Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn và khảo sát hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa các dịch chiết tinh dầu từ dược liệu cúc tần và xuyên tâm liên (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN
VÀ KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG POLYPHENOL,
HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CÁC DỊCH CHIẾT
TINH DẦU TỪ DƢỢC LIỆU CÚC TẦN VÀ XUYÊN
TÂM LIÊN

Ngƣời thực hiện
Mã sinh viên

: Phạm Thị Huế
: 637229

Lớp

: K63CNSHC

Khoa

: Công nghệ sinh học

Ngƣời hƣớng dẫn

: PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải
TS. Nguyễn Thị Thanh Hà

Bộ môn

: Công nghệ sinh học Thực vật

HÀ NỘI - 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cảm đoan các số liệu, hình ảnh và kết quả trong báo cáo này là
trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ một cơng trình
khoa học nào.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp
đã đƣợc cảm ơn và các thơng tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đều đƣợc chỉ rõ nguồn
gốc trong danh mục tài liệu tham khảo của khóa luận
Hà Nội, ngày

tháng năm 202

Sinh viên

Phạm Thị Huế


LỜI CẢM ƠN
Với tình cảm chân thành và lịng biết ơn sâu sắc, cho phép tôi gửi lời cảm ơn
chân thành nhất tới Ban giám đốc, các phòng ban của Học viện Nông nghiệp Việt
Nam, Khoa Công nghệ sinh học, Bộ môn Thực vật , các thầy cô đã tận tình giảng dạy
và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành
khóa luận.

Đặc biệt tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ngƣời hƣớng dẫn tôi: PGS.TS
Nguyễn Thanh Hải và TS Nguyễn Thị Thanh Hà, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ
bảo, giúp đỡ và quan tâm động viên trong suốt khoảng thời gian tơi làm và hồn thành
khóa luận.

Cẩm ơn sự hỗ trợ của các bạn sinh viên dành cho tơi trong thời gian cùng
làm khóa luận.
Cuối cùng, với tất cả lịng kính trọng và biết ơn vơ hạn, tơi muốn gửi lời cảm ơn
đến bố mẹ, anh, chị những ngƣời thân của tơi và tồn thể bạn bè đã giúp đỡ, hỗ trợ
đông viên tạo động lực cho tôi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm
Sinh viên

Phạm Thị Huế

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................... vii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN ................................................................................... ix
Phần I. MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1.

Đặt vấn đề ................................................................................................. 1

1.2.

Mục đích – yêu cầu ................................................................................... 1

1.3.

Ý nghĩa ...................................................................................................... 2

Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
2.1. Các dƣợc liệu sử dụng ................................................................................. 3
2.1.1. Cây cúc tần ................................................................................................ 3
2.2.

Các loại vi khuẩn đƣợc sử dụng ................................................................ 5

2.3.

Tổng quan về Polyphenol ......................................................................... 6

2.4.

Hoạt tính chống oxy hóa ........................................................................... 8

2.5.Tình hình nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, hàm lƣợng polyphenol và
hoạt tính chống oxy hố của 2 dƣợc liệu ................................................. 9
2.5.1.Nghiên cứu nƣớc ngồi ................................................................................ 9
2.5.2.Nghiên cứu trong nƣớc............................................................................... 11
Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 12

3.1.

Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 12

3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................... 12
3.1.1. Phƣơng pháp chiết suất tinh dầu ............................................................. 12
3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................. 12
3.1.2.1.Vi khuẩn .................................................................................................. 12
3.1.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị................................................................... 13
3.2.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 14

3.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu......................................................................... 14
iii


3.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu........................................................... 14
3.3.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dƣợc
liệu trên vi khuẩn..................................................................................... 16
3.3.3. Phƣơng pháp xác định đƣờng kính vịng vơ khuẩn tinh dầu cúc tần. ..... 19
3.3.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenol ....................................... 20
3.3.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa ..................................... 21
3.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu....................................................................... 23
Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 24
4.1.

Kết quả xác định đƣờng kính vịng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc

liệu theo phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch........................................... 24

4.1.1. Kết quả đƣờng kính đƣờng kính vịng vơ khuẩn của cao chiết cúc tần .. 24
4.1.2. Đƣờng kính vịng vơ khuẩn Xun tâm liên ........................................... 27
4.2.

Kết quả đƣờng kính vịng vơ khuẩn của tinh dầu cúc tần....................... 31

4.3.

Hàm lƣợng polyphenol ........................................................................... 32

4.3.1. . Kết quả xây dựng đồ thị chuẩn giữa hàm lƣợng acid chlorogenic và
sự gia tăng giá trị mật độ quang đo đƣợc khi phản ứng với thuốc thử
Folin Ciocalteu ........................................................................................ 33
4.3.2. Kết quả hàm lƣợng polyphenol dịch chiết cúc tần và xuyên tâm liên .... 34
4.4.

