Khảo sát một số thông số của quá trình tạo vi nang probiotic hướng giải phóng tại đại tràng khoá luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU TRANG

KHẢO SÁT MỘT SỐ THƠNG SỐ
CỦA Q TRÌNH TẠO
VI NANG PROBIOTIC HƯỚNG
GIẢI PHĨNG TẠI ĐẠI TRÀNG
KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2023
1


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU TRANG
1801712

KHẢO SÁT MỘT SỐ THƠNG SỐ
CỦA Q TRÌNH TẠO
VI NANG PROBIOTIC HƯỚNG
GIẢI PHĨNG TẠI ĐẠI TRÀNG
KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS. TS. Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghệ sinh học Dược
Khoa Công nghệ sinh học

HÀ NỘI – 2023
2


LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày đề tài khố luận của mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến thầy cơ, bạn bè, gia đình đã ln quan tâm, hỗ trợ động viên và giúp đỡ em hồn
thành khố luận một cách tốt nhất.
Với tất cả lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến người cơ
đáng kính PGS. TS. Đàm Thanh Xn, đã ln tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em từ
những ngày đầu tiên thực hiện khóa luận. Cảm ơn cơ đã luôn ở bên động viên, cho em
những lời khuyên quý báu, kịp thời giúp em vượt qua những lúc khó khăn.
Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Khắc Tiệp,
Ths. Lê Ngọc Khánh. Cảm ơn hai thầy đã luôn giúp đỡ, hỗ trợ và cho em những lời
khuyên bổ ích trong suốt q trình làm khố luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả thầy cô, anh chị kỹ thuật viên khoa Công nghệ
sinh học. Em cảm ơn chị Phạm Thị Thanh Huyền, chị Nguyễn Thị Kim Chi - kỹ thuật
viên, chị Trần Thị Minh Thu, chị Đỗ Thị Huyền Thương - học viên cao học khoá 27,
bạn Khổng Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Lan Anh, Thân Đắc Hùng, Vũ Thành Lập,
Bùi Thị Mai Nhung, Bounthavy PHENGSAVATDY, Bùi Thị Phương Thanh, Mai
Phương Thu - sinh viên nghiên cứu khoá 73, cùng các em khố 74 bộ mơn Cơng nghệ
sinh học Dược đã luôn đồng hành sẻ chia, giúp đỡ em trong thời gian làm khoá luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em tham gia nghiên cứu khoa học,
trang bị cho em những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn
bè đã ln động viên, giúp đỡ vào tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập
của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Trang


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Hệ giải phóng tại đại tràng ....................................................................................2
1.1.1. Đặc điểm giải phẫu của đại tràng ......................................................................2
1.1.2. Yếu tố ảnh hưởng hệ giải phóng tại đại tràng ..................................................2
1.1.2.1. pH đường tiêu hoá .............................................................................................. 2
1.1.2.2. Thời gian vận chuyển thuốc trong đường tiêu hoá .............................................2
1.1.2.3. Hệ vi sinh vật tại đại tràng ..................................................................................2
1.1.3. Các hệ giải phóng tại đại tràng ..........................................................................3
1.2. Tổng quan về probiotic .......................................................................................... 3
1.2.1. Khái niệm về probiotic .......................................................................................... 3
1.2.2. Một số vi khuẩn có lợi trong đại-trực tràng........................................................... 3
1.2.3. Vai trò probiotic trong điều trị bệnh ở đại tràng ...................................................4
1.2.4. Một số chế phẩm probiotic trên thị trường ............................................................ 5
1.3. Tổng quan về vi nang và các phương pháp tạo vi nang ......................................5
1.3.1. Tổng quan về vi nang ............................................................................................ 5
1.3.2. Một số nguyên liệu thường được sử dụng để tạo vi nang probiotic ......................7
1.3.2.1. Alginat ................................................................................................................7
1.3.2.2. Tinh bột...............................................................................................................7
1.3.2.3. Chitosan ..............................................................................................................8

