Nghiên cứu xác định hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của một số dịch chiết vi tảo để phát triển kem làm trắng da tự nhiên (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
~~~~~***~~~~~

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
ENZYME TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT VI
TẢO ĐỂ PHÁT TRIỂN KEM LÀM TRẮNG DA TỰ NHIÊN

Sinh viên thực hiện

:

Trần Thị Thảo Vân

Mã sinh viên

:

637090

Lớp

:

K63CNSHA

Giảng viên hướng dẫn

:

TS. Nguyễn Thanh Hảo

Hà Nội, 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài “NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME
TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT VI TẢO ĐỂ PHÁT TRIỂN LÀM
KEM TRẮNG DA TỰ NHIÊN” là cơng trình nghiên cứu cá nhân của tơi trong thời
gian qua. Mọi số liệu được sử dụng, hình ảnh, kết quả nghiên cứu là do tơi tự tìm
hiểu, phân tích một cách khách quan, trung thực, có nguồn gốc rõ ràng và chưa
được cơng bố dưới bất kì hình thức nào.
Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài này đã được cảm ơn và các thơng
tin trích dẫn trong đề tài đều được ghi nguồn gốc rõ ràng.
Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước Học viện và Hội
đồng.
Hà Nội, ngày

8

tháng 3

Sinh viên

Trần Thị Thảo Vân

i

năm 2022


LỜI CẢM ƠN
Sau khi kết thúc thời gian thực tập tại Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ
Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam được sự quan tâm, chỉ bảo tận tình của
các Thầy giáo, Cơ giáo và cán bộ tại phịng thí nghiệm; cùng với sự cố gắng, nỗ lực
của bản thân, tôi đã rút ra những bài học kinh nghiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh
học cùng tồn thể các Thầy giáo, Cơ giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thức
chuyên ngành, kỹ năng làm việc trong phịng thí nghiệm và những bài học q báu
trong suốt thời gian học tập, rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thanh Hảo,
người thầy hướng dẫn tận tâm, giải đáp các thắc mắc câu hỏi cũng như giúp đỡ tơi
nhiệt tình trong q trình làm thí nghiệm và thu được kết quả tốt nhất.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô và cán bộ Viện nghiên cứu Vi
tảo và Dược mĩ phẩm đã tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư duy và cách làm việc
khoa học. Đó là nhứng góp ý hết sức q báu khơng chỉ trong q trình thực hiện
khóa luận tơt nghiệp mà cịn là hành trang tiếp bước cho tơi trong q trình học tập
và làm việc sau này.
Cuối cùng, với tất cả lịng kính trọng và biết ơn vơ hạn, tơi xin gửi lời cảm ơn
sâu sắc tới gia đình cùng những người thân,bạn bè và Thầy Cô đã luôn luôn động viên,
giúp đỡ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như trong
quá trình làm khóa luận.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 8

tháng 3

Sinh viên

Trần Thị Thảo Vân

ii

năm 2022


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii
DANH MỤC ĐỒ THỊ ............................................................................................. viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... ix
TÓM TẮT ...................................................................................................................x
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài .................................................................................2
1.2.1. Mục đích của đề tài ...........................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu của đề tài .............................................................................................2
1.3.Ý nghĩa đề tài ........................................................................................................2
1.3.1.Ý nghĩa khoa học ...............................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................2
2.1. Giới thiệu về enzyme tyrosinase ..........................................................................3
2.1.1. Khái niệm và nguồn gốc của enzyme tyrosinase trong tự nhiên ......................3
2.1.2.Vai trò và ứng dụng của enzyme tyrosinase ......................................................4
2.1.3. Sự hình thành enzyme tyrosinase trong tự nhiên và hình thành sắc tố da ở
người ..............................................................................................................6

2.1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme tyrosinase .........................................................8
2.1.5. Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme tyrosinase ..................8
2.2. Động học phản ứng enzyme tyrosinase .............................................................12
2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ chuyển hóa cơ
chất ...............................................................................................................12
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ...................................................13
2.3. Các chất ức chất enzyme tyrosinase...................................................................15

iii


2.4. Ứng dụng chất ức chế enzyme tyrosinase ..........................................................19
2.5. Các nghiên cứu về sàng lọc các chất ức chế enzyme tyrosinase .......................20
2.5.1. Nghiên cứu hoạt động ức chế enzyme tyrosinase từ tảo lam ..........................20
2.6.1. Khái quát chung về Spirulina platensis loại vi tảo có hoạt tính ức chế
tyrosinase......................................................................................................21
2.6.2. Hoạt chất sinh học có trong Spirulina platensis ..............................................21
2.7. Giới thiệu về một số phương pháp chiết ............................................................22
2.7.1. Phương pháp chiết Soxhlet .............................................................................23