Hàm lƣợng hoạt tính chống oxy hố ....................................................... 36

4.4.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của chất chuẩn VTME
(Alpha tocopherol) .................................................................................. 36
4.4.2. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dƣợc liệu ...................... 38
Phần V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 43
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 43
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 44
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 48

iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1 Kích thƣớc đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) của dƣợc liệu cúc tần
trên B.subtilis. và G. philus. ................................................................ 24
Bảng 4.2 Kích thƣớc đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) của dƣợc liệu cúc tần
trên . S. aureus 25923; E. coli 85922. ................................................. 25
Bảng 4.3 Đƣờng kính vịng vô khuẩn (mm) của dƣợc liệu xuyên tâm liên........ 27
Bảng 4.4 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) tại 5 nồng độ khác nhau của tinh
dầu cúc tần phƣơng pháp khuếch tán. ................................................. 31
Bảng 4.5 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) tại 5 nồng độ khác nhau của tinh
dầu cúc tần phƣơng pháp khuếch tán. ................................................. 32
Bảng 4.6 Mức độ gia tăng giá trị mật độ quang (OD values) theo nồng độ
chất chuẩn acid chlorogenic (mg/ml)................................................. 33
Bảng 4.6 Hàm lƣợng polyphenol dƣợc liệu cúc tần và xuyên tâm liên ở nồng
độ 100 (mg/ml).................................................................................... 35
Bảng 4.7 Hoạt tính chống oxy hóa của chất chuẩn VTME xác định theo
phƣơng pháp sử dụng DPPH tại các nồng độ khác nhau (AA%). ...... 37
Bảng 4.8 Hoạt tính chống oxy hố quy đổi theo mg VTME/ 100mg dƣợc
liệu chiết bằng các dung môi khác nhau. ............................................ 39

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Cúc tần.................................................................................................... 3
Hình 2.2 Xun tâm liên ....................................................................................... 4
Hình 2.3 Phân loại polyphenol .............................................................................. 7
Hình 3.1 Dƣợc liệu đƣợc nghiền thành bột ......................................................... 14
Hình 3.2 Dịch chiết trong tube 15ml ................................................................... 15

Hình 3.3 Máy cơ quay dƣợc liệu (ảnh chụp tại phịng thí nghiệm) .................... 15
Hình 3.4 Các bƣớc tiến hành ............................................................................... 17
Hình 3.5 Ống khâu sử dụng trong quá trình đục lỗ thạch ................................... 18
Hình 3.6 Ảnh khả năng ức chế của xuyên tâm liên ở 3 dung môi trên vi
khuẩn S. ureus 25023 sau 12 giờ ni cấy.......................................... 18
Hình 3.7 Máy quang phổ so màu 722 (Ultraviolet - Víibiliti Spectrum,
Trung Quốc) ........................................................................................ 21
Hình 3.8 Phản ứng chuyển màu của dung môi dƣợc liệu cúc tần nồng độ 20
mg/ml sử dụng thuốc thử Folin- Ciocalteu's phenol reagent .............. 21
Hình 3.9 Cơ chế phản ứng chuyển màu trong xác định hoạt tính chống oxy
hố sử dụng chất thử nghiệm DPPH ................................................... 23
Hình 4.1. Biểu đồ đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) của các dịch chiết cúc
tần tại nồng độ 2000 mg/ml. .............................................................. 26
Hình 4.2 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn sau 12 giờ ni cấy dịch chiết cúc tần. ... 26
Hình 4.3 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch chiết xuyên tâm liên dung môi
ethanol trên khuẩn E.coli 25922 và E.coli 85922. .............................. 29
HÌnh 4.4 Đƣờng kính vịng vô khuẩn dịch chiết xuyên tâm liên dung môi
methanol. ............................................................................................. 30
Hình 4.5 Biểu đồ so sánh kích thƣơc đƣờng kính vịng vơ khuẩn xun tâm
liên nồng độ 2000 mg. ........................................................................ 30
Hình 4.6 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn nồng độ 0.1/tinh dầu cúc tần trên
B.subtilis phƣơng pháp khuếch tán. .................................................... 32

vi


Hình 4.7 Đồ thị mối tƣơng quan của nồng độ của acid chlorogenic (mg/ml)
với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value) ................... 34
Hình 4.8 Sự đổi màu từ vàng sang xanh các dung môi dƣợc liệu xuyên tâm
liên. ...................................................................................................... 35

Hình 4.9 Biểu đồ so sánh hàm lƣợng polyphenol (quy đổi theo mg acid
chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu) của các dịch chiết. ........................... 36
Hình 4.10 Biểu đồ đƣờngchuẩn biểu đạt mối tƣơng quan giữa nồng độ
VTME (chất chuẩn) và hoạt tính chống oxy hóa. ............................... 38
Hình 4.11 Phản ứng đổi màu đổi màu của dịch chiết ở các dung môi khác
nhau của cúc tần tại nồng độ 20 mg dƣợc liệu. .................................. 39
Hình 4.12 Sự thay đổi màu của dịch chiết methanol nồng độ 10 mg dƣợc
liệu ....................................................................................................... 40
Hình 4.13 Sự thay đổi màu của các dung môi dƣợc liệu xuyên tâm liên nồng
độ 20 mg dƣợc liệu. ............................................................................ 40
Hình 4.14 Sự thay đổi màu sắc của dịch chiết xuyên tâm liên ethyl và hexan
ở nồng độ 100 mg và 200 mg. ............................................................ 41
Hình 4.15 Biểu đồ hoạt tính chống oxy hóa tổng số của các dịch chiết cúc
tần và xuyên tâm liên quy đổi theo hàm lƣợng VTME (100 mg
dƣợc liệu). ........................................................................................... 42

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Viết đầy đủ

ATCC

American Type Culture Collection

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

DPPH

1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl

VTME

Vitamin E

B. subtilis

Bacillus subtilis

E. coli

Eschrichia Coli

G. philus

Geobacillus stearothermophilus

Pseudo

Pseudomonas aeruginosa

S.aureus

Staphylococcus aureus

Sal

Salmonella

viii


TĨM TẮT KHĨA LUẬN
MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn từ tinh dầu cúc tần và dịch chiết của dƣợc
liệu cúc tần và xuyên tâm liên trên vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633; Geobacillus
stearothermophilus

ATCC

7953;

Pseudomonas

aeruginosa

ATCC

9027;

