng kết hợp với nhau
ngay trong polyribosome tạo ra 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ. Ngay sau khi các chuỗi
globulin miễn dịch đã hình thành xong thì các đường hydratcarbon sẽ liên kết nhau và
kháng thể ra khỏi bào tương.
2.4.3. Miễn dịch thu được

2.4.3.1. Định nghĩa
Miễn dịch thu được là trạng thái miễn dịch xuất hiện khi cơ thể tiếp xúc với
kháng nguyên. Kháng nguyên có thể được chủ động đưa vào (vacxin) hay do tiếp xúc
ngẫu nhiên (nhiễm khuẩn). Miễn dịch thu được cịn có thể xuất hiện do truyền các tế
bào có thẩm quyền miễn dịch (miễn dịch mượn: adoptive immunity) hoặc truyền
kháng thể (miễn dịch thụ động: passive immunity). Miễn dịch thu được có hai đặc
điểm khác cơ bản miễn dịch tự nhiên là khả năng nhận dạng và khả năng ghi nhớ về
kháng nguyên.
2.4.3.2. Các giai đoạn miễn dịch thu được
gồm 3 giai đoạn chính

Giai đoạn nhận diện kháng nguyên
Giai đoạn đầu của đáp ứng miễn dịch là làm biến đổi một kháng nguyên có cấu
trúc phức tạp thành ra những peptit nhỏ để các tế bào có thẩm quyền của hệ thống
miễn dịch có thể nhận biết được. Không kể một số kháng nguyên là chất đa đường hay
protein có cấu trúc lặp đi lặp lại nhiều lần, có khả năng được nhận diện trực tiếp bởi tế
bào lympho B, thì mọi kháng nguyên đều được xử lý và trình diện bởi các tế bào trình
diện kháng nguyên (antigen presenting cell, APC) và nhận biết bởi tế bào lympho T
nhờ những cơ quan cảm thụ có sẵn trên các tế bào ấy trong khuôn cảnh của các phân
tử phức hệ phù hợp tổ chức yếu.

11



Giai đoạn hoạt hóa, tương tác và ghi nhớ
Kháng nguyên sau khi bị xử lý thành các mảnh peptit nhỏ thì được các APC trình
cho tế bào lymphơ T tại các hạch. Nếu phản ứng đầu của đáp ứng miễn dịch có tính
chất đặc hiệu với kháng ngun thì khi tế bào được hoạt hoá tiết ra cytokine để tác
động lên các tế bào khác tính chất đáp ứng được khuếch đại, nhưng do mỗi cytokine
có thể có tác dụng trên nhiều tế bào cho nên tạo nên mạng lưới có tính chất điều hồ
nữa.

Những tế bào nhận thơng tin, tham gia vào đáp ứng miễn dịch lần đầu được gọi là
đã mẫn cảm, tức là chúng đã được tiếp xúc với kháng nguyên và sản xuất ra những
chất chống lại đặc hiệu với kháng nguyên ấy. Những chất đó được gọi là kháng thể.
Kháng thể có thể được đổ vào dịch nội mơ, đó là kháng thể dịch thể, kháng thể dịch
thể do tế bào lympho B sản xuất. Loại kháng thể thứ hai nằm ngay trên màng của
những tế bào sinh ra nó, đó là kháng thể tế bào, do một quần thể tế bào khác gọi là tế
bào lympho T sản xuất.

Giai đoạn hiệu ứng
Tức khi các tế bào lympho đã được mẫn cảm sản xuất ra kháng thể (dịch thể hay
tế bào) và kháng thể này kết hợp với kháng nguyên đặc hiệu dẫn đến viêm và tiêu diệt
kháng nguyên ấy. Để dễ hiểu, người ta chia đáp ứng miễn dịch tế bào, nhưng thực tế
hai loại đáp ứng này có liên quan mật thiết và có sự tương tác phức tạp.
2.5. VACXIN VÀ NGUYÊN LÝ TÁC DỤNG
Vacxin là những chế phẩm sinh học dùng để kích thích hệ thống miễn dịch đặc
hiệu của cơ thể động vật hoạt động.
Người đề xướng và sử dụng vacxin đầu tiên trên thế giới là một bác sĩ người Anh
tên Edward Jenner. Loại vacxin đầu tiên này là loại virus đậu bò dùng để chủng cho
người. Vào cuối thế kỷ 19, nhà khoa học người Pháp Louis Pastuer thơng qua các cơng
trình nghiên cứu và thành cơng rực rỡ của mình mới thực sự là người mở đầu cho kỷ
ngun dùng vacxin với mục đích phịng bệnh.
Sau khi chủng vacxin tuỳ thuộc vào tính chất và phương pháp sử dụng vacxin,
các kháng thể hoặc tế bào miễn dịch (tế bào lympho T) được tạo thành, có thể bảo vệ
động vật khỏi tác động gây bệnh của vi sinh vật cùng loại với vacxin. Khi các kháng
thể và tế bào miễn dịch tạo thành lưu hành chủ yếu trong máu chúng ta nhận được
12