1.3.3. Các phương pháp tạo vi nang ................................................................................8
1.3.3.1. Phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ ............................................................. 8
1.3.3.2. Phương pháp nhũ tương hoá ...............................................................................9
1.3.3.3. Kỹ thuật phủ Chitosan ........................................................................................ 9
1.3.4. Một số nghiên cứu chế phẩm hướng giải phóng tại đại tràng trên thế giới và tại
Việt Nam........................................................................................................................ 10
1.3.4.1. Một số nghiên cứu trên thế giới........................................................................10
1.3.4.2. Một số nghiên cứu tại Việt Nam ......................................................................10
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .............................................................................................................11
2.1. Nguyên liệu và thiết bị .......................................................................................... 11
2.1.1. Chủng vi sinh vật .................................................................................................11


2.1.2. Hố chất, thiết bị dụng cụ ....................................................................................11
2.1.3. Các mơi trường nghiên cứu .................................................................................12
2.1.4. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ............................................................ 12
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................13
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm [4].......................................................... 13
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào [7] ....................................................13
2.3.3. Phương pháp tạo vi nang .....................................................................................14
2.3.4. Phương pháp đông khô vi nang [7] .....................................................................15
2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vi sinh vật [4] .....................15
2.3.6. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật vi nang đông khô [12] ....................16
2.3.7. Phương pháp đánh giá độ rã của vi nang trong môi trường dịch tiêu hố mơ phỏng
.......................................................................................................................................16
2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật trong môi trường dạ dày mô
phỏng và dịch ruột mô phỏng [12] ................................................................................16
2.3.9. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng vi sinh vật trong môi trường đại tràng

mô phỏng ....................................................................................................................... 17
2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................17
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN .......................................18
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong cơng thức đến một số đặc tính
của vi nang ....................................................................................................................18
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột hồ hoá đến khả năng tạo và một số đặc tính
của vi nang .....................................................................................................................18
3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng lớp phủ Chitosan đến độ rã của vi nang ............................. 20
3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tới vị trí đại
tràng .............................................................................................................................. 25
3.2.1. Tạo vi nang chứa vi sinh vật theo công thức alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5%, phủ
chitosan 3% sau quá trình đơng tụ. ................................................................................25
3.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang trong môi trường dạ dày mô
phỏng và dịch ruột mô phỏng ........................................................................................ 26
3.2.3. Đánh giá khả năng giải phóng vi sinh vật của vi nang trong môi trường đại tràng
mô phỏng ....................................................................................................................... 28
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................30
4.1. KẾT LUẬN ...........................................................................................................30
4.2. ĐỀ XUẤT ..............................................................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
B. bifidum

: Bifidobacterium bifidum

B. longum
B. breve

: Bifidobacterium longum
: Bifidobacterium breve

E. coli
CFU

: Escherichia coli
: Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units)

FAO

: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
(Food and Agriculture Organization of the United Nations)
: Khối lượng/thể tích

kl/tt

L. casei
: Lactobacillus casei
L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus
LAB
MRS
MT
ĐTMP
TBHH
VSV
WHO
CAP

: Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacterium)

: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe)
: Môi trường
: Đại tràng mô phỏng
: Tinh bột hồ hoá
: Vi sinh vật
: Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization)
: Cellulose Acetat Phthalat

HPMP
EC N7
PI3K/Akt
NF-κB
TNF
IL

: Hypromellose Phthalat
: ETHOCEL standard 7 premium
: Phosphatidylinositol-3-Kinase and Protein Kinase B
: Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
: Yếu tố hoại tử u (Tumor Necrosis Factors)
: Interleukin


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh mục hoá chất sử dụng ..........................................................................11
Bảng 2.2. Danh mục thiết bị sử dụng ............................................................................11
Bảng 2.3. Danh mục dụng cụ sử dụng...........................................................................11
Bảng 2.4. Môi trường MRS lỏng ...................................................................................12
Bảng 3.1. Đặc điểm vi nang alginat-tinh bột hồ hoá khi thay đổi nồng độ tinh bột .....19
Bảng 3.2. Kết quả thử độ rã các mẫu vi nang alginat 2%-tinh bột hồ hố có hoặc khơng

có lớp phủ chitosan trong mơi trường dịch tiêu hố mơ phỏng ....................................22
Bảng 3.3. Kết quả số lượng VSV bao gói trong vi nang T5C-2 đông khô ....................26