Staphylococcus aureus ATCC 25023; Staphylococcus aureus ATCC 25923;
Escherichia coli ATCC 85922; Escherichia coli ATCC 35218; Escherichia coli ATCC
25922 và Salmonella ATCC 13311.
Xác định trong đƣợc dung mơi chiết xuất có khả năng kháng khuẩn tốt nhất của

từng dƣợc liệu.
Khảo sát đƣợc hàm lƣợng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch
chiết cúc tần và xuyên tâm liên, xác định dung mơi có khả năng thu đƣợc hàm lƣợng
tốt nhất.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phƣơng pháp chiết suất dƣợc liệu
- Phƣơng pháp chƣng cất cuốn hơi nƣớc tách chiết tinh dầu
- Phƣơng pháp tác dụng ức chế của các dịch chiết đƣợc thực hiện theo nguyên
lý khuếch tán trên thạch của Kirby-Bauer trên 9 chủng vi khuẩn
- Phƣơng pháp xông hơi và khuếch tán tinh dầu
- Sử dụng phƣơng pháp Folin Cio-cautel và chất chuẩn acid chlorogenic để
xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết.
- Sử dụng phƣơng pháp DPPH scavenging activity với thuốc thử 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) và chất chuẩn vitamin E ( VTME ) để xác định hoạt tính chống oxy
hóa của dịch chiết.
- Xác định hoạt tính oxy hố bằng các phân tích sử dụng chất DPPH (1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl), theo phƣơng pháp của Masuda et al. (2002)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Dƣợc liệu cúc tần dung mơi methanolthích hợp cho kết quả đƣờng kính vịng vơ
khuần lớn.

ix


Xun tâm liên có phổ kháng rộng, dụng mơi thích họp nất là ethanol cho
đƣờng vịng vơ khuẩn lớn nhất và thể hiện tính kháng trên cả chin chủng vi khuẩn.
Tình dầu cúc tần có hoạt tính kháng khuẩn.
Dịch chiết các cây đều có chứa thành phần polyphenol và có hoạt tính chống
oxy hóa.

x


Phần I. MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Theo quan niệm truyền thống kháng sinh đƣợc định nghĩa là những chất do các
vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) tạo ra có khả năng ức chế sự phát triển hoặc
tiêu diệt vi khuẩn. Hiện nay, khoa học kĩ thuật ngày càng phát triển kháng sinh không
chỉ đƣợc tạo ra bởi các vi sinh vật mà cịn đƣợc tạo ra bằng q trình bán tổng hợp
hoặc tổng hợp hóa học. Nguồn kháng sinh này đƣợc sử dụng khơng hợp lý, có phần
lạm dụng kháng sinh gây hiện tƣợng kháng sinh, tồn chất kháng sinh trong thực phẩm,
chăn ni. Ngày nay có càng nhiều mối quan tâm đối với việc tìm kiếm các chất kháng
khuẩn có nguồn gốc tự nhiên. Đặc biệt các cây dƣợc liệu, chúng cho ít tác dụng phụ,
khả năng kháng chậm hơn, an toàn khi sử dụng.
Cúc tần và xuyên tâm liên đƣợc dân gian sử dụng để chữa trị rất nhiều bệnh và
dịch chiết của chúng đƣợc cho là có khả năng kháng khuẩn tốt. Ngồi ra, các nhà khoa
học cũng quan tâm về các hoạt tính chống oxy hố. Q trình sản xuất và tích lũy q
mức các gốc tự do trong cơ thể là nguyên nhân chính dẫn đến lão hóa và các bệnh
thối hóa nhƣ bệnh đái tháo đƣờng, ung thƣ, xơ vữa động mạch, bệnh tim mạch…
(Badhani et al., 2015). Ngoài ra, chất kháng oxy hóa tổng hợp (nhƣ butylated
hydroxyanisol và butylated hydroxytoluene) đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành công
nghiệp thực phẩm đã đƣợc chứng minh là có hại cho sức khỏe do độc tính tiềm tàng và
là các tác nhân gây ung thƣ (Gorinstein et al., 2003). Do đó, trong nghiên cứu này tôi
đã đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn và khảo sát hàm lƣợng polyphenol và hoạt tính
chống oxy hố.

1.2.

Mục đích – yêu cầu
- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn từ tinh dầu cúc tần và dịch chiết của dƣợc

liệu cúc tần và xuyên tâm liên trên vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633; Geobacillus
stearothermophilus

ATCC

7953;

Pseudomonas

aeruginosa

ATCC

9027;

Staphylococcus aureus ATCC 25023; Staphylococcus aureus ATCC 25923;
Escherichia coli ATCC 85922; Escherichia coli ATCC 35218; Escherichia coli ATCC
25922 và Salmonella ATCC 13311.

1


Xác định trong đƣợc dung mơi chiết xuất có khả năng kháng khuẩn tốt nhất của
từng dƣợc liệu.
Khảo sát đƣợc hàm lƣợng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch
chiết cúc tần và xuyên tâm liên, xác định dung mơi có khả năng thu đƣợc hàm lƣợng
tốt nhất.

1.3.

Ý nghĩa
Kết quả thu đƣợc có ý nghĩa quan trọng trong việc tuyển chọn các loại dƣợc liệu có

thể bổ sung vào thức ăn của vật nuôi thay thế thuốc kháng sinh trong chăn ni. Từ đó
chúng ta có thể xây dựng một nguồn thực phẩm sạch an toàn cho con ngƣời.
Kết quả của đề tài là nguồn tài liệu tham khảo cho các đề tài nghiên cứu dƣợc
liệu sau này.

