Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng quận chúa (dianthus caryophyllus l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ HOÀNG HIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ
SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA
CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG QUẬN
CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)

CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC CÂY TRỒNG
MÃ SỐ

: 62.62.01.10

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI – 2014


Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH

Phản biện 1:

PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Thảo

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 2:

PGS.TS. Lê Huy Hàm
Viện Di truyền Nông nghiệp

Phản biện 3:

TS. Đặng Văn Đông
Viện Nghiên cứu Rau quả

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi

, ngày

tháng

năm 2014

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
-

Thư viện Quốc gia Việt Nam

-

Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cẩm chướng là một trong bốn loài hoa cắt cành được trồng phổ
biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị
Kim Lý, 2012). Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản
xuất nội tiêu cũng như xuất khẩu của Việt Nam. Ở nước ta hiện nay,
chủ yếu trồng các giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngoài do đó
không chủ động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể mở
rộng sản xuất và xuất khẩu bởi không có bản quyền giống. Vì vậy,
việc nghiên cứu chọn tạo những giống hoa cẩm chướng mới đáp ứng
được nhu cầu thị trường, phù hợp với điều kiện sinh thái và có bản
quyền của Việt Nam là yêu cầu bӭc thiết.
Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung chủ yếu là tạo
giống có màu sắc mới. Điều này được thực hiện thông qua con
đường lai xa và gây tạo đột biến. Tuy nhiên đối với cây hoa cẩm
chướng ở nước ta việc lai xa rất khó thực hiện bởi khả năng thụ phấn
thụ tinh rất khó. Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể
thực hiện thông qua con đường gây tạo đột biến. Phương pháp chọn
tạo giống bằng gây tạo đột biến được phát triển từ giữa thế kỷ 20 và
ngày càng phát triển rộng rãi mang lại những thành tựu to lớn trong
công tác chọn tạo giống cây trồng. Hơn thế nữa, việc gây tạo đột
biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trở
thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí và thời gian chọn tạo
giống cây trồng mới. Kỹ thuật này đã làm tĕng tần số xuất hiện đột
biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung
và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây
trồng. (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013). Xuất phát từ
những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo

đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di
truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa
(Dianthus caryophyllus L.)”.
1


2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định
được phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến
dị di truyền làm nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa
cẩm chướng mới.
3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định khả năng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng
giống Quận Chúa, làm cơ sở cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh
các mẫu xử lý đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến.
- Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm
chướng trong nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao:
+ Xác định nồng độ, thời gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân
in vitro cây hoa cẩm chướng.
+ Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho
chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng.
+ Xác định hiệu quả của xử lý phối hợp EMS và tia gamma
nguồn 60Co cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng.
- Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro.
- Sàng lọc các dạng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong
điều kiện tự nhiên.
- Đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng đột biến có triển
vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR.
- Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trường nhân nhanh,
môi trường ra rễ và giá thể ra cây thích hợp cho một số dòng đột biến

có tiềm năng được tuyển chọn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học
có giá trị về việc ứng dụng nhân giống in vitro và phương pháp tạo
giống mới thông qua xử lý đột biến in vitro của cây hoa cẩm chướng.
Các kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu
tạo dòng đột biến làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo
giống cẩm chướng mới. Đồng thời là tư liệu có giá trị cho việc
nghiên cứu lĩnh vực công nghệ sinh học và chọn tạo giống cây trồng.

2


4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho một số
dòng, giống hoa cẩm chướng, góp phần giải quyết khó khĕn trong
thực tiễn về nhân giống hiện nay; ứng dụng thành công phương pháp
xử lý đột biến in vitro và xây dựng được quy trình xử lý gây tạo đột
biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho cây hoa cẩm chướng bằng tác nhân
EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; tạo được các vật liệu khởi
đầu phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống hoa cẩm
chướng mới và chọn lọc được một số dòng đột biến có triển vọng.
5. Những đóng góp mới của luận án
Các kết quả nghiên cứu đã xác định được tác nhân gây đột biến
EMS và tia gamma cho hiệu quả cao trong việc gây tạo biến dị có
tiềm năng có thể làm vật iệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm
chướng mới.
Đề tài đã tạo ra các dòng đột biến có tiềm năng và đánh giá được
đặc điểm sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến mới về mầu