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Bifidobacterium bifidum ..................................................................................4
Hình 1.2. Lactobacillus acidophilus ................................................................................4
Hình 1.3. Các loại vi nang chứa VSV .............................................................................6
Hình 1.4. Cấu trúc hố học alginat ..................................................................................7
Hình 1.5. Mơ hình vỉ trứng của phức hợp Alginat-Calci ................................................7
Hình 1.6. Cấu trúc hố học Chitin và Chitosan ............................................................... 8
Hình 3.1. Vi nang T2, T5, T7 tươi...................................................................................19
Hình 3.2. Vi nang T2, T5, T7 đơng khơ ..........................................................................19
Hình 3.3. Hình ảnh mẫu vi nang T5C-2 tươi (a), đơng khơ (b) .....................................22
Hình 3.4. Vi nang T5C-2 sau 2 giờ trong dịch dạ dày mô phỏng (c); ........................... 22
Hình 3.5. Vi nang T5 sau 4 giờ trong dịch ruột mô phỏng (e); vớt ra đĩa petri (f) ........23
Hình 3.6. Vi nang T5C-1 (g); Vi nang T5C-2 (h) sau 4 giờ ở dịch ruột mô phỏng .......23
Hình 3.7. Vi nang T5C-1 (i); Vi nang T5C-2 (k) sau 3 giờ ở đại tràng mơ phỏng ........23
Hình 3.8. Hình ảnh vi nang T5C-2 sau 4 giờ ở dịch ruột mơ phỏng ............................. 24
Hình 3.9. Vi nang tươi T5C-2 chứa VSV ......................................................................26
Hình 3.10. Vi nang đơng khơ T5C-2 chứa VSV ............................................................ 26
Hình 3.11. Biểu đồ số lượng VSV sống sót trong vi nang T5C-2 chứa VSV khi qua dịch
tiêu hố mơ phỏng theo thời gian ..................................................................................27
Hình 3.12. Biểu đồ số lượng VSV giải phóng ra mơi trường đại tràng mô phỏng của vi
nang T5C-2 chứa VSV theo thời gian ............................................................................29


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thị trường probiotic đang phát triển với tốc độ rất nhanh do ngày càng có nhiều
nghiên cứu lâm sàng chứng minh tác dụng tuyệt vời mà nhóm vi khuẩn này đem lại [46].

Các nghiên cứu phân tích thị trường dự báo chế phẩm này sẵn sàng tăng trưởng 31,07
tỷ USD trong giai đoạn 2022-2026 với tốc độ tăng trưởng kép hàng năm là 8,54% [86].
Đây là cơ hội cũng như động lực cho các doanh nghiệp dược phẩm đẩy mạnh nghiên
cứu phát triển thêm nhiều sản phẩm mới đáp ứng nhu cầu thị trường.
Hệ vi sinh vật đường ruột đặc biệt là hệ vi sinh vật ở đại tràng có liên hệ chặt chẽ
đến một số bệnh như béo phì, tiểu đường, bệnh rối loạn chuyển hố, viêm nhiễm, ung
thư đại tràng [18], [49]. Việc bổ sung chế phẩm probiotic bằng đường uống nhắm mục
tiêu giải phóng tại đại tràng đang dần trở thành cách dùng được ưa chuộng hơn so với
các phương pháp khác do sự tiện lợi, đơn giản, hiệu quả và không xâm lấn [26]. Tuy
nhiên, các vi khuẩn probiotic rất nhạy cảm với điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hố
nên khi uống thì chỉ một lượng rất nhỏ VSV có thể đi đến đại tràng, làm giảm hiệu quả
của chế phẩm [36], [19]. Vì vậy việc ứng dụng hướng giải phóng tại đích hứa hẹn nhiều
triển vọng trong sản xuất chế phẩm probiotic giải phóng tại đại tràng.
Với mục đích tăng cường khả năng bảo vệ vi sinh vật trong đường tiêu hoá, định
hướng giải phóng vi sinh vật với nồng độ cao tại đại tràng, đề tài: “Khảo sát một số
thông số của q trình tạo vi nang probiotic hướng giải phóng tại đại tràng” được
tiến hành với các mục tiêu nghiên cứu sau:
1. Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong cơng thức đến một số đặc tính của
vi nang.
2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tới vị trí đại tràng.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Hệ giải phóng tại đại tràng
1.1.1. Đặc điểm giải phẫu của đại tràng
Ống tiêu hoá cơ thể người chia làm 5 phần. Đi từ trên xuống dưới bao gồm miệng,
thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già. Trong đó ruột già là đoạn cuối của đường tiêu hố,
có cấu tạo chia làm 4 phần: Manh tràng, đại tràng, trực tràng, hậu môn [5].