2.7.2. Ngấm kiệt ........................................................................................................24
2.7.3. CO 2 tới hạn ......................................................................................................25
2.7.4. Lôi cuốn hơi nước ...........................................................................................26
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .............................................................................................27
3.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu...........................................................................27
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................27
3.1.2. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ .......................................................................27
3.1.3. Thiết bị ............................................................................................................27
3.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................27
3.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................28

3.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................28
3.3.1. Phương pháp tách chiết, tạo cao bằng kỹ thuật Soxhlet .................................28
3.3.2. Phương pháp thử hoạt tính enzyme tyrosinase ...............................................29
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................39
4.1. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả tách chiết .............................................39
4.2. Xác định động học enzyme tyrosinase ...............................................................42
4.2.1. Xác định nồng độ enzyme tối ưu cho phản ứng..............................................42
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất L-DOPA đến phản ứng ...............................43
4.2.3. Đánh giá khả năng phân giải arbutin của enzyme tyrosinase của dịch
chiết vi tảo ....................................................................................................45
4.3. Xác định động học enzyme tyrosinase khi có mặt dịch chiết tảo ......................46

iv


4.3.1. Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase của dịch chiết tảo trong
dung môi ethyl acetate .................................................................................46
4.3.2. Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase của dịch chiết tảo trong
dung mơi ethanol (96%) ...............................................................................49
4.3.3. Phân tích động học enzyme tyrosinase khi có chất ức chế tham gia ..............51
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................54
5.1. Kết luận ..............................................................................................................54
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................55

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha của đệm Potassium .......29

Bảng 3.2. Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha của hóa chấtL-DOPA
(3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) ..........................................................31
Bảng 3.3. Dãy nồng độ pha lỗng của acid arbutin ..................................................31
Bảng 3.4. Khối lượng, thể tích, nồng độ cần pha của hóa chất acid arbutin ............32
Bảng 3.5. Dãy nồng độ pha loãng từ dung dịch gốc .................................................34
Bảng 3.6. Thể tích hút của mỗi chất vào giếng trên bản ELISA ..............................36
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của dung môi và thời gian đến khối lượng cao chiết tảo
xoắn S.platensis 1 .........................................................................................39
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của dung môi và thời gian đến khối lượng cao chiết tảo
xoắn S.platensis 3 .........................................................................................40
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của dung môi và thời gian đến khối lượng cao chiết tảo
xoắn S.platensis 5 .........................................................................................40
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất L-DOPA đến phản ứng .........................44
Bảng 4.7. Bảng đo độ hấp thụ huỳnh quang của đối chứng (+) ...............................45
Bảng 4.8. Khả năng ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethyl acetate ..............47
Bảng 4.9. Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại dịch chiết tảo trong
dung môi ethyl acetate .................................................................................47
Bảng 4.10. Khả năng ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethanol (96%) .........49
Bảng 4.11. Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại dịch chiết tảo bằng
dung môi ethanol (96%) ...............................................................................50
Bảng 4.12. Tổng hợp Ic50, mức độ ức chế, Km và Vmax của ba dịch chiết tảo
trong 2 loại dung môi ...................................................................................53

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của enzyme tyrosinase ..................................................................3
Hình 2.2. Cơ chế tổng hợp melanin hình thành sắc tố da và vai trò của enzyme
tyrosinase xảy ra trong melanosome ..............................................................7

Hình 2.3. Sự hình thành các mảng sắc tố da dưới tác dụng của tia UV và
enzyme tyrosinase ..........................................................................................8
Hình 2.4. Sơ đồ chất kìm hãm cạnh tranh: cơ chất(S) và chất kìm hãm (I)................9
Hình 2.5. Lineweaver –Burk plot ..............................................................................10
