Khảo sát nguồn gen các mẫu giống nghệ vàng mới thu thập (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

O

N

N

N

Ọ

------- -------

Ĩ LUẬN TỐT N
ĐỀ TÀ :
ẢO ÁT N UỒN
ỐN

N

VÀN

EN Á MẪU
MỚ T U T ẬP

Hà Nội - 2022

P

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

O

N

N

N

Ọ

------- -------

Ĩ LUẬN TỐT N
ĐỀ TÀI:
ẢO ÁT N UỒN
ỐN

N

VÀN

EN Á MẪU
MỚ T U T ẬP

Ngƣời thực hiện:

NGUYỄN THÀNH CHUNG

Mã sinh viên:

637210

Lớp:

K63CNSHC

Ngành:

CÔNG NGH SINH HỌC

iáo viên hƣớng dẫn:

GS. TS. PHAN HỮU TÔN

Hà Nội - 2022

P


LỜ

M ĐO N

Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng em. Các số liệu, kết
quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc dùng để bảo vệ
học vị nào, nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Sinh viên

Nguyễn Thành Chung

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản
thân em đã nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ tần tình của thầy cơ, bạn bè và gia đình.
Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với Ban
giám hiệu của trƣờng Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học cùng tồn thể các thầy, cơ giáo trong khoa đã tạo điều kiện cho em học
tập, truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian theo học tại
trƣờng.
Và em cũng xin chân thành cám ơn đến GS.TS. Phan Hữu Tơn giúp đỡ,tận tính
hƣớng dẫn em trong suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp này.
Em cũng chân thành cảm ơn đến các cán bộ, các anh chị công tác tại Trung tâm
bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp
đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình.
Và cuối cùng, với tất cả lịng kính trọng và biết ơn vơ hạn, em xin gửi lời cảm
ơn đến gia đình và ngƣời thân đã động viên, giúp đỡ và tạo động lực cho em trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 5 tháng 7 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Thành Chung

ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ............................................. v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii
TĨM TẮT .......................................................................................................... viii
PHẦN I: MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài ............................................................................. 2
1.2.1. Mục đích ...................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
PHẦN II: TỔNG QUAN VỀ CÁC TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ........................... 3
2.1. Giới thiệu chung về cây nghệ (Curcuma longa L.)........................................ 3
2.1.1. Vị trí và phân loại ........................................................................................ 3
2.1.2. Đặc điểm thực vật học................................................................................. 3
2.1.3. Nguồn gốc và phân bố sinh thái .................................................................. 4
2.1.4. Các giai đoạn sinh trƣởng của nghệ ............................................................ 5
2.1.5. Thành phần hóa học cây nghệ ..................................................................... 6
2.1.6. Tác dụng dƣợc lý ......................................................................................... 8
2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nghệ ............................................................. 10
2.2.1. Trên thế giới .............................................................................................. 10
2.2.2. Tại Việt Nam ............................................................................................. 10
2.3. Các phƣơng pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA thƣờng dùng trong
nghiên cứu đa dạng di truyền .................................................................. 11
2.3.1. Kỹ thuật RAPD ......................................................................................... 11
iii

2.3.2. Kỹ thuật ISSR............................................................................................ 15
2.3.4. Phần mềm thống kê NTSYSpc ................................................................. 17
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 19
3.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 19
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................ 19
3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................. 19
3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 19
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
3.4.1. Bố trí thí nghiệm ....................................................................................... 19
3.4.2. Theo dõi các đặc điểm nông sinh học ....................................................... 20
3.4.3. Sử dụng chỉ thị phan tử để đánh gía sự đa hình của các mẫu giống
nghệ ......................................................................................................... 20
3.4.4. Xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 ....................................................... 22
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 23
4.1. Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của các mẫu nghệ nghiên cứu. ... 23
4.2. Sử dụng các chỉ thị phân tử ISSR và RAPD để đánh giá sự đa hình
DNA của các mẫu giống nghệ ................................................................ 39
4.2.1. Chỉ thị ISSR 17 ......................................................................................... 41
4.2.2. Chỉ thị ISSR 6 ........................................................................................... 42
4.2.3. Chỉ thị OPB 7 ............................................................................................ 43
4.2.4. Chỉ thị OPB 10 .......................................................................................... 44
4.3. Mối quan hệ di truyền giữa các giống nghệ dựa trên phân tích bằng chỉ
thị ISSR và RAPD................................................................................... 45
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................ 47
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 47
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HI U

Chữ viết tắt

Giải nghĩa

NTSYSpc

Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

AFLP

Amplyfied fragment length polymorphism

DNA

Deoxyribonucleic acid

RAPD

Random Amplified Polymorphims DNA

PCR

Polymerase-Chain-Reaction

Cs

Cộng sự

bp

Base pair

kb

Kilobase

ISSR

Inter Simple Sequence Repeats

SSR

Simple Sequence Repeat

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR ............................... 22
Bảng 4.1. Các chỉ tiêu về chất lƣợng các mẫu nghệ ........................................... 24
Bảng 4.2. Tổng kết các chỉ tiêu về chất lƣợng các mẫu nghệ ............................. 27
Bảng 4.3. Các chỉ tiêu nông sinh học về sinh trƣởng phát triển ......................... 29