Đại tràng là phần dài nhất của ruột già nối tiếp sau manh tràng gồm đại tràng lên,
đại tràng ngang, đại tràng xuống, đại tràng sigma. Đại tràng có đường kính khoảng 5-7
cm, lớp cơ dọc phân bố không đều, lớp niêm mạc mỏng hơn, khơng có các nếp lồi lõm
và được bao phủ bởi lớp chất nhầy [5].
Đặc điểm sinh lý của đại tràng có nhiều điểm khác biệt so với các phần khác
của đường tiêu hóa và các phần của đại tràng cũng có nhiều đặc điểm khác nhau gây
khó khăn cho việc nghiên cứu và phát triển các hệ giải phóng thuốc tại đại tràng [27].
1.1.2. Yếu tố ảnh hưởng hệ giải phóng tại đại tràng
1.1.2.1. pH đường tiêu hố
Giá trị pH ở các vị trí khác nhau trong đường tiêu hố là khơng giống nhau. Ở dạ
dày, pH khoảng 1,0-2,5 lúc đói và tăng lên sau khi ăn [30]. Đoạn đầu ruột non pH nằm
trong khoảng 6,5 và lên đến 7,5 ở cuối ruột non [30], [56]. Độ pH sau đó giảm dần từ
phần cuối ruột non xuống đại tràng và tăng dần một lần nữa ở đại tràng [30]. Giá trị pH
tại manh tràng là 5,5-7,0; ở đại tràng lên là 5,7-6,9; đại tràng ngang từ 5,8-7,4; đại tràng
xuống đạt 6,3-7,7; đại tràng sigma và trực tràng khoảng 7,0 [48], [51], [66].
Một số bệnh lý như viêm loét đại tràng hay bệnh Crohn cũng có thể làm thay đổi
pH đại tràng ảnh hưởng đến dược lực học, dược động học của thuốc chứa dược chất có
độ tan phụ thuộc pH. Đặc biệt với chế phẩm probiotic có thể làm giảm tỷ lệ sống sót của
vi sinh vật [15].
1.1.2.2. Thời gian vận chuyển thuốc trong đường tiêu hoá
Thời gian thuốc di chuyển trong đường tiêu hoá ảnh hưởng đến thời gian thuốc
được đưa tới đại tràng từ đó ảnh hưởng hiệu quả sử dụng thuốc. Tuy nhiên thời gian di
chuyển của thuốc trong đường tiêu hoá bị ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố bệnh lý, sự có
mặt của thức ăn, dạng bào chế vì vậy rất khó xác định chính xác thời điểm thuốc được
di chuyển tới đại tràng [71].
1.1.2.3. Hệ vi sinh vật tại đại tràng
Hệ vi sinh vật tại đại tràng rất phong phú với khoảng 400 loài khác nhau, nồng độ
1011 - 1012 CFU/ml, trong đó chiếm chủ yếu là chi Bacteroides, ngồi ra cịn có các chi
như Escherichia, Clostridia, Lactobacili…các vi sinh vật này có khả năng tiết ra enzym
để phân giải một số polysaccharid như alginat, chitosan, pectin… [37], [15].