sắc hoa trong điều kiện tự nhiên. Các dòng đột biến này cũng đã
được đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR và xác
định mối quan hệ di truyền với cây mẹ.
Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho 2 dòng
đột biến có triển vọng (dòng H6 và dòng H7) trong số các dòng đột
biến nêu trên, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo để phát triển hai
dòng này thành giống hoa cẩm chướng mới.
6. Giới hạn của đề tài
- Thời gian nghiên cứu từ nĕm 2009 – 2013.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện
Nông nghiệp Việt Nam.
7. Bố cục của luận án
Nội dung chính của luận án được thể hiện trong 130 trang, gồm: 4
trang mở đầu, 34 trang tổng quan, 17 trang vật liệu nội dung và
phương pháp nghiên cứu, 73 trang kết quả và thảo luận, 2 trang kết
luận và kiến nghị. 126 tài liệu tham khảo, trong đó 32 tài liệu tiếng
Việt, 94 tài liệu tiếng Anh. Kết quả nghiên cứu có 34 bảng số liệu và
41 hình. Phần phục lục hình ảnh minh họa và kết quả xử lý số liệu.
3


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI Liệu
Cẩm chướng là loại hoa có giá trị kinh tế cao, chiếm tỷ lệ lớn trong
các loài hoa cắt cành trên thế giới (chiếm 17%) và trong các loài hoa
xuất khẩu ở nước ta. Việc đẩy mạnh sản xuất và nâng cao chất lượng
sản phẩm hoa cẩm chướng ở Việt Nam còn nhiều hạn chế, trong đó
đề bản quyền giống đang là khó khĕn trong việc tiếp cận thị trường
hoa thế giới.
Đột biến đóng vai trò quan trọng trong chọn giống cây trồng, nhờ

vào quá trình đột biến mà chúng ta đã tạo ra nhiều giống hoa mới, đặc
sắc có năng suất cao, khả năng chống chịu tốt, kháng sâu bệnh,... trên
lĩnh vực hoa cảnh nói riêng và trong ngành chọn giống nói chung. Xử
lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro có nhiều ưu điểm so với
phương pháp chọn giống truyền thống: tần số đột biến cao và khả
năng thu nhận những thể đột biến đồng nhất về kiểu gen dễ dàng hơn;
có thể xử lý một số lượng lớn tế bào, mô, cây con mà không đòi hỏi
diện tích lớn; có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau của cây (tế bào,
mô sẹo, chồi in vitro, đoạn thân, hạt, …); có khả năng rút ngắn thời
gian so phương pháp truyền thống (chỉ cần 3 - 6 thế hệ).
Các kết quả nghiên cứu của các tác giả về chọn tạo giống đột biến
hoa cẩm chướng cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật gây tạo đột
biến nhân tạo đối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói
riêng mang lại hiệu quả rất lớn. Có rất nhiều giống hoa cẩm chướng
mới với những tính trạng mới được tạo ra nhờ xử lý gây tạo đột
biến. Vì vậy, có thể nói rằng, phương pháp chọn giống cẩm chướng
và các loại hoa nói chung bằng xử lý đột biến là một phương pháp
đầy triển vọng trong công tác chọn tạo giống hoa mới cho sản xuất.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Mắt ngӫ của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng thơm giống Quận
Chúa (Tên khoa học Dianthus caryophyllus “Princess”; tên thương
mại Princess).
4


- Các thiết bị dụng cụ hóa chất trong nuôi cấy mô tế bào.

5

- Phản ứng PCR-SSR được tiến hành 20 mồi SSR của hãng
Bioneer
(theo Smulders et al., 2003, Tetsuya et al., 2009).
- Hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử như Tris bazơ,
agarose, isopropanol, Ethanol, chloroform, isoamylalcohol,
CH3COONa, SDS, CTAB, Nacl, ETDA,…
- Các hóa chất cho phản ứng PCR gồm deoxynucleotit triphosphat
(dNTPs) của Sigma, Taq-DNA polymeraza của Fermentas.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống
Quận Chúa
- Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ
sống của mẫu.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hệ số
nhân, sự sinh trưởng của chồi in vitro:
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS
đến hệ số nhân, sự sinh trưởng của chồi in vitro.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp cytokinin và auxin đến
hệ số nhân, sự sinh trưởng của chồi in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính trong môi
trường MS tới khả năng ra rễ của chồi in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm.
2.2.2. Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro
cho cây cẩm chướng
- Nghiên cứu xử lý EMS cho cây hoa cẩm chướng in vitro.
- Nghiên cứu xử lý tia gamma nguồn 60Co cho cây hoa cẩm
chướng in vitro.

- Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho
cây
cẩm chướng in vitro.
2.2.3. Nghiên cứu phân lập các d̩ng chồi in vitro biến dị sau xử lý
và đánh giá sự sinh trưởng phát triển của các d̩ng chồi
- Nghiên cứu phân lập các dạng chồi biến dị về mặt hình thái.
- Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi phân lập sau xử lý.
- Nghiên cứu khả năng sinh trưởng phát triển của các dạng chồi
6


trong điều kiện vườn ươm.
2.2.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các d̩ng
biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên
Cây cẩm chướng sau xử lý được đưa ra trồng tại nhà lưới, theo
dõi phân lập các dạng biến dị.
2.2.5. Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng
biến dị có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR
Chọn lọc một số dòng biến dị có tiềm năng đánh giá sự sai khác
di truyền ở mӭc độ phân tử bằng chỉ thị SSR.
2.2.6. Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng
đột biến được tuyển chọn
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của
mẫu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hệ số
nhân, sinh trưởng của chồi in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin trong môi trường MS tới khả
năng ra rễ của chồi in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm.

2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại.
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản
MS (Murahige and Skoog, 1962) với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose và
100 mg/l innositol) có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng.
Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh mẫu được nuôi
cấy ở nhiệt độ 20 – 220C, cưӡng độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian
chiếu sáng
16 giӡ/ngày. Các công thӭc thí nghiệm được bố trí hoàn toàn
ngẫu nhiên, mỗi công thӭc thí nghiệm bố trí 150 mẫu, chia làm 3 lần
nhắc lại.
2.3.3. Phương pháp gây t̩ạo đột biến in vitro

7


Phương pháp gây tạo đột biến được tiến hành theo quy trình của
Novak and Brunner (1992) có cải tiến. Mỗi công thӭc thí nghiệm xử
lý 3 lần nhắc lại mỗi lần 60 mẫu với liều lượng xử lý như sau:
- Xử lý gây tạo đột biến bằng tác nhân EMS: Mẫu được xử lý ở

8


các mӭc nồng độ EMS 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0% với 3 mӭc thời gian 1,
2 và 3 giӡ.
- Xử lý gây tạo đột biến bằng tia gamma nguồn 60Co: Mẫu được
xử lý với các liều hấp thụ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 Gᵧ.

- Xử lý gây tạo đột biến bằng EMS kết hợp tia gamma nguồn
60
Co: Mẫu được xử lý EMS với nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% trong
thời gian 2 giӡ kết hợp tia gamma nguồn Co60 với liều hấp thụ 10,
20, 30 Gᵧ.
2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng
đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR
Để tiến hành phân tích và đánh giá sự sai khác di truyền của các
giống hoa cẩm chướng ở mӭc độ phân tử, DNA của 7 mẫu hoa cẩm
chướng được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR. Các
sản phẩm được điện di trên gel agarose 3,5%.
2.3.4.1. Phương pháp chiết tách DNA
Trong thí nghiệm này chúng tôi chiết tách DNA tổng số của các
mẫu cẩm chướng dựa theo phương pháp của Obara – Okeyo P. and
Kako (1998) có cải tiến.
2.3.4.2. Phương pháp PCR – SSR
Phản ứng PCR được thực hiện với nhiều chu kì, nhiệt độ biến
tính DNA 950C, nhiệt độ gắn mồi 37- 550C tuỳ theo từng mồi, nhiệt
độ tổng hợp chuỗi DNA 720C.
2.3.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Sản phẩm của phản ứng PCR-SSR được kiểm tra trên gel agarose
1% và soi gel dưới ánh sáng đèn UV, nhận biết sản phẩm khuếch đại
dựa vào thang chuẩn DNA 1Kb.
2.3.4.4. Phương pháp phân tích số liệu
Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc
2.1 của Rohlf (2002) để tính ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu.
ảệ số PIC - Chỉ số thông tin đa hình (Nei, 1973).

9

��� = 1 −

2

∑ ��

Trong đó: pi là tần số xuất hiện alen thӭ i.

10


Tỷ lệ dị hợp tử (ả%)
Số mồi xuất hiện ≥2 alen/ 1locus SSR
H%= Tổng
số mồi sử dụng-Số mồi khuyết số liệu x 100
2.3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá đặc điểm nông, sinh học
Các chỉ tiêu đánh giá ngoài đồng ruộng theo Quy phạm khảo
nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định của Hiệp hội
Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới (Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ
giống cây trồng mới, 2008).
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương phân tích phương sai (ANOVA)
theo chương trình Irristat 5.0S và Excel. Số liệu phân tích SSR được
xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1. Sử dụng thuật toán nội suy
lagrange để xây dựng mô hình toán học. Sử dụng phương pháp Reed
and Muench (1983), Behrens and Karber (1935) để xác định liều gây
chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50).