2


Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Các dƣợc liệu sử dụng
2.1.1. Cây cúc tần
Cúc tần hay cịn có tên gọi khác là cây từ bi, đại ngải, nan luật. Cây có tên khoa
học là Pluchea indica (L.) Less thuộc họ Cúc (Asteraceae), chi Cúc tần Pluchea. Cây
bụi mọc dại, cao từ 1 – 2m, đƣợc bao phủ bởi một lớp lơng tơ mỏng, có mùi thơm dịu
nhẹ. Cành cây phát triển từ thân, mảnh và nhỏ, có nhiều lơng nhẵn. Lá mọc so le nhau,
khơng có cuống hoặc cuống rất ngắn. Lá cây có hình elip dài hẹp, hình bầu dục, đầu lá
nhọn, mép có răng cƣa.

Hình 2.1 Cúc tần
Trong các nghiên cứu đƣợc công bố Pluchea indica đƣợc sử dụng rộng rãi để
điều trị đái tháo đƣờng, u bƣớu, tăng huyết áp và viêm bàng quang (chewchida &
Vongsak, 2019). Dịch chiết P.indica có khả năng kháng vi khuẩn gram âm và gram
dƣơng (Qiu et al, 2008). Lá Pluchea indica đƣợc phát hiện có nhiều hoạt tính sinh học
khác nhau bao gồm chất chống oxy hóa ( Widyawati et al., 2014), chống viêm
(Buapool et al., 2013).

3


2.1.2. Cây Xuyên tâm liên

Hình 2.2 Xuyên tâm liên
Xuyên tâm liên có tên khoa học là Andrographis paniculata (Burm.f.) Wall. ex
Nees (đồng nghĩa Justicia paniculata (Burm.f.) Nees ), có tên gọi khác là công cộng,
lam khái liên, cây lá đắng, khổ đàm thảo, nhất kiến kỷ,… thuộc họ Ơ rơ (
Acanthaceae). Xuyên tâm liên là cây thuốc quan trọng và đƣợc sử dụng rộng rãi trên
khắp thế giới.
Xuyên tâm liên có hoạt tính kháng sinh mạnh với nhiều loại vi khuẩn, làm tăng
lƣợng bạch cầu, có tác dụng giảm đau tƣơng tự nhƣ aspirin. Thƣờng dùng trị cảm sốt,
cúm,… Cũng đƣợc dùng để chữa bệnh cho gia súc gia cầm. Xuyên tâm liên là vị thuộc
đƣợc thế giới đƣa vào nghiên cứu bệnh AIDS. Xuyên tâm liên có tác dụng chống
COVID- 19, tại Thái Lan cuộc thử nghiệm lâm sàng đầu tiên đã đƣợc Viện Nghiên
cứu y học cổ truyền Thái Lan (2020) tiến hành trên những bệnh nhân đã biểu hiện triệu
chứng nhiễm COVID-19 nhẹ nhƣ đau họng, nhức đầu, ho hay sổ mũi. Ngƣời bệnh
đƣợc cho uống 180mg Xuyên tâm liên/ngày, chia đều làm 3 lần vào lúc 6 giờ sáng, 2
giờ chiều và 10 giờ tối, uống liên tục trong 5 ngày. Cuộc thử nghiệm cho kết quả khả
quan, trong vòng 3 ngày kể từ khi sử dụng Xuyên tâm liên tình trạng sức khỏe của các
tình nguyện viên mắc COVID-19 đều đƣợc cải thiện.
Trong cây và lá chứa 2 nhóm hoạt chất chính là diterpen lacton và flavonoid,
hợp chất chính là andrographolide, arabinogalactan ngồi ra cịn có các acid hữu cơ,
tanin, nhựa, đƣờng,…

4


2.2.Các loại vi khuẩn đƣợc sử dụng

Trong đề tài nghiên cứu của mình tơi sử dụng chín chủng vi khuẩn, đã đƣợc

xác định rõ đặc tính và nằm trong danh sách bộ mẫu đã đƣợc sƣu tập các bộ
chủng giống vi sinh, virus, tế bào động vật, thực vật và cả các ADN tái tổ hợp lớn
nhất thế giới là ATCC (American Type Culture Collection, Mỹ) và đƣợc bảo quản tại
bộ môn Nội – Chẩn – Dƣợc – Độc chất khoa Thú y.
E. coli là trực khuẩn gram âm . Tế bào thƣờng có hình que. Vi khuẩn tồn tại
trong mơi trƣờng hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện. Kích thƣớc trung bình 2 - 3 x 0,5 µm.
Vi khuẩn có khả năng di dộng, có tiên mao. Vi khuẩn phát triển ở 5- 40o C nhiệt độ tối
ƣu ở 37oC. Trong những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian
phân chia chỉ khoảng 20 đến 30 phút. E. coli gây nên bệnh tiêu chảy. (Nghiêm Văn
Hùng 2020)
S. aureus là vi khuẩn gram âm có hình cầu. Staphylococci (tụ cầu khuẩn) là
những vi khuẩn kỵ khí dễ sinh trƣởng bằng cách hơ hấp hiếu khí hoặc bằng cách lên
men tạo ra chủ yếu là axit lactic. Vi khuẩn có catalase dƣơng tính và oxidase âm tính.
S. aureus có thể phát triển ở nhiệt độ từ 15 đến 45oC. và ở nồng độ NaCl cao tới 15%.
( Foster, T. J. 2002.)
B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, bắt màu tím Gram dƣơng, kích thƣớc
0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ
sinh trƣởng tối ƣu 37oC. Độ pH của vi khuẩn sinh trƣởng phù hợp từ 7.0- 7.4 B.
subtilis đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến và đƣợc xem nhƣ sinh vật phòng và trị các
bệnh về rối loạn đƣờng tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu
chảy…Ngày nay, B. subtilis đã và đang đƣợc nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng
và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trƣờng…( Kovács, Á.
T. 2019)
Pseudo là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que với khả năng di chuyển một
cực. Vi khuẩn sống trong điều kiện hiếu khí và kị khí tùy tiện. Nhiệt sinh trƣởng của
chúng từ 4 oC- 42 oC nhiệt độ phát triển tối ƣu từ 37 oC. Pseudo là một trong những
nguyên nhân gây bệnh viêm phổi.( Yvon Michel-Briand & Christine Baysse. 2002)