Hình 2.6. Đồ thị đảo ngược kép mô tả các kiểu ức chế phản ứng enzyme ...............11
Hình 2.7. Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] .............................................13
Hình 2.8. Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất ...................................14
Hình 2.9. Tinh chất dưỡng trắng da Naris Nature Whitening Serum Nhật Bản .......20
Hình 2.10. Hình ảnh tảo S.Platensis 1, S.Platensis 3, S.Platensis 5 được chụp
dưới kính hiển vi...........................................................................................21
Hình 2.11. Hình ảnh dụng cụ Soxhlets .....................................................................23
Hình 2.12. Sơ đồ hoạt động bộ chiết CO 2 siêu tới hạn .............................................25
Hình 2.13. Sơ đồ hoạt động chưng cất lơi cuốn hơi nước.........................................26
Hình 3.1. Máy đọc miễn dịch ELISA MR-96A Mindray Xuất xứ: Trung Quốc
và giếng ELISA (96 giếng ) .........................................................................29
Hình 3.2. Hóa chất L-DOPA (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) 98%– Hãng
Sigma............................................................................................................30
Hình 3.3. Hóa chất acid arbutin 98% -Hãng Acros organics ....................................32
Hình 3.4. Enzyme mushroom tyrosinase – Hãng Sigma Aldrich - Mỹ ....................33
Hình 4.1. Chiết bột tảo bằng máy Soxhlet ................................................................41
Hình 4.2. Dịch chiết của ba loại tảo sau khi chiết Soxhlet .......................................41
Hình 4.3. Cao chiết ba loại tảo ..................................................................................42
Hình 4.4. Phản ứng trên đĩa microtiter ......................................................................42
Hình 4.5. Phản ứng trên đĩa microtiter ......................................................................44

vii


DANH MỤC ĐỒ THỊ
Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme khác nhau đến phản ứng enzyme

– cơ chất .......................................................................................................43
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc phản ứng ..............................44
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ arbutin đến khả năng ức chế enzyme
tyrosinase......................................................................................................46
Biểu đồ 4.4. Khả năng ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethyl acetate .........47
Biểu đồ 4.5. Khả năng ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethanol (96%) .......50
Biểu đồ 4.6. Mức độ ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethanol .....................50
Biểu đồ 4.7. Linweaver- Burk plots về hoạt động của tyrosinase với cơ chất LDOPA và nồng độ của dịch chiết tảo S. platensis 1 lần lượt là
50,200,400 và 800µg/ml. .............................................................................52
Biểu đồ 4.8. Linweaver- Burk plots về hoạt động của tyrosinase với cơ chất LDOPA và nồng độ của dịch chiết tảo S. platensis 3 lần lượt là
50,200,400 và 800µg/ml. .............................................................................52
Biểu đồ 4.9. Linweaver- Burk plots về hoạt động của tyrosinase với cơ chất LDOPA và nồng độ của dịch chiết tảo S. platensis 5 lần lượt là
50,200,400 và 800µg/ml. .............................................................................53

viii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

UVA

: Tia cực tím B

UVB

: Tia cực tím B

DNA

: Deoxyribonucleic acid

TYR

: Tyrosinase

L-DOPA

: 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine)

HQ

: Hydroquinone

DMSO

: Dimethylsulfoside

S. Ob

: Scenedesmus obliquus

ix


TĨM TẮT
Đề tài được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng hoạt tính ức chế
enzyme tyrosinase, khả năng chống oxy hóa của cao chiết từ bột tảo của 3 chủng
giống vi tảo Spirulina platensis: Spirulina platensis 1 (Sp1), Spirulina platensis 3
(Sp3), Spirulina platensis 5 (Sp5) từ đó làm tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng
cao chiết tảo trong việc phát triển kem làm trắng da tự nhiên. Cao chiết được chuẩn

bị từ dung môi chiết là ethanol (96%) và ethyl acetate bằng máy Soxhlet. Khả năng
ức chế enzyme tyrsoinase từ 3 mẫu dịch chiết vi tảo Spirulina platensis: S.platensis
1, S.platensis 3, S.platensis 5 là phản ứng cạnh tranh với phần trăm ức chế lần lượt
là: 57,2785%, 42,8072%, 53,1488% trên dung môi ethyl acetate lần lượt và
59,0564%, 46,855%, 51,1775% trên dung môi ethanol (96%). Kết quả của phản
ứng enzyme tyrosinase và cơ chất L-DOPA nồng độ 4mM với chất ức chế là dịch
chiết ba chủng vi tảo S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5 thu được giá trị của
lần lượt là:
Spirulina platensis 1: Km = 3,3 mM, Vmax = 0,12 µmol min-1
Spirulina platensis 3: Km = 2,3mM, Vmax = 0,33 µmol min-1
Spirulina platensis 5: Km = 2,6 mM, Vmax = 0,25 µmol min-1
Từ những kết quả thí nghiệm trên, khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ
dịch chiết tảo thì tảo Splatensis 1 có khả năng ức chế enzyme tyrsosinase cao nhất,
từ đó phát triển làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất các loại kem làm trắng da có
nguồn gốc tự nhiên.

x


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sắc tố tạo nên màu của da, tóc, màng nhầy và võng mạc của mắt. Sắc tố được
hình thành do sự lắng đọng của sắc tố melanin. Trong khi đó, melanin được sản
xuất bởi các tế bào melanocytes và sắc tố da có ở lớp đáy của thượng bì, các sắc tố
melanin có tác dụng chống lại ảnh hưởng của tia cực tím UV từ mặt trời. Sắc tố
melanin được chia thành hai loại: Eumelanin có màu đen hoặc nâu sẫm và được tìm
thấy ở những người có làn da xỉn, mờ (nó có tác dụng bảo vệ da tránh được tia UV).
