Lương hồng hà nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ quả cần tây sử dụng dung môi eutectic khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
--------

LƯƠNG HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN
QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT APIGENIN
TỪ QUẢ CẦN TÂY
SỬ DỤNG DUNG MƠI EUTECTIC
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯƠNG HỒNG HÀ
1801164

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN
QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT APIGENIN
TỪ QUẢ CẦN TÂY
SỬ DỤNG DUNG MƠI EUTECTIC
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng
2. ThS. Nguyễn Văn Phương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược liệu

Khoa Dược liệu - DHCT

HÀ NỘI - 2023


LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng. Cô đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết để chỉ bảo,
hướng dẫn, truyền đạt cho tơi những kinh nghiệm q báu, động viên và khích lệ tơi trong
suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Văn Phương, người thầy nhiệt huyết,
người đã hướng dẫn, quan tâm, hỗ trợ và truyền động lực cho tôi trong suốt chặng đường
làm khóa luận vừa qua.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng viên cũng như kỹ thuật viên đang công
tác tại bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp tơi trong
q trình thực hiện khóa luận.
Để hồn thành khóa luận này không thể không nhắc tới sự giúp đỡ nhiệt tình của các
bạn, các em sinh viên đang học tập và nghiên cứu khoa học tại bộ môn. Đặc biệt, tôi xin
được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai em Trần Thị Hương Giang và Ngô Hằng Nga đã
luôn động viên, hỗ trợ và sát cánh cùng tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, các phịng ban cùng tồn thể thầy cô
Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quan trọng, bổ ích khơng chỉ
là nền tảng cho q trình thực hiện khóa luận mà cịn là hành trang cho chặng đường phía
trước.
Lời cảm ơn cuối cùng tơi xin được gửi đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn
bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi để tơi có thêm động lực vượt qua mọi khó khăn
trong cuộc sống và học tập.
Và chắc hẳn, khóa luận của tơi vẫn cịn những hạn chế về năng lực và thiếu sót trong
q trình nghiên cứu. Tơi rất mong được lắng nghe và tiếp thu những ý kiến đóng góp của
các thầy cơ và bạn bè để khóa luận được hồn thiện hơn.

Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2023
Sinh viên

Lương Hồng Hà


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3
1.1. Tổng quan về quả Cần tây ...................................................................................... 3
1.1.1. Thành phần hóa học............................................................................................ 3
1.1.2. Tác dụng sinh học .............................................................................................. 4
1.1.3. Các quy trình chiết xuất flavonoid từ quả Cần tây ............................................. 6
1.2. Các phương pháp thủy phân glycosid ................................................................... 7
1.2.1. Phương pháp thủy phân glycosid bằng acid ....................................................... 7
1.2.2. Phương pháp thủy phân glycosid bằng enzym ................................................... 8
1.3. Các phương pháp chuyển apiin thành apigenin trong Cần tây .......................... 9
1.4. Tổng quan về dung môi eutectic............................................................................. 9
1.4.1. Định nghĩa .......................................................................................................... 9
1.4.2. Thành phần ....................................................................................................... 10
1.4.3. Ứng dụng .......................................................................................................... 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 13
2.1. Nguyên liệu, thiết bị ............................................................................................... 13
2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 13
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và phần mềm ........................................................................ 13
2.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................. 13

2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 14
2.3.1. Quy trình chiết xuất dự kiến ............................................................................. 14
2.3.2. Phương pháp định lượng apigenin trong dịch chiết quả Cần tây ..................... 15
2.3.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các điều kiện tối ưu
đến quá trình chiết xuất .............................................................................................. 15
2.3.4. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân dịch
chiết quả Cần tây ........................................................................................................ 16


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................... 17
3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất apigenin từ quả Cần
tây ................................................................................................................................... 17
3.1.1. Thời gian chiết xuất .......................................................................................... 17
3.1.2. Tỷ lệ dung môi/dược liệu ................................................................................. 18
3.1.3. Hàm lượng nước trong hệ dung môi ................................................................ 19
3.2. Khảo sát lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất apigenin từ
quả Cần tây ................................................................................................................... 19
3.2.1. Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm .................................................... 19
3.2.2. Kết quả tối ưu hóa q trình chiết xuất ............................................................ 21
3.2.3 Kết quả lựa chọn điều kiện tối ưu của các biến đầu vào ................................... 24
3.3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân dịch chiết
quả Cần tây ................................................................................................................... 25
3.3.1. Lượng nước ...................................................................................................... 25
3.3.2. Nhiệt độ thủy phân ........................................................................................... 26
3.3.3. Thời gian thủy phân .......................................................................................... 27
3.3.4. Dung môi eutectic............................................................................................. 28
3.4. Bàn luận .................................................................................................................. 30
3.4.1. Về việc chiết xuất apigenin từ quả Cần tây ...................................................... 30
3.4.2. Về việc thủy phân dịch chiết quả Cần tây ........................................................ 31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................................. 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ANOVA

Phương pháp phân tích phương sai (Analysis of variance)

DES

Dung mơi eutectic (Deep Eutectic Solvent)

DMSO

Dimethyl sulfoxid

HBA

Chất nhận liên kết hydro (Hydrogen Bond Acceptor)

HBD

Chất cho liên kết hydro (Hydrogen Bond Donor)

HPLC

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

kl/kl

Tỷ lệ khối lượng/khối lượng

MLR

Hồi quy tuyến tính đa biến (Multiple Linear Regression)

OFAT

Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time)

RSM

Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology)

STT

Số thứ tự

XO

Xanthin oxidase


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Ký

Tên bảng

hiệu

Trang

1

1.1

Khung cấu trúc của apigenin, apiin và dẫn xuất của chúng

3

2

3.1

Kết quả mã hóa biến đầu vào ở 3 mức -1; 0; 1

19

3

3.2

Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm

20

Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mơ hình biểu thị

4

3.3

mối tương quan giữa hàm lượng apigenin trong dịch chiết với

23

các biến đầu vào
5

3.4

Kết quả kiểm định mơ hình bằng thực nghiệm

25

6

3.5

Các hệ dung mơi được lựa chọn để khảo sát

29


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
STT

Hình

Tên hình

Trang

1

1.1

Khung cấu trúc hóa học của flavonoid trong quả Cần tây

3

2

2.1

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

14

3

3.1

Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất

17

4

3.2

Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu

18

5

3.3

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng apigenin
trong dịch chiết với các biến đầu vào

