nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng glycerol trong công nghệ cấy truyền phôi

Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng glycerol
trong công nghệ cấy truyền phôi

Hoàng Kim Giao, Lu Công Khánh, Nguyễn Thị Thoa
Nguyễn Thị Kim Anh, Nguyễn Văn Lý, Phan Lê Sơn
Bộ môn Cấy truyền phôi


1. Đặt vấn đề

Kỹ thuật gây siêu bài non, tạo phôi tơi là vô cùng quan trọng, song chỉ
đáp ứng một phần nào công nghệ cấy truyền phôi, vì phôi tơi chỉ sử dụng để cấy
cho cái nhận phôi đạt hiệu quả trong vòng 4-6 giờ kể từ khi phôi đợc lấy ra khỏi tử
cung bò cái cho phôi. Mặt khác khi có nhiều cái nhận phôi, có khi lại thiếu phôi,
ngợc lại, ít cái nhận lại thừa phôi. Hơn nữa, kỹ thuật gây siêu bài non một mình
không đáp ứng đợc tính chất thơng mại hoá của công nghệ này, cũng nh việc bảo
tồn quĩ gen động vật quí hiếm có nguy cơ bị diệt chủng.

Để khắc phục, các nhà khoa học đ tìm ra phơng pháp đông lạnh phôi để
khắc phục nhợc điểm của công nghệ phôi tơi và cũng làm tăng khả năng ứng
dụng của công nghệ phôi mà vẫn bảo đảm tỷ lệ phôi sống >80% sau giải đông và
tỷ lệ cấy phôi đông lạnh đạt 45-50% có chửa.

Xuất phát từ lý do trên, chúng tôI đ tiến hành nghiên cứu ứng dụng đông
lạnh phôi bằng glycerol.

2. Tình hình nghiên cứu trớc đây

Wilmut và Kowon (1973) đ đông lạnh phôi bò trong dung dịch PBS có
chứa 2M Dimetyl Sunfoxid (DMSO) giảm nhiệt độ 0,2
0

C/phút, giải đông nhanh và
cấy phôi có chửa.

Vào những năm sau, với những nghiên cứu của Willadsen và ctv (1977-
1978); Trouson và ctv (1978); Lehsen và ctv (1978); Massip và ctv (1979);
Schneider và ctv (1980), đ đổi mới phơng pháp đông lạnh theo chiều hớng giảm
cân bằmg với các chất bảo vệ lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và giải đông mà
vẫn bảo tồn sức sống của phôi và đ thu đợc kết quả tốt ở bò và chuột. Ngày nay
việc đơn giản hoá kỹ thuật đông lạnh và giải đông với phơng pháp một bớc (one
step method) do Leibo và ctv (1982) và Reinard và ctv (1982) đ thực sự thúc đẩy
việc sử dụng phôi đông lạnh với sức sống của phôi trên 80% và tỷ lệ thụ thai đạt
50-60%.

ở nớc ta, từ năm 1984 đ có những công trình nghiên cứu về đông lạnh
phôi (Nguyên và ctv, 1984) và từ năm 1984, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
đông lạnh và cấy phôi đông lạnh đ thu đợc các kết quả bớc đầu, tỷ lệ thụ thai đạt
40-45% (Hoàng Kim Giao và ctv, 1997), nhng cha có công trình nào nghiên cứu
ứng dụng phôi bò bằng glycerol.

3. Mục tiêu của đề tài

ứng dụng qui trình đông lạnh phôi bò đạt hiệu quả cao trong điều kiện chăn
nuôi ở Việt Nam.

4. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

4.1. Đối tợng
Phôi bò ở giai đoạn 7 ngày tuổi

4.2. Phơng pháp nghiên cứu

Tác động của sự hạ nhiệt độ và tăng nhiệt độ trong quá trình đông lạnh hoặc
giải đông đ làm giảm sức sống của phôi sau bảo quản, dẫn đến tỷ lệ thụ thai thấp.
Vì vậy phải chọn các phơng pháp thích hợp, đó là:

4.2.1. Trạng thái phát triển của phôi:
Chọn trạng thái phát triển của phôi thích hợp là một biện pháp rất quan
trọng để có tỷ lệ sống cao sau đông lạnh và giải đông. Những nghiên cứu trên phôi
chuột 1 tế bào cho đến phôi nang đợc đông lạnh 196
0
C của Whittingham (1972)
và Willadsen (1980) làm cơ sở ban đầu để nghiên cứu ứng dụng ở các loài gia súc
khác.