Pheo-melanin: loại sắc tố này còn được gọi là melanin đỏ, thường xuất hiện ở
những người có làn da trắng hoặc tóc đỏ. Pheo-melanin khơng có tác dụng bảo vệ
chống lại tia UV. Ngược lại, sự tổng hợp của loại sắc tố này sẽ tạo ra các gốc tự do

tấn công da. Hai loại sắc tố melanin này thường xuất hiện ở tất cả các làn da của
mỗi người. Tuy nhiên, với từng cá nhân sẽ có tỷ lệ khác nhau. Số lượng hai loại sắc
tố này sẽ là yếu tố quyết định màu da tự nhiên của mỗi người, cũng như độ rám
nắng của họ khi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời.
Sắc tố da là kết quả của một quá trình hoạt động với bốn giai đoạn phức tạp.
Giai đoạn đầu tiên, tia cực tím và các chất trung gian sinh học (các chất được
tìm thấy trong tế bào da) kích thích q trình tạo sắc tố. Giai đoạn tiếp theo, melanin
được sản xuất bởi melanocytes. Giai đoạn thứ ba, melanin sản xuất bởi melanocytes
được phân phối qua hai lớp biểu bì da. Giai đoạn cuối cùng, sắc tố melanin di
chuyển đến bề mặt da thông qua sự đổi mới liên tục của các tế bào trong lớp biểu bì.
Nám da, sạm đen là các dấu hiệu bệnh lý do sự biểu hiện vượt mức melanin ở da.
Để khắc phục các triệu chứng này, người ta thường sử dụng các hóa chất có
khả năng ức chế enzyme tyrosinase tham gia sinh tổng hợp melanin. Tuy nhiên,
việc sử dụng các hóa chất này có thể gây ra tác dụng phụ cho người dùng, trong số
đó một số loại đã bị cấm sử dụng ở nhiều nước. Vậy nên những hoạt chất chiết xuất
từ dược liệu có khả năng ức chế tyrosinase được sử dụng bởi hiệu quả làm trắng da
và tính an toàn, vẫn là mối quan tâm của các ngành cơng nghệ dược phẩm và hóa
mỹ phẩm Các chiết xuất từ vi tảo như: Endarachne binghamiae, Schizymenia
dubyi, Ecklonia cava, Sargassum silquastrum, Scenedesmus obliquus đã chứng

1


minh hoạt động ức chế tyrosinase mạnh mẽ tương tự như acid arbutin đối chứng.
Việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới ức chế tyrosinase là một quy trình rất tốn
kém cả về thời gian và tiền bạc, tuy nhiên tỷ lệ thất bại lại tương đối cao. Do đó,
trong nghiên cứu này đã ứng dụng phương pháp tính tốn và mô phỏng phân tử (gọi
tắt là phương pháp invitro silico) trên ba chủng vi tảo Spirulina Platensis để sàng
lọc các hợp chất ức chế enzyme tyrosinase nhằm giảm thiểu chi phí và thời gian
tìm kiếm hợp chất tiềm năng ức chế enzyme tyrosinase.

1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục đích của đề tài
Khảo sát và đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại cao chiết
vi tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
Tách chiết thu cao chiết từ ba chủng vi tảo Spirulina platensis: S.platensis 1,
S.platensis 3, S.platensis 5
Nghiên cứu đánh giá thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ ba chủng vi
tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5.
1.3.Ý nghĩa đề tài
1.3.1.Ý nghĩa khoa học
Sàng lọc và phát hiện một số loại vi tảo có hoạt chất ức chế enzyme
tyrosinase từ đó làm cơ sơ thực hiện những nghiên cứu tiếp theo, ví dụ như làm kem
trắng sáng da.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Dựa vào kết qủa nghiên cứu để lựa chọn một số loại vi tảo làm nguyên liệu để sản
xuất các sản phẩm làm kem làm trắng da.

2


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về enzyme tyrosinase
2.1.1. Khái niệm và nguồn gốc của enzyme tyrosinase trong tự nhiên
Enzyme tyrosinase (EC 1.14.18.1) hay còn gọi là enzyme polyphenol
oxidase (PPO), là một enzyme monooxygenase có chứa đồng tham gia vào hai phản
ứng của q trình chuyển hóa melanin; một là hydroxyl hóa monophenol thành Odophenol, hai là oxi hóa O-diphenol thành O-quinon; sau đó, O-quinon tham gia
một loạt các phản ứng ức chế để tạo thành melanin. Các nghiên cứu khoa học đã
chứng minh sự hiện diện của enzyme chứa đồng trong các mô động vật và thực vật,
xúc tác bởi q trình oxy hóa từ tyrosine melanin và các sắc tố khác. Ở thực vật,

tyrosinase là enzyme chịu trách nhiệm tạo ra màu nâu không mong muốn khi để
thực vật trong khơng khí (ví dụ như khoai tây). Tyrosinase nằm trong các tế bào sắc
tố da, đặc biệt trong các melanosome. Gen TYR là gen chịu trách nhiệm mã hóa
tyrosinase ở người.