22

6

3.4

Kết quả tối ưu điều kiện chiết xuất

24

7

3.5

Kết quả khảo sát lượng nước trong hệ dung môi

26

8

3.6

Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân

27

9

3.7

Kết quả khảo sát thời gian thủy phân

28

10

3.8

Hàm lượng apigenin trong các mẫu dịch chiết

29


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cần tây (Apium graveolens L.) là loài cây được trồng phổ biến trên thế giới và đã
được di thực về Việt Nam. Bên cạnh vai trò là làm thực phẩm và gia vị, Cần tây cũng được

sử dụng rộng rãi như một loại thảo dược [3], [49]. Ngoài các tác dụng như chống viêm [55],
giảm đau [2], hạ huyết áp [61], chống ngưng tập tiểu cầu và kéo dài thời gian đơng máu
[39], quả Cần tây cịn được đánh giá là một dược liệu tiềm năng để phòng và điều trị bệnh
gút với tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase [50]. Flavonoid là một trong những
nhóm chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng nhất của quả Cần tây, trong đó thành phần chính
là apigenin đã được chứng minh tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase [26], [34],
[48]. Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất apigenin từ quả Cần tây là cần thiết để từ đó phát
triển các sản phẩm phịng và điều trị bệnh gút từ dược liệu này.
Trong các công bố trước đây, các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, hexan…
thường được sử dụng trong các quy trình chiết xuất flavonoid từ quả Cần tây [33]. Đây
cũng là các dung môi được sử dụng phổ biến trong chiết xuất dược liệu do đem lại hiệu quả
chiết tương đối tốt, rẻ tiền, dễ kiếm. Tuy nhiên, các dung môi này thường dễ bay hơi ở nhiệt
độ phòng, dễ cháy nổ. Đồng thời, việc sử dụng các dung môi này trong thời gian dài cịn
tác động xấu đến mơi trường và sức khỏe con người. Với mối quan tâm ngày càng tăng về
sinh thái và kinh tế, một trong những xu hướng hiện nay trong chiết xuất là sử dụng các
dung môi xanh [54]. Các đặc tính lý tưởng của dung mơi xanh bao gồm độc tính thấp, khơng
bắt lửa, ổn định, không gây đột biến và dễ điều chế [62].
Trong một nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự năm 2021 [49] về
chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả Cần tây đã sử dụng hệ dung môi eutectic
(DES - Deep Eutectic Solvent). Đây là được coi là hệ dung môi xanh, thân thiện với môi
trường và là giải pháp thay thế cho các dung môi hữu cơ truyền thống với các ưu điểm nổi
bật như an tồn, dễ tổng hợp, dễ phân hủy, có thể dễ dàng tái chế với khả năng chiết xuất
chọn lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học [49]. Việc sử dụng dung môi eutectic đã khắc
phục được các nhược điểm của dung môi hữu cơ truyền thống. Tuy nhiên, quy trình chiết
xuất trên được thực hiện ở nhiệt độ cao. Mặt khác, phần lớn apigenin trong quả Cần tây tồn
tại dưới dạng glycosid chứ khơng phải dạng aglycon. Vì thế, hàm lượng apigenin thu được
theo quy trình trên là tương đối thấp so với hàm lượng apigenin toàn phần trong dược liệu.
Do đó, để cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ quả Cần tây bằng dung môi eutectic, việc
sử dụng quy trình chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở nhiệt độ thường và thực hiện
thủy phân dịch chiết để chuyển glycosid thành aglycon đã được lựa chọn để tăng hàm lượng

1


apigenin trong sản phẩm. Mặc dù đã có một số nghiên cứu sử dụng phương pháp thủy phân
glycosid để làm tăng hàm lượng aglycon trong chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học từ
dược liệu nhưng chưa có nghiên cứu nào ứng dụng quá trình thủy phân glycosid trong dung
mơi eutectic để chiết xuất apigenin từ quả Cần tây.
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ quả Cần tây
sử dụng dung môi eutectic” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các điều kiện chiết xuất tối ưu cho quá trình
chiết xuất apigenin từ quả Cần tây.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các điều kiện cụ thể cho quá trình thủy phân
dịch chiết quả Cần tây trong hệ dung môi eutectic.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về quả Cần tây
Quả Cần tây là quả chín đã phơi hay sấy khơ của cây Cần tây (Apium graveolens
L.), họ Cần (Apiaceae) [1].
1.1.1. Thành phần hóa học
1.1.1.1. Flavonoid
Flavonoid là nhóm chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng nhất của quả Cần tây và hầu
hết chúng tồn tại dưới dạng glycosid [34]. Trong đó, hai thành phần chính là apigenin và
apiin [37]. Khung cấu trúc của apigenin, apiin (apigenin 7-O-apiosylglucosid) và dẫn xuất
của chúng được thể hiện ở hình 1.1 và bảng 1.1.

