Đánh giá tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư của các phân đoạn từ củ của loài stephania dielsiana y c wu

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ứ c CHẾ MỘT SÓ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ củ CỦA LỎÀISTEPHANIA DIELSIANA Y.C.WU
' Nguyễn Thi Minh Trang

HDKH: ^ TS. Nguyễn Quốc Huy, ^ TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung
‘ Lớp N1K65 - Trường Đại học Dược Hà Nội
^ Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội
^ Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐH Quốc gia Hà Nội
Từ khóa: Stephania dieỉsiana Y. c. Wu, ức chế dòng tế bào ung thư.
Tóm tắt
Nghiên cứu đã đánh giá tác dụng ức chế sáu dòng tế bào ung thư của ba
phân đoạn SMỈ, SM2, SM3 phân lập từ dịch chiết củ Stephania dieỉsiana
Y.C.Wu, bao gồm tế bào ung thư cổ tử cung (Hela), tế bào ung thư biểu mô
cuống phổi và phế nang ở người (H358), tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR8), tế bào ung thư dạ dày (N87), tế bào ung thư vú (MDA-MB-231), tế bào ung
thư gan (HepG2) và một dòng tể bào lành là tế bào thận ở phôi người (HEK293)
bằng phương pháp MTS. Kết quả thu được cho thấy phân đoạn SM2 có tác dụng
ức chế tốt trên cả sáu dòng tế bào ung thư và ức chế yếu hơn trên dòng tê bào
lành (HEK293), với IC 50 lần lư 0 là 22,84; 30,09; 12,21; 10,27; 18,24; 26,18;
48,12 ụ.g/ml, phân đoạn SMl có tác dụng yếu và phân đoạn SM3 không có tác
dụng trên các dòng tế bào ung thư.
Đặt vấn đề
Những năm gần đây, sổ lượng bệnh nhân mắc ung thư trên thế giới và Việt
Nam ngày càng gia tăng. Thực tế đó đòi hỏi cần phải tàng cưÒTTig nghiên cửu các
phương pháp cũng như các thuốc và hóa chất điều trị ung thư. Trong quá trình
nghiên cứu tác dụng của một sổ họp chất từ chi Stephania Lour, trên một số dòng
tế bào ung thư, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ và Lê Mai Hương đã phát
hiện được tác dụng ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư của họp chất
oxostephanin được phân lập từ củ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu trên các dòng
tế bào ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU), ung thư màng tim (RD) [3].
Nhằm tiếp tục nghiên cứu tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thư của củ loài
Stephania dielsiana Y.C.Wu và lựa chọn phân đoạn dịch chiết từ củ có tác dụng

ức chế tốt tế bào ung thư, tiến tới phân lập và lựa chọn được các hoạt chất có tác
dụng, chúng tôi thực hiện nghiên cứu "Đánh giá tác dụng ức chế một sổ dòng tế
bào ung thư của các phân đoạn từ củ của loài Stephania dieỉsiana Y.c. Wu". Sau
đây là một số kết quả thu được từ nghiên cứu.


Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Cắn các phân đoạn dịch chiết SMl, SM2, SM3 phân lập từ dịch chiết củ
loài Stephania dielsiana Y.C.Wu (Ba Vì, Hà Nội, 4/2013)
Các dòng tế bào ung thư: tế bào ung thư cổ tử cung (Hela ATCC), tế bào
ung thư biểu mô cuống phổi và phế nang ở người (H358 ATCC), tế bào ung thư
buồng trứng (OVCAR-8 ATCC), tế bào ung thư dạ dày (N87 ATCC), tế bào ung
thư vú (MDA-MB-231 ATCC), tế bào ung thư gan (HEPG2 ATCC). Dòng tế bào
lành: tể bào thận ở phôi người (HEK293 ATCC).
Chất đối chứng dưong Taxol.
Thiết bị và hóa chất
Thiết bị
Máy cất quay áp suất giảm, bình gạn, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm,
máy Elisa, tủ ấm 5% CO2, tủ hút, buồng đếm tế bào, đĩa nuôi cấy đa giếng, ống
bảo quản mẫu, ống Falcon, ống ly tâm.
Hóa chất
Dung môi chiết: methanol, acid acetic, nước cất, dung dịch amoniac 6 N,
n-hexan, diclomethan, ethylacetat.
Môi ừường nuôi cấy tế bào: các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi
trường DMEM hoặc RPMI có bổ sung 10% huyết thanh thai bò FBS và 1%
kháng sinh penicillin/streptomycin.
Các hóa chất khác: thuốc nhuộm Blue Trypan, bộ kit xác định lượng tế
bào CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Prolifération Assay, dung dịch PBS,
dung dịch Trypsin - EDTA.