2


1.1.3. Các hệ giải phóng tại đại tràng
Việc nghiên cứu các chế phẩm giải phóng tại đại tràng gặp rất nhiều khó khăn do
đặc điểm sinh lý phức tạp của đường tiêu hoá. Các hướng tiếp cận hiện nay chủ yếu là
sử dụng các hệ giải phóng phụ thuộc pH, thời gian, enzym hệ vi sinh vật đại tràng…
Hệ giải phóng phụ thuộc pH lợi dụng sự thay đổi pH trên từng đoạn của ống tiêu
hoá. Tuy nhiên, hệ giải phóng thuốc theo pH lại có một số hạn chế như pH thay đổi ở
từng cá thể do ảnh hưởng của tuổi, bệnh lý, thức ăn… [16].
Hệ giải phóng phụ thuộc thời gian dựa vào thời gian vận chuyển thuốc trong đường
tiêu hố. Rất khó để dự đốn chính xác thời gian vận chuyển đến đại tràng của các dạng
bào chế. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng 5 giờ là khoảng thời gian đủ để thuốc được vận
chuyển xuống đến đại tràng, trong đó thời gian lưu ở dạ dày là 1-2 giờ, ruột non là 3-4
giờ [14], [48].
Hệ giải phóng phụ thuộc vi sinh vật ở đại tràng được thiết kế dựa trên những loại
enzym đặc hiệu do hệ vi sinh vật tại đại tràng tiết ra và những polyme có thể bị phân
huỷ bởi enzym này. Những polyme hay được sử dụng là pectin, gôm guar, chitosan, do
chúng có thể giữ nguyên vẹn cấu trúc ở đoạn trên của ống tiêu hoá nhưng bị phân huỷ
bởi vi sinh vật ở đại tràng và giải phóng ra dược chất ở đây [41], [69].
Mỗi hệ giải phóng đều có ưu nhược điểm riêng vì vậy để tăng hiệu quả giải phóng
tại đại tràng cần kết hợp nhiều hệ giải phóng khác nhau nhằm tăng cường khả năng bảo
vệ probiotic ở đường tiêu hoá trên và đưa được lượng vi sinh vật vừa đủ tác dụng đến
đại tràng.
1.2. Tổng quan về probiotic
1.2.1. Khái niệm về probiotic
Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự sống”
dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho vật chủ. Thuật ngữ
probiotic được nhà khoa học Đức Werner Kollath giới thiệu lần đầu vào năm 1953 để
chỉ “các chất cần thiết cho sự phát triển của sự sống”. Năm 1965, thuật ngữ này được

Lilly và Stillwell sử dụng để biểu thị “các chất do một vi sinh vật tiết ra để kích thích sự
phát triển của vi sinh vật khác” [58]. Năm 1989, Fuller đã định nghĩa lại probiotic là
“một chất bổ sung các vi sinh vật sống có lợi cho cơ thể vật chủ bằng cách cải thiện sự
cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” [31]. Năm 2002, tổ chức FAO và WHO quyết định
đưa ra một định nghĩa thống nhất về probiotic là “vi sinh vật sống, khi sử dụng với lượng
vừa đủ sẽ mang lại lợi ích sức khoẻ cho vật chủ” [32].
1.2.2. Một số vi khuẩn có lợi trong đại-trực tràng
Hệ vi sinh vật đại-trực tràng vô cùng đa dạng phong phú bao gồm cả vi khuẩn có
lợi và vi khuẩn có hại. Các vi khuẩn có lợi hay gặp như Lactobacillus acidophilus,
3


Bifidobacterium spp, Lactobacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus, [28],
[57], [79]… trong đó các lồi thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium thường được
bổ sung trong các chế phẩm probiotic [74].
Vi khuẩn Bifidobacterium lần đầu tiên được phân lập và mô tả vào năm 1899–
1900 bởi Tissier, người đã mô tả các vi sinh vật kỵ khí hình que, khơng sinh khí, hiện
diện trong phân của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ mà ông gọi là Bacillus bifidus. Bifidobacterium
thường là vi khuẩn kỵ khí gram dương, không sinh bào tử, không di động và phản ứng
catalase âm tính. Chúng có nhiều hình dạng khác nhau bao gồm que ngắn, que cong,
que chia nhánh hình chữ Y [75], [76]. Hiện tại có khoảng 30 lồi thuộc chi
Bifidobacterium có nguồn gốc từ người, động vật, nước thải, sữa lên men. Một số loài
thường gặp trong chế phẩm probiotic như B. longum, B. bifidum, B. breve…. Các vi
khuẩn này phát triển ở pH tối ưu là 6,0-7,0 và nhiệt độ thích hợp 37-41°C [38], [67].

