Nghiên cứu tạo đột biến in vitro cây trầu bà xanh (epipremnum aureum) bằng xử lý sodium azide (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO CÂY
TRẦU BÀ XANH (EPIPREMNUM AUREUM ) BẰNG
XỬ LÝ SODIUM AZIDE”

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thúy Nga

Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Ninh Thị Thảo
Mã sinh viên

: 637340

Lớp

: K63CNSHD

Bộ Môn

: Công nghệ sinh học Thực vật

Khoa

:Công nghệ sinh học

HÀ NỘI – 2022


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan kết quả của đề tài khóa luận tốt nghiệp ―Nghiên cứu tạo
đột biến in vitro cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum) bằng xử lý sodium
azide‖ là trung thực. Đề tài đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Ninh
Thị. Tất cả các số liệu, bảng và hình ảnh đƣợc lấy từ thực tiễn trong q trình
thực hiện đề tài khóa luận.
Một lần nữa em xin cam đoan và chịu trách nhiệm với những số liệu và
kết quả đƣợc sử dụng trong đề tài khóa luận này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2022
Ngƣời thực hiện

Nguyễn Thúy Nga

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đƣợc đề tài khóa luận tốt nghiệp, lời đầu tiên cho phép em
đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới:
- Các thầy (cô) của khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt là các thầy (cô) của
Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – khoa Công nghệ sinh học, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam.
- TS. Ninh Thị Thảo – ngƣời đã luôn hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
- Bố mẹ, bạn bè những ngƣời đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên em trong
thời gian em thực hiện đề tài.
Do bản thân em cịn thiếu kinh nghiệm nên khơng tránh khỏi những sai

sót khi thực hiện. Em mong nhận đƣợc những lời nhận xét, góp ý từ thầy (cơ) để
em có thể hồn thiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2022
Ngƣời thực hiện

Nguyễn Thúy Nga

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC .....................................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH...................................................................................................... vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................... ix
TÓM TẮT....................................................................................................................... x
PHẦN I: MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Mục đích của đề tài .................................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu .................................................................................................................... 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
2.1. Giới thiệu về cây trầu bà xanh ................................................................................. 3
2.1.1. Sơ lƣợc và phân bố ............................................................................................ 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 3
2.1.3. Đặc tính sinh học và sinh thái ........................................................................... 4
2.1.4. Giá trị sử dụng ................................................................................................... 4
2.2. Khái quát về xử lý đột biến trong chọn tạo giống cây trồng ................................... 5

2.2.1. Khái niệm về đột biến ....................................................................................... 5
2.2.2. Các tác nhân gây đột biến ................................................................................. 5
2.2.3. Cơ chế di truyền của đột biến............................................................................ 6
2.2.4. Kỹ thuật RAPD ................................................................................................. 7
2.2.4.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD ......................................................................... 7
2.2.4.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD .............................................................. 7
2.2.4.3. Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD.................................................................... 8
2.2.4.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD ....................................................................... 8
2.2.5. Giới thiệu về Sodium Azide .............................................................................. 8
iii


2.3. Tình hình nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng bằng xử lý đột biến in vitro .... 9
PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 12
3.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 12
3.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 12
3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 13
3.3.1. Nội dung 1: Xử lý tạo đột biến bằng sodium azide (NaN3) ............................ 13
3.3.2. Đánh giá khả năng sinh trƣởng và duy trì biến dị của chồi sau khi xử lý với
NaN3 sau các lần cấy chuyển .................................................................................... 15
3.3.3. Đánh giá sự khác di truyền của dòng trầu bà xanh đột biến ........................... 16
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................... 16
3.4.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm........................................................................ 16
3.4.2. Phƣơng pháp xử lý đột biến ............................................................................ 16
3.4.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA cây trầu bà xanh .............................................. 16
3.4.4. Phƣơng pháp đánh giá sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD ........... 18
3.4.5. Chỉ tiêu theo dõi .............................................................................................. 20
3.4.6. Phân tích số liệu .............................................................................................. 20
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 21
4.1. Xử lý tạo đột biến chồi trầu bà xanh (Epipremnum) bằng sodium azide (NaN3) . 21