Hình 1.1. Khung cấu trúc hóa học của flavonoid trong quả Cần tây
Bảng 1.1. Khung cấu trúc của apigenin, apiin và dẫn xuất của chúng trong quả Cần tây

STT

Tên hợp chất

R1

R2

R3

TLTK

1

Apigenin

H

H

H

[23],
[37], [67]

2

Apiin

H

H

[23],
[37], [67]

3

Apigenin-7-O[2”-O-(5”’-Oferuloyl)-β-Dapiofuranosyl]β-Dglucopyranosid

H

H

[37]

3


4

6”-Malonylapiin

H

H

[37]

5

Apigenin-7-Omalonylapiosyl-

H

H

[37]

glucosid
1.1.1.2. Tinh dầu
Quả Cần tây chứa khoảng 1,8 – 3,4% tinh dầu [38], trong đó chủ yếu là các hợp
chất terpen, phenolic và dẫn xuất của chúng [34]. Sử dụng phương pháp sắc ký khí kết hợp
khối phổ (GC-MS), 18 hợp chất đã được xác định từ tinh dầu quả Cần tây với thành phần
chính là limonen (31,15%), β-selinen (22,28%), p-cresyl iso-valerat (14,94%), γ-terpinen
(1.6%) và α-pinen (0.2%) [33], [34], [38].
1.1.1.3. Coumarin
Cho đến nay, có 20 hợp chất furanocoumarin đã được phát hiện trong quả Cần tây
[5], [38], [42]. Một số hợp chất điển hình trong số đó là: umbelliferon [15], psoralen [12],
[38], [68], bergapten [12], [15], [68], xanthotoxin [12], [15], [68] và isopimpinellin [15].
1.1.2. Tác dụng sinh học
1.1.2.1. Tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase
Một nghiên cứu trên chuột tăng acid uric máu gây ra bởi kali oxonat cho thấy khi
dùng đường uống với liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg trong 5 ngày, cao ethanol
chiết xuất từ quả Cần tây làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh lần lượt là 59,3; 52,5 và
43,8% so với lô chứng. Hơn nữa, cao ethanol chiết từ quả Cần tây với liều 250 mg/kg và
500 mg/kg ức chế đáng kể hoạt tính xanthin oxidase gan chuột với phần trăm ức chế tương
ứng là 12,1 và 10,5% [50].
Một nghiên cứu khác trên chuột tăng acid uric máu bởi kali oxonat từ nấm men cho
thấy cao chiết nước của quả Cần tây ở các mức liều 75 mg/kg, 300 mg/kg và tinh dầu quả

Cần tây ở các mức liều 0,058 ml/kg; 0,233 ml/kg đều làm giảm mạnh nồng độ acid uric
huyết thanh ở chuột so với lô chứng. Đặc biệt, cao chiết nước của quả Cần tây liều thấp ức
chế 41,9% hoạt tính xanthin oxidase trong huyết thanh và 11,3% trong gan chuột [59].
4


1.1.2.2. Tác dụng chống viêm
Trên mơ hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, cao ethanol chiết từ quả
Cần tây với liều 250 và 500 mg/kg có tác dụng chống viêm cấp, làm giảm phù bàn chân
chuột so với lô chứng với tỷ lệ ức chế lần lượt là 37,6% và 60,6% tại thời điểm 1 giờ sau
khi gây viêm [2].
Trên mơ hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối chuột cống bằng tinh thể natri urat,
cao ethanol chiết từ quả Cần tây liều 250 mg/kg làm giảm triệu chứng viêm so với lô chứng
tại thời điểm 4 và 5 giờ sau khi gây viêm trong khi liều 500 mg/kg làm giảm triệu chứng
viêm so với lô chứng tại cả ba thời điểm 4; 5 và 6 giờ sau khi gây viêm [2].
Trên mơ hình gây phù tai chuột bằng xylen, cao chiết nước và hexan từ quả Cần tây
với các liều 100, 200, 300, 400, 500 mg/kg có tác dụng chống viêm, giảm phù tai chuột.
Trong đó, tác dụng chống viêm của cao chiết hexan từ quả Cần tây liều 200 mg/kg tương
đương với dexamethason liều 15 mg/kg với tỷ lệ ức chế lần lượt là 76,06% và 76,74% [55].
1.1.2.3. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu và kéo dài thời gian đông máu
Dịch chiết ethanol quả Cần tây có tác dụng ức chế sự ngưng tập tiểu cầu ở nồng độ
thấp 0,05 mg/ml (p<0,05) và tác dụng ức chế rõ rệt ở các nồng độ thí nghiệm 0,10 mg/ml;
1,00 mg/ml; 2,00 mg/ml và 3,00 mg/ml so với mẫu chứng một cách có ý nghĩa thống kê
(p<0,01). Dịch chiết ethanol quả Cần tây có tác dụng ức chế sự ngưng tập tiểu cầu mạnh
hơn dung dịch aspirin 81 μg/ml ở các nồng độ thí nghiệm 0,10mg/ml; 1,00 mg/ml; 2,00
mg/ml và 3,00 mg/ml (p<0,01) [4].
Dịch chiết ethanol quả Cần tây có tác dụng kéo dài thời gian đơng máu PT ở các
nổng độ 6,0 mg/ml; 7,5 mg/ml và 10,0 mg/ml so với mẫu chứng (p<0,05). Trong đó nồng
độ 10,0 mg/ml có tác dụng kéo dài thời gian PT tương đương với dung dịch heparin 0,5
lU/ml (p>0,05). Dịch chiết ethanol quả Cần tây cũng có tác dụng kéo dài các thời gian đông

máu APTT và TT ở tất cả các nồng độ thí nghiệm: 3,3 mg/ml; 5,0 mg/ml; 6,0 mg/ml; 7,5
mg/ml và 10,0 mg/ml so với mẫu chứng (p<0,05). Trong đó, nồng độ 6,0 mg/ml và 7,5
mg/ml có tác dụng kéo dài thời gian TT tương đương với dung dịch heparin 0,5 lU/ml
(p>0,05). Nồng độ dịch chiết 10 mg/ml cho tác dụng kéo dài thời gian TT mạnh hơn dung
dịch heparin 0,5 lU/ml (p<0,05) [4].
1.1.2.4. Tác dụng hạ huyết áp
Một nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng đơn nhóm trên 30 bệnh nhân tăng huyết áp
nhẹ đến trung bình được cho sử dụng dịch chiết Cần tây chuẩn hóa chứa khoảng 85% 3-n5