Hình 2.1. Cấu trúc của enzyme tyrosinase
(Ali Nawaz và cs. (2017)
Do có nhiều nguồn tyrosinase, đặc tính cấu trúc của enzyme rất đa dạng
trong tự nhiên cùng với sự phân bố của chúng trong các mô và tế bào, vì vậy khơng
có loại protein chung nào được quan sát thấy ở tất cả các loài. Sự khác biệt được
quan sát thấy trong cấu trúc chính, kích thước, ở các vị trí như vị trí hoạt động và
trong cơ chế glycosyl hóa. Điểm chung ở tất cả các tyrosinase là tâm đồng loại III
của chúng chứa hai nguyên tử đồng, mỗi nguyên tử được kết nối với sáu phân tử
histidine ở vị trí hoạt động của chúng.

3


Enzyme tyrosinase đã được phân lập và tinh chế từ các nguồn khác nhau
chẳng hạn như một số thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật,. Trong số các nguồn
tyrosinase khác nhau, tyrosinase từ nấm: Agaricus bisporus, Agaricus bisporus,
Neurospora crassa,

Amanita muscaria, Lentinula edodes, Aspergillus oryzae,

Portabella mushrooms, Pycnoporussanhuineus, Lentinula boryana (Ali Nawaz và
cs. (2017) là một nguồn chính và rẻ của enzyme tyrosinase với tính tương đồng và
tương đồng cao so với tyrosinase của người. Do những đặc tính tốt này, cấu trúc,
chức năng và đặc điểm sinh hóa của tyrosinase nấm đã được được nghiên cứu rộng
rãi như một hệ thống mơ hình để sàng lọc tyrosinase các chất ức chế và các nghiên

cứu tạo hắc tố, các phản ứng xúc tác bởi enzyme và các nghiên cứu cấu trúc chất ức
chế enzyme cho đến nay. Tyrosinase từ Agaricus bisporus với hai đơn vị con, nặng
và nhẹ, được phân lập đầu tiên bởi Bourquelot và Bertrand năm 1895. Nó có ba
miền và hai vị trí liên kết đồng liên kết với sáu gốc histidine và tương tác với oxy
phân tử trong vị trí hoạt động của tyrosinase, liên kết disulfua ổn định cấu trúc hơn.
Bên cạnh đó tyrosinase được thu nhận từ vi khuẩn: Rhizobium, Symbiobacterium
thermo-philum, Pseudomonas maltophilia, Sinorhizobium meliloti, Marinomonas
mediterra-nea, Thermomicrobium roseum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas
putida,

Streptomyces

castaneoglo-bisporus,

Ralstoniasolana

cearum,

Verrucomicrobium spino-sum (Ali Nawaz và cs. (2017) . Tyrosinase thu nhận từ
thực vật: Monastrell grape, táo, hoa hướng dương, Solanum melongena, Portulaca
grandiflora (Ali Nawaz và cs. (2017).
2.1.2.Vai trò và ứng dụng của enzyme tyrosinase
Ứng dụng y tế / lâm sàng
Tyrosinase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp melanin trong các
melanosome gây ra sắc tố da, tóc và mắt ở động vật có vú, giúp bảo vệ chống lại tia
UV. Đóng một phần quan trọng trong phản ứng miễn dịch và chữa lành vết thương
ở thực vật, động vật không xương sống khác nhau cũng như bọt biển. Tyrosinase có
ý nghĩa đối với sự hình thành bào tử, bảo vệ sự tồn tại của các mô sau một số tổn
thương hoặc tổn thương ở nấm, là một phần quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn.

4


Các ứng dụng y tế quan trọng bao gồm tổng hợp melanin cho mục đích điều trị, sản
xuất
L-DOPA, một loại thuốc được sử dụng để điều trị bệnh Parkinson, sản xuất
lincomycin kháng sinh và điều trị các bệnh thần kinh khác nhau tyrosinase nấm có
ứng dụng lâm sàng để điều trị bệnh bạch biến. Là tiền chất trong xét nghiệm miễn
dịch và vi phân giải kháng thể để sản xuất L-DOPA. (Ali Nawaz và cs. (2017)
Ngành công nghiệp thực phẩm
Tyrosianse tạo ra hydroxyl tyrosol có ứng dụng làm phụ gia thực phẩm. Điều
này được sử dụng trong các ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm, chẳng hạn như
để sản xuất theaflavin, một tập hợp các hợp chất trong trà đen có tác dụng chống
ung thư và các đặc tính khác. Các chất tạo màng sinh học đang được phát triển bởi
các ngành cơng nghiệp thực phẩm có các đặc tính cụ thể. Các đặc tính của thịt như
khả năng tạo gel, đặc tính kết cấu và liên kết là rất quan trọng để sản xuất các sản
phẩm thịt khác nhau Sự kết dính của các protein cơ gây ra bởi nhiệt rất nghiêm
trọng trong quá trình chế biến thịt vì nó quyết định kết cấu của sản phẩm cuối cùng.