5


G. philus là vi khuẩn gram dƣơng, vi khuẩn ƣa nhiệt, hiếu khí, kí khí tùy tiện
tạo bào tử chịu nhiệt. Nhiệt độ sinh vi khuẩn này đƣợc ứng dụng trong kiểm tra
hàm lƣợng chất kháng sinh tồn dƣ trong sữa và các thực phẩm từ động vật và thực
vật. G. stearothermophilus sản xuất một loạt các enzym ổn định nhiệt với các ứng
dụng công nghiệp (P. Kotzekidou. 2014).
Salmonella là một loại vi khuẩn Gram âm kỵ khí đầu que, trùng roi, kỵ khí và
một lồi thuộc giống Salmonella. Một số huyết thanh của nó là mầm bệnh nghiêm
trọng cho ngƣời (bệnh truyền nhiễm, bệnh đƣờng ruột,…). Hầu hết các trƣờng hợp
nhiễm khuẩn salmonella là do thức ăn bị nhiễm S. enterica , thƣờng lây nhiễm cho gia
súc và gia cầm, mặc dù các động vật khác nhƣ mèo đồng nhà và chuột cũng đã đƣợc
chứng minh là nguồn lây bệnh ở ngƣời . Các cuộc điều tra về túi của máy hút bụi đã
chỉ ra rằng các hộ gia đình có thể hoạt động nhƣ một ổ chứa vi khuẩn; điều này dễ xảy
ra hơn nếu hộ gia đình tiếp xúc với nguồn lây nhiễm (ví dụ: các thành viên làm việc
với gia súc hoặc trong phòng khám thú y).( Figueroa IOM & Verdugo RA. 2005 )

2.3.Tổng quan về Polyphenol
Cấu tạo, phân loại, tác dụng của polyphenol
Polyphenol là hợp chất có chứa một hay nhiều vịng thơm liên kết với một
hoặc nhiều nhóm hydroxyl (-OH). Polyphenol trong thực vật phân bố khá rộng và đa
dạng, chúng hiện diện trong trái cây, lá cây, rau quả, ngũ cốc, các loại đậu… Các hợp
chất polyphenol từ thực vật đƣợc biết đến là có thể có tác dụng nhƣ chất kháng sinh,
thuốc diệt côn trùng tự nhiên, chất hấp dẫn cho côn trùng thụ phấn, chống lại tia cực
tím, làm cho thành tế bào khơng thấm khí và nƣớc, đồng thời hình thành nên màu tự
nhiên của thực vật (Harbome & William, 2001). Đồng thời, những nghiên cứu hiện đại
cũng chỉ ra rất nhiều ảnh hƣởng tích cực của polyphenol lên sức khỏe. Do đó, thành
phần này của thực vật rất hay đƣợc đƣa vào các chế phẩm thuốc hay thực phẩm chức
năng sử dụng cho việc cải thiện và nâng cao sức khỏe.

6


Hình 2.3 Phân loại polyphenol
Polyphenol cịn là chất chống oxy hóa, chúng tiếp nhận gốc tự do sinh ra trong
quá trình bệnh lý, kìm hãm sự phát triển của các khối u, chống phóng xạ và một số
bệnh ung thƣ. Các gốc tự do dƣ thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên
các nghiên cứu đều hƣớng tới việc khảo sát khả năng kháng oxy hóa, quét gốc tự do
trong quá trình tìm kiếm các hợp chất trong thiên nhiên có khả năng ngăn chặn hoặc
chữa bệnh. Polyphenol cũng có thể đi qua hệ tiêu hóa mà khơng đƣợc hấp thụ, do đó
ảnh hƣởng đến hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Điều này có thể dẫn đến hai hậu quả: thứ
nhất, polyphenol bị biến đổi thành dạng hoạt động của chúng; thứ hai, chúng làm thay
đổi thành phần của hệ vi sinh vật đƣờng ruột, có thể là ức chế vi khuẩn gây bệnh và
làm giàu vi khuẩn có lợi. Do đó, polyphenol có tác động đáng kể đến sức khỏe vật chủ
của con ngƣời (Abbas et al., 2017).
Tác động của polyphenol trên vi khuẩn khuẩn Gram dƣơng , Gram âm
Cấu tạo vi khuẩn khuẩn Gram dương, Gram âm
Điểm khác nhau chủ yếu giữa vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm liên quan đến
thành phần thành tế bào của chúng. Vi khuẩn Gram dƣơng có thành tế bào đƣợc cấu
tạo chủ yếu từ một đƣợc gọi là peptidoglycan. Các vi khuẩn này sẽ có màu tím sau khi
nhuộm Gram. Vi khuẩn Gram âm có thành tế bào gồm một lớp mỏng peptidoglycan và
màng ngồi có lipopolysaccharide khơng có ở vi khuẩn Gram dƣơng. Vi khuẩn Gram
âm có màu đỏ hoặc hồng sau khi nhuộm Gram.