butylphthalid với mức liều 150 mg/ngày, sau 6 tuần huyết áp tâm thu giảm 8,2 mmHg và
huyết áp tâm trương giảm 8,5 mmHg [39].
Dịch chiết methanol, hexan, ethanol 80% của quả Cần tây làm giảm huyết áp và tăng
nhịp tim ở chuột bị tăng huyết áp, nhưng khơng có tác dụng đối với chuột có huyết áp bình
thường. Khi sử dụng mức liều 300 mg/kg, cao chiết hexan, methanol và ethanol 80% của
quả Cần tây làm giảm huyết áp tương ứng 38, 24 và 23 mmHg và làm tăng nhịp tim tương
ứng là 60, 25 và 27 nhịp/phút [61].
1.1.2.5. Một số tác dụng khác
Bên cạnh các tác dụng trên, quả Cần tây còn thể hiện một số tác dụng khác như:
giảm đau [2], [53], chống ung thư [11], [22], hạ đường huyết [20], chống oxy hóa [9],[32],
cải thiện trí nhớ [13], chống ung thư [7], kháng khuẩn [9], [11], [53], kháng nấm [41], hạ
lipid máu [40].
1.1.3. Các quy trình chiết xuất flavonoid từ quả Cần tây
1.1.3.1. Quy trình chiết xuất của tác giả Javadi và cộng sự
Quả Cần tây sau khi làm sạch và sấy khô đã được nghiền và sau đó được ngâm với
ethanol 70% trong 3 ngày. Sau đó, tiến hành lọc và thu lấy dịch chiết. Dịch lọc được cô đặc
dưới áp suất giảm và sấy khô để thu được cao khơ [27].
1.1.3.2. Quy trình chiết xuất của tác giả Jianfeng và cộng sự
Quả Cần tây khô sau khi nghiền nhỏ được chiết hồi lưu với ethanol 95% 1 - 2 lần.
Tỷ lệ dung môi/dược liệu mỗi lần chiết là 2 - 4 lần và thời gian chiết xuất mỗi lần là 1h.

Tiến hành gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới khi khơng cịn
ethanol. Sau đó, tiến hành pha lỗng dịch chiết với nước và lắc với ethyl acetat nhiều lần.
Gộp các dịch chiết ethyl acetat sau đó loại dung mơi để thu được sản phẩm [30].
1.1.3.3. Quy trình chiết xuất của tác giả Qian Zhang và cộng sự
Apigenin được chiết xuất từ quả Cần tây bằng phương pháp siêu âm có sự hỗ trợ của
enzym pectinase. Quy trình cụ thể như sau: bột dược liệu được phân tán trong 75 ml dung
dịch enzym. Điều kiện tối ưu để thủy phân bằng enzym pectinase là thời gian phản ứng 30
phút và nồng độ enzym là 0,4 mg/ml ở pH 5,5. Điều kiện chiết xuất tối ưu là thời gian chiết
xuất 30 phút, nhiệt độ 25◦C, công suất 80 W. Tại điều kiện này, hàm lượng apigenin thu
được là 25,3 mg/g, tăng 32,2 lần so với quy trình chiết bằng nước mà không xử lý bằng
enzym hoặc siêu âm [66].
1.1.3.4. Quy trình chiết xuất của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự
6


Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thu Hằng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ứng
dụng hệ dung môi eutectic (DES) để chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả
Cần tây. Kết quả khảo sát cho thấy, hầu hết các hệ DES đều có khả năng chiết xuất apigenin
và luteolin tốt hơn nước, methanol và ethanol 70%, trong đó hệ có thành phần betain và
propylen glycol có tỷ lệ 1:8 có khả năng chiết xuất tốt nhất. Các điều kiện ảnh hưởng đến
quá trình chiết xuất cũng đã được tối ưu hóa để thu được cao Cần tây với hàm lượng
apigenin và hàm lượng luteolin lớn nhất [49].
Như vậy, các quy trình trên đã có những cải thiện đáng kể để nâng cao hàm lượng
apigenin trong sản phẩm cuối cùng so với quy trình chiết xuất thơng thường. Tuy nhiên,
các quy trình này mới chỉ tập trung chiết flavonoid tồn phần trong quả Cần tây mà khơng
có bước xử lý tiếp theo dẫn đến hàm lượng apigenin thu được trên thực tế còn thấp, đặc
biệt khi so sánh với hàm lượng flavonoid toàn phần.
1.2. Các phương pháp thủy phân glycosid
Q trình thủy phân glycosid có thể được thực hiện thông qua 2 cách: thủy phân
bằng acid hoặc thủy phân bằng enzym.

1.2.1. Phương pháp thủy phân glycosid bằng acid
Quá trình thủy phân có thể được thực hiện bằng acid vô cơ mạnh với nồng độ 1-2 M
[43]. Tuy nhiên, các loại flavonoid khác nhau đòi hỏi các điều kiện thủy phân khác nhau.
Ngoài ra, tốc độ thủy phân bằng acid cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác [8], [43]. Nói
cách khác, q trình thủy phân là khác nhau tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu và phải
được tối ưu hóa riêng cho từng dược liệu [51]. Do đó, khơng có quy trình chuẩn hóa cho
q trình thủy phân bằng acid của flavonoid glycosid.
Nghiên cứu của Hertog và các cộng sự đã tiến hành thủy phân flavonoid glycosid
trong Xà lách tươi (Lactuca sativa L.), Tỏi tây (Allium porrum L.), Cần tây (Apium
graueolens L.), Hành tây (Allium cepa L.), Rau diếp xoăn (Chicorium endiuia L.) và Nam
việt quất (Vaccinium macrocarpon Ait.) theo quy trình sau: 0,25 g dược liệu được chiết với
20 ml dung dịch methanol 60%. Thêm tiếp vào dịch chiết một lượng HCl 6 M để thu được
25 ml dung dịch HCl 2 M trong methanol 50%. Sau đó, tiến hành đun hồi lưu ở 90°C trong
4 giờ [43].
Nghiên cứu của Mohamad Shazeli và cộng sự đã tiến hành thủy phân các hợp chất
từ lá Cọ dầu (Elaeis guineensis Jacq.) bằng cách cho 5 g cao chiết lá Cọ dầu phân tán trong
50 ml dung dịch HCl và ủ ở nhiệt độ và thời gian tối ưu. Hỗn hợp sau đó được làm nguội
và trộn với 20 ml methanol, lắc xốy ở tốc độ 3000 vịng/phút trong 30 giây. Tiến hành siêu
7