4.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NaN3 đến khả năng sống và sinh trƣởng của chồi trầu
bà xanh (Epipremnum aureum) ................................................................................. 21
4.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý NaN3 1,0 mM đến khả năng sống và sinh
trƣởng của chồi trầu bà xanh ..................................................................................... 23
4.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NaN3 khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đến khả
năng sống và sinh trƣởng của chồi trầu bà xanh ....................................................... 26
4.2. Đánh giá sự duy trì biến dị của chồi trầu bà xanh qua các lần cấy chuyển ........... 28
4.2.1. Đánh giá khả năng sinh trƣởng và duy trì biến dị của chồi trầu bà xanh sau xử
lý NaN3 ở các nồng độ khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 1 ....................................... 28
4.2.2. Đánh giá khả năng sinh trƣởng và duy trì biến dị của chồi trầu bà xanh sau xử
lý NaN3 ở thời gian khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 1 ............................................ 31
4.3. Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng biến dị giả định sau xử lý NaN3 bằng
chỉ thị RAPD ................................................................................................................ 33
iv


4.3.1.Kết quả xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số .......................... 34
4.3.2. Kết quả phân tích RAPD – PCR ..................................................................... 35
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 40
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 40
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 41
Tài liệu tham khảo trong nƣớc...................................................................................... 41
Tài liệu tham khảo quốc tế ........................................................................................... 41
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 43

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các mồi RAPD đƣợc sử dụng trong nghiên cứu……………………18
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR………………………………………….19
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR……………………………………..19
Bảng 4.1. . Ảnh hƣởng của nồng độ NaN3 đến khả năng sống và sinh trƣởng
của chồi (sau 6 tuần) ………………………………………………………......21
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý NaN3 1,0 mM đến khả năng sống
và sinh trƣởng của chồi sau 6 tuần……………………………………………..24
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NaN3 khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi
cấy đến khả năng sống và sinh trƣởng của chồi……………………………….26
Bảng 4.4. Khả năng sinh trƣởng và duy trì biến dị của chồi sau khi xử lý
NaN3 ở các nồng độ khác nhau ở lần cấy chuyển 1……………………………28
Bảng 4.5. Khả năng sinh trƣởng và duy trì biến dị của chồi sau khi xử lý
NaN3 1,0 mM trong các khoảng thời gian khác nhau ở lần cấy
chuyển 1…………………………......................................................................31
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA của các mẫu cây
trầu bà xanh…………………………………………………………………….32
Bảng 4.7. Kết quả RAPD – PCR………………………………………………33
Bảng 4.8. Hệ số tƣơng đồng di truyền của mẫu đối chứng và 3 mẫu biến
dị giả định……………………………………………………………..……….36

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum)……………………………..3
Hình 2.2. Cấu trúc 2D của Sodium azide (NaN3)……………………………….9
Hình 3.1. Chồi in vitro cây trầu bà xanh……………………………………….12
Hình 4.1. Chồi trầu bà xanh đã đƣợc xử lý NaN3 ở các nồng độ khác nhau sau
8 tuần ……………………………………………………………………….....23
Hình 4.2. Chồi trầu bà xanh đã xử lý NaN3 1,0 mM trong các khoảng thời

gian khác nhau sau 6 tuần ………………………………………………….....25
Hình 4.3. Chồi trầu bà xanh nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung NaN3 ở các
nồng độ khác nhau……......................................................................................27
Hình 4.4. Chồi in vitro cây trầu bà xanh sau 1 tuần nuôi cấy trong môi
trƣờng bổ sung trực tiếp NaN3……………………………………………...….27
Hình 4.5. Chồi in vitro cây trầu bà xanh sau 2 tuần cấy trên môi trƣờng bổ
sung NaN3 trực tiếp ………………………………………………………..…..28
Hình 4.6. Chồi trầu bà xanh sau khi xử lý NaN3 ở các nồng độ khác nhau
trong 60 phút nuôi cấy trên môi trƣờng MS + 2 mg/l BA + 5 mg/l
adenin sulfat ở lần cấy chuyển 1……………………………….........................30
Hình 4.7. Chồi cây trầu bà xanh sau xử lý NaN3 1,0 mM trong các các
khoảng thời gian khác nhau nuôi cấy trên môi trƣờng trƣờng MS + 2 mg/l
BA + 5 mg/l adenin sulfat ở lần cấy chuyển 1………………………..……....33
Hình 4.8. Các dịng biến dị giả định. (DC) cơng thức đối chứng, (D1)
dịng có chiều cao cây cao vƣợt trội, (D2) dịng có hình thái lá thon
vii