Bảng 4.4. Bảng tống kết các chỉ tiêu nông sinh học về sinh trƣởng và phát
triển ......................................................................................................... 32
Bảng 4.5. Đặc điểm thân- lá của các mẫu nghệ .................................................. 34
Bảng 4.6. Tổng kết các đặc điểm thân-lá của các mẫu nghệ .............................. 37
Bảng 4.7: Số băng DNA xuất hiện ở từng mẫu nghệ nghiên cứu....................... 40
Bảng 4.8. Hệ số tƣơng đồng di truyền của 22 mẫu giống nghệ nghiên cứu. ...... 45

vi


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Hệ thống phân loại và hình thái cây nghệ ............................................. 3
Hình 2.2. Ba thành phần chủ yếu trong curcuminoid ........................................... 7
Hình 2.3. Các thành phần chủ yếu trong tinh dầu nghệ ........................................ 8
Hình 4.1. Màu sắc củ........................................................................................... 23
Hình 4.2. Màu sắc thân........................................................................................ 38
Hình 4.3. Đặc điểm sọc tím chạy giữa phiến lá ở các mẫu giống nghệ. ............. 38
Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR17 ................................ 41
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 mẫu giống nghệ với chỉ thị
ISSR 6 ................................................................................................. 42
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 mẫu giống nghệ với chỉ thị
OPB 7 .................................................................................................. 43
Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 mẫu giống nghệ với chỉ thị
ISSR6 .................................................................................................. 44
Hình 4.9. Biểu đồ mơ tả qua hệ di truyền của 22 mẫu giống nghệ. .................... 46

vii

TÓM TẮT
Nghệ là cây thảo mộc sống lâu năm, từ lâu đa đƣợc sử dụng làm dƣợc liệu
trong các bài thuốc dân gian. Cây nghệ đƣợc sử dụng làm thuốc chữa một số
bệnh về hệ thống tiêu hóa, đau nhức, các rối loạn ở gan. Ngày nay, nghệ đƣợc sử
dụng để chữa nhiều bệnh nhƣ ung thƣ, đang đƣợc nghiên cứu trong chữa trị một
số bệnh Alzheimer, bệnh tiểu đƣờng,… Ở Việt Nam, có tập đồn nghệ vơ cùng
phong phú. Vì vậy cần xác định xem giống nghệ nào tốt, đem lại hiệu quả kinh
tế cao. Do đó chúng tơi tiến hành đề tài: “Khảo sát nguồn gen các mâu giống
nghệ vàng mới thu thập’’ để tạo cơ sở cho việc bảo tồn nguồ gen nghệ, chọn
tạo giống trong tƣơng lai.
Bằng việc sử dụng các phƣơng pháp nghiên cứu: theo dõi, đánh giá các đặc
điểm nông sinh học, phân biệt các mâu giống nghệ, sử dụng chỉ thị phân tử
RAPD và ISSR để kiểm tra sự khác nhau về bản chất di truyền của các giống
nghệ chúng tôi đã đạt đƣợc những kết quả:
 Các mẫu nghệ nghiên cứu có sự khác biệt về các đặc điểm củ, thân – lá.
 Bằng các chỉ thị phân tử RAPD và ISSR đã nhân lên 338 băng vạch
DNA đƣợc nhân lên từ hệ gen của 22 mẫu nghệ. Tất cả các mồi đƣợc sử dụng
đều thể hiện tính đa hình.
 Có sự đa dạng di truyền giữa các mẫu nghệ nghiên cứu. Hệ số sai khác
giữa các mẫu dao động từ 7,7%- 53,8%. Qua đề tài đã xác định đƣợc 2 cặp mẫu
nghệ có sự tƣơng đồng cao là mẫu 214 và 216, 216 và 218. Cặp mẫu có sự khác
biệt lớn về mặt di truyền là 213 và 217

viii


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), có
nguồn gốc từ Ấn Độ và đƣợc trồng nhiều ở những vùng có khí hậu nóng ẩm nhƣ