Trong chế biến sữa để liên kết chéo các protein sữa khác nhau. Vì vậy, các tyrosinae
liên kết ngang được khai thác để điều chỉnh các đặc tính gel hóa này. Các tyrosinase
như transglutaminase, laccase và tyrosinase gần đây đã được sử dụng để kiểm tra
protein thịt lợn và gà (Ali Nawaz và cs. (2017).
Khử nhiễm phenol bằng tyrosinase
Các ngành công nghiệp khác nhau như giấy, hóa chất, dệt may, khai thác mỏ,
than đá và dầu mỏ tạo ra nước thải bao gồm các phenol và các dẫn xuất của nó.
Tyrosinase có khả năng oxy hóa phenol thành các chất khơng hịa tan có thể được
loại bỏ bằng cách kết tủa hoặc lọc chúng. Các hợp chất phenolic có trong dung dịch
nước có thể được loại bỏ bằng cách hấp phụ chúng vào than hoạt tính dạng hạt . Vì
tyrosinase là chất khử độc của xenobiotics có cấu trúc phenol, do đó trong số đó,
chlorophenol là chất gây ơ nhiễm cụ thể có trong nước thải. Các ngành cơng nghiệp

như da, dệt, dược phẩm và giấy, tạo ra các loại thuốc nhuộm khác nhau, chủ yếu là
thuốc nhuộm azo, là chất nguy hiểm cho môi trường. Trong những điều kiện nhất
định, chúng bị vi khuẩn khử màu và sau đó bị phân hủy bởi tyrosinase. Cơ chế như

5


chất nhũ hóa và sản xuất thực phẩm ít chất béo hơn và ít calo hơn. Làm cảm biến
sinh học để phát hiện hợp chất phenolic độc hại.
Các polyme tự nhiên có thể được liên kết chéo để tạo ra các polyme mới
bằng cách sử dụng tyrosinase của nấm. Chúng hình thành các liên kết chéo trên cơ
sở khả năng tiếp cận và sự phong phú của protein mục tiêu. Những thay đổi trong
các đặc tính là rất quan trọng để sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau như chế biến
thực phẩm. Tyrosinase có thể được sử dụng để ghép các hợp chất cụ thể với các
chất tạo màng sinh học và tạo ra các sản phẩm sinh học mới. Tyrosinase cung cấp
một phương pháp dễ dàng trong việc chuyển đổi các sản phẩm phụ của quá trình
chế biến thực phẩm thành các mặt hàng có lợi cho mơi trường với các đặc tính chức
năng có giá trị và chuyển đổi L –tyrosine thành L-DOPA và sau đó thành odopaquinone liên quan đến việc áp dụng tyrosinase. (Ali Nawaz và cs. 2017)
2.1.3. Sự hình thành enzyme tyrosinase trong tự nhiên và hình thành sắc tố da
ở người
Sắc tố da Melanin là chất được bắt nguồn từ tyrosinase, một acid amin nằm
trong tế bào sắc số Melanocyte ở tầng thượng bì của da, quy định màu sắc của da,
tóc và mắt của cơ thể con người với vai trò quan trọng là bảo vệ da khỏi tác hại của
các yếu tố bên ngoài bao gồm tia UV trong ánh nắng mặt trời, từ đó giảm thiểu các
nguy hiểm như tổn thương cấu trúc DNA, ung thư da, tuy nhiên đây cũng là nguyên
nhân gây ra nhứng vấn đề nám, sạm, thâm trên da.
Quy trình hình thành Melanin được chia làm ba bước, trong đó enzyme
tyrosinase đóng vai trị hết sức quan trọng.
Bước 1: Enzyme tyrosinase được kích hoạt dưới tác dụng của ánh nắng mặt
trời, tổn thương vật lý, hormone, stress.

Bước 2: Sau khi enzyme Tyrosinase được kích hoạt, nó sẽ kích hoạt q
trình sinh sản melanin trong melanosome – một bộ phận của tế bào sắc tố qua 3
phản ứng hóa học:
Acid amin tyrosine⟶DOPA⟶Dopaquinone⟶Melanin (Pheo-melanin hay
EU-melanin).
Bước 3: Melanin từ melanasome qua tế bào keratinocyce và đưa lên trên bề
mặt da, tạo thành những vùng sạm, nám hoặc vết thâm.

6


Sự hình thành melanin cịn chịu ảnh hưởng của yếu tố nội tiết và thần kinh, do đó sự
hình thành sắc tố da phụ thuộc vào cơ địa của mỗi người và tùy thuộc vào điều kiện
sinh lý cũng như nội tiết của người đó.