dài, (D3) dịng có hình thái tƣơng tự chồi đối chứng nhƣng có nhiều
chồi ………….....................................................................................................34
Hình 4.9. Kết quả phản ứng RAPD – PCR của 4 mẫu trầu bà xanh…………...37
Hình 4.10. Sơ đồ hình cây biết hiện mối tƣơng quan di truyền của mẫu đối
chứng và 3 dòng biến dị giả định của cây trầu bà xanh. (N1) mẫu đối chứng,
(N2) chiều cao vƣợt trội, (N3) lá thon dài, (N4) hình thái tƣơng tự đối
chứng nhƣng nhiều chồi………………………..……………………….……...38

viii


BA

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Benzyl adenin

CT

Công thức

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EI

Ethylene imin

EMS

Ethyl methanesulfonate

LSD 0.05

Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa

MS

Mơi trƣờng Murashige và Skoog, 1962

NMU

Nitroso metyl ure

PCR

Polymerase chain reaction

P-value

Probability value

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

TAE

Tris – acetate EDTA

ix


TĨM TẮT
Cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum) là một lồi cây cảnh rất đƣợc ƣa
chuộng trên thị trƣờng. Nên việc nghiên cứu xử lý tạo đột biến cây trầu bà xanh
tạo các dịng biến dị phục vụ cơng tác chọn tạo giống cây trồng là cần thiết. Kết
quả nghiên cứu xử lý đột biến bằng sodium azide trên cây trầu bà xanh cho
thấy:
Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng về thời gian và nồng độ NaN3 cho
thấy việc xử lý NaN3 để tạo đột biến cho cây trầu bà xanh in vitro là có khả
quan, các mẫu có thể sinh trƣởng và phát triển tốt, có xuất hiện những biến dị

giả định. Đối với thí nghiệm bổ sung trực tiếp NaN3 và môi trƣờng nuôi cấy, các
mẫu chết với tỷ lệ 100%, điều này chứng tỏ rằng không thể bổ sung NaN3 trực
tiếp vào môi trƣờng nuôi cấy trầu bà xanh để tạo đột biến.
Xuất hiện mẫu biến dị giả định ở thí nghiệm xử lý NaN3 1,0 mM ở các
khoảng thời gian 30, 60, và 90 phút.
Kết quả phân tích RAPD – PCR cho thấy có sự sai khác di truyền giữa
các dòng biến dị giả định và mẫu đối chứng. Điều này chứng tỏ việc xử lý đột
biến bằng sodium azide trên cây trầu bà xanh là có thể tạo ra các đột biến.

x


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum) là một cây thuộc họ ráy (Araceae),
vốn là loài cây bản địa Autralia . Đây là một loài cây đƣợc trồng trong nhà phổ
biến ở các vùng ôn đới nhƣng cũng đã đƣợc nhập nội trong các khu rừng nhiệt
đới và cận nhiệt đới trên thế giới nhƣ miền bắc Nam Phi, Úc, Đông Nam Á,
Quần đảo Thái Bình Dƣơng và Tây Ấn. Ở Việt Nam, cây trầu bà xanh đƣợc
trồng rộng rãi khắp cả nƣớc bởi dễ trồng, tạo nên sự sinh động hay nhờ màu
xanh của nó. Bên cạnh đó, cây trầu bà xanh trong nƣớc cịn có thể làm sạch
khơng khí, loại bỏ Aldehyde formic và các chất ô nhiễm.
Cây trầu bà xanh thƣờng đƣợc bán với giá từ vài trăm nghìn thậm tới vài
triệu tùy vào cây. Đặc biệt cây có những màu sắc đột biến đƣợc bán với giá càng
cao mở ra hƣớng đi mới cho những ngƣời trồng trầu bà xanh. Tần suất đột biến
ngoài tự nhiên thƣờng rất thấp nên việc gây đột biến in vitro bằng xử lý hóa chất
để tăng tuần suất đột biến là cần thiết. Đột biến in vitro là phƣơng pháp kết hợp
giữa kỹ thuật nuôi cấy mô trong ống nghiệm với phƣơng pháp cảm ứng gây đột
biến làm tăng khả năng tạo biến dị của cây trồng (Walther &Sauer, 1986). Ở
Việt Nam, hiện nay đã có khá nhiều nghiên cứu về phƣơng pháp gây đột biến in

vitro cây trồng cho kết quả khả quan. Tuy nhiên, cho đến nay chƣa thấy có cơng
bố chính thức về đột biến in vitro cây trầu bà xanh. Do đó, tơi thực hiện đề tài
―Nghiên cứu tạo đột biến in vitro cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum) bằng
xử lý sodium azide‖ để tạo ra các dòng biến dị di truyền làm nguyên liệu cho
công tác chọn giống cây trầu bà xanh.