Phôi bò ở trạng thái 8-16 tế bào (Wilmut và ctv, 1975) và 16-24 tế bào
(Trouson và ctv, 1976) giảm sức sống ở 0
0
C, trong khi ở trạng thái cao hơn phôi
nang - với 0
0
C sức sống duy trì đợc 2 ngày (Trouson và ctv, 1976; Bondurant và
ctv, 1982).

Bảng1. Trạng thái phát triển phôi ở nhiệt độ thấp (Willasen, 1976)

Trạng thái phát triển lúc thu phôi

Ngày 3
(8-16 tế bào)

Ngày 5

(phôi dâu)
Ngày 6
(Phôi nang sớm)

Ngày 7
(Phôi nang)
Nhiệt độ 18
0
C 0
0
C 0
0
C -196
0
C
Thời gian 6
h
2 phút 30 phút

Tỷ lệ phát triển %

9/22-40,0 8/21-38,0 13/14-92,0 20/51-54,0


Sự khác nhau về sự sống của trạng thái phát triển có liên quan đến sự khác
nhau về kích thớc tế bào trong quá trình phát triển, đến sự biến đổi tính thẩm thấu
này với nhiệt độ. Phôi nang (6-8 ngày) có màng trong suốt, có sức kháng cơ học
với biến đổi nhiệt độ tốt hơn và hạn chế tổn hại hơn. Polge và ctv (1974) cho rằng
ở bò, phôi nang nên chọn để đông lạnh và giải đông; phôi gin nở (expanded
blastocyst) và phôi nang mở (hatched blastocyst) có khả năng nhạy cảm hơn phôi

dâu muộn và phôi dâu sớm vì tầm vóc của phôi (đĩa phôi và xoang phôi phát triển
hơn (Willadsen, 1980). Tuy nhiên sức đề kháng cơ học khi xoang phôi lớn sẽ kém
hơn với biến đổi nhiệt độ, tuy nhiên tỷ lệ tế bào sống sau đông lạnh cao nên khả
năng phục hồi tốt hơn. Vì vậy, trên thực tế sản xuất ngời ta chọn phôi dâu và phôi
nang sớm để đông lạnh là phù hợp hơn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi qua
đánh giá hình thái của phôi dâu và phôi nang sau giải đông đạt loại 1 và 2 là 82%
và 83% là phù hợp với yêu cầu đ đề ra.

4.2.2. Chất lợng phôi
Chất lợng phôi có vị trí quan trọng quyết định khả năng sống khi đông lạnh
và giải đông. Thông thờng, ở bất kỳ trạng thái phát triển nào, trong quá trình đông
lạnh và giải đông chất lợng phôi ít nhiều đều bị giảm. Phôi bò sau khi 4 16 tế
bào sau khi làm lạnh xuống 4
o
C vì cấu trúc không gian của tế bào bị sắp sếp lại,
mất đi sự đồng chất của một số thể vùi hình túi (inclusion vesiculaire) trong
nguyên sinh chất (Mohr và ctv, 1981) ở phôi nang bò 7 8 ngày tuổi, % diện tích
thể hạt xoang nớc so với thể hạt đối lập trong nguyên sinh chất (mitochondrie
vacuolise, mitochondrie courtaste) ở đông lạnh chiếm là 43, không đông lạnh là
37. (Debem A.R và ctv, 1983). Những biến đổi này làm giảm sức sống của phôi và
tỷ lệ thụ thai. Vì vậy cần phải chọn lọc nghiêm khắc chất lợng phôi trớc khi đông
lạnh để tránh mất mát trớc khi giải đông. Một số tác giả (Lindner và Wright, 1983)
cho rằng chất lợng phôi quan trọng hơn trạng thái phát triển, tuy nhiên cần thiết
cần quan tâm cả 2 biện pháp này. Trong thực tế sản xuất việc đánh giá phân loại 2
chỉ tiêu này. Trong thực tế sản xuất việc đánh giá phân loại 2 chỉ tiêu này thờng
tiến hành song song. Nói chung chất lợng phôi trớc đông lạnh tốt đảm bảo tỷ lệ
phôi tốt sau đông lạnh và tỷ lệ có chửa cao, tuy nhiên việc đánh giá chủ yếu dựa
vào hình thái học nên vẫn có thể bị sai sót đáng kể vì khó phát hiện những biến đổi
vì cấu trúc của tế bào phôi.