Hình 1.1. Bifidobacterium bifidum [87]
Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus thuộc chi Lactobacillus, nằm trong nhóm vi
khuẩn lactic (LAB) [6]. Chúng là trực khuẩn hình que, thuộc nhóm vi khuẩn Gram
dương, kích thước khoảng 0,6-0,9 x 1,5-6,0 μm, thường tồn tại dưới dạng đơn lẻ, xếp
đôi hoặc chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không di động, kỵ khí khơng bắt buộc, phản

ứng catalase âm tính. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 37-42oC, có thể phát triển ở nhiệt độ
cao tới 45oC. Loài này đạt tốc độ tăng trưởng cao nhất trong môi trường hơi acid pH
5,5-6,0 và sự tăng trưởng dừng lại ở pH dưới 4,0 [22].

Hình 1.2. Lactobacillus acidophilus [63]
1.2.3. Vai trị probiotic trong điều trị bệnh ở đại tràng
Probiotic đã được nghiên cứu rộng rãi trên nhiều loại bệnh đường tiêu hóa, trong
4


đó có một số bệnh ở đại tràng như viêm đại tràng và ung thư đại tràng. Probiotic có thể
thúc đẩy quá trình bài tiết các yếu tố chống viêm bằng cách cải thiện hàng rào niêm mạc
ruột và chức năng hệ thống miễn dịch, do đó ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại.
Các nghiên cứu chỉ ra rằng chế phẩm probiotic có tác dụng trong điều trị viêm lt đại
tràng. Thơng qua con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt và NF-κB, men vi sinh làm giảm
các cytokin tiền viêm như TNF-α và IL-1β và tăng yếu tố chống viêm IL-10, do đó cải
thiện các triệu chứng của viêm loét đại tràng [68].
Bifidobacterium là một trong những vi sinh vật chính ở ruột người trưởng thành
[77], có vai trò thúc đẩy tăng khả năng miễn dịch chống ung thư và ngăn ngừa tái phát
viêm loét đại tràng [20], [81].
L. acidophilus đã được phát hiện có một số ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe
đường tiêu hóa, chẳng hạn như điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột [78], giảm tiêu chảy
[35], và giảm viêm đại tràng [23]. Nhiều chủng L. acidophilus có thể làm giảm viêm đại
tràng bằng cách điều chỉnh sự tiết ra các cytokin trong ruột, cải thiện hàng rào ruột
và/hoặc điều chỉnh việc sản xuất các acid béo chuỗi ngắn [42], [47], [55].
Chủng L. plantarum YYC-3 được nghiên cứu là có thể ngăn chặn sự xuất hiện của
ung thư trực tràng giai đoạn đầu ở chuột bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch, ức
chế tình trạng viêm qua con đường truyền tín hiệu NF-κB, Wtn và ngăn ngừa sự mất
cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột [80].
1.2.4. Một số chế phẩm probiotic trên thị trường