âm ở tần số 40 Hz trong 10 phút và ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút thu được dịch chiết.
Cất loại dung môi và sấy khô thu được sản phẩm cuối cùng [44].
Nghiên cứu của Moussa - Ayoub và cộng sự đã tiến hành thủy phân glycosid từ vỏ
Xương rồng lê gai khô (Opuntia ficus indica) và Hành tây (Allium cepa L.) bằng HCl 1 M
trong MeOH:H2O (50:50) ở 90◦C và 100◦C trong 1 giờ. Sau khi thủy phân, tất cả các mẫu
được pha loãng với methanol, siêu âm và sau đó lọc [46].
1.2.2. Phương pháp thủy phân glycosid bằng enzym
Một số enzym được sử dụng để thủy phân glycosid bao gồm pectinase, cellulase, βglucosidase, naringinase (hỗn hợp của α-L-rhamnosidase và β-D-glucosidase)... Việc sử
dụng các enzym để thay đổi cấu trúc và cải thiện các tính chất hóa lý cũng như sinh học

của flavonoid đang ngày được quan tâm do tính sẵn có, chọn lọc cao, chi phí thấp và hiệu
suất cao với ít sản phẩm phụ.
Nghiên cứu của Freischmidt và cộng sự đã tiến hành thủy phân glycosid trong dịch
chiết vỏ cây Liễu (Salix purpurea) bằng enzym β-glucosidase theo quy trình sau: 50 mg
cao chiết vỏ cây Liễu được siêu âm với 10,0 ml methanol/nước 7:3 (v/v) trong 15 phút. Sau
khi lọc, lấy 1,0 ml dịch chiết trộn với 1,0 ml dung dịch methanol/nước 3:7 (v/v) và đun
nóng trong 30 phút ở 120◦C. Sau khi để nguội, thêm 0,6 ml dung dịch NaOH 2 M để điều
chỉnh pH từ 6 đến 7. Lấy 1,0 ml và trộn với 0,6 ml dung dịch β-glucosidase (2 mg/ml βglucosidase trong nước) và 1,0 ml H2O rồi để yên trong 30 phút ở 37◦C [21].
Trong một nghiên cứu khác, Haselmair - Gosch và cộng sự đã sử dụng naringinase
để thủy phân flavanol và flavonol glycosid từ cao chiết hoa Dạ yến thảo (Petunia hybrida
Vilmor.) theo quy trình sau: đun nóng hỗn hợp gồm 1 g dược liệu và 1 ml dung dịch HCl 2
M trong methanol. Tiến hành ly tâm rồi lấy 20 µl dịch ly tâm trên để thủy phân bằng enzym
bởi 10 U Naringinase trong 20 phút ở 40◦C tại pH = 4 [25].
Nghiên cứu của Yuan - Yuan Zang và cộng sự chiết xuất quercetin từ Hòe (Sophora
japonica L.) bằng cách sử dụng dung môi eutectic (NADESs) để chiết rutin, sau đó thủy
phân rutin thành quercetin bằng enzym phân hủy rutin thu được từ hạt mạch đắng nảy mầm.
Cụ thể, Y.Y.Zang đã tiến hành siêu âm hỗn hợp 40 mg bột dược liệu và 1,5 ml NADES
trong 45 phút. Sau đó, ly tâm trong 30 phút thu lấy dịch. Hạt mạch đắng nảy mầm sau đó
được hịa trong dung dịch đệm acid acetic 0,2 M (pH=5) khuấy ở 4 °C trong 24 giờ, ly tâm
thu được dung dịch enzym. Dung dịch enzym được thêm vào dung dịch đệm Tris - HCl
0,02 M (pH = 7,0) ủ ở 37°C trong 15 phút. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm vào
hỗn hợp trên 1 ml methanol [64].
8


1.3. Các phương pháp chuyển apiin thành apigenin trong Cần tây
Trong quả Cần tây, apiin (apigenin 7-O-apiosylglucosid) là một diglycosid của
apigenin. Vì vậy khi thủy phân apiin thành apigenin sẽ giúp tăng hàm lượng apigenin trong
dịch chiết quả Cần tây.
Trong các nghiên cứu trước đây, apiin được thủy phân một cách hiệu quả thành

apigenin 7-O-glucosid với sự kết hợp của các phương pháp xử lý bằng acid và nhiệt.
Apigenin 7-O-glucosid sau đó có thể được chuyển đổi bằng enzym thành apigenin [23].
Nghiên cứu của Denis Nchang Che và cộng sự sử dụng acid citric và β-glucosidase
để biến đổi apiin trong Cần tây thành apigenin. Phân tích chi tiết các kết quả thu được cho
thấy acid citric không chuyển được apiin thành apigenin mà chủ yếu thu được apigetrin
(apigenin-7-O-β-D-glucosid). Tiếp tục xử lý hỗn hợp trên bằng β-glucosidase thì thấy phần
lớn apigetrin đã chuyển hóa thành apigenin [18].
Nghiên cứu của Gregory L. Hostetler và các cộng sự đã kết hợp của quá trình thủy
phân acid và enzym glycosidase trong hạt hạnh nhân và hạt lanh để chuyển apiin và
apigenin. Cụ thể, lá Cần tây được acid hóa đến pH = 2,7 bằng H3PO4 1,5 N và đun nóng
trong nồi cách thủy sơi (100◦C) trong 90 phút. Sau đó thêm bột hạnh nhân, hạt lanh xay
hoặc bột đậu xanh, ủ ở 50◦C trong 2 giờ. Kết quả cho thấy apigenin 7-O-glucosid gần như
đã chuyển hóa hồn tồn thành aglycon với hiệu suất 95% [23].
Tương tự, nghiên cứu của Jae Young Shin và cộng sự đã tiến hành thủy phân dịch
chiết Cần tây bằng HCl ở 80°C trong 2 giờ. Quá trình thủy phân đã làm giảm hàm lượng
apiin từ 3,11 xuống 0,10 mg/g. Mặt khác, apigenin 7-glucosid, apigenin và luteolin đã tăng
lên sau quá trình thủy phân tương ứng từ 0,09 đến 1,41 mg/g, 0,38 đến 2,10 mg/g và 0,12
đến 0,55 mg/g [29].
1.4. Tổng quan về dung môi eutectic
1.4.1. Định nghĩa
Dung môi eutectic (DES-Deep Eutectic Solvent ) bao gồm hỗn hợp của ít nhất hai
thành phần: chất nhận liên kết hydro (HBA-Hydrogen Bond Acceptor) và chất cho liên kết
hydro (HBD-Hydrogen Bond Donor) và có khả năng tự liên kết để tạo thành pha eutectic
mới được đặc trưng bởi điểm nóng chảy (dưới 100◦C) thấp hơn so với từng thành phần
riêng lẻ. Các thành phần cấu thành này cũng phải có các đặc tính an tồn, độc tính thấp,
khả năng tái tạo và khả năng phân hủy sinh học cũng như chi phí thấp [19].