7


Thành tế bào Gram dƣơng đƣợc cấu tạo chủ yếu bởi peptidoglycan. Các lớp
peptidoglycan này giúp nâng đỡ màng tế bào và cung cấp vị trí liên kết cho các phân

tử. Các lớp dày là nguyên nhân khiến cho vi khuẩn Gram dƣơng có thể giữ lại hầu hết
chất nhuộm tím trong tinh thể trong q trình nhuộm, khiến chúng có màu tím. Tế bào
Gram dƣơng cũng chứa các chuỗi axit teichoic kéo dài từ màng sinh chất qua
peptidoglycan. Axit teichoic giúp một số vi khuẩn Gram dƣơng xâm nhập vào tế bào
và gây bệnh.
Vi khuẩn Gram âm đƣợc cấu tạo bởi peptidoglycan. Tuy nhiên, peptidoglycan
của vi khuẩn Gram âm chỉ là một lớp mỏng so với các lớp dày của tế bào Gram dƣơng.
Vì mỏng nên lớp này khơng giữ lại màu nhuộm tím của thuốc nhuộm ban đầu mà tạo
ra màu hồng trong quá trình nhuộm Gram. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn Gram
âm thì phức tạp hơn so với vi khuẩn Gram dƣơng. Ở giữa peptidoglycan mỏng và
màng sinh chất là chất nền. Không giống nhƣ ở vi khuẩn Gram (+), vi khuẩn Gram

(-) có lớp màng bên ngồi nằm bên ngồi lớp peptidoglycan.
2.4.Hoạt tính chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa từ thực vật thƣờng đƣợc biết đến bởi khả năng hỗ trợ
cho hệ thống bảo vệ của cơ thể, ngăn chặn những quá trình oxy hóa khơng mong muốn
gây nhiều tác hại lên sức khỏe. Trong đời sống các sinh vật, quá trình hô hấp tạo ra
những hợp chất trung gian là các gốc tự do nhƣ anion Superoxide (O2-), hydroxyl (OH-),
H2O2 ..., là nguyên nhân gây tổn hại các phân tử sinh học nhƣ DNA, lipid, protein...
Bản thân sinh vật cũng có những hệ thống enzyme nhằm điều hòa các gốc tự do. Tuy
nhiên, đôi khi hệ thống tự vệ này bị q tải. Ví dụ: khơng khí bị ơ nhiễm, khói thuốc
lá, bức xạ tử ngoại.. . khiến hàm lƣợng các gốc tự do vƣợt quá khả năng xử lý của cơ
thể và trở thành nguồn gây bệnh hoặc thúc đẩy nhanh q trình lão hóa. Việc bổ sung
các chất chống oxy hóa từ thực vật đƣợc biết đến là góp phần hỗ trợ cho hệ thống
chống gốc tự do của cơ thể, ngăn chặn những phản ứng oxy hóa khơng mong muốn và
theo đó gia tăng sức khỏe.
Các hợp chất nội sinh trong tế bào bao gồm chất chống oxy hóa enzyme và chất
chống oxy hóa khơng enzyme.
Các enzyme có thể chống oxy hóa bằng cách trực tiếp tham gia vào q trình
trung hồ gốc ROS và RNS là: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT),

8


glutathione peroxidase (GPx) và glutathione reductase (GRx). SOD, tuyến phòng thủ
đầu tiên chống lại các gốc tự do, xúc tác việc phá hủy gốc anion superoxide (O2•-)
thành hydrogen peroxide (H2O2). Chất oxy hóa hình thành (H2O2) đƣợc chuyển thành
nƣớc và oxy (O2) bởi catalase (CAT) hoặc glutathione peroxidase (GPx). Enzyme
GPx selenoprotein loại bỏ H2O2 bằng cách sử dụng nó để chuyển glutathione (GSH)
thành glutathione bị oxy hóa (GSSG).
Các chất chống oxy hóa khơng enzyme cũng đƣợc chia thành chất chống oxy
hóa trao đổi chất và chất chống oxy hóa chất dinh dƣỡng. Các chất chống oxy hóa trao
đổi chất thuộc các chất chống oxy hoá nội sinh, đƣợc tạo ra bởi sự trao đổi chất trong
cơ thể, chẳng hạn nhƣ lipoic acid, glutathione, L-arginine, coenzyme Q10, melatonin,
acid uric, bilirubin, protein có khả năng quét ion kim loại, transferrin, Trong khi các
chất chống oxy hóa dinh dƣỡng thuộc các chất chống oxy hóa ngoại sinh, là các hợp
chất khơng thể sinh ra trong cơ thể và phải đƣợc cung cấp thông qua thực phẩm hoặc
các chất bổ sung nhƣ vitamin E, vitamin C, carotenoids, nguyên tố kim loại vi lƣợng
(selen, mangan, kẽm), flavonoid, omega- 3 và axit béo omega-6,…
Chất chống oxy hóa là chất dinh dƣỡng có thể làm sạch các gốc tự do bằng
cách đƣa lên một lectron, Khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một
phân tử chống oxy hóa, các gốc tự do trở lên ổn định và khơng cịn khả năng gây hại.
Ngồi ra, chất chống oxy hóa cịn giúp hạn chế sự phân hủy các hydroperoxide
(Dƣơng Thị Thanh, 2018).

2.5.Tình hình nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, hàm lƣợng polyphenol và
hoạt tính chống oxy hố của 2 dƣợc liệu
2.5.1.Nghiên cứu nƣớc ngồi
Các hợp chất kháng khuẩn, polyphenol có nguồn ngốc từ tự nhiên là nguồn chất
tốt, an toàn khi sử dụng.