Hình 2.2. Cơ chế tổng hợp melanin hình thành sắc tố da và vai trị của enzyme
tyrosinase xảy ra trong melanosome
(Hearing V. J, 2011)
Như vậy, sự hình thành các vết nám hay tàn nhang là do sự tích lũy của
melanin là sản phẩm chuyển hóa xúc tác bởi enzym tyrosinase và có sự tham gia
của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời. Tia tử ngoại, tia UV trong ánh nắng mặt
trời sẽ kích hoạt các tế bào melanocyte dẫn đến tăng sản xuất melanin và hậu quả
tạo ra các vến nám, tàn nhang trên da. Khi lượng melanin tăng quá mức sẽ tạo ra
các vùng tích lũy melanin khơng đều gây ra hiện tượng da không đồng nhất màu
làm ảnh hưởng đến thẩm mĩ. Việc ngăn chặn hoặc loại bỏ melanin tích lũy dưới da
sẽ giúp làm cho da dần trở lại sáng hơn hay cịn gọi là q trình làm trắng sáng da.
Cơ chế này khác với cách làm trắng da nhanh chóng bằng cách sử dụng các loại
kem có tính axit mạnh làm tẩy lột da nhưng khơng có tác dụng ức chế sự hình thành
melanin từ bên trong nên lớp da mới hình thành lại tiếp tục bị nám sau 1 thời gian.
Nếu lạm dụng các kem làm sáng da theo tính chất trên sau một thời gian sẽ làm da

bị hỏng, lão hóa khơng thể phục hồi hoặc tạo ra sự rối loạn tổng hợp melanin giữa
các lớp da dẫn đến hiện tượng tàn nhang hoặc loang lổ màu trên da rất khó điều trị

7


và phục hồi.

Hình 2.3. Sự hình thành các mảng sắc tố da dưới tác dụng của tia UV và
enzyme tyrosinase
(Jean-Yves Berthon và cs, 2017)
2.1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme tyrosinase
Cơ chế hoạt động của enzyme tyrosianse gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn đầu : enzyme tyrosinase kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo
thành phức hợp enzyme – cơ chất (E-S) khơng bền nhờ hình thành liên kết đặc biệt
là liên kết hydrogen. Sự liên kết này làm thay đổi cấu hình khơng gian của cơ chất
làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở
nên linh hoạt hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng.
Giai đoạn tiếp theo xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ
các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
Giai đoạn cuối cùng enzyme tyrosinase xúc tác lên cơ chất tạo thành sản
phẩm, enzyme tyrosinase được giải phóng dưới dạng tự do.
2.1.5. Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme tyrosinase
Chất ức chế enzyme hay chất kìm hãm enzyme là phân tử liên kế với enzyme
và làm giảm hoạt độ của enzyme. Tốc độ của phản ứng enzyme sẽ bị giảm bởi tác
các tác dụng của các chất ức chế đặc hiệu – chất ức chế đặc hiệu kết hợp với
enzyme và ngăn cản enzyme kết hợp với cơ chất một cách bình thường.
Các dạng chất kìm hãm thuận nghịch

8

Chất kìm hãm thuận nghịch liên kết với các enzyme bằng các liên kết (tương
tác) phi đồng hóa trị như liên kết hydro, tương tác hydrophobic và liên kết ion. Các
liên kết yếu giữa chất kìm hãm và trung tâm hoạt động của enzyme tạo nên kiểu liên
kết đặc thù. So với cơ chất và chất kìm hãm khơng thuận nghịch, nói chung các chất
kìm hãm thuận nghịch khơng có phản ứng hóa học với enzyme và có thể loại bỏ dễ
dàng bởi chất pha loãng hoặc chất thẩm tách. Có 3 kiểu ức chế thuận nghịch mang
các đặc điểm động học khác nhau. Đó là kiểu ức chế cạnh tranh (competitive
inhibition và hai kiểu ức chế không cạnh tranh (noncompetitive và uncompetitive
inhibition).
Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
Các chất ức chế cạnh tranh có thể kết hợp thuận nghịch với trung tâm hoạt
động của enzyme và cạnh tranh với cơ chất để lấy trung tâm hoạt động. Khi trung
tâm hoạt động bị chất ức chế chiếm giữ, không thể kết hợp với cơ chất. Sự kết hợp
của chất ức chế cạnh tranh I với enzyme E có thể được mơ tả giống sự kết hợp giữa
enzyme và cơ chất, mặc dù chất ức chế khơng chuyển hóa thành sản phẩm:
E + I  EI
Hằng số phân ly Ki của phức hệ EI là:
Ki =

Hình 2.4. Sơ đồ chất kìm hãm cạnh tranh: cơ chất(S) và chất kìm hãm (I)
(GS.TS. Mai Xuân Lương, 2005)

9


Đặc điểm của ức chế cạnh tranh là có cùng điểm cắt trục tung (1/V max ) như
phản ứng không ức chế nhưng độ nghiêng thì khác với phản ứng không ức chế bởi
giá trị 1+ [I]/K m

V0 =
=

+

Là đồ thị có dạng tương tự: y = ax+ b
Trong đó: y là
x là

Hình 2.5. Lineweaver –Burk plot
(GS.TS. Mai Xuân Lương, 2005)

10


Đồ thị trong hình dưới đây cho thấy rõ khi nồng độ của S cao thì phản ứng ít
bị ức chế, ngược lại khi nồng độ của S giảm thì mức độ ức chế tăng lên cùng với
các giá trị [I]/ [S] và K im .