9

1.4.2. Thành phần
Một hệ eutectic bao gồm hai thành phần chính là chất nhận liên kết hydro (HBA) và
chất cho liên kết hydro (HBD) [6], [19]. Giữa các thành phần này khơng có phản ứng hóa
học xảy ra và khơng tạo thành sản phẩm phụ [28].
Chất nhận liên kết hydro (HBA) thường được sử dụng là các muối amoni bậc 4.
Trong đó cholin chlorid là HBA được sử dụng phổ biến nhất do giá thành rẻ, có khả năng
phân hủy sinh học và khơng độc hại, có thể chiết xuất từ sinh khối hoặc dễ dàng tổng hợp
từ nhiên liệu hóa thạch [28]. Ngồi ra, một số HBA khác như betain, acid lactic, prolin...
cũng được ứng dụng rộng rãi trong các hệ dung môi eutectic [35].
Chất cho liên kết hydro (HBD): Thường là các hợp chất tự nhiên chứa O, N như:
ure, glycerol, acid carboxylic, acid succinic, acid citric,… [35], [52].
1.4.3. Ứng dụng
1.4.3.1. Ứng dụng trong chiết xuất
Hiện nay, các phương pháp chiết xuất thường có thời gian chiết xuất kéo dài và tiêu
thụ một lượng lớn dung môi hữu cơ [52]. So với các dung môi hữu cơ thông thường gây ra
nhiều lo ngại về sức khỏe và môi trường, dung môi eutectic không chỉ thân thiện với môi
trường, không độc hại và là các hợp chất hữu cơ có thể phân hủy sinh học mà cịn có một
chi phí thấp, dễ điều chế trong phịng thí nghiệm [57]. Các DES được sử dụng phổ biến
nhất thường bao gồm acid lactic, cholin clorid và 1,2-propandiol [36].
Ngồi ra, dung mơi eutectic cho thấy hiệu quả chiết tốt hơn và giá trị thu hồi cao
hơn đối với các chất phân tích mục tiêu tự nhiên được nghiên cứu so với nước và nhiều
dung mơi hữu cơ thơng thường, thể tích dung môi thấp hơn được sử dụng với thời gian
chiết xuất ngắn hơn.
Nhờ khả năng hình thành liên kết hydro, các hợp chất polyphenol đã trở thành mục
tiêu chiết xuất của dung môi eutectic thông qua cơ chế liên kết hydro với các nhóm hydroxyl
của polyphenol, thúc đẩy q trình hịa tan của các hợp chất này. Tùy thuộc vào thành phần
trong hệ, độ phân cực của dung mơi eutectic có thể được điều chỉnh để chiết xuất được các
hợp chất polyphenol từ ít phân cực đến phân cực nhiều. Vì vậy, DES được xem như một
dung môi đầy hứa hẹn cho việc hòa tan chọn lọc các hợp chất polyphenol trong thực vật
[60].

1.5.3.2. Một số ứng dụng khác
Ngoài ứng dụng trong chiết xuất, DES còn được ứng dụng trong một số lĩnh vực
khác như:
10


Trong sắc ký: DES đã thu hút sự chú ý ngày càng tăng trong sắc ký để tách các hợp
chất mục tiêu từ tự nhiên. Nhờ khả năng chiết xuất chọn lọc và cho hiệu suất chiết xuất cao
đối với hợp chất tự nhiên, DES có thể được sử dụng trong sắc ký để làm pha động hoặc
tách các thành phần có hoạt tính sinh học trong giai đoạn xử lý mẫu [35]. Việc sử dụng
DES đã được chứng minh giúp cải thiện đáng kể độ phân giải của các pic sắc ký [52].
Hỗn hợp eutectic ChCl/ure và ChCl/glycerol được kết hợp làm chất phụ gia trong
quá trình điều chế tinh bột ngô và chất điện phân polyme dựa trên cellulose, cũng như trong
quá trình chế tạo màng thạch. Việc sử dụng DES để biến đổi tinh bột ngô và cellulose cho
thấy những ưu điểm như tính bền vững, chi phí thấp và độc tính thấp hơn của q trình hóa
dẻo, cũng như các đặc tính tồn vẹn về hình thái, dẫn điện, nhiệt và hóa học vượt trội của
chất điện phân polyme tự nhiên [19].
Trong y sinh: có thể thay thế các dung môi hữu cơ như DMSO làm mơi trường hịa
tan trong các thử nghiệm sinh học [36].
Trong tinh chế và sản xuất dầu diesel sinh học: Glycerol là sản phẩm phụ không
mong muốn và phải được loại bỏ trước khi dầu diesel sinh học có thể được sử dụng làm
nhiên liệu vì độ nhớt của glycerol hiện diện cản trở hệ thống phun áp suất cao của động cơ
diesel hiện đại. Dung môi DES được sử dụng để chiết xuất glycerol từ dầu diesel sinh học
[60].
Trong nhiên liệu: DES có khả năng khử nitơ và lưu huỳnh - những chất ức chế q
trình hydrodesulfur hóa trong các loại nhiên liệu [35].
1.5.3.3. Một số nghiên cứu ứng dụng hệ dung mơi eutectic trong lĩnh vực chiết xuất
Nhóm nghiên cứu của tác giả X. Shang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng
DES để chiết xuất 5 flavonoid từ lá Thanh tiền liễu (Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja)
là kaempferol-7-0-α-L-rhamnosid, kaempferol, quercetin, quercetin-3-O-β-D-glucuronid,