Phương pháp nghiên cứu
Chiết xuất và phân đoạn dịch chiết từ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu
Cân 500 g bột dược liệu, thấm ẩm bằng hỗn hợp dung môi methanol:acid
acetic 5% (3:2) tại pH 4-5, chiết với dung môi methano:acid acetic 5% (3:2) pH
4-5 bằng phương pháp ngấm kiệt. Dịch chiết được cất thu hồi dung môi rồi chiết
lần lượt với n-hexan, diclomethan, ethylacetat. Phần dịch chiết nước còn lại được
kiếm hóa bằng dung dịch amoniac đến pH 9-10 và được chiết lần lượt với
diclomethan, ethylacetat. cất thu hồi dung môi các phân đoạn n-hexan,
diclomethan, ethylacetat tại pH 4-5 và pH 9-10 ở 60°c [1,4].


Hình 1. Sắc ký đồ các phân đoạn thu được và chất chuẩn oxostephanin
(Thứ tự các vết từ trái sang phải lần lượt là là phân đoạn n-hexan, diclomethan,
ethylacetat ở pH 4-5 và 9-10, phân đoạn nước còn lại, oxostephanin)
Lựa chọn 3 phân đoạn để thử tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thư:
phân đoạn SMl, SM2 và SM3.
Bảng 1. Khối lượng cắn thu được ở mỗi phân đoạn SMl, SM2, SM3
Khôi lượng căn (g)
Phân đoạn
0,28
n-hexan
SMl
Diclomethan (pH 4-5; pH 9-10)
SM2
1,64
Ehthyl acetat (pH 4-5; pH 9-10)
6,46
SM3
Nước
Stephania dielsiana Y.C.Wu

Nguyên tắc
Tỷ lệ tế bào sống sót được xác định dựa vào phương pháp MTS. MTS là
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)2H-tetrazolium). Khi có mặt phenazinemethosulfate (PMS), MTS sẽ được enzym
ty thể của tế bào sống chuyển hóa thành dẫn chất formazan có màu tan trong môi
trường nuôi cấy. Lượng formazan tạo ra tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống trong
môi trường nuôi cấy và được xác định bằng phương pháp đo quang ở 490 nm.
Quy trình thí nghiệm


Các dòng tế bào được hoạt hóa và nhân nuôi ở điều kiện ứiích hợp. Nạp tế
các tế bào vào đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 5000 - 7000 tế bào trong 180 (J.1 môi
trưòfng nuôi cấy thích họfp, ủ trong tủ ấm 37°c, 5% CO2 trong 24 giờ để tế bào ổn
định và bám đều lên mặt đĩa. Tiếp tục ủ tế bào 48 giờ với các phân đoạn và Taxol
ở nồng độ theo bảng 2 .
Bảng 2. Dải nồng độ ứiử nghiệm của các phân đoạn và chất đổi chứng Taxol (đv: |J.g/ml)
Mẩu
C2
C4
C1
C3
C5
C6
C7
C8
C9
Phân
đoạn

10 0 0

500

250

Taxol

30

3

0.3

10 0

50

25

3x10'

3x10’

2

3

10

5

2.5

Đo mật độ quang (OD) của các mẫu bằng máy ELISA. Các giá trị OD được xử lý
bằng phần mềm thống kê GraphPad PrismS, thu được đưòíng cong tỷ lệ tế bào
sống sót phụ thuộc nồng độ và các chỉ số IC50 [2 , 5, 6 ],
Kết quả
Dựa vào các giá trị OD, xây dựng đường cong tỷ lệ tế bào sống sót theo
nồng độ chất thử.
N87

1

2
L o g [SMO. u glm l

OVCAR

3

1

-8

HeLa

3

2

L o g (SM |, ug/m i

t o g (S M Ỉ. us/iT d

MOA

Hep62

1

2
L o g {SM], u g /m l

A%

3

H

358

2

3

L o g [SNQ, u g /m l

•

SM2

*>

SM1

»

SM3

Hình 2. Đường cong tỷ lệ tê bào sông sót theo nông độ chât thử trên sáu dòng tê
bào ung thư
Tỷ lệ sống sót của tế bào ung thư khi ủ với phân đoạn SM2 là thấp nhất
trên cả 6 dòng tế bào ung thư ở tất cả các nồng độ trong dải nồng độ thử nghiệm,


với phân đoạn SM l, tỷ lệ sống sót chỉ giảm ở khoảng nồng độ 10^ - 10^ |j.g/ml trừ
đối với dòng N87, với phân đoạn SM3 tỷ lệ sống sót giảm không đáng kể hoặc
nhẹ.
Từ đường cong tỷ lệ tế bào sống sót theo nồng độ chất thử, xác định được
giá trị IC50 (nồng độ tại đó chất thử có khả năng ức chế 50% sự tăng trưởng của
tế bào) của các phân đoạn với mỗi dòng tể bào.
Bảng 3. Giá trị IC50 của các phân đoạn SMl, SM2, SM3 và chất đối
chứng dương Taxol trên các dòng tế bào thử (đv: Ịig/ml)
Mâu
thử
SMl
SM2
SM3
Taxol