miễn dịch hệ thống, còn trường hợp chúng khu trú ở trên bề mặt hệ thống khí quản
trong cơ thể thì chúng ta có miễn dịch tại chỗ hay miễn dịch cục bộ.
Hiện nay trên thị trường có hai loại vacxin chính: vacxin chết và vacxin sống

nhược độc.
Các loại vacxin sống được chế từ vi khuẩn hoặc virus còn sống có độc lực thấp,
nhận được bằng phương pháp chọn lọc tự nhiên hoặc giảm độc nhân tạo.
Các vacxin sống có thể sử dụng bằng phương pháp tiêm dưới da, bắp thịt…. Các
vacxin sống kích thích hệ thống miễn dịch có thể tạo ra đồng thời miễn dịch thể, miễn
dịch tế bào cũng như miễn dịch tại chỗ, do vậy thường tạo được khả năng phòng bệnh
mạnh mẽ và vững chắc, nhưng có thể gây ra một số phản ứng phụ. Đặc biệt nguy hiểm
là các vi sinh vật nhược độc có thể trở thành cường độc, do vậy cần phải hết sức cẩn
thận trong quá trình bảo quản và sử dụng vacxin sống.
Các vacxin chết hoặc vô hoạt được chết từ vi khuẩn hoặc virus gây bệnh được
giết chết bằng các phương pháp vật lý (nhiệt độ cao, bức xạ đồng vị, tia cực tím) hay
hóa học. Các chất hóa học thường dùng để vô hoạt vi sinh vật trong sản xuất vacxin
như formaldehyde, ethylene imine…
So với vacxin sống, các vacxin vơ hoạt an tồn hơn nhưng có hiệu lực miễn dịch
yếu hơn và không tạo miễn dịch tại chỗ. Để tạo được miễn dịch phòng bệnh đủ mạnh
cần phải tiêm vacxin với liều lớn hơn và thường sử dụng 2 - 3 lần.
Để nâng cao hiệu quả của các loại vacxin vô hoạt, người ta phải bổ sung thêm các
chất bổ trợ miễn dịch. Các chất bổ trợ có tác dụng tăng khả năng miễn dịch và kéo dài
thời gian miễn dịch của các loại vacxin chết, nhưng các chất bổ trợ cũng có thể gây
phản ứng viêm tại chỗ.

13


2.6. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VACXIN RHD (THEO OIE, 2004)
Để chế vacxin phòng bệnh RHD, mẫu gan, lách của thỏ chết do Calicivirus được
nghiền nhỏ (dùng cối vô trùng) và hịa với dung dịch đệm PBS vơ trùng, có chứa
kháng sinh thành nồng độ 1/10. Dùng 2 thỏ khỏe mạnh khơng có kháng thể RHD (HI
âm tính) gây nhiễm với liều 1ml/con. Theo dõi thời gian bệnh và chết của thỏ. Thỏ
chết với triệu chứng điển hình của RHD, mổ khám kiểm tra bệnh tích, thu hoạch gan,

lách một cách vô trùng. Kiểm tra mẫu gan, lách về mặt vi khuẩn học và xác định hiệu
giá HA. Quá trình tiếp đời được thực hiện liên tục qua 4 đời và giống virus chứa trong
gan, lách thỏ, ở lần tiếp đời cuối cùng được giữ như giống gốc dùng nghiên cứu chế
vacxin phịng bệnh cho thỏ.
Qui trình sản xuất vacxin được tóm tắt như sau:
Gan, lách xay nhỏ hịa với đệm PBS  Ly tâm lấy phần dịch trong ở trên  Vô
hoạt virus  Xác định hiệu giá virus  Pha thành nồng độ thích hợp  Cho chất bổ
trợ.
Vacxin khi sản xuất được kiểm tra vô trùng trên các môi trường kiểm tra như:
thạch máu, thạch nấm, môi trường yếm khí và lọ nước thịt 50 ml. Vacxin chỉ được
dùng kiểm tra an toàn và hiệu lực khi đạt chuẩn về kiểm tra vô trùng.
Nhiệt độ bảo quản vacxin tốt nhất ở 2 - 80C.
2.7. TIÊU CHUẨN CỦA VACXIN
Một vacxin được đưa vào sử dụng phải bảo đảm đạt chỉ tiêu về an tồn và hiệu
lực.
• An tồn: Một vacxin được coi là đảm bảo tiêu chuẩn an toàn có nghĩa là sau
khi đưa vào cơ thể động vật không gây ra bệnh do vi sinh vật trở lại độc lực
(đối với vacxin sống), không gây độc và gây phản ứng (đối với vacxin vô hoạt).
Để đạt được tiêu chuẩn này vacxin sau khi sản xuất ra phải được các trung tâm
kiểm định tiêu chuẩn kiểm tra chặt chẽ về các mặt vơ khuẩn, thuần khiết và
khơng cịn độc tính.
• Hiệu lực: Vacxin có hiệu lực là vacxin tạo ra được tình trạng miễn dịch cho thú
được tiêm chủng ở mức độ cao và duy trì được một thời gian dài.
Hiệu lực của một vacxin được định giá trên cơ sở thí nghiệm trên động vật và sau
đó là trên thực địa tiêm chủng ở động vật đích.
14