Trung Quốc, Indonesia, Ấn Độ,… và Việt Nam. Cây nghệ từ lâu đã đƣợc sử
dụng để làm các loại gia vị, chất bảo quản, chất tạo màu trong thực phẩm. Đồng
thời cây nghệ còn đƣợc sử dụng nhƣ một cây thuốc quý. Trong các bài thuốc
dân gian, cây nghệ đƣợc sử dụng để chữa nhiều loại bệnh nhƣ bệnh vàng da, các
bệnh về gan, mật, u nhọt, viêm khớp, chữa dạ dày tá tràng… Trong các thập kỉ
gần đây, nhiều nghiên cứu đã đƣợc công bố về hoạt tính sinh học và dƣợc học
của cây nghệ vàng cũng nhƣ các thành phần chiết xuất từ củ nghệ, trong đó
curcuminoid và tinh dầu nghệ đƣợc chứng minh là những thành phần chính tạo
nên dƣợc tính cao của cây Nghệ vàng. Hàm lƣợng curcumin đƣợc đánh giá để
đo chất lƣợng của cây nghệ vàng. Curcumin là chất có tính kháng viêm, kháng
khuẩn, kháng nấm và có tác dụng chống ung thƣ, điều trị các bệnh về tim mạch.
Hiện nay cây nghệ vàng phân bố ở nhiều tỉnh thành tại Việt Nam nhƣ
Vĩnh Phúc, Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Đồng Nai, Bình Dƣơng,… Thành phần và
hàm lƣợng curcuminoid trong cây nghệ vàng có sự khác nhau do các ảnh hƣởng
của khí hâu, thổ nhƣỡng, điều kiện trồng trọt,… Việc nhiên cứu nguồn gen của
các giống nghệ vàng sẽ giúp xác định tốt hơn các giống nghệ vàng có năng suất
và chất lƣợng cao từ đó có thể định hƣớng tốt hơn cho sự phát triển của cây
nghệ vàng trong nƣớc.
Trong thực tế sản xuất, khi trồng cây dƣợc liệu sẽ đem lại hiệu quả kinh tế
cao hơn so với việc trồng các loại cây lƣơng thực. Và cây nghệ là một loại cây
dƣợc liệu có giá trị kinh tế cao, giúp đem lại nguồn thu nhập cao cho ngƣời nông
dân. Hiện Trung tâm Bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng đã đi thu thập
đƣợc một tập đoàn nguồn gen các mẫu giống nghệ từ nhiều vùng khác nhau ở
miền Bắc Việt Nam. Các mẫu giống đó có đặc điểm sinh trƣởng, phát triển ƣu
1


việt nhƣ thế nào? Có năng suất chất lƣợng, hàm lƣợng curcumin ra sao? Các
mẫu giống đó có bị trùng nhau hay khơng, hay tính đa dạng di truyền nhƣ thế
nào thì chúng ta cần phải khảo sát, đánh giá. Thơng qua phân tích một số gen,

chỉ thị để xác định mã code và từ đó có thể xác định đƣợc đa dạng di truyền là
cần thiết để bảo tồn và phát triển nguồn gen nghệ Việt Nam.
Trong số các nghiên cứu gần đây, có nhiều nghiên đƣợc thực hiện để đánh
giá sự di truyền trên cây nghệ: phát hiện và đánh giá di truyền ở nghệ bằng chỉ
thị RAPD (Sanghamitra Nayak và cs., 2005); Đánh giá sự đa dạng di truyền của
nghệ bằng việc sử dụng các chỉ thị ISSR và RAPD (Shikha Singh và cs., 2011);
khảo sát sự đa dạng di truyền ở nghệ bằng chỉ thị ISSR (Nguyễn Lộc Hiền và
cs., 2013); đã có nghiên cứu sử dụng chỉ thị ISSR và RAPD để đánh giá sự di
truyền trên cây nghệ (Bùi Thị Cẩm Hƣờng & cs., 2016).
Chính vì vậy, để xác định đƣợc các giống nghệ đem lại hiệu quả kinh tế
cao từ các mẫu giống thu thập đƣợc chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát nguồn
gen các mẫu giống nghệ vàng mới thu thập”
1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục đích
Đánh giá đặc điểm sinh trƣởng, phát triển và tính đa dạng di truyền các mẫu
nghệ thu đƣợc.
1.2.2. Yêu cầu
Đánh giá đƣợc đặc điểm sinh trƣởng, phát triển, năng suất và tính đa dạng
di truyền các mẫu nghệ thu đƣợc
Ứng dụng chỉ thị phân tử để xác định sự đa hình, xác định mối quan hệ di
truyền của các mẫu giống nghệ.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN VỀ CÁC TÀI LI U NGHIÊN CỨU

2.1. Giới thiệu chung về cây nghệ (Curcuma longa L.)
2.1.1. Vị trí và phân loại
Tên khoa học: Curcuma longa L. (Curcuma domestica Lour.).