Thị trường probiotic ngày càng phát triển đã thúc đẩy các hãng dược phẩm nghiên
cứu cho ra đời những dạng bào chế có nhiều ưu điểm hơn. Xu hướng tăng cường lớp
bao bảo vệ trong kỹ thuật vi nang hoá đang được quan tâm và hứa hẹn nhiều tiềm năng
[7], [26].
Một số chế phẩm thường gặp trên thị trường với nhiều dạng bào chế khác nhau
như cốm, bột pha hỗn dịch uống (Antibio Pro của Hàn Quốc), viên nén (Duolac-Hàn
Quốc), viên nang cứng (Probiotic Acidophilus của hãng Puritan’s Pride, Mỹ), hỗn dịch
dầu (Nature’s Way Kids Smart của Australia), vi nang (Bifina R của Nhật Bản), …
Được quan tâm nhiều nhất hiện nay là sản phẩm Bifina R với công nghệ bao kép
độc quyền. Công nghệ bao 2 lớp gồm lớp màng kháng acid ngoài cùng và lớp màng siêu
bảo vệ bên trong giúp lợi khuẩn Bifidobacterium và Lactobacillus sống an tồn khi qua
mơi trường acid dạ dày vào đến ruột non và đại tràng với tỷ lệ sống sót cao. Vì vậy,
Bifina R được xem như chế phẩm probiotic hướng giải phóng tại đại tràng [85].
1.3. Tổng quan về vi nang và các phương pháp tạo vi nang
1.3.1. Tổng quan về vi nang
1.3.1.1. Khái niệm
5


Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc khơng xác định, kích
thước từ 0,1 μm tới 5,0 mm (thơng thường từ 100 đến 500 μm) có thể được bao bởi các
hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp [3].
Từ quan điểm vi sinh học, vi nang hóa có thể được định nghĩa là q trình bẫy/bao
gói các tế bào vi sinh vật bằng cách bao phủ chúng trong lõi nhân (gọi là hydrocolloid)
thích hợp nhằm ngăn cách chúng với môi trường xung quanh và giải phóng các tế bào
VSV tại vị trí thích hợp trong ruột [52].
Vi nang hóa probiotic là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử
dụng rộng rãi hiện nay, trong đó phần nhân hay chất được bẫy là các tế bào VSV sống;
phần vỏ là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan,
cellulose,...hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat,

polyacrylamid, polyester, ... tạo nên màng mỏng, bề dày từ 0,1 đến 200,0 μm [3].
1.3.1.2. Đặc điểm của vi nang
Vi nang hóa là phương pháp phổ biến nhất trong nghiên cứu tạo nguyên liệu
probiotic hiện nay. Vi nang chứa vi sinh vật có thể chia làm 3 loại [64].

Hình 1.3. Các loại vi nang chứa VSV [64]
Hệ chứa: bao gồm 2 phần, phần lõi ở trong chứa VSV và phần vỏ bao bên ngồi.
Hệ chứa điển hình cho vi nang tạo bởi phương pháp bao gói vi sinh vật. Ưu điểm của
loại này là thường bao gói được lượng VSV đồng nhất trong các vi nang.
Matrix: chứa VSV phân tán khắp vi nang, được tạo thành từ phương pháp bẫy. Ưu
điểm của vi nang dạng này là bao gói được VSV cùng cơ chất một cách chắc chắn.
Bao matrix: là vi nang dạng matrix có lớp bao phía bên ngồi. Lớp bao này có thể
có nhiều vai trị khác nhau như bảo vệ nhân chứa VSV khỏi tác động từ môi trường xung
quanh như ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ. Khi vào cơ thể, có thể bảo vệ VSV khỏi tác động
của pH dạ dày, muối mật...
Tạo vi nang bằng phương pháp bẫy có khả năng cố định được lượng tế bào lớn và
chắc chắn so với các phương pháp khác. Mỗi loại vật liệu tạo vi nang và mỗi loài VSV
được bao gói đều yêu cầu phải khảo sát những yếu tố trong quá trình tạo thành như:
phương pháp, nhiệt độ, thời gian, pH... để đảm bảo không ảnh hưởng đến tính chất và
6


khả năng bảo vệ VSV của vi nang. Vi sinh vật trong vi nang được giải phóng theo các
cơ chế như: gãy vỡ màng, hòa tan màng, khuếch tán qua màng, hoặc giải phóng theo cơ
chế mài mịn do sự va chạm, ma sát giữa các vi nang [11].
1.3.2. Một số nguyên liệu thường được sử dụng để tạo vi nang probiotic
1.3.2.1. Alginat
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng anion.
Acid alginic là một polysaccharid mạch thẳng ưa nước, cấu tạo từ hai gốc acid uronic là
acid β-D-mannuronic (M) và acid α-L-guluronic (G) nối với nhau bằng liên kết 1,4glycosid [54], [65].