Chương 3

Kết QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống
Quận Chúa
3.1.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu
Kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với cây cẩm chướng giống
Quận Chúa sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu có hiệu
quả tốt hơn so với NaOCl (5%). Trong các công thӭc thí nghiệm
được nghiên cứu công thӭc 2 (sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 7
phút) cho hiệu quả tốt nhất.
3.1.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro
3.1.2.1ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số
nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng
Kết quả nghiên cứu cho thấy: các công thӭc có bổ sung kinetin
hoặc BA đều cho sự phát sinh chồi cao hơn đối chứng. Tuy nhiên, ở
mỗi nồng độ BA hoặc kinetin bổ sung khác nhau thì số chồi phát
11


sinh và sự sinh trưởng thân lá của các chồi cũng có sự khác nhau
khác nhau. Trong các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT6 (MS + 1,0
mg/l kinetin) cho hệ số nhân chồi cao nhất.
3.1.2.2ảnh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân,
sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng
Số liệu cho thấy, khi cố định nồng độ kinetin thay đổi nồng độ
IAA và α-NAA với các mӭc 0,25; 0,50; 0,75 và 1,0 mg/l thì chiều
cao và hệ số nhân chồi có xu hướng giảm dần (hệ số nhân chồi đạt từ
2,11 đến 2,72 chồi/tháng), thấp hơn so với đối chứng.
Từ kết quả thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 cho thấy môi trường
MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi cao chất lượng chồi
tốt nhất cho giống Quận Chúa.

3.1.3. Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh
Các công thӭc thí nghiệm khác nhau cho tỷ lệ mẫu phát sinh rễ,
số lượng, chiều dài rễ, chiều cao cây, số cặp lá trên cây ở các công
thӭc thí nghiệm rất khác nhau. Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ ở các công
thӭc thí nghiệm đều cao hơn so với đối chứng (đạt 92,22 đến 100%).
Công thӭc thí nghiệm MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l
α-NAA cho tỷ lệ phát sinh rễ, số rễ và chiều dài rễ cao hơn và thời
gian ra rễ sớm hơn so với các công thӭc thí nghiệm khác.
3.1.4. Nghiên cứu ̫nh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ
sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm
Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi thấy công thӭc cho tỷ lệ sống
cao thì đồng thời cây cũng sinh trưởng phát triển tốt. Trong các loại
giá thể được sử dụng giá thể đất cho tỷ lệ sống thấp (83,33%), giá thể
đất + trấu hun (1:1) cho tỷ lệ sống cao và chất lượng tốt.
3.2. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng
in vitro bằng EMS và chiӃu xҥ tia gamma nguӗn 60Co
3.2.1. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng
nuôi cấy in vitro bằng EMS
3.2.1.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của EMS tới sự sinh trưởng của chồi
in vitro cây hoa cẩm chướng
EMS đã có ảnh hưởng đến khả năng sống của mẫu. Ở các công


thӭc xử lý EMS, tỷ lệ mẫu sống giảm mạnh khi tĕng nồng độ EMS
và thời gian xử lý. Tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất tại công thӭc xử lý
nồng độ 0,2% trong thời gian 1 giӡ (91,11%) và tỷ lệ mẫu sống thấp
nhất tại công thӭc xử lý nồng độ 1,0% trong thời gian 3 giӡ
(18,89%). Trong các công thӭc xử lý EMS ở mӭc thời gian 1 và 2
giӡ tỷ lệ phát sinh chồi đạt cao nhất khi xử lý ở mӭc nồng độ 0,4%.
Bằng thuật toán nội suy chúng tôi đã xây dựng được mô hình toán

học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ mẫu chết
với các mӭc thời gian 1, 2 và 3 giӡ như sau:
Y = - 62,16x + 1157,07x2 – 4145,10x3 + 5626,30x4 – 2508,33x5
Y = 1,17 + 52,91x-57,06x2+563,85x3-1107,81x4+581,77x5
Y = 2,22+195,48x-997,26x2+2299,84x3-2109,11x4+689,48x5

Trong đó: x là nồng độ EMS xử lý ; Y là tỷ lệ mẫu chết.
Từ kết quả nghiên cứu đã xác định được liều gây chết 50% mẫu
thí nghiệm (LD50) với các mӭc thời gian 1, 2 và 3 giӡ như sau:
LD50, EMS,1 giӡ = 0,79%; LD50, EMS,2 giӡ = 0,76%; LD50, EMS, 3 giӡ = 0,71%.
3.2.1.2ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và kh̫ năng
sinh trưởng của các d̩ng chồi in vitro của cây cẩm chướng
Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 5 dạng chồi (Dạng A, dạng
b, dạng C, dạng D và dạng E).