1

2
3
4

N87

OVCAR

35.730
10.270
ND
0.450

174.100

MDAMB-231
ND
18.240
ND
0.500

-8
12.210
ND
0.040

HeLa

HepG2

H358

94.600
22.840
ND

87.200
26.180
ND
0.032

ND
30.090
ND
0.700

HEK
293
ND
48.120
ND
13.600

0.011
(ND: không thể xác định, c 0 nông độ cân xác c ịnh lớn hơn 5000 I^g/ml)
Trên sáu dòng tế bào ung thư, giá trị IC50 của phân đoạn SM 2 đều nhỏ
nhất, giá trị IC50 của phân đoạn SM3 lớn hơn khoảng nồng độ thử nghiệm, giá trị
IC50 của phân đoạn SMl cao hơn của phân đoạn SM2 từ 3 - 14 lần.
Đối với phân đoạn SM2, giá trị IC50 trên các dòng tế bào ung thư buồng
trứng (OVCAR-8 ), tế bào ung thư dạ dày (N87), tế bào ung thư vú (MDA-MB231) thấp hơn so với giá trị ừên ba dòng tế bào ung thư còn lại, trên dòng tế bào

lành cao hơn trên các dòng tế bào ung thư.
Quan sát đường cong tỷ lệ tế bào sống sót theo nồng độ của phân đoạn
SM2 và chất đối chứng dương Taxol ừ-ên bảy dòng tế bào thử nghiệm thấy khá
tưcmg đồng về hình dạng, chứng tỏ rằng phân đoạn SM2 có tác động điển hình
của một chất ức chế tăng trưởng tế bào ung thư.
A%

SM2

100-

A

»

V
o
*

50

1

T axol

A%

•
■

2

Log [SIVI], ug/m l

OVCAR-8
HepG2
HeLa
HEK293
N87
H358
MDA

ISOn

» OVAR-8

100 -

-2

■
i
T
V
*

HepG2
HeLa
HEK293
MDA

H358

•

N 78

0

Log (TaxoỊ], ug/ml

Hình 3. Đường cong tỷ lệ tê bào sông sót theo nông độ của ba phân đoạn và đôi
chứng dương Taxol ừên các dòng tế bào thử


Bàn iuận
Trong số ba phân đoạn, phân đoạn SM2 có tác dụng ức chế tế bào ung thư
mạnh nhất trên cả 6 dòng tế bào ung thư, trên tế bào lành SM2 cũng có tác dụng
ức chế nhưng ở mức độ thấp hon so với trên các dòng tế bào ung thư.
Theo tiêu chuẩn đánh giá của NCI (Viện Nghiên cứu Quốc gia về Ung
thư, Mỹ), các chất chiết tự nhiên dạng thô có IC50 dưới 100 Ịag/ml được coi là có
hoạt tính ức chế tế bào ung thư; dưới 20 Ịig/ml là có hoạt tính mạnh [5, 6 ], Các
giá trị IC50 của SM2 đều nằm trong giới hạn có độc tính với 6 dòng tế bào ung
thư, trong đó SM2 có hoạt tính mạnh với OVCAR-8 , MDA-MB-231 và N87.
SM1 có tác dụng trên ba dòng tế bào ung thư là HeLa, HepG2 và N87.
Kết luận
Phân đoạn SM2 có tác dụng ức chế tốt sự tăng trưởng của 6 dòng tế bào
ung thư N87, OVCAR-8 , MDA-MB-231, HeLa, HepG2, H358 với IC50 lần lượt
là 10.270; 12.210; 18.240; 22.840; 26.180; 30.090 ịig/ml
Phân đoạn SMl chỉ có tác dụng ức chế trên ba dòng tế bào ung thư N87,
HepG2, HeLa với IC50 tương ứng là 35.73; 87.2; 94.6 |xg/ml.

Phân đoạn SM3 không có tác dụng trên 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
Tài liệu tham khảo
1. Bộ môn Dược liệu (2004), Bài giảng dược liệu, tập II, NXB Y học, tr. 5-27.
2. Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Minh Khởi, Hoàng Thị Mỹ Nhung, Nguyễn Thị
Quỳ, Phương Thiện Thưcmg, Phí Thị Xuyến (2011), Độc tính của các lignan
phân lập từ hạt nhục đậu khấu trên một số dòng tế bào ung thư, Tạp chí
Dược liệu, số 16(5), tr. 303-306.
3. Nguyễn Quốc Huy, Lê Mai Hương, Phạm Thanh Kỳ (2009), Nghiên cứu tác
dụng gây độc tế bào của 1 0 họp chất phân lập từ một số loài bình vôi
(Stephania Lour.) ở Việt Nam, Tạp chỉ dược liệu, số 14(4), tr. 218-220.
4. Nguyễn Thượng Dong (2008), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học
và Kỹ thuật, tr. 39-44.
5. Figg. w ., McLeod H. L. (2004), Handbook o f anticancer pharmacokinetics
and pharmacodynamics, Ed XV. Humana Press Inc.,
6 . Teicher B. A., Andrews p. A. (2004), Anticancer drug development guide
(Second edition), Humana Press Inc.