Tên khác: Nghệ vàng, uất kim, khƣơng hoàng,…
Tên nƣớc ngoài: Common turmeric, long turmeric (Anh); safran des Indes
(Pháp).
Tại Việt Nam đã phân loại đƣợc 16 lồi trong đó có 6 lồi phổ biến đƣợc
sử dụng làm thuốc là nghệ vàng (C.longa L.), nghệ đen (C. zedoaria(B)R.), nghệ
trắng (C.aromatica S.), nghệ pierre (C. pierre G.), nghệ rễ vàng (C.
xanhthorrhiza R.), nghệ ten đồng (C. aeruginosa R.),… ( Đỗ Huy Bích và cs.
2004)
Hệ thống phân loại nghệ (Curcuma longa) theo Võ Văn Chi (2012)

Hình 2.1. Hệ thống phân loại và hình thái cây nghệ
2.1.2. Đặc điểm thực vật học
Nghệ là cây thân thảo, cao 0.6-1 m. Thân rễ to, có ngấn, phân nhánh thành
nhiều củ bầu dục, màu vàng sẫm đen đến vàng đỏ, rất thơm. Lá mọc thẳng từ

3


thân rễ, gốc thuôn hẹp, đầu hơi nhọn, dài 30-40 cm, rộng 10-15cm, hai mặt
nhẵn, có màu lục nhạt, mép nguyên uốn lƣợn, bẹ lá rộng và dài.
Cụm hoa hình trụ hoặc hình trứng đính trên một cán mập dài đến 20cm,
mọc từ giữa túm lá; lá bắc rời, màu rất nhạt, những lá phía dƣới mang hao sinh
sản, màu lục nhạt hoặc trắng nhạt, những lá gần ngọn không mang hoa hẹp hơn
và pha màu hồng ở đầu lá; đài có 3 răng khơng đều; tràng có ống dài, cánh giữa
dài hơn các cánh bên, màu vàng; nhị có bao phấn có cựa do một phần lồi ra của
trung đới ở dƣới các ô; nhị lép dài hơn bao phấn; cánh mơi gần hình mắt chim,
hƣơi chia 3 thùy; có bầu lơng. Quả nang 3 ơ, hạt có áo, mùa hoa quả: tháng 3tháng 5 (Đỗ Huy Bích và cs. 2004).
2.1.3. Nguồn gốc và phân bố sinh thái
Theo Đỗ Tất Lợi (2011) nguồn gốc nguyên thủy của cây nghệ ở nƣớc Ấn
Độ, sau này đƣợc nhân rộng khắp thế giới, nhất là ở các nƣớc nhiệt đới nhƣ Việt

Nam, Indonesia, Lào, Trung Quốc. Nghệ đƣợc trồng ở khắp nơi trong nƣớc ta để
làm gia vị và làm thuốc. Ngày nay, nghệ là một cây trồng quen thuộc ở nhiều
nƣớc nhƣ Trung Quốc, Myanmar, Pakistan, Iran, Bangladesh, Đài Loan,
Indonesia, Việt Nam với diện tích trồng từ nhỏ lẻ đến quy mô lớn theo trang trại.
Nhƣng cây chủ yếu vẫn là đƣợc trồng trong vƣờn nhà và mục đích thƣờng sử
dụng cho tiêu dùng (Ravindran el al., 2007).
Còn theo Đỗ Huy Bích và ctv., (2004), ở Việt Nam nghệ cũng đƣợc coi là
cây trồng cổ ở khắp các địa phƣơng, từ vùng đồng bằng, ven biển đến vùng núi
cao trên 1.500 m. Một số nơi trồng nghệ nhƣ huyện Quản Bạ, Yên Minh, Đồng
Văn, Mèo Vạc (Hà Giang), Quảng Bình, Sìn Hồ, Phong Thổ (Lai Châu), Quảng
Nam và Đắc Nông. Nghệ có khoảng 110 lồi đƣợc phân bố ở vùng nhiệt đới
Châu Á. Nhiều lồi có giá trị kinh tế cao, trong đó lồi Curcuma longa là lồi
quan trọng nhất (Ravindran et al., 2007).

4


Nghệ là cây ƣa ẩm, ƣa sáng và có thể hơi chịu bóng; cây có biên độ sinh
thái rộng, thích nghi đƣợc với nhiều tiểu vùng khí hậu khác nhau. Từ nơi có khí
hậu nhiệt đới điển hình, nhiệt dộ trung bình đến 25-26℃ ở các tỉnh miền nam
đến những nơi có khí hậu cận nhiệt đới núi cao phía bắc, nhiệt độ trung bình
dƣới 20℃. Tồn bộ phần trên mặt đất tàn lụi vào mùa đông ở các tỉnh phía bắc
và mùa khơ ở các tỉnh phía nam. Cây mọc lại vào giữa mùa xuân, có hoa sau khi
đã ra lá. Hoa mọc trên những thân của những chồi năm trƣớc. Những thân đã ra
hoa thì năm sau khơng mọc lại nữa và phần thân rễ của chúng trở thành những
củ “cái” già, sau 1-2 năm bị thối, cho những nhành non nẩy chồi thành cá thể
mới. Trên một cụm hoa, các hoa phía gốc nở trƣớc và thời gian hoa nở kéo dài
3-4 ngày. Hoa tự thụ phấn hoặc nhờ cơn trùng (Đỗ Huy Bích và cs. 2004).
2.1.4. ác giai đoạn sinh trƣởng của nghệ
Quá trình sinh trƣởng của các cây họ Gừng gồm bốn giai đoạn chính