Dạng A

Dạng B

Dạng C
Dạng D
Dạng E
Hình 3.1. Các dҥng chӗi thu đѭӧc sau xử lý EMS
EMS có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng phát triển


của chồi cũng như sự biến đổi hình thái của chồi. Ở các công thӭc thí
nghiệm, tỷ lệ chồi biến dị tĕng dần theo sự tĕng của nồng độ và thời
gian xử lý EMS. Sự phân bố của các dạng chồi ở các công thӭc
không giống nhau. Khi xử lý ở nồng độ 0,2% xuất hiện 4 dạng chồi:

A, B, C và D. Khi tĕng nồng độ EMS lên 0,4; 0,6; 0,8% thì kết quả
cho cả 5 dạng chồi A, B, C, D, E. Ở nồng độ xử lý 1,0 % số dạng
chồi xuất hiện lại giảm chỉ có 4 dạng: A, B, C và D.
Bҧng 3.1. Ҧnh hѭởng của EMS đӃn sự phát sinh hình thái
của chӗi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 1 giӡ
Tỷ lệ các dạng chồi (%)
Nồng độ
Công
Tỷ lệ
EMS
Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng
thӭc
chồi
(%)
A
B
C
D
E
biến dị
ĐC
0,0
97,76
2,24
0,00
0,00
0,00
2,24
CT1.1
0,2

86,75
8,10
2,16
3,00
0,00
13,20
CT1.2
0,4
74,40 17,32
2,54
4,19
1,55
15,60
CT1.3
0,6
64,91 22,32
4,78
4,28
3,70
34,75
CT1.4
0,8
54,62 33,25
6,12
3,82
2,19
45,72
CT1.5
1,0
47,50 34,72 15,45

2,33
0,00
52,50
Bҧng 3.2. Ҧnh hѭởng của EMS đӃn sự phát sinh hình thái của
chӗi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 2 giӡ
Nồng
Tỷ lệ các dạng chồi (%)
Công
độ
Tỷ lệ
Dạng Dạng
Dạng Dạng Dạng
thӭc EMS
chồi biến
A
B
C
D
E
dị
(%)
ĐC
0,0
95,81
4,19
0,00
0,00
0,00
4,19
CT2.1

0,2
81,82 10,08
3,13
3,29
1,69
18,51
CT2.2
0,4
70,24 17,55
3,75
4,64
3,81
28,25
CT2.3
0,6
61,36 27,11
5,42
3,69
2,41
38,53
CT2.4
0,8
51,15 32,51
10,63
3,47
2,25
49,53
CT2.5
1,0
42,12 36,42

21,46
0,00
0,00
57,88


Khi xử lý ở nồng độ cao và thời gian dài cho tỷ lệ chồi biến dị
nhiều tuy nhiên số dạng chồi biến dị xuất hiện lại giảm, đa số các
chồi bị chết. Dạng biến dị tĕng chủ yếu ở dạng biến dị B, C, trong đó
dạng chồi C có khả năng sinh trưởng phát triển kém. Nồng độ EMS
thích hợp cho xử lý gây tạo đột biến in vitro đối với cây cẩm chướng
giống Quận Chúa là 0,4% trong thời gian 2 giӡ.
Bҧng 3.3. Ҧnh hѭởng của EMS đӃn sự phát sinh hình thái của
chӗi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 3 giӡ
Công
thӭc

Nồng
độ
EMS
(%)

Dạng
A

Dạng
B

Dạng
C

Dạng
D

Dạng
E

ĐC
CT3.1
CT3.2
CT3.3
CT3.4
CT3.5

0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

94,13
69,71
66,33
53,59
44,71
34,76

5,87
19,71

21,73
31,46
38,06
35,44

0,00
4,69
5,39
9,31
14,33
29,80

0,00
3,50
4,36
3,57
2,90
0,00

0,00
2,39
2,20
2,08
0,00
0,00

Tỷ lệ các dạng chồi (%)
Tỷ lệ
chồi
biến dị

5,87
29,93
33,33
46,01
56,33
64,49

Từ kết quả thu được, chúng tôi đã xác định được hệ số tương
quan giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ chồi biến dị và xây dựng được
mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS và tỷ lệ
biến dị của chồi với các mӭc thời gian xử lý 1, 2 và 3 giӡ như sau:
Y = 2,24 + 266,34x-1823,63x2+4983,33x3-5431,25x4+2061,46x5
Y = 4,19+99,15x-192,33x2+311,72x3-201,04x4+36,20x5
Y = 5,87+327,25x-1665,40x2+3870,73x3-3865,10x4+1391,15x5
Trong đó : Y là tỷ lệ chồi biến dị; x là Nồng độ EMS xử lý.
3.2.2. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng
nuôi cấy in vitro bằng chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co
3.2.2.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của xử lý chiếu x̩ tia gamma nguồn
60
Co tới sự phát sinh và sinh trưởng của cây hoa cẩm chướng in vitro
Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở các công thӭc thí nghiệm cho


thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều lượng xử lý chiếu xạ tia
gamma nguồn 60Co và tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi. Khi
liều lượng xử lý tĕng, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi giảm. Trong
các công thӭc thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi đạt cao
nhất tại CT1 (tỷ lệ sống đạt 91,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt
91,99%), khi xử lý ở liều hấp thu 70 Gᵧ thì 100% mẫu bị chết.
Từ kết quả thu được, bằng thuật toán nội suy Lagrange chúng tôi