và kaempferol-3-O-β-D-glucuronid. Kết quả cho thấy, các DES khác nhau cho hiệu suất
chiết xuất khác nhau. Các điều kiện chiết xuất tối ưu như sau: hệ thống DES cholin
clorua:1,4-butanediol (tỷ lệ mol 1:5); hàm lượng nước trong DES: 30%; thời gian chiết: 30
phút; nhiệt độ chiết: 60◦C; và tỷ lệ dung môi/dược liệu: 20 mg/ml [58].
Trong một nghiên cứu khác, Bubalo Marina Cvjetko và cộng sự đã tiến hành nghiên
cứu ứng dụng DES để chiết xuất các hợp chất phenolic từ vỏ quả Nho (Vitis vinifera) bằng
ba kỹ thuật chiết xuất khác nhau: chiết xuất thực hiện trong máy lắc (CE), chiết xuất có hỗ
trợ của vi sóng (MAE) và chiết xuất có hỗ trợ của siêu âm (UAE). Trong số các DES được

11


thử nghiệm, cholin clorid:acid oxalic với 25% nước thể hiện là dung môi tốt nhất và phương
pháp chiết xuất tốt nhất xác định được là UAE [14].
Nhóm nghiên cứu của tác giả Mohammad Chand Ali và các cộng sự đã sử dụng
dung môi DES để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả Câu kỷ (Lycium
barbarum L.). Trong số các DES được nghiên cứu, hỗn hợp tỷ lệ 1:2 của cholin clorid và
acid p-toluen sulfonic (DESs-6) kết hợp với phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm
(UAE) cho hiệu quả chiết xuất tốt nhất với hàm lượng myricetin, morin và rutin thu được
lần lượt là 57,2 mg/g; 12,7 mg/g và 9,1 mg/g. Ngoài ra, phương pháp UAE còn cho thấy
hiệu quả vượt trội hơn đáng kể so với gia nhiệt và khuấy thông thường [45].
Trong một nghiên cứu khác, nhóm nghiên cứu của tác giả Yuntao Dai và cộng sự đã
ứng hệ dung môi eutectic để chiết xuất anthocyanin từ hoa Dừa cạn (Catharanthus roseus
(L.) G. Don) bằng phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm. Kết quả cho thấy tại
các điều kiện đã được tối ưu hóa, 2 hệ NADES bao gồm acid lactic-glucose (LGH) và 1,2propanediol-cholin clorua (PCH) có khả năng chiết xuất anthocyanin tương tự như các dung
môi hữu cơ thông thường. Hơn nữa, trong số các NADES được sử dụng, LGH thể hiện khả
năng ổn định cyanidin cao hơn ít nhất ba lần so với ethanol đã acid hóa [65].

12

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu là quả Cần tây được thu hái tại Hải Hậu, Nam Định. Dược liệu sau khi
thu hoạch được phơi khô và bảo quản ở nơi khơ ráo, thống mát.
Mẫu Cần tây có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Phòng tiêu bản - Bộ môn Thực vật
- Khoa Dược liệu - DHCT - Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu HNIP/18542/19.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và phần mềm
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích bao gồm:
-

Các dung mơi/hóa chất hữu cơ: ethanol 90%, acid citric, acid acetic, propylen glycol,
glycerin, betain, acetonitril (HPLC).

-

Hóa chất vơ cơ: nước cất 2 lần.

2.1.2.2. Dụng cụ
-

Cân phân tích Presica (Thụy Sỹ), độ chính xác 0,1mg

-

Cân kỹ thuật Sartorius (Đức), độ chính xác 0,01g

-

Máy siêu âm Sonic vibra cell (Mỹ)

-

Máy ly tâm Universad 320 (Đức)

-

Máy đo pH

-

Bộ dụng cụ chiết Soxhlet

-

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu CDD-10AVP; detector DAD; cột sắc ký
Shim-pack GIS C18, kích thước 250 × 4,6 mm; đường kính hạt 5µm

-

Máy đo hàm ẩm Presica XM60 (Thụy Sỹ)

-

Thiết bị cách thủy Memmert (Đức)

-

Các dụng cụ lấy mẫu: Pipet chính xác 2 ml, 5 ml, 10 ml, quả bóp cao su, cốc cỏ mỏ,
ống Falcon

-

Màng lọc 0,45 µm

2.2. Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
Nội dung 1: Khảo sát và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất apigenin từ quả
Cần tây với sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở nhiệt độ thường.

13


Nội dung 2: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân trong dịch chiết quả
Cần tây, từ đó lựa chọn các điều kiện cụ thể của quá trình thủy phân.
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình dự kiến
2.3.1.1. Quy trình chiết xuất dự kiến:
Quả Cần tây được xay nhỏ và rây qua rây có kích thước mắt rây là 0,25 mm, lấy
phần bột lọt qua rây để chiết xuất.
Cân chính xác khoảng 0,1000 g dược liệu cho vào ống nghiệm. Thêm chính xác 2
ml dung mơi eutectic betain - acid citric tỷ lệ 1:1. Tiến hành siêu âm trong 20 phút ở nhiệt
độ thường thu được dịch chiết quả cần tây.
2.3.1.2. Quy trình thủy phân dự kiến
Dịch chiết quả cần tây thu được chuyển vào bình cầu, thêm nước vừa đủ 10 ml. Tiến

hành đun trong 30 phút rồi cô dịch chiết lấy cắn. Cắn thu được đem hịa tan trong 10 ml
ethanol 90% sau đó ly tâm 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Gạn thu lấy phần dịch chiết.
Dịch chiết đem cơ lấy cắn rồi hịa tan trong 2 ml ethanol 90% và định lượng apigenin bằng
phương pháp HPLC.
14