(Nguyễn Thị Kim Huê, 2009).
 Giai đoạn nảy mầm: bắt đầu khi chồi ngủ (thân rễ mẹ) đâm chồi cho ra
một lá đầu tiên. Giai đoạn này khoảng 50 ngày. Dinh dƣỡng cho sự nảy mầm và
tạo rễ là chất dinh dƣỡng dự trữ trong chồi ngủ.
 Giai đoạn cây con: tính từ khi lá đầu tiên mở ra đến cây hình thành rễ và
thân rễ phân nhánh. Giai đoạn này khoảng 60-70 ngày. Trong giai đoạn này, cây
lấy dinh dƣỡng từ thân rễ, sau đó hấp thu nhờ hệ thống rễ. Dƣới điều kiện bình
thƣờng, thân khí sinh phát triển tốc độ 1-1,5 cm/ngày.
 Giai đoạn sinh trƣởng mạnh: khoảng 70-80 ngày, tính từ khi thân rễ phân
nhánh liên tục đến lúc thu hoạch. Giai đoạn này nhiều chồi mới và lá đƣợc tạo ra
và thân rễ cũng đƣợc phân nhánh mạnh mẽ. Lá thực hiện quang hợp chuyển đất
dinh dƣỡng cho thân rễ. Sự cung cấp phân bón và nƣớc đều đặn thì rất có hiệu
quả trong thời gian này vì nó cần thiết cho thân rễ và lá duy trì sự sinh trƣởng,
phát triển.

5


 Giai đoạn nghỉ: Các cây họ Gừng không chịu đựng đƣợc thời tiết lạnh
giá. Điều này bắt buộc chúng phải trải qua thời kỳ nghỉ. Vì vậy, chúng thƣờng
đƣợc thu hoạch trƣớc khi mùa đông đến và để lại trong đất chồi ngủ. Khi nhiệt
độ tăng trở lại hay mùa xuân đến, chồi ngủ sẽ tiếp tục thời kỳ sinh trƣởng, phát
triển.
Cây nghệ thƣờng đƣợc thu hoạch vào mùa thu. Khi thu, cắt bỏ hết phần rễ
và để riêng, thân rễ để riêng. Nếu muốn bảo quản đƣợc lâu phải hấp trong 6 đến
12 giờ, sau đó đợi ráo nƣớc, đem phơi nắng hoặc sấy khô (Đỗ Tất Lợi, 2011).
2.1.5. Thành phần hóa học cây nghệ
Các hoạt chất chính của củ nghệ có thể đƣợc phân loại thành hai nhóm
chính: khơng bay hơi và bay hơi. Nhóm khơng bay hơi bao gồm các thành phần
chính nhƣ curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin, đƣợc gọi

chung là curcuminoids. Curcumonoids có các hoạt tính chống oxy hóa, chống
ung thƣ, chống đột biến, kháng viêm và kháng khuẩn (Kao et al., 2007). Các
thành phần bay hơi đƣợc gọi chung là tinh dầu nghệ.
Trong củ nghệ thành phần chính bao gồm: curcumin, zingiberine,
phellandreen, sabenene, cineol, borneaol, sesquiterpene, curcuminoids, và tinh
dầu (Jayaprakasha et al., 2005). Ngoài ra, nó cũng chứa chất béo, chất xơ,
vitamin, protein, khống chất, và carbohydrate (Bakhru, 1997). Ngồi ra theo
Kapoor (1990) thì nghệ chứa protein (6,3%), chất béo (5,1%), chất vô cơ
(3,5%), carbohydrate (69,4%) và nƣớc (13,1%), carotene và vitamin; tinh dầu
(5,8%) có màu vàng nhạt, thơm.
Theo Giáo sƣ Tiến sĩ Đỗ Tất Lợi thì thành phần hóa học có trong Nghệ
vàng gồm: Chất màu curcumin 0.3%, tinh dầu 1-5% màu vàng nhạt, thơm gồm
25% carbua tecpenic, chủ yếu là zingiberen và 65% ceton sesquitecpenic, các
chất turmeron, 5% paratolylmetyl carbinol và 1% long não hữu tuyến. Hai chất
sau chỉ thấy trong Curcuma xanthorrhiza Roxb. Ngồi ra cịn tinh bột, canxi
oxalate, chất béo.
6


Curcumin dạng tinh thể thƣờng là dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy
từ 179-1830C. Curcumin tan tốt trong dầu, dung môi hữu cơ nhƣ mathanol,
ethanol, acetone, tetrahydrofuran, acetylacetone. Kém tan trong nƣớc ở pH acid
và trung hòa nhƣng tan trong pH kiềm. Trong dung dịch, curcumin có màu vàng
ở pH acid và màu đỏ ở pH kiềm (Aggarwal et al., 2006). Curcumin có vai trị
quyết định màu sắc cho sản phẩm tinh bột nghệ sau khi sấy. (Nguyễn Văn Toản,
2017).
Lƣợng hợp chất curcuminoids trong bột nghệ khoảng từ 3-4% trong đó
bao gồm chủ yếu là chất curcumin (chiếm 77%). Do curcumin chiếm phần lớn
so với hai dẫn xuất còn lại nên hỗn hợp curcuminoids thƣờng đƣợc gọi chung là
curcumin (Aggarwal et al., 2005). Trong đó bao gồm chủ yếu là chất curcumin