đã xây dựng mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng
xử lý gamma với tỷ lệ mẫu chết.
-10
-6
-4
-3
Y= 57,83.10 x7 + 1,42.10 x6 - 1,38.10 x5 + 6,65.10 x4
- 0,166x3 + 1,995x2 - 8,096x + 2
Trong đó: Y : Tỷ lệ mẫu chết (%); x: Liều lượng xử lý gamma
(Gᵧ)
Bằng phương pháp Behrens and Karber (1935), đã xác định được
liều lượng gây chết 50% mẫu thí nghiệm LD50= 38,57Gᵧ
3.2.2.2ảnh hưởng của chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co đến sự phát
sinh biến dị hình thái chồi in vitro cây cẩm chướng
Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 6 dạng chồi (Dạng A, dạng
F, dạng G, dạng H, dạng I và dạng K).

Dạng A

Dạng F

Dạng G

Dạng H
Dạng I
Dạng K
Hình 3.2. Các dҥng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn
60
Co
Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính của tỷ lệ

các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao


tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự phân bố của các dạng chồi ở các công
thӭc thí nghiệm không giống nhau. Khi xử lý ở liều hấp thu 20Gᵧ đến


50Gᵧ xuất hiện 6 dạng chồi: A, F, G, H, I và K. Ở liều hấp thu thấp
10Gᵧ chỉ thu được 3 dạng chồi A, F, H. Đặc biệt khi tĕng liều lượng
xử lý lên 60Gᵧ chỉ thu được 2 dạng chồi I và K. Ở liều lượng xử lý
cao, tỷ lệ chồi biến dị cao tuy nhiên số dạng chồi biến dị lại giảm.
Đặc biệt dạng chồi G, H (chồi có khả năng sinh trưởng phát triển tốt)
có xu hướng giảm mạnh.
Bҧng 3.4. Tỷ lӋ chӗi biến dӏ và các dҥng chӗi sau xử lý tia gamma
nguӗn 60Co
Liều
Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng
Tỷ lệ
hấp thu
A
F
G
H
I
K
biến
(Gᵧ)
(%)
(%)
(%)

(%) (%)
(%)
dị (%)
0
10
20
30
40
50
60
70

96,20
89,68
64,04
52,99
41,54
22,34
0,00
0,00

3,80
6,53
9,53
10,72
18,00
25,12
0,00
0,00

0,00
0,00
7,39
13,69
8,92
8,37
0,00
0,00

0,00
3,79
7,39
8,93
6,77
8,37
0,00
0,00

0,00
0,00
6,35
6,54
10,16
13,71
16,67
0,00

0,00
0,00
5,29

7,14
14,61
22,09
83,33
0,00

3,80
10,32
35,96
47,01
58,46
77,66
100,0
0,00

Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi cũng đã xây dựng được mô hình
toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý tia gamma
nguồn 60Co và tỷ lệ chồi biến dị.
-8

-6

-4

Y= 7,255.10 x6 - 15,533.10 x5 + 12,865.10 x4 - 5,05.10
x3

-2

+ 0,92x2 - 4,639x + 3,80

Trong đó: Y là tỷ lệ chồi biến dị (%); X liều hấp thu (Gᵧ).
3.2.3. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và chiếu x̩ tia gamma
nguӗn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro
3.2.3.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma
nguồn 60Co tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng
Kết quả thí nghiệm cho thấy khi tĕng liều xử lý lên thì tỷ lệ mẫu
sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần. Trong các công thӭc thí


nghiệm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao nhất tại
công thӭc CT1 (Tỷ lệ mẫu sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi
89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công thӭc CT12 (Tỷ lệ mẫu
sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%).
3.2.3.2ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co
đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro
Sau xử lý chúng tôi đã phân lập 8 dạng chồi (Dạng A, dạng F,
dạng G, dạng L, dạng M, dạng N, dạng O và dạng P).