1


1.2. Mục đích của đề tài
Xác định đƣợc phƣơng pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo đƣợc các dịng
biến dị di truyền làm nguồn ngun liệu cho cơng tác chọn giống cây trầu bà
xanh (Epipremnum aureum).
1.3. Yêu cầu
- Xác định nồng độ sodium azide thích hợp đến khả năng sống và tạo biến dị
của chồi cây trầu bà xanh.
- Xác định đƣợc thời gian xử lý sodium azide thích hợp đến khả năng sống
và tạo biến dị của chồi cây trầu bà xanh.
- Đánh giá đƣợc khả năng duy trì biến dị của chồi cây trầu bà xanh
(Epipremnum aureum) qua các lần cấy chuyển.
- Đánh giá đƣợc sự sai khác di truyền của dòng trầu bà xanh biến dị.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây trầu bà xanh
2.1.1. Sơ lƣợc và phân bố
Cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum) thuộc họ Ráy (Araceae) cịn có
tên gọi khác là cây vạn niên thanh, hoàng tam điệp, thạch cam tử,… đƣợc trồng

nhiều ở các văn phịng, cơng sở, trong các gia đình, nhà hàng, qn cafe, các
shop bn bán… Cây trầu bà xanh là loài cây bản địa của Australia, Indonesia,
Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ và đã đƣợc trồng rộng rãi trên nhiều nƣớc trong
đó có Việt Nam. Cây có lá vuốt nhọn ở đỉnh và tim ở gốc.

Hình 2.1. Cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum)
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Rễ: Rễ chùm; bộ rễ phát triển mạnh mẽ, khi cịn non rễ màu xanh nhạt,
sau đó rễ đậm màu dần.
Thân: Cây thân thảo leo, có hình trụ mập, bám chặt vào gỗ hay vách đá.

3


Lá: Có lá lớn, lúc cịn non mép lá ngun, sau đó xẻ thùy sâu dần với gốc
lá hình tim, cuống lá dài có bẹ, lá thƣờng có màu xanh lục, phiến lá trơn nhẵn và
bóng mƣợt, lá già thì thƣờng thơ nhám hơn, gân lá hình xƣơng với gân chính rõ
ràng và thuộc dạng mọc cách.
Hoa: Cụm hoa bơng mập có mo, cuống ngắn và bng thõng xuống.
2.1.3. Đặc tính sinh học và sinh thái
Cây trầu bà ƣa sống trong mơi trƣờng nóng ẩm, u cầu đất trồng phải tơi
xốp, màu mỡ và thốt nƣớc tốt. Cây thích hợp sinh trƣởng trong mơi trƣờng có
ánh sáng tán xạ mạnh. Nhiệt độ sinh trƣởng là 20 – 28°C (vào ban ngày), 15 18°C (vào ban đêm). Mùa đông nhiệt độ trong nhà cần trên 10°C là cây có thể
sống an toàn. Nếu nhiệt độ trên 5°C cây rễ rụng lá, ảnh hƣởng đến sự sinh
trƣởng. Ở miền Bắc, nếu nhiệt độ từ 20°C trở lên, cây có thể sinh trƣởng bình
thƣờng. Cây trầu bà xanh có thể nhân giống bằng cách cắt một đoạn cành già
trên cây sau đó cắm vào đất ẩm trong 2 tuần rồi mang trồng vào nơi cần trang
trí.
2.1.4. Giá trị sử dụng
Giá trị kinh tế: Hiện nay, cây trầu bà xanh đang đƣợc bán với giá từ vài

trăm nghìn đến vài chục triệu, thậm chí vài trăm triệu tùy vào kích thƣớc của
cây. Đặc biệt những cây mang đột biến có giá càng cao. Giá trị kinh tế của cây
trầu bà xanh là rất lớn vì phù hợp với khí hậu Việt Nam, dễ dàng chăm sóc và
mang lại hiệu quả kinh tế cao (Tơn Linh, 2021).
Cây trầu bà xanh khơng chỉ có tác dụng trang trí mà cịn có tác dụng lọc
khơng khí đem lại không gian sống trong lành. Theo phong thủy đây là loại cây
xua đuổi tà khí và vận xấu.