(diferuloyl methae), demethoxy-curcumin và bisdemethoxycurcumin (ChainaniWu, 2003). Curcumin là phẩm màu an tồn đƣợc đƣa vào Hình 2.8 Cấu trúc của
các hợp chất curcumin trong củ 13 hệ thống đánh số quốc tế INS (International
Numbering System) cho phụ gia thực phẩm với mã E100 (Strimpakos and
Sharma, 2008).

Hình 2.2. Ba thành phần chủ yếu trong curcuminoid

7


Hình 2.3. Các thành phần chủ yếu trong tinh dầu nghệ
2.1.6. Tác dụng dƣợc lý
Nghệ từ lâu đã đƣợc sử dụng nhiều trong phịng bệnh và chữa bệnh. Nó
có thuộc tính chống oxy hóa, kháng kháng sinh, chống viêm và thậm chí chống
khối u. Trong tinh bột nghệ có chứa nhiều loại vitamin thiết yếu nhóm B nhƣ
vitamin B6, B3, B9 và B2 giúp hỗ trợ điều trị thiếu máu, da hồng hào, ngăn chặn
các bệnh do bức xạ, hỗ trợ điều trị các bệnh viêm da, nám da, tàn nhang. Ngồi
ra cịn giúp tăng cƣờng chuyển hóa và hấp thu dinh dƣỡng cho cơ thể. Bên cạnh
đó, trong tinh bột nghệ còn cung cấp năng lƣợng, cacbohydrates, protein và chất
xơ cho cơ thể. Đặc biệt, trong tinh bột nghệ hồn tồn khơng chứa thành phần
cholesterol mà lại giàu các chất chống oxy hóa và chất xơ có khả năng tác động
và kiểm soát cholesterol xấu trong máu. Đây là điều tốt cho những bệnh nhân có
hàm lƣợng cholesterol trong máu không ổn định, giúp hỗ trợ điều trị các bệnh về
xơ vữa động mạch.

8


Nghệ có tác dụng kích thích bài tiết của tế bào gan do chất paratolyl
metylcacbinol. Chất curcumin gây co bóp túi mật và có tác dụng giảm 4

cholesterol trong máu. Ngồi ra cịn có tác dụng chống viêm, giảm đau (Phạm
Xuân Sinh, 1999).
Theo Đỗ Huy Bích và cs., (2004), một số tác dụng dƣợc lý của nghệ đã
đƣợc nghiên cứu nhƣ: tác dụng đối với cơ năng giải độc của gan. Đối với bệnh
nhân bị galactoza niệu sau khi uống thuốc có nghệ 10 ngày, kiểm tra galactoza
bằng phƣơng pháp Banev thì thấy lƣợng galactoza giảm xuống. Đối với lƣợng
urobilin tăng trong nƣớc tiểu, uống thuốc có nghệ vài ngày sẽ thấy lƣợng
urobilin giảm xuống. Dùng nghệ trong những bệnh về gan và mật thì thấy chóng
hết đau. Nhƣng trong những trƣờng hợp sỏi mật cấp tính thì kết quả chậm, chỉ
có tác dụng từ từ.
Curcumin có tác dụng chống đơng máu và hạ huyết áp, sodium
curcuminate có tác dụng chống co thắt ruột, curcuminoide và secquiterpen có
tác dụng chống viêm nhiễm. Ngồi ra, curcumin cịn có khả năng chống oxy hóa
bảo vệ tế bào, kìm hãm sự phát sinh khối u và một số dạng ung thƣ ở chuột nhƣ
ung thƣ ruột kết, ung thƣ dạ dày, ung thƣ vú và ung thƣ buồng trứng, và ngồi ra
nó cịn có tác dụng kháng khuẩn. (Phạm Đình Tỵ, 2000).
Hoạt tính sinh học của curcumin giúp chống oxy hóa, kháng viêm, kháng
khuẩn, kháng nấm, kháng ung thƣ, kháng virus, giúp tăng cƣờng chữa lành vết
thƣơng và hỗ trợ điều trị các bệnh tim mạch. Tuy nhiên curcumin là chất có sinh
khả dụng rất thấp do sự hấp thu kém, chuyển hóa nhanh và thời gian bán thải
ngắn (Đoàn Văn Hồng Thiện, 2015).
Từ năm 1993, các nhà khoa học thuộc ĐH Harvard (Mỹ) đã cơng bố 3
chất có tác dụng kìm hãm tế bào HIV-1, HIV-1-RT và 1 trong 3 chất đó là
Curcumin.