Dạng A

Dạng E

Dạng G

Dạng L

Dạng M
Dạng N
Dạng O
Dạng P Hình

3.3. Các dҥng chӗi sau xử lý kӃt hӧp EMS và tia gamma
nguӗn 60Co
Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính của tỷ lệ
các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao
tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự biến động về số dạng chồi biến dị
cũng có xu hướng tương tự như khi xử lý riêng rẽ EMS hoặc chiếu
xạ tia gamma. Khi tĕng liều xử lý thì tỷ lệ chồi biến dị có xu hướng
tĕng lên, tuy nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm ở các công
thӭc xử lý với liều lượng cao. Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả
năng sinh trưởng phát triển tốt) chỉ xuất hiện ở công thӭc CT4 đến
CT10. Công thӭc CT5 xuất hiện nhiều dạng chồi, trong đó dạng chồi
tiềm năng có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%). Xử lý kết hợp EMS và tia
gamma xuất hiện nhiều dạng chồi biến dị hơn hơn so với xử lý riêng
rẽ hai tác nhân này (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009).


16

Bҧng 3.5. Tỷ lӋ chӗi biến dӏ và các dҥng chӗi
Nồng
Liều
Dạng Dạng
Công
độ
hấp thụ
A
F (%)
thӭc
EMS gamma
(%)

(%)
(Gᵧ)
0,00
ĐC
95,92
4,73
0,0
0,0
CT1
86,79
5,33
0,1
10
79,65
11,63
CT2
0,1
20
71,26
8,48
0,1
30
CT3
72,66
7,98
0,2
10
CT4
57,50 18,40
CT5

0,2
20
37,89 13,27
0,2
30
CT6
45,96 15,48
CT7
0,3
10
34,34 18,49
0,3
20
CT8
29,49 16,36
0,3
30
CT9
39,62 25,52
0,4
10
CT10
28,90 27,87
0,4
20
CT11
27,77
0,4
30
CT

12

in vitro sau xử lý kӃt hӧp EMS và tia gamma nguӗn 60Co
Tỷ lệ
Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng
chồi
G
L (%)
M
N
O
P (%)
biến dị
(%)
(%)
(%)
(%)
0,00
0,00
(%)
0,00
4,08
0,00
0,00
0,00
0,00
4,08
0,00
8,50
0,00

0,00
0,00
0,00
13.21
0,00
10,18
4,84
0,00
0,00
0,00
20,35
0,00
10,95
6,17
0,00
0,00
0,00
28,74
3,26
8,36
7,26
0,00
0,00
5,37
27,34
9,12
11,30
8,72
0,00
0,00

6,90
42,50
6,90
13,80
9,20
6,90
0,00
9,32
62,11
6,60
11,18 11,18
2,49
4,78
9,39
54,04
7,16
11,13 11,45
6,26
6,54
9,95
65,66
5,44
12,04 12,04
6,02
7,38
8,90
70,51
4,36
12,26 11,12
0,00

7,82
10,36
60,38
0,00
15,65
7,82
3,91
8,96
8,62
71,10
0,00
18,15
0,00
8,62
72,23
16


3.3. Nghiên cứu khҧ năng sinh trưởng của các dҥng chӗi in
vitro
3.3.1. Nghiên cứu kh̫ năng ra rễ của các d̩ng chồi in vitro cây
cẩm chướng sau xử lý
Trong môi trường ra rễ, trừ dạng chồi G, các dạng chồi biến dị có
khả năng ra rễ thấp hơn so với dạng chồi bình thưӡng. Khả năng ra
rễ cao nhất là dạng G (100%) thấp nhất là dạng chồi C (37,78%), đặc
biệt dạng chồi I và dạng chồi M không có khả năng sống khi cấy
sang môi trường ra rễ.
3.3.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d̩ng chồi
in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh
Các dạng chồi biến dị có khả năng sống và sinh trưởng thân lá

thấp hơn rất nhiều so với dạng chồi bình thưӡng. Tỷ lệ sống của các
dạng chồi rất khác nhau, cao nhất là chồi dạng G (100%) sau đó là
chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K,. Chồi dạng C, K có khả năng
sống rất thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%). Chồi dạng I, M, O
không có khả năng sống ngay cả trong điều kiện vườn ươm.
3.3.3. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d̩ng chồi
in vitro cây cẩm chướng sau xử lý giai đo̩n ngoài đồng ruộng
Hầu hết các dạng chồi khả năng trong điều kiện vườn ươm kém
(dạng C, K, P) đều bị chết sau khi trồng ra ngoài ruộng. Khả năng
sống và sinh trưởng của các dạng chồi ở giai đoạn ngoài đồng ruộng
cũng có sự tương đồng với giai đoạn trong phòng thí nghiệm và giai
đoạn khí canh. Cụ thể dạng chồi G, A có khả năng sinh trưởng phát
triển tương đối tốt, cho tỷ lệ sống cao trên 80%, thân lá phát triển tốt.
Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống thấp.
3.4. Nghiên cứu ҧnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát
sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoҥn ngoài đồng ruộng
Để đánh giá hiệu quả của sự tác động của các tác nhân gây đột
biến chúng tôi đã tiến hành phân lập các dạng biến dị về mặt hình
thái và khả năng sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng giai đoạn
ngoài đồng ruộng. Qua theo dõi chúng tôi đã phân lập được một số
dạng biến dị về thời gian sinh trưởng, hình thái lá và màu sắc hoa và
được phân thanh 3 nhóm như sau:
17