Hình 2.6. Đồ thị đảo ngược kép mô tả các kiểu ức chế phản ứng enzyme
(GS.TS. Mai Xuân Lương, 2005)
(a): ức chế competive, (b): ức chế uncompetitive, (c): ức chế noncompetitive.
K m và V max được xác định từ độ dốc và các điểm cắt của các phản ứng khơng ức
chế, cịn K i – từ độ dốc và/hoặc chỗ cắt của các phản ứng bị ức chế.
Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I ( noncompetitive inhibition )
Trong trường hợp này khơng có mối quan hệ giữa mức độ ức chế với nồng
độ cơ chất. Ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế. Trái ngược với chất
ức chế cạnh tranh, người ta cho rằng sự hình thành EI xảy ra tại nơi không phải để
enzyme tiếp xúc với cơ chất.

11


E + I  EI
ES + I  ESI

Và

Cả EI và ESI đều là những phức hệ không hoạt động. Có hai hằng số phân ly:
K i EI =
Và K i ESI =
Các chất ức chế noncompetitive không phản ứng tại trung tâm hoạt động mà
tại một nơi nào đó trên phân tử enzyme dẫn đến sự biến đổi đáng kể hình dạng của
enzyme để ngăn cản trung tâm hoạt động kết hợp một cách bình thường với cơ chất.
Nhiều hợp chất kết hợp không thuận nghịch với enzyme và tạo ra các dẫn xuất
đồng hóa trị tại trung tâm hoạt động hay tại một bộ phận khác của phân tử không
tham gia trực tiếp trong tương tác enzyme - cơ chất. Đây không phải là chất ức chế
noncompetitive với ý nghĩa chặt chẽ vì chúng ức chế enzyme một cách khơng thuận
nghịch. Ví dụ papain chưa một nhóm thyol duy nhất tại trung tâm hoạt động, nó
phản ứng rất nhanh chóng với iodoacetate để tạo ra nhóm S-carboxylmethylcystein.
Mức độ ức chế papain bởi chất ức chế này tỷ lệ thuận với mức độ S-carboxymethyl
hóa. Iodoacetate cũng ức chế một số enzyme có chứa nhóm thyol khơng phải tại
trung tâm hoạt động mà làm suy yếu hoạt tính xúc tác do làm biến đổi cấu trúc của
phân tử enzyme.
Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II (uncompetitive inhibition).
Kiểu ức chế này xảy ra khi một chất ức chế chỉ kết hợp thuận nghịch với phức
hệ ES để tạo ra ESI mà sau đó khơng thể tạo ra sản phẩm (các chất ức chế
noncompetitive có thể kết hợp với cả enzyme tự do và với phức hệ ES) như vậy:
Ki =
2.2. Động học phản ứng enzyme tyrosinase

2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ chuyển hóa cơ
chất
Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụ
thuộc vào [E], V= K[E] có dạng y=ax. Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận
tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác.

12


Có nhiều trường hợp trong mơi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì vận
tốc phản ứng do enzyme xúc tác khơng phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.

Hình 2.7. Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]
(GS.TS. Mai Xuân Lương, 2005)
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất chỉ một cơ chất với:
E: Nồng độ enzyme tyrosinase
S: Cơ chất
k 1 : Tốc độ chuyển hóa tạo ra phúc chất (ES) và ngược lại
k 2 : Tốc độ chuyển hóa phúc chất (ES) tạo ra (E) và (P)
(P): Sản phẩm tạo ra

Gọi v 1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
Gọi V -1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S.
Gọi V 2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
V1 =

k 1 [E][S]

V -1 = k -1 [ES]

V 2 = k 2 [ES]
Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:
k -1 [ES]+k 2 [ES] = k 1 [E][S]
(k -1 +k 2 )[ES] = k +1 [E][S] (2)
Gọi E 0 là nồng độ ban đầu:
[E 0 ]=[E]+[ES]=>[E]=[E 0 ]-[ES] (3)

13


Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có: (k -1 +k 2 )[ES] = k 1 ([E 0 ]-[ES]) [S]
[ES] =
Nếu đặt Km= (k- 1 +k 2 )/ k 1
(Km: gọi là hằng số Michelis Menten)
Ta có: [ES] = [E0][S]/ Km+[S]
Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là:
V = k 2 [ES]
Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:
V=

(4)

Từ đây ta thấy, nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn.
Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất, nghĩa là:
V max = k 2 [E 0 ]
Thay vào phương trình (4) ta được:
V= Vmax

(5)

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten
Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme. Km đặc trưng cho
ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ
chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn.

Hình 2.8. Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất
(GS.TS. Mai Xuân Lương, 2005)

14