4


2.2. Khái quát về xử lý đột biến trong chọn tạo giống cây trồng
2.2.1. Khái niệm về đột biến
Đột biến là những biến đổi bất thƣờng trong vật chất di truyền ở cấp độ
phân tử (DNA, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột
ngột của một hay một số tính trạng, những biến đổ này có tính chất bền vững và
có thể di truyền cho đời sau.
Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định
hƣớng ở cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên.
2.2.2. Các tác nhân gây đột biến
Các tác nhân gây đột biến tồn tại trong môi trƣờng sống của chúng ta và
đƣợc chia làm 2 loại là tác nhân bên ngoài cơ thể và tác nhân bên trong cơ thể.
Tác nhân bên ngoài cơ thể đƣợc chia làm 3 loại chính là: tác nhân vật lý,
tác nhân hóa học và tác nhân sinh học.
- Tác nhân vật lý gây đột biến gồm 3 loại chính: tia phóng xạ, tia tử ngoại,
sốc nhiệt. Tia phóng xạ là các tia X, tia gamma, tia alpha, tia beta,…
những tia này tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên ADN trong tế bào gây
ra đột biến gen hoặc làm chấn thƣơng NST gây ra đột biến NST khi xuyên
qua mô; tia X và tia gamma là 2 dạng tia đƣợc sử dụng nhƣ nguồn chiếu
xạ cơ bản trong các thực nghiệm, do có bƣớc sóng rất ngắn và vận tốc rất

lớn, khơng có khối lƣợng và điện tích, khơng bị lệch trong điện trƣờng và
có sức xun khá lớn. Khả năng xuyên của tia tử ngoại không bằng tia
phóng xạ nên dùng để xử lý vi sinh vật, bào tử và hạt phấn, chủ yếu gây
nên các đột biến gen. Sốc nhiệt là sự thay đổi nhiệt độ môi trƣờng một
cách đột ngột làm cơ chế tự bảo vệ cân bằng của cơ thể chƣa kịp điều

5


chỉnh gây chấn thƣơng trong bộ máy di truyền hoặc làm tổn thƣơng thoi
phân bào gây đột biến số lƣợng NST.
- Tác nhân hóa học: 5BU (5-Bromuraxin) là đồng đẳng của T có khả năng
gây đột biến thay thế cặp A-T thành cặp G-X; 2-Aminopurin tác động vào
giai đoạn sao chép, làm sai hỏng DNA trong giai đoạn sao chép; EMS là
đồng đẳng của A và G gây đột biến thay thế cặp G-X thành cặp A-T;
Acridine gây đột biến mất hoặc thêm cặp nucleotide, nếu đƣợc chèn vào
mạch khuôn cũ gây đột biến thêm cặp nucleotide; Colchicine – gây đột
biến đa bội, ngăn chặn sự hình thành vi ống trong q trình phân chia tế
bào, do đó các NST khơng tách ra nhƣ bình thƣờng đẫn đến 1 tế bào có
gấp đơi số lƣợng NST.
- Tác nhân sinh học bao gồm virus và vi khuẩn. Các tác nhân này xâm nhập
vào sẽ kết hợp với DNA vật chủ gây ra sự thay đổi trong hoạt động của
gen dẫn tới rối loạn quá trình phân bào (Dixit và Kumar, 2018).
Do nguyên nhân bên trong cơ thể:
- Những biến đổi bất thƣờng gây rối loạn các quá trình sinh lý và sinh hóa
trong tế bào.
2.2.3. Cơ chế di truyền của đột biến
Đột biến có thể xảy ra bất kỳ lúc vào bất kỳ tế bào nào và phân chia theo
nhiều cách khác nhau.
Đột biến phát sinh trong quá trình giảm phân hình thành giao tử, xảy ra ở

tế bào sinh dục nào đó thơng qua thụ tinh sẽ đi vào hợp tử. Nếu là gen trội sẽ
đƣợc biểu hiện ngay thành kiểu hình trên cơ thể mang gen đó. Nếu là gen lặn thì
sẽ khơng biểu hiện ra bên ngồi nhƣng không mất đi mà tiếp tục tồn tại và sẽ
biểu hiện ra khi gặp đồng hợp lặn.
6