4.2.3. Bổ sung chất bảo vệ lạnh (Cryoprotector)
Trong quá trình đông lạnh, phôi chỉ có khả năng sống đợc nếu trong môi tr-
ờng có chất bảo vệ lạnh (cryoprotector) thích hợp. Các chất có tác dụng tơng tự
là: Dimethylsulfoxid (DMSO), glycerol, một số glycol (ethylenglycol), sucrose.
Tuy nhiên cơ chế chính xác về sự bảo vệ lạnh đối với tế bào còn cha hiểu biết hết.
Moore và Bilton (1977) đ công nhận glycerol 1,4M thu đợc phôi có sức sống cao
khi đông lạnh với tốc độ 0,3
0
C/phút đến -30-35
0
C và sau đó cho vào Nitơ lỏng
196
0
C để bảo quản. Ngày nay glycerol đợc sử dụng phổ biến để bảo vệ lạnh phôi
và trớc khi hạ nhiệt độ phải cho phôi cân bằng với dung dịch glycérol với nồng độ
tăng dần. Renard và ctv (1986) đ áp dụng 6 bớc với nồng độ 0,25M; 0,5M;
0,75M; 1,0M; 1,25M; 1,5M cách nhau 10 phút và giữ phôI ở nồng độ cuối cùng.
Về sau Kennedy và ctv (1983) đ áp dụng cân bằng với 0,47M; 0,93M; 1,4M và
0,33M; 0,67M; 1,0M và đ thu đợc tỷ lệ phôi sống cao hơn. Leibo và ctv (1983) đ
đông lạnh phôi bò trong cọng rạ 0,25ml và chỉ cân bằng một bớc (glycerol 1,4M)
và đông nhanh ở bảo tồn ôn (bain Marie) nhiệt độ 37
0
C và sau đó rửa phôi vào
dung dịch PBS có 0,25M sucrose. Renard và ctv (1983) có phơng pháp cải tiến
hơn là cân bằng phôi 1 bớc với 1,4M glycerol trong cọng rạ Cassou nhng trong
cọng ra có môi trờng PBS + 0,25M sucrose và môi trờng B
2
và cấy phôi ngay sau
khi giải đông ở bảo ôn 37
0

C và không cần phân loại. Tuy nhiên phơng pháp này
có thể giảm tỷ lệ chửa đến 10%, bởi vì ngời ta chứng minh khi không đông lạnh
phôi bò tổn hại 10-15%.

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng glycerol và sucrose.

4.2. Phơng pháp đông lạnh
Có hai phơng pháp đông lạnh, đó là phơng pháp nhanh và phơng pháp
chậm. Trong thí nghiệm này chúng tối dùng phơng pháp chậm của Australia.
Chúng tôi đông lạnh đợc 42 phôi và đ giải đông và cấy số phôi đ đợc nghiên cứu.
Phơng pháp đông lạnh chậm theo qui trình của Australia: máy CL-2000 theo sơ
đồ sau:


S¬ ®å 1. Ch−¬ng tr×nh ®«ng l¹nh ph«i bß

NhiÖt ®é (0C)

-5

















-10

-15

-20

-25

-30

-35

0

15

30

45

60

75

90 Thời
gian
(phút)



4.3. Phơng pháp giải đông và pha loãng chất bảo vệ lạnh
Về nguyên tắc phơng pháp giả đông và pha long chất bảo vệ lạnh phụ
thuộc vào phơng pháp đông lạnh và bổ sung chất bảo vệ lạnh, thông thờng có quá
trình ngợc lại với đông lạnh và kết thúc bảo quản. Về mặt sinh học, giải đông là
làm cho phôi chuyển từ trạng thái tiềm sinh lạnh ở nhiệt độ môi trờng cực thấp (-
196
0
C) sang trạng thái sinh học của nhiệt độ môi trờng 37
0
C. Vì vậy, sức sống của
phôi còn có thể bị mất đi ở mỗi giai đoạn này, thậm chí phôi còn có thể bị phá huỷ
cấu trúc, biến dạng hình thái.