9


Năm 1977, phòng vi trùng Viện chống lao và Viện đơng y Hà Nội đã tiến
hành thí nghiệm khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn lao Mycobacterium

tuberculosis H37RV của tinh dầu nghệ với nồng độ 1 γ/ml.
2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nghệ
2.2.1. Trên thế giới
Ấn Độ là nƣớc sản xuất và tiêu thụ lớn nhất thế giới. Sản lƣợng nghệ của
Ấn Độ chiếm 78% sản lƣợng bột nghệ của toàn thế giới (Shree Kanungovà cs.,
2015). Diện tích trồng nghệ ở Ấn Độ có xu hƣớng ngày càng tăng: 215,97 nghìn
ha, sản lƣợng 1247,05 nghìn tấn, năng suất 5,3 tấn / ha vào năm 2018. (G.
Ramakrishna và cs., 2017).
Cây nghệ cũng đƣợc trồng ở nhiều nơi nhƣ Trung Quốc, Bangladesh,
Myanmar, Ni-gelia,… Có nhiều lồi trong chi Curcuma đƣợc trồng nhƣng loài
đƣợc trồng và sử dụng nhiều nhất là loài nghệ vàng (Curcuma Longa L.)…
2.2.2. Tại Việt Nam
Nghệ vàng đƣợc trồng khá phổ biến tại Việt Nam để làm gia vị và làm
thuốc. Diện tích trồng nghệ ngày càng mở rộng, sản lƣợng nghệ ƣớc đạt khoảng
gần 10000 tấn nghệ thô phục vụ chon nhu cầu trong nƣớc và xuất khẩu. Tuy sản
lƣợng nghệ rất lớn nhƣng công tác chọn giống nghệ chƣa thực sự đƣợc quan
tâm, đặc biệt khâu chọn tạo giống nghệ cho năng suất và tinh dầu cao ( Bộ Y Tế,
2009). Bên cạnh nguồn cung cấp trong nhân dân, một số địa phƣơng phía bắc,
nghệ mọc hoang dại ƣớc tính dự trữ khoảng 1000 tấn. Sản lƣợng nghệ ở Việt
Nam hàng năm đạt vài chục ngàn tấn nghệ tƣơi chủ yếu sử dụng làm thực phẩm.
Tinh chất nghệ (Curcumin) chủ yếu còn nhập khẩu từ Ấn Độ và Trung Quốc
hàng năm ƣớc tính 20 - 30 tấn, chất lƣợng Curcumin nhập khẩu không ổn định.
Trong khi nhu cầu Curcumin ở Việt Nam ngày một gia tăng, ƣớc tính khoảng
100 tấn/năm trong năm 2016 (tƣơng đƣơng với 40.000 tấn nghệ khô; 268.000
tấn nghệ tƣơi (tức là diện tích trơng nghệ trên 10.000 ha hàng năm).
10


Các nhà nghiên cứu tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã chiết
xuất đƣợc hoạt chất curcumin với độ tinh khiết 92-95%. Nhóm nghiên cứu của

TS Phạm Đình Tỵ đã tạo ra 2 chế phẩm TNV-999 và TNV-999-AC gọi chung là
bột đƣờng tinh nghệ chứa Curcumin độ tinh khiết 92,5%. Phối hợp với Học viện
quân y, nhóm nghiên cứu đã thử thành cơng độ an tồn và hiệu lực của
Curcumin.
Ở Việt Nam có khoảng 18 lồi nghệ khác nhau. Nhiều loài nghệ trong số
này đã đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam. Một số lồi tuy có tên trong sách phân loại
nhƣng hiện nay khơng tìm thấy, ngƣợc lại một số lồi nghệ khác đƣợc tìm thấy
nhƣng chƣa đƣợc định danh. Các loài nghệ khác nhau đƣợc ngƣời dân trồng thì
có nhiều lồi khác nhau, chƣa xác định đƣợc năng suất, chất lƣợng từ đó hiệu
quả kinh tế khơng cao. Từ đó thì cần đánh giá sự đa dạng, chọn lọc ra những loại
giống nghệ tốt, chất lƣợng, năng suất cao để đem lại hiệu quả kinh tế.
2.3. ác phƣơng pháp sử dụng chỉ thị phân tử DN thƣờng dùng trong
nghiên cứu đa dạng di truyền
2.3.1. Kỹ thuật RAPD
 Khái niệm
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer
ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu
nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo
nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR
– RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều
dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau.
Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ
tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ
thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Một trong những giới hạn của PCR chuẩn
đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải đƣợc
biết rõ trƣớc khi chuẩn bị các primer tƣơng ứng.
11


Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thƣờng là 10

nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34-37oC). Mặc dù trình tự mồi
RAPD là ngẫu nhiên nhƣng phải đạt đƣợc hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu phải
là 40% (thƣờng là 50-80%) và khơng có trình tự bazơ đầu xi và ngƣợc giống
nhau. Sản phẩm PCRRAPD thƣờng đƣợc phân tách trên gel agarose 1,5-2,0%.
 Nguyên lý kỹ thuật RAPD:
Về cơ bản kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc: Tách chiết DNA
tổng số, nhân DNA bằng máy PCR; điện di trên gel agarose hoặc gel
polyacrylamid; xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng
(NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc
cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu (Bùi Chí
Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999).
Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA đƣợc nhân
bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu
nhiên. Thƣờng primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có
hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhƣng số lƣợng primer dùng trong
nghiên cứu này rất hạn chế.
Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai
mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng
có thể nhân bản đƣợc (thƣờng 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ đƣợc
nhân lên.
Sự có mặt của sản phẩm này đƣợc quan sát thơng qua điện di trên gel
agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tƣơng đồng hồn tồn hay một
phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong
RAPD có kích thƣớc ngắn nên dễ tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên các mạch
đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phƣơng pháp có hiệu quả để xác định
tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể.

12

 Ƣu nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD
Ưu điểm:
Về mặt kỹ thuật:
+ Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành cơng do khơng cần biết trƣớc
trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu.
+ Thao tác đơn giản.
+ Chất lƣợng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao.
+ Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.
_ Về mặt kinh tế:
+ Chi phí thực hiện thấp.
+ Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao
cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy
cao
_ Chỉ thị RAPD khơng cần biết trƣớc trình tự nuleotide của đoạn DNA
cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao,
tiến hành chỉ với một lƣợng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lƣợng
mẫu thí nghiệm lớn.
_ Đồng thời RAPD khơng dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do
đó RAPD thƣờng dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa
các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại.
_ Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành
với các bƣớc nhƣ sau:
+ Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.
+ Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.
+ Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thơng dụng
(NTSYS-pc, UPGMA cluster.). Ngồi những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa
đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh
vật, chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử dụng cho những mục đích sau:
13

+ Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào
đó nhƣ tính trạng chất lƣợng sợi ở cây bơng, tính trạng kháng virus ở cà.
+ Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.
+ In dấu vân tay (DNA fingerprinting).
+ Phát hiện sự khác biệt trong các dịng soma (Somaclonal variation)
Nhược điểm:
Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhƣng chỉ thị RAPD
cũng có một số hạn chế nhƣ sau:
+ Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt đƣợc những gen lặn hay cá
thể dị hợp tử.
+ Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thƣờng khơng thống nhất.
+ Cần phải có các thiết bị điện tốn để xử lý số liệu.
+ Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân.
_ Kỹ thuật RAPD có độ chính xác khơng cao.
_ Khơng ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).
_ Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện
đa hình thấp
_ Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy khơng cao.
 Ứng dụng kỹ thuật RAPD:
+ Đánh giá đa dạng di truyền: Đã đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng: cúc
lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,… Cần
quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy
PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao.
+ Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã đƣợc áp dụng để phân
tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau nhƣ: Leptosphaeria
maculans (Desm.) Ces. et de Not, Corynespra cassiicola, Rhizoctonia solani, ...

14

+ Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền
và mối tƣơng quan giữa kiểu gene và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ơn của một
số giống lúa ở Việt Nam.
 Cải tiến của kỹ thuật RAPD:
+ Kỹ thuật thứ nhất: sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng
1 primer nhƣ kỹ thuật RAPD thơng thƣờng. Phƣơng pháp này có thể làm tăng
hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng
cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa
hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình.
+ Kỹ thuật thứ hai: cắt DNA bằng các enzyme giới hạn trƣớc hoặc sau
khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là
có thể làm giảm số lƣợng các băng khó xác định (complex band), điều đó làm dễ
dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu
có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào
chiến lƣợc nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể đạt đƣợc các chỉ thị đồng
trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ
thể là tốc độ, giá thành, và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và ctv, 1995).
2.3.2. Kỹ thuật ISSR
 Khái niệm
ISSR là những chỉ thị đƣợc nhân bản bằng PCR với một mồi bổ trợ với
tiểu vệ tinh (microsatellite) đích. Mỗi băng tƣơng ứng với chuỗi DNA đƣợc giới
hạn bởi các tiểu vệ tinh đảo ngƣợc. Kết quả dẫn đến đa locus, có sự đa hình cao
và tạo ra các chỉ thị trội.
ISSR-PCR là kỹ thuật đánh giá kiểu gen nhanh, khơng đắt; sự đa hình dựa
trên sự thay đổi trong các vùng nằm giữa các tiểu vệ tinh. Kỹ thuật này khơng
cần thơng tin về trình tự, tạo đƣợc nhiều locus, có tính đa hình cao và tạo ra chỉ
thị trội. Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai vùng lặp
lại giống hệt và ngƣợc chiều nhau. Kỹ thuật này sử dụng các tiểu vệ tinh nhƣ các
15