2.3.2. Phương pháp định lượng apigenin trong dịch chiết quả Cần tây
Dịch chiết quả Cần tây được lọc qua màng lọc 0,45 µm và được xác định hàm lượng
apigenin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các điều kiện cụ thể như sau [49]:
-

Cột sắc ký: Shim-pack GIS C18 (250 ì 4,6 mm; 5 àm)

-

Pha ng: Acetonitril Acid phosphoric 0,1% tỷ lệ 40:60

-

Bước sóng phát hiện: 335 nm

-

Tốc độ dịng: 0,5 ml/phút
Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
Từ kết quả sắc ký đồ thu được, tiến hành xác định hàm lượng apigenin trong dịch

chiết dựa trên diện tích pic tương ứng theo công thức:
𝑋=

(𝑆 − 𝑏). 𝑉. 100
(𝑚𝑔/𝑔)
𝑎. 𝑚. (100 − 𝐴%). 1000

Trong đó:
X: hàm lượng apigenin trong dịch chiết (mg/g)
S: diện tích pic (µAU.s)
V: thể tích dịch chiết (ml)
b: hệ số chặn đường chuẩn (b = 104787,6691)
a: hệ số góc đường chuẩn (a = 116907,3427)
m: khối lượng dược liệu (g)
A%: độ ẩm dược liệu, được xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô,
kết quả đo hàm ẩm được xác định: A% = 10,00%
Phương pháp định lượng đã được tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự thẩm định
đạt yêu cầu về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng và độ lặp
lại [49].
2.3.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các điều kiện tối ưu đến
quá trình chiết xuất
2.3.3.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time - OFAT)
Các yếu tố thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi/dược liệu, hàm lượng nước trong hệ
dung môi lần lượt được khảo sát bằng cách thay đổi một yếu tố, các yếu tố cịn lại sẽ được
giữ cố định và khơng thay đổi giữa các thí nghiệm. Từ kết quả các khảo sát, lựa chọn các
khoảng giá trị tương ứng cho hàm lượng apigenin lớn nhất và tiến hành tối ưu hóa bằng
phương pháp bề mặt đáp ứng. Thơng số đánh giá là hàm lượng apigenin trong dịch chiết từ
quả Cần tây.
15


2.3.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM)

Biến đầu vào
Từ kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp thay đổi một yếu tố,
ba biến đầu vào được lựa chọn là: thời gian chiết xuất (X1), hàm lượng nước trong hệ dung
môi (X2), tỷ lệ dung môi/dược liệu (X3) với khoảng khảo sát như sau:
- Thời gian chiết xuất (X1): 15 phút - 25 phút
- Hàm lượng nước trong hệ dung môi (X2): 30% - 50%
- Tỷ lệ dung môi/dược liệu (X3): 15 ml/g – 25 ml/g
Các biến đầu vào sẽ được mã hóa thành các giá trị -1; 0; 1.
Biến đầu ra
Với các điều kiện biến đầu vào được khảo sát, biến đầu ra được lựa chọn là: hàm
lượng apigenin (Y1).
Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng phần mềm Design Expert 11, lựa chọn thiết kế thí nghiệm Box - Behnken
để xác định sự phụ thuộc của biến đầu ra (Y1) đối với biến đầu vào (X1, X2, X3).
Tối ưu hóa q trình chiết xuất
Q trình chiết xuất tối ưu được tối ưu hóa thơng qua các bước:
Bước 1: Xây dựng mơ hình thể hiện sự phụ thuộc của biến đầu ra (Y1) đối với biến
đầu vào (X1, X2, X3) bằng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến (Multiple Linear
Regression - MLR) sử dụng phần mềm Design Expert 11.
Bước 2: Từ kết quả xây dựng mơ hình, lựa chọn các điều kiện tối ưu của các biến
đầu vào để đạt được mục tiêu thu được hàm lượng apigenin tối đa. Tại điều kiện tối ưu
được lựa chọn, tiến hành kiểm định mơ hình bằng thực nghiệm ba lần nhằm đánh giá độ
lặp lại, độ chính xác và sự phù hợp giữa mơ hình so với giá trị thực nghiệm.
2.3.4. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân dịch
chiết quả Cần tây
Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân dịch chiết quả Cần tây được nghiên
cứu bằng phương pháp khảo sát một yếu tố (OFAT). Các yếu tố cụ thể như sau:
- Nhiệt độ thủy phân
- Thời gian thủy phân
- Lượng nước

- Dung môi eutectic
16


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất apigenin từ quả Cần tây
3.1.1. Thời gian chiết xuất
Tiến hành khảo sát thời gian chiết xuất với các giá trị lần lượt là 10, 15, 20, 25 và 30
phút. Các thông số khác được cố định bao gồm: hàm lượng nước: 40% (kl/kl); tỷ lệ dung
môi/dược liệu: 20 ml/g. Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất được trình bày ở hình 3.1.
0.05

Hãm lượng (mg/g)

0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
10 phút

15 phút

20 phút

25 phút

30 phút

Thời gian (phút)
Hình 3.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất
Nhận xét:
Từ biểu đồ hình cho thấy, trong khoảng thời gian từ 10 phút đến 20 phút, khi tăng
thời gian chiết xuất thì hàm lượng apigenin chiết được tăng lên. Tuy nhiên, khi tăng thời
gian chiết lớn hơn 20 phút, hàm lượng hoạt chất trong dịch chiết giảm dần.
Điều này có thể giải thích do hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu ra
môi trường. Khi đạt đến điểm cân bằng, quá trình khuếch tán dừng lại. Lúc này, nồng độ
hoạt chất đạt giá trị lớn nhất. Nếu quá trình chiết xuất vẫn tiếp tục thì nồng độ hoạt chất có
thể khơng tăng nữa mà có khả năng hòa tan thêm tạp chất cũng như phân hủy hoạt chất.
Từ kết quả trên, khoảng thời gian từ 15 phút đến 25 phút được lựa chọn làm khoảng
khảo sát để xây dựng mơ hình bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) trong bước tối ưu
hóa tiếp theo.

17