Phơng pháp cơ bản để giải đông gồm có phơng pháp chậm và phơng
pháp nhanh. Phơng pháp chậm đợc tiến hành nh sau: cọng rạ phôi đợc đa vào
thiết bị đông lạnh để nâng nhiệt độ bằng với nhiệt độ môi trờng (37
0
C), tốc độ giải
đông thờng là 4
0
C/phút đến 25
0
C/phút và rút các chất bảo vệ lạnh bằng cách rửa
phôi vào dung dịch pha long với 4-6 nồng độ là 1,5M; 1,25M; 1M; 0,75M; 0,5M;

0,25M (Tervit và ctv, 1984). Nhng phơng pháp này khi thực hiện trong đIều kiện
sản xuất thờng gặp nhiều khó khăn, có nhiều biến động lớn. Phơng pháp giải
đông nhanh một bớc, cọng rạ chứa phôI đợc đa vào nhiệt độ 37
0
C trong 10 giây với
tốc độ 360
0
C/phút; và các dung dịch bảo vệ lạnh có trong cộng rạ để giải đông
giống nh sử dụng cọng rạ dẫn tinh. Solano và ctv (1987) đ đạt tỷ lệ sống của phôi
89,5% và 87,4% khi sử dụng phơng pháp giải đông một bớc với dung dịch
sucrose 0,25M (A) và 4 bớc với nồng độ glycerol (B) 1,5M; 1,0M 0,75M và 0,35M
để giải đông.

Bảng 2. So sánh kết quả phôi nuôi sống (2-4 giờ) của hai phơng pháp

Phơng pháp A Phơng pháp B Chỉ tiêu
Phôi
dâu
Phôi
nang
Tổng số

Phôi
dâu
Phôi
nang
Tổng
số
Số phôi sống/số
phôi giải đông

42/48

77/85

119/133

42/50

41/50

83/95

Tỷ lệ phôi sống
(%)
87,5 70,5 89,5 84,0 91,1 87,4


Renard và các cộng tác viên đ thực hiện đông lạnh và giải đông trong cọng
rạ chỉ một bớc đ đạt tỷ lệ chửa xấp xỉ 50%.

Trên đây là những biện pháp chủ yếu, ngoài ra các thao tác nhằm đảm bảo
khoảng không khí ngăn cách phôi với 2 đầu cọng rạ và có dung tích thích hợp cũng
có tác dụng giữ phôi an toàn khi đông lạnh và giải đông

Chúng tôi dùng phơng pháp giải đông của Australia nh sau: cọng rạ có
chứa phôi đợc đa vào cốc nớc 30-37
0
C trong 2-3 giây và rút các chất bảo vệ lạnh
bằng cách rửa phôi qua ba bớc.

Bớc 1: Môi trờng I gồm PBS + 20% HTB + 6% v/v Glycerol + 10,3% w/v
sucrose. Thời gian 5 phút

Bớc 2: Môi trờng II gồm PBS + 20% HTB + 3 %v/v glycerol + 10,3% w/v
sucrose. Thời gian 5 phút

Bớc 3: Môi trờng III gồm PBS + 20 % HTB +10,3% w/v sucrose. Thời gian
5 phút

Sau đó chuyển sang môi trờng nuôi phôi trong thời gian 5 phút, rồi hút phôi
lên cọng ra. Sau đó đem đi cấy cho bò nhận phôi.

5. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm cấy truyền phôi-Viện chăn nuôi, Trại bò Cầu
diễn, Phù

Đổng, Ba Vì, Một số nông trại ở huyện Đông Anh, Hà Nội, TP Hồ Chí
Minh.

- Thời gian nghiên cứu: 1999-2001

6. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

6.1. Chất lợng phôi bò trớc đông lạnh
Bảng 3. Chất lợng phôi thu đợc

Số phôi

Chỉ tiêu theo dõi

n

%

Tổng số phôI và trứng thu đợc

Số trứng không thụ tinh (n)

Số phôi chậm phát triển (n)

Số phôi thoái hoá (n)

Số phôi có khả năng cấy

62

4

2

6

50

100

6,45

3,23

9,68

80,64



Qua bảng 3 nhận thấy tổng số phôi thu đợc là 62 (100%) trong đó có 6,45%
phôi không thụ tinh; 3,23 số phôi chậm phát triển và 9,68% số phôi thoái hoá. Số
phôi có khả năng cấy là 80,64%.