Nhóm 1: Biến dị về hình thái lá: lá cuộn, lá hình ống.
Nhóm 2: Chồi nách phát triển.
Nhóm 3: Biến dị về màu sắc hoa: H1: Hoa màu tím; H2: Hoa màu
phấn hồng viền tím; H3: Hoa màu trắng viền đỏ; H4: Hoa màu trắng
sọc tím; H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, một số cánh hoa không có

viền tím; H6: Hoa trắng viền phấn hồng; H7: Hoa màu tím nhạt viền
tím đậm.

Đối chứng
Lá hình ống
Đầu lá cuộn Chồi nách phát triển
Hình 3.10. Một số dҥng biến dӏ vӅ hình thái thơn lá

Đối chứng

H1

H2

H3

H4
H5
H6
H7
Hình 3.4. Hình ҧnh một số dҥng biến dӏ vӅ màu sắc hoa
3.4.1ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây
cẩm chướng giai đo̩n ngoài đồng ruộng
Khi xử lý EMS xuất hiện cả 3 nhóm biến dị, trong đó có 5 dạng
biến dị về màu sắc hoa (H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không
xuất hiện khi xử lý EMS. Ở các công thӭc xử lý nồng độ cao và thời
gian dài, các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị
về hoa tĕng chủ yếu ở dạng H5 (dạng biến dị không có lợi). Trong
các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT7 (xử lý EMS nồng độ 0,4%
trong thời gian 2 giӡ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc

biệt là dạng hoa H7 chỉ xuất hiện ở công thӭc này.
18


3.4.2. Ҧnh hưởng của xử lý chiếu xҥ tia gamma nguồn 60Co đến tỷ
lệ
biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoҥn ngoài đồng
ruộng
Kết quả nghiên cứu cho thấy khi xử lý chiếu xạ gamma xuất hiện
2 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá và biến dị về màu sắc hoa),
biến dị khả năng phát triển chồi nách mạnh không xuất hiện. Trong
nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 3 dạng (H4, H5, H6), dạng
H1, H2, H3 và H7 không xuất hiện khi xử lý chiếu xạ gamma riêng
rẽ. Trong các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT3 (xử lý liều 30Gᵧ)
cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc biệt là dạng hoa H7 chỉ
xuất hiện ở công thӭc này.
3.4.3ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu x̩ tia gamma
nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai
đo̩n ngoài đồng ruộng
Kết quả nghiên cứu cho thấy việc xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ
gamma đã làm tĕng tỷ lệ biến dị lên rất nhiều so với xử lý riêng rẽ
EMS hoặc gamma. Tỷ lệ biến dị đạt cao nhất tại công thӭc CT5
(24,66%) và thấp nhất tại công thӭc CT1 (4,0%). Xử lý kết hợp EMS
và chiếu xạ gamma cho kết quả xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị
về hình thái lá, biến dị về phát triển chồi nách và biến dị về màu sắc
hoa). Tuy nhiên, trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 5
dạng (H1, H3, H4, H5 và H7), dạng H2 và H6 không xuất hiện. Kết
quả nghiên cứu cho thấy khi xử lý kết hợp làm xuất hiện thêm một
dạng mới (H3). Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dạng biến dị về
màu sắc tập chung chủ yếu ở dạng chồi A (dạng chồi bình thưӡng),

một số ít xuất hiện ở dạng chồi B, F, G, H. Dạng biến dị H5 chiếm tỷ
lệ cao ở dạng chồi F. Các dạng chồi D, E, L chỉ xuất hiện các biến dị
về hình thái lá và khả năng phát triển chồi nách mạnh.
3.4.4. Đặc điểm hình thái một số d̩ng biến dị về màu sắc hoa sau
xử lý giai đo̩n ngoài đồng ruộng
Về đặc điểm hình thái của một số dạng biến dị về màu sắc hoa ở
các chỉ tiêu khác nhau có sự khác nhau.
Trong các giai đoạn phát triển khác nhau, các cá thể trong các
19