Các nhà nghiên cứu đã sử dụng các loại chiết xuất khác nhau của A.
paniculata để khám phá tiềm năng của chúng chống lại nhiều vi khuẩn xâm nhập, bao
gồm các chủng kháng kháng sinh, chẳng hạn nhƣ S. aureus kháng methicillin
(MRSA), E. faecalis kháng vancomycin (VRE), kháng carbapenem Actinobacillus
baumannii, âm tính với β-Lactamase, kháng ampicillin (BLNAR) Haemophilus
influenza , Pseodo. (Hossain S. et al., 2021).

9


Dịch chiết trong nƣớc của A. paniculata cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng
kể, liên quan đến sự hiện diện của các protein andrographolides và arabinogalactan

Singha et al (2003). Ngƣợc lại, chiết xuất methanol của lá cho thấy hoạt động đáng
kể chống lại E. coli cùng với Pseudo, K. pneumonia, S. aureus, B. subtilis và
Streptococcusosystemidis (Sahalan A.Z et al. 2007 ). Tuy nhiên, các chất chiết xuất từ
etanol chỉ có hiệu quả đối với Legionella pneumophila và Bordetella pertussis (Xu Y
et al. 2006 ).
Hoạt tính kháng khuẩn đáng kể của hexan, cloroform, n-butanol, và các phân
đoạn dung dịch nƣớc tiếp theo của các chất chiết xuất đƣợc xử lý bằng rƣợu etylic
50% của A. paniculata đƣợc thể hiện chống lại E. coli (Li B. et al. 2018). Tƣơng tự,
tác dụng ức chế mạnh mẽ của chiết xuất ethanol của các bộ phận trên không đối với sự
phát triển của cả vi khuẩn gram dƣơng và gram âm, cụ thể là Salmonella typhi, V.
cholera, V. alginolyteus, S. aureus, Shigella boydii, Shigella sonnei, E. . coli, B.
licheniformis và Salmonella typhimurium.
Những phát hiện này chỉ ra rằng quá trình chiết xuất và dung mơi có một vai trị
quan trọng trong hiệu quả của A. paniculatavì số lƣợng và sản lƣợng của các chất
chuyển hóa tinh khiết rất khác nhau tùy thuộc vào các loại phân đoạn.
Trong một nghiên cứu năm 2021 của Sirikhwan T. et al. cho thấy chiết xuất thô
của Pluchea indica (L.) phần lá chứa nhiều thành phần hóa thực vật bao gồm saponin,

tannin, flavonoid steroid, tecpenoit và ancaloit. Các loại chất chuyển hóa thứ cấp từ
nguyên liệu thực vật phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi đƣợc sử dụng để chiết
xuất. 95% chiết xuất etanolic của lá cúc tần thể hiện rõ rệt các hoạt động chống oxy
hóa và kháng khuẩn mạnh hơn các dung môi khác (nƣớc cất, 75% axeton và 99.8%
chloroform).
Ngoài ra cho thấy phổ ức chế (chín chủng vi khuẩn) và tiêu diệt (bảy chủng vi
khuẩn) đối với cả vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng, đặc biệt là S. aureus ATCC
25923 với vòng kháng khuẩn là 16.67 ± 0.58 – 46.67 ± 0.58 mm (MIC và MBCs của
25 và 50 mg/ml, tƣơng ứng). Hơn nữa, 95% chiết xuất etanolic cho thấy tổng các hoạt
chất chống oxy hóa và phenolic và flavonoid cao nhất (DPPH và FRAP) là 61.37 ±
0.41% ức chế và giá trị IC50 là 6.80 ± 0.04 μg / ml bằng DPPH. Theo đó, chiết xuất lá
cúc tần trong 95% ethanol là một nguồn giàu hợp chất chống oxy hóa và kháng khuẩn.

10


2.5.2.Nghiên cứu trong nƣớc
Năm 2021, Nguyễn Thị Thanh Hà & cs đã khảo sát hàm lƣợng polyphenol, hoạt
tính chống oxy hóa và kháng khuẩn trên vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 của
một số lồi thảo dƣợc, trong đó có xun tâm liên. Dƣợc liệu đƣợc chiết xuất với các
dung môi gồm ethanol, methanol và nƣớc nóng, sau đó hịa lỗng trong dung dịch
Dimethyl Sulfoxide để xác định hoạt tính kháng khuẩn, hàm lƣợng polyphenol tổng số
và khả năng chống oxy hóa. Xuyên tâm liên hàm lƣợng polyphenol giảm dần từ
ethanol (1.331± 0.045 ), methanol (1.091b ± 0.064) và nƣớc nóng (0.772 ± 0.046) và
tƣơng ứng với nó hoạt tính chống oxy hố của xun tâm liên giảm từ ethanol. Dung
mơi ethanol có hoạt tính kháng trên chủng E. coli, 2 dung mơi cịn lại thì khơng có
đƣờng kính vịng vơ khuẩn.
Năm 2021, nghiên cứu của Phùng Thị Hằng cho thấy P. indica có thể kháng
đƣợc E. coli, Pseudo và B. cereus, điều này tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của
Sittiwet (2009) và Sirikhwan (2021). Đối với tính kháng của cao chiết P. pteropoda,

trong nghiên cứu của Linh (2013), P. pteropoda có khả năng kháng đối với dịng E.
coli.
Cao chiết nƣớc, ethanol của P. indica và cao ethanol của P. pteropoda kháng
đƣợc cả 6 dòng khuẩn nghiên cứu. Cao chiết nƣớc của P. pteropoda không kháng B.
cereus và E. coli. Cao chiết nƣớc của P. indica có khả năng kháng khuẩn tốt nhất trong
các cao chiết đƣợc thử nghiệm trong nghiên cứu này.