- Giai đoạn phát triển của phôi ảnh hởng rất lớn đến chất lợng của phôi khi
đông lạnh. Vì vậy chúng tôi đánh giá chất lợng của phôi theo giai đoạn phát triển
của chúng ở bảng 4.

Bảng 4. Đánh giá chất lợng phôi theo giai đoạn phát triển

Số phôi



Chỉ tiêu theo dõi

n

%

Tổng số phôi và trứng thu đợc

Phôi kém chất lợng

Phôi có khả năng cấy

Trong đó: Phôi dâu

phôi nang

62

12

50

28

22

100

19,35

80,64

56,00

44,00



- Tỉ lệ phôi có khả năng cấy là 80,64%. Trong đó phôi dâu chiếm 56%, phôi

nang chiếm 44%.

- Ngoài đánh giá phân loại phôi theo giai đoạn phát triển, chúng tôi còn
phân loại phôi theo giai đoạn tốt xấu, A, B, C. Thờng ngời ta chỉ đông lạnh phôi
loại A, B. Kết quả phân loại đợc trình bày ở bảng 5.
Bảng 5
. Phân loại chất lợng phôi theo A, B, C

Số phôi



Chỉ tiêu

N

%

Phôi để đông lạnh

Phôi loại A

Phôi loại B

Phôi không có khả năng đông lạnh

Phôi loại C

42

24

18



8

67,47

57,14

42,86



12,90



Qua bảng 5 cho thấy tỷ lệ phôi loại A, B đạt 67,47% là có khả năng đông
lạnh. Còn loại C chiếm 12,9% không nên đông lạnh.
6.2. Chất lợng phôi bò sau giải đông
Bảng 6. Đánh giá chất lợng phôi sau giải đông theo giai đoạn phát triển

Tổng số

Phôi dâu

Phôi nang

Chỉ tiêu

n

%

n

%

n

%

Số phôi giải đông

Số phôi còn lại sau giải đông

Số phôi chết, thoái hoá

Số phôi có khả năng cấy

42

42

8

34

100

100

19,05

80,95

24

24

5

19

57,4

57,4

11,9

52,24

18

18

3

15

42,86

42,86

7,75

28,71



Nh vậy, khả năng sống của phôi trong quá trình đông lạnh là tốt, 80,95%.

Bảng 7. Đánh giá chất lợng phôi sau giải đông theo mức độ tốt xấu

Phôi sau giải đông



Phôi trớc giải đông

Phôi chết, thoái hoá

Phôi có thể cấy

A

B



A

B



A

B

C

Phôi dâu



Phôi
nang

23

(100)



19

(100)

12

(52)



12

(63,15)

11

(47,83)



7

(36,84)

5

(21,74)



3

(15,79)

3





2

2





1

19

(82,61)

15

(78,95)

10

(52,63)



7

(46,67)



7

(36,84)



7

(46,67)

2

(10,53)



1

(6,66)

Tổng số

42

(100)

24

(57,14)

18

(42,86)

8

(19,05)

5

(62,5)

3

(37,5)

34

(80,95)

17

(50,0

14

(41,88)

3

(8,82)



Qua bảng 7 cho thấy, trớc đông lạnh phôi loại A có 24/42 (57,14%); phôi
loại B là 18/42 (42,86%). Sau giải đông phôi có khả năng cấy 34/42 (80,95%).
Loại A có 17/34 (50,0%), loại B có 14,34 (41,18%), loại C có 3/34 (8,82%). Tỷ lệ
phôi chết, thoái hoá là 8/42 (19,05%). Số liệu trên cho thấy trong quá trình đông
lạnh, một số phôi bị giảm chất lợng, hoặc chết, thoái hoá.

Bảng 8. Tỷ lệ có chửa theo giai đoạn phát triển của phôi sau giải đông

Số bò có chửa

Giai đoạn phát triển
của phôi

Số bò đ cấy

N

%

Phôi dâu

Phôi nang

19

15

6

7

36,84

40,0

Tổng số

34

13

38,24



Qua bảng 8 ta thấy: tỷ lệ có chửa khi cấy phôi đông lạnh là 38,24% so với
phôi đông lạnh nhập là 40,43%. Tỷ lệ có chửa đạt ở phôi nang so với phôi dâu t-
ơng ứng là 40,0 và 36,84%.