Ở đột biến soma, đột biến xảy ra ở tế bào soma, từ một tế bào bị đột biến
thông qua ngun phân đƣợc nhân lên thành mơ và có thể di truyền bằng sinh
sản sinh dƣỡng. Nếu là gen trội sẽ đƣợc biểu hiện ra, gọi là ―thể khảm‖. Nếu là
gen lặn sẽ khơng biểu hiện ra ngồi và mất đi khi cơ thể chết đi.
Đột biến tiền phôi xảy ra ở những lần nguyên phân đầu tiên của hợp tử,
giao đoạn 2 từ 8 tế bào. Nó có thể đi vào hợp tử và di truyền cho thế hệ sau qua
sinh sản hữu tính nếu tế bào đó đột biến thành tế bào sinh dục.
2.2.4. Kỹ thuật RAPD
2.2.4.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những đoạn
mồi (primer) ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc đem bắt cặp,
nhân bản ngẫu nhiên với các đoạn DNA có trình tự bổ sung với các đoạn mồi.
Theo nguyên tắc, các cả thể hoàn toàn giống nhau sau khi thực hiện kỹ thuật
RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn DNA bằng nhau và có
chiều dài tƣơng ứng bằng nhau. Nếu xảy ra đột biến làm xuất hiện hoặc mất đi
một vị trí bắt cặp nào đó sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác
nhau, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể dùng để phát hiện đột biến.
Kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo 3 bƣớc: Tách chiết DNA tổng số,
nhân bản DNA với các mồi ngẫu nhiên bằng phƣơng pháp PCR; điện di sản
phẩm PCR; xác định tính đa dạng di truyền.
2.2.4.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trình tự
bộ gen đối tƣợng nghiên cứu. Độ tinh sạch của ADN không cần cao, thời gian

thực hiện nhanh với khả năng nhân bản cao, chi phí thực hiện thấp. (Nguyễn Thị
Lang, 2002).
7


2.2.4.3. Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD
Độ chính xác của kỹ thuật không cao và không ổn định. Khả năng xuất
hiện đa hình thấp và độ tin cậy khơng cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử
thấp và độ tin cậy không cao (Nguyễn Thị Lang, 2002).
2.2.4.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:
- Đánh giá đa dạng di truyền: Đã áp dụng trên các đối tƣợng nhƣ: cúc lai, cà phê,
ngô, đậu nành, lúa, dâu tây, cà chua, khoa tây,…
- Nhận diện chỉ thị phân tử: Nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tƣơng quan
giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ảnh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở
Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và cộng tác viên, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002).
- Xây dựng bản đồ gene: (Nguyễn Thị Lang, 2002).
2.2.5. Giới thiệu về Sodium Azide
Sodium azide là hợp chất vơ cơ có cơng thức NaN3. Là một chất rắn kết
tinh hình lục giác khơng màu đến trắng, khơng mùi. Mật độ 1,85 g/cm3. Bỏng
trong khơng khí và có thể nổ nếu dính một lƣợng lớn. Nhiễm độc khi ăn phải
(PubChem, n.d.).
Khối lƣợng mol: 65,007 g/mol
Khối lƣợng riêng: 1,846 g/cm3 (20°C)
Điểm sơi: Phân hủy trong chân khơng
Điểm nóng chảy: Phân hủy ở 527°F thành Natri và Nitơ
Điểm chớp cháy: Khơng dễ cháy
Nhiệt độ nóng chảy: 257°C

8

Độ hòa tan: 50 – 100 mg/ml Ở 72°F. Hòa tan nhiều trong nƣớc: 41,0
g/100 ml ở 17°C. Ít tan trong etanol và khơng tan trong ete etylic.

Hình 2.2. Cấu trúc 2D của Sodium azide (NaN3)
( />Cơ chế tác động của sodium azide: Sodium azide ức chế chuỗi vẫn
chuyển electron, ức chế enzyme catalase, peroxidase, và cytochrome oxidase, do
đó ảnh hƣởng đến quả trình hơ hấp, giảm hiệu quả sửa chữa đột biến ADN.
Một số ứng dụng của sodium azide: Một trong những ứng dụng rất quan
trọng của sodium azide là dùng trong sản xuất các dù cứu hộ cho ô tơ và máy
bay. Là chất diệt khuẩn trong phịng thí nghiệm và bệnh viện. sản xuất thuốc nổ,
phái hoa trong cơng nghiệp. Trong phịng thí nghiệm đƣợc sử dụng nhƣ chất xúc
tác trong nhiều phản ứng hóa học. Là phụ gia trong sản xuất hóa chất và các chế
phẩm hóa học.
2.3. Tình hình nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng bằng xử lý đột biến
in vitro
Trên thế giới hiện nay đã có nhiều nghiên cứu tạo đột biến in vitro bằng
phƣơng pháp hóa học. Kết quả của các nghiên cứu là nền tảng để thực hiện các
nghiên cứu tiếp theo dựa trên kết quả đạt đƣợc.
P. Srivastava và các cộng sự (2011) đã nghiên cứu về ảnh hƣởng của
sodium azide đối với các đặc điểm sinh trƣởng của giống lúa mì HD-2733. 100
9