11


Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: từ tháng 10/2021 đến 5/ 2022.
Địa điểm: phịng thí nghiệm Bộ môn Nội-Chẩn-Dƣợc-Độc Chất - Khoa Thú yHọc viện Nông nghiệp Việt Nam.

3.1.1. Phƣơng pháp chiết suất tinh dầu
Phƣơng pháp chƣng cất cuốn hơi nƣớc là phƣơng pháp phổ thông và dễ dàng
thực hiện nhất.
Cúc tần liệu sau khi thu hái đƣợc cắt nhỏ, ngâm ngập trong nƣớc muối 20%
(1kg/5l nƣớc) trong vịng 12h- 24h. Sau đó cho ngun liệu vào nồi cất, đun sôi. Hơi
nƣớc và tinh dầu sẽ đƣợc kéo sang ống sinh hàn để làm lạnh, tinh dầu đọng thành một
dòng dịch lỏng, một phần nhỏ tan trong nƣớc, tinh dầu nhẹ nổi lên trên mặt nƣớc, tinh
dầu nặng sẽ chìm xuống dƣới. Sử dụng bình florentin để gạn riêng lấy tinh dầu cúc
tần. Để lấy đƣợc phần cịn lại của tinh dầu có thể sử dụng muối ăn để tăng tỉ trọng làm
tinh dầu nổi nhiều lên trên hoặc sử dụng dung môi dễ bay hơi (hexan) để hoà tan tinh
dầu trong dịch chiết rồi đem hexan đã có tinh dầu đi cơ quay hút chân không để tận thu
tinh dầu. Cách này áp dụng với dƣợc liệu mà nƣớc trƣng thu đƣợc khơng có tinh dầu
nổi trên bề mặt hay lơ lửng bên trong nƣớc trƣng.

3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu
3.1.2.1.

Vi khuẩn

Vi khuẩn chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc mua tại Viện Công nghệ
sinh học Và đƣợc bảo quản tại Bộ môn Nội-Chẩn-Dƣợc-Độc Chất - Khoa Thú y.

3.1.2.2.

Dƣợc liệu

Chúng tôi lựa chọn dƣợc liệu dựa trên kinh nghiệm công dụng của dƣợc liệu
trong các bài thuốc y học cổ truyền có khả năng kháng khuẩn chống viêm. Để so sánh
khả năng kháng khuẩn, hàm lƣợng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa chúng tơi sử
dụng các bộ phận của cây của cây để nghiên cứu.
Cúc tần nguồn gốc dƣợc liệu: Làng Nghĩa Trai, Văn Lâm, Hƣng Yên

12


Xuyên tâm liên đã qua sơ chế do công ty dƣợc liệu cổ truyền Bình An (Nghĩa
Trai, Hƣng Yên) cung cấp.

3.1.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
 Hóa chất
- Dung mơi ngâm chiết dƣợc liệu: nƣớc nóng, ethanol, methanol,
ethanol,ethyl acetate, hexan.
- Dung mơi hịa tan: Dimethyl Sulfoxide (DMSO), Ethyl acetate.

- Muối: NaCl, Na2CO3.
- Thuốc thử: Folin- Ciocalteu′s phenolreagent, DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) .
- Chất chuẩn: Acid chlorogenic, Vitamin E
- Mueller hinton Agar: casein acid hydrolysate, agar, beef, starch.
- Mueller hinton Broth (MH broth)
- Tryptic Soy Broth (TS Broth) : tryptone, soytone, NaCl
- TS agar
- Chất cân bằng pH: NaOH, HCl.
 Dụng cụ và thiết bị
Tất cả thiết bị và dụng cụ đề tài thuộc phịng thí nghiệm bộ mơn Nội- ChẩnDƣợc- Độc Chất.
Dụng cụ: pipet, đĩa pettri, tube các loại, paraffin, pincet,…
Thiết bị:
- Máy ly tâm
- Máy đo pH
- Máy Vortex
- Máy hấp autoclave
- Máy lắc nhiệt
- Máy ủ nhiệt
- Tủ sấy
- Máy quang phổ so màu 722,…

13


3.2. Nội dung nghiên cứu
Xác định khả năng ức chế vi khuẩn từ dịch chiết của dƣợc liệu cúc tần và
xuyên tâm liên từ 6 dung môi chiết xuất trên chín chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn.
Xác định khả năng ức chế vi khuẩn của tinh dầu cúc tần trên chín chủng vi
khuẩn đƣợc lựa chọn theo 2 phƣơng pháp khác nhau.
Khảo sát đƣợc hàm lƣợng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch

chiết và tinh dầu cúc tần, dịch chiết xuyên tâm liên.

3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu
Dƣợc liệu khô đƣợc nghiền nhỏ, mịn với kích thƣớc < 0,5 mm. Ngâm dƣợc liệu
trong từng loại dung mơi nƣớc nóng, methanol, ethanol, ethyl acetate, aceton và hexan
với tỉ lệ 1/30 (g/ml) cứ 10g dƣợc liệu khô ngâm trong 300ml dung môi. Với dung môi
ethanol, methanol vortex dung dịch 5 - 10 phút để ngâm sau 24 giờ. Đối với dung mơi
nƣớc nóng vortex 30 phút sau đó lọc qua bằng vải lọc. Sử dụng các ống tube 15ml để
đựng dịch chiết dƣợc liệu chuẩn bị để li tâm. Ly tâm lọc tại tần số 3500 vòng/ phút
trong thời gian 10 phút lắng các cặn thảo dƣợc. Dùng giấy lọc để loại vỏ phần cặn bị
trơi trong q trình đổ dịch chiết từ tube 15ml thu lấy dịch chiết cúc tần và xuyên tâm
liên.

Hình 3.1 Dƣợc liệu đƣợc nghiền thành bột

14