Bảng 9. Tỷ lệ có chửa theo chất lợng phôi sau giải đông

Số bò đ cấy

Số bò có chửa

Chất lợng phôi
sau giải đông

n

%

n

%

A

B

C

17

14

3

50,0

41,2

8,8

7

5

1

41,18

35,71

33,33

Tổng số

34

100

13

38,24



Bảng 9 cho thấy: phôi chất lợng loại A đạt tỷ lệ cấy có chửa cao nhất:
41,18%; thấp nhất là phôi loại C:33,33%.

7. Kết luận và đề nghị

7.1. Kết luận
Sử dụng Glycerol 10% làm chất bảo vệ lạnh và áp dụng qui trình đông lạnh
của Australia trên máy CL 2000 và giải đông 3 bớc đạt kết quả tốt.

7.2. Đề nghị
- ứng dụng qui trình đông lạnh và giải đông

- Nghiên cứu phơng pháp đông lạnh bằng EG và giải đông một bớc theo
qui trình của Nhật để có thể triển khai cấy truyền phôi ra diện rộng nh thụ tinh
nhân tạo bằng tinh cọng rạ.



Tóm tắt

Trong thí nghiệm này chúng tôi dùng máy CL-2000 để đông lạnh theo ph-
ơng pháp đông lạnh chậm của Australia. Chúng tôi đông lạnh đợc 42 phôi và đ
giải đông và cấy số phôi đó cho bò nhận. Kết quả cho thấy trớc đông lạnh tỷ lệ
phôi loại A là 57,14%; phôi loại B là 42,86%. Sau giải đông phôi có khả năng cấy
đạt 80,95%. Trong đó phôi loại A chiếm 50,0%, loại B chiếm 41,18% và loại C
chiếm 8,82%. Tỷ lệ phôi chết, thoái hoá là 19,05%. Số liệu trên cho thấy trong quá
trình đông lạnh, một số phôi bị giảm chất lợng, hoặc chết, thoái hoá. Sau khi cấy
cho con nhân., phôi loại A đạt tỷ lệ cấy có chửa cao nhất: 41,18% và thấp nhất là
phôi loại C:33,33%.







Abstract

In this study machine CL-2000 was used to freeze embryo for slow method
of Australia. 42 embryos were frozen/thawed and transferred to recipients. The
results show that prior freezing the percentage of embryos graded A and B were
57,14% and 42,86%, respectively. The percentage of transferable embryos after
freezing/thawing were 80,95%, of those embryos gtraded A, B, C and degeneration
were 50,0; 41,18; 8,82 and 19,05%, respectively. These results suggested that
during freezing, a percentage of embryos were reduced their quality or
degenerated. After transfer to recipients, the pregnancy rate of embryos graded A
was highest (41,18%), and the lowest percentage was obtained from embryos
graded C (33,33%).

Tµi liÖu tham kh¶o



1.

Transferencia de embriones, Ministerio de la agriculture de Cuba, 1988.

2.

Reproduction in farm animals. E.S.E. Hafez. 5th Edition. Lea and Febiger.
Philadelphia, 1987.

3.

Training manual for embryo transfer in cattle. George, E. Seidel, Tr. And Sarah
Moor Seidel. FAO. Rome, 1991.

4.

Artificial insemination manual for cattle. Association of livestock technology,
1992.

5.

Manual of embryo transfer and in vitro fertilization in cattle. Norio Saito.
Japan, 1994.

6.

Manual of bovine embryo transfer. Japan Livestock Technology Association,
1995.

7.

Training manual for embryo transfer in cattle. N. Sanderson, Le Ngoc Chi
Minh, New Zealand, 1997.

8.

Effect of one-step dilution procedure on the viability of bovine embryo frozen-
thawed in E.G. Osames Dochi et al. “Journal of Rakun Gaknen University”, Vol.
25, No 1, 2000.

9.

Current Therapy in Theriogenology 2. David., A. Morrow, 1998.

10.

Reproduction in cattle, A. R. Reters, 2000.