hạt giống của giống lúa mỳ này đƣợc xử lý đột biến với nồng độ sodium azide
lần lƣợt là: 0,02%, 0,04% và 0,06%. Tỷ lệ nảy mầm của mẫu đối chứng và các
mẫu hạt cao nhất là mẫu đối chứng (99,55%), sau đó lần lƣợt mẫu xử lý NaN3
0,02% (97,11%), mẫu sử dụng NaN3 0,04% (95,55%), mẫu sử dụng sodium
azide 0.06% (85,77%). Kết quả này cho thấy nồng độ sodium azide cao làm

giảm tỉ lệ nảy mầm của hạt tuy nhiên nếu ở một lƣợng nhỏ thì tỉ lệ này vẫn ở
trong mức kiểm sốt. Vì vậy tỉ lệ sodium azide ở trong mức cho phép có thể làm
cây bị đột biến mà vẫn đảm bảo sức sống cho cây trồng.
Gehan G. Mostafa (2010) đã gây đột biến hạt giống của giống Helianthus
annuus Giza 1 và 102 bằng cách ngâm hạt trong dung dịch sodium azide với
các nồng độ 0, 100, 200, 300, 400 và 500 ppm trong 4 giờ. Hạt đƣợc chia làm 2
đợt gieo trồng trong hai vụ vào ngày 31 tháng 5 năm 2008 và ngày 28 tháng 7
năm 2009. Sau 1 tuần, tỷ lệ nảy mầm của hạt Giza 1 giảm đáng kể sau khi đã
đƣợc xử lý sodium azide (<50% số hạt). Hạt Giza 102 đƣợc xử lý bằng dung
dịch sodium azide nồng độ 100 ppm có tỷ lệ nảy mầm khơng khác biệt so với tỷ
lệ nảy mầm của hạt đối chứng, các hạt đƣợc xử lý bằng các dung dịch sodium
azide nồng độ khác giảm đáng kể tỷ lệ nảy mầm. Ngoài ra kết quả còn cho thấy
ở cả hai kiểu gen Giza 1 và 102 đều cho ra những thay đổi về hình thức lá và
hoa của cây và có khả năng di truyền cho đời sau ở từng cây đƣợc xử lý bằng
sodium azide có nồng độ khác nhau và khác so với cây đối chứng. Đột biến gây
ra sự thay đổi về chiều cao cây, cây có nhiều hoa và tạo ra các cây có màu sắc
loang lổ ở lá cây và cánh hoa. Điều này chứng tỏ sodium azide gây ảnh hƣởng
đến kiểu hình của cây hƣởng đến kiểu hình của cây từ đó ta có thể rút ra kết luận
rằng sử dụng NaN3 có thể gây ra đột biến về màu sắc của lá cũng nhƣ hoa ở thực
vật tùy theo từng nồng độ đƣợc sử dụng.
Viện nghiên cứu Nông nghiệp, Đại học Ahmadu Bello Zaria, Nigeria
(2007) đã xử lý hạt cà chua khô bằng sodium azide ở nồng độ 1,0, 2,0 và 4,0 để
xác định ảnh hƣởng của đột biến về đặc điểm hình thái của cây cà chua. Sự khác
10


biệt có ý nghĩa rất lớn (P <0,01) đã đƣợc quan sát thấy ở các giống và nghiệm
thức đối với các tính trạng đƣợc nghiên cứu (sự nảy mầm của hạt, tỷ lệ sống của
cây con, chiều cao cây con, chiều dài rễ, số lá trên cây con, chiều cao khi trƣởng
thành, số cành trên cây và quả mỗi cây). Tƣơng tác giữa nghiệm thức và giống

có ý nghĩa tƣơng tự cao (P <0,01) đối với tất cả các tính trạng ngoại trừ chiều
cao khi trƣởng thành.
Tại Việt Nam, phƣơng pháp sử dụng sodium azide chƣa thật sự phổ biến
trên cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum) nhƣng đã đƣợc sử dụng trên một số
cây khác nhƣ gây đột biến lan Erycina pusilla.
SBC scientific (2019) đã gây đột biến ở lan Erycina pusilla bằng SMS và
NaN3. Các PLB in vitro của Erycina pusilla đã đƣợc tiếp xúc với các phƣơng
pháp thử nghiệm EMS khác nhau ở 0, 0,1, 0,2, 0,4 và 0,8% trong 0,5, 1 và 2 giờ
và đƣợc tiếp xúc với các phƣơng pháp thử nghiệm NaN3 khác nhau ở 0, 0,5, 1, 2
và 4 mM trong 0,5, 1 và 2 giờ. . Tỷ lệ sống, số lƣợng cây hồi phục và kỹ thuật
Phân tích tế bào theo dịng chảy (Flow cytometry), tất cả sẽ đƣợc tiến hành sau
khi thử nghiệm bằng EMS và NaN3. Một tháng sau khi thử nghiệm
bằng EMS và NaN3, một số PLB co lại và bắt đầu chuyển sang màu nâu. Kết
quả cho thấy các phƣơng pháp thử nghiệm 0,1% EMS trong 1 giờ và 0,5 mM
NaN3 trong 0,5 đến 2 giờ có tỷ lệ sống sót cao và số lƣợng cây pusilla Erycina.
Nhìn chung, phƣơng pháp thử nghiệm EMS có hiệu quả hơn trong việc giảm tỷ
lệ sống sót và số lần tái sinh thực vật so với phƣơng pháp thử nghiệm NaN3.
Nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng sự khuếch tán của EMS và NaN3 vào PLBs
Erycina pusilla đã thành công khi đƣợc chứng minh bằng việc mất dần khả năng
sống sót trong nuôi cấy với việc tăng thời gian tiếp xúc và nồng độ của EMS và
NaN3. Nồng độ thấp EMS và Na ít ảnh hƣởng đến thiệt hại sinh học và sẽ phù
hợp để gây ra đột biến mong muốn ở Erycina pusilla. Tuy nhiên, những thay đổi

11


trong hồ sơ của biểu đồ tế bào theo dòng chảy đã đƣợc tìm thấy trong một số cây
pusilla Erycina phục hồi đƣợc thử nghiệm bằng EMS và NaN3.
PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu

- Đối tƣợng nghiên cứu: cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum)
- Vật liệu nghiên cứu: chồi in vitro cây trầu bà xanh đƣợc cung cấp bởi bộ môn
Công nghệ sinh học Thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nơng nghiệp
Việt Nam.

Hình 3.1. Chồi in vitro cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum)
3.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 2/2022 – 7/2022.
- Địa điểm: Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Thực vật, Khoa
Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

12


3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Xử lý tạo đột biến in vitro cây trầu bà xanh bằng sodium
azide (NaN3)
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ NaN3 đến khả năng sống và
sinh trưởng của chồi Epipremnum aureum.
Các chồi in vitro cây trầu bà xanh đƣợc ngâm trong dung dịch NaN3 ở các
nồng độ khác nhau trong 1 giờ. Sau khi xử lý bằng NaN3, các chồi đƣợc thấm
khô bằng giấy thấm và cấy vào môi trƣờng nhân nhanh (MS + 2 mg/l BA + 5
mg/l adenin sulfat + 30 g/l đƣờng) và theo dõi trong 6 tuần.

CT

Nồng độ NaN3 (mM)

CT1

0

CT2

0,5

CT3

1,0

CT4

2,5

CT5

5,0

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý NaN3 1,0 mM đến khả
năng sống và sinh trưởng của chồi.
Các chồi in vitro đƣợc ngâm trong dung dịch NaN3 nồng độ 1,0 mM trong
các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi xử lý bằng NaN3, các chồi đƣợc thấm
khô bằng giấy thấm và cấy vào môi trƣờng nhân nhanh (MS + 2 mg/l BA + 5
mg/l adenin sulfat + 30 g/l đƣờng) và theo dõi trong 6 tuần.

13


CT

Thời gian ngâm mẫu
(phút)

CT1

0

CT2

30

CT3

60

CT4

90

CT5

120

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NaN3 khi bổ sung vào môi
trường nuôi cấy đến khả năng sống và biến dị của chồi.
Các chồi in vitro đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS + 2 mg/l BA + 5 mg/l
adenin sulfat + 30 g/l đƣờng + NaN3 ở các nồng độ khác nhau.
CT

Nồng độ NaN3 (µM)

CT1

0

CT2

1

CT3

10

Các mẫu sau khi xử lý đột biến in vitro bằng NaN3 đƣợc nuôi cấy trên môi
trƣờng nhân nhanh (MS + 2 mg/l BA + 5 mg/l adenin sulfat + 30 g/l đƣờng)
trong 6 tuần nhằm mục đích chọn những cá thể biến dị giả định. Các biến dị giả
định này sẽ đƣợc theo dõi tiếp tục qua các lần cấy chuyển để chọn lọc những cá
thể mang biến dị không hồi phục.
14