Hình 1.4. Cấu trúc hoá học alginat [43]
Alginat là polyme được sử dụng phổ biến trong vi nang hoá probiotic nhờ đặc tính
an tồn, khả năng tạo gel với kim loại hố trị II như Ca2+ nhờ liên kết chéo được mô tả
theo mơ hình “vỉ trứng” (Hình 1.5). Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống tạo nên
mạng lưới không gian ba chiều. Cấu trúc gel bán thấm này khi sử dụng làm màng bao,
chúng có vai trị như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và
cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng có kiểm sốt [54]. Tuy nhiên, độ
bền cơ học của màng alginat và tính tồn vẹn có thể bị ảnh hưởng bởi pH thấp, sự có
mặt của các ion hóa trị I, các chất tạo phức chelat với ion Ca2+ như phosphat, lactat,
citrat. Có thể khắc phục những vấn đề trên bằng cách phối hợp alginat với polyme khác,
phủ thêm lớp màng ngoài trên vi nang, hoặc thay đổi cấu trúc alginat bằng cách sử dụng
thêm các tá dược khác. Kết hợp alginat và tinh bột là một biện pháp phổ biến cải thiện
hiệu quả quá trình vi nang hóa [52]. Ngồi ra alginat tích điện âm nên có thể lợi dụng
bao thêm lớp bao mới nhờ lực hút tĩnh điện với polyme tích điện dương [19], [21].

Hình 1.5. Mơ hình vỉ trứng của phức hợp Alginat-Calci [43]
1.3.2.2. Tinh bột
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, có tính tương hợp sinh học. Tinh bột không
7


độc, không sinh đáp ứng miễn dịch, được sử dụng làm tá dược độn phổ biến, giá rẻ và
có thể được phân hủy bởi α-amylase [62].
Tinh bột được sử dụng làm tá dược bảo vệ trong q trình đơng khơ theo cơ chế
làm giảm lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào VSV trong mẫu. Khi tạo vi nang
calci alginat, tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện thể chất
của vi nang sau đông khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện khả năng sống sót trong
q trình đơng khơ và bảo quản [13]. Bên cạnh đó có một số nghiên cứu sử dụng tinh
bột hồ hoá nhằm tạo ra một hỗn hợp đồng nhất với alginat vì khả năng liên kết tốt và đủ

độ hồ tan so với tinh bột khơng hồ hố [29], [45], [53]. Ngồi ra, khi vào trong ruột,
tinh bột còn tạo ra nguồn dinh dưỡng đối với vi sinh vật [52].
1.3.2.3. Chitosan
Chitosan là một polyaminosaccharid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng
deacetyl hóa của chitin [70]. Khi mức độ deacetyl hóa của chitin đạt khoảng 50% (tùy
thuộc vào nguồn gốc của polyme), nó có khả năng tan được trong dung dịch có tính acid
[60]. Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu (pKa của các nhóm amin xấp xỉ
6,5), thấm nước, khơng tan trong mơi trường trung tính và kiềm, tan trong hầu hết dung
dịch acid hữu cơ pH dưới 6,5 [70]. Tính chất tích điện dương giúp chitosan hoạt động
như một chất bám dính sinh học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như
alginat. Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi nang bao chitosan [1], [7].

Hình 1.6. Cấu trúc hoá học Chitin và Chitosan [70]
1.3.3. Các phương pháp tạo vi nang
Có nhiều phương pháp khác nhau để tạo vi nang dựa vào các q trình hố học,
hoá lý, tĩnh điện, cơ học. Đối với vi nang probiotic thường sử dụng các phương pháp
tách pha đông tụ, phương pháp nhũ hoá, phương pháp phun sấy, phương pháp đông khô,
phương pháp phun đông khô,… [50]
1.3.3.1. Phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ
Đây là phương pháp kinh điển nhất trong tạo vi nang. Phương pháp này liên quan
đến việc chuyển tiếp từ pha lỏng sang pha gel do tương tác ion xảy ra giữa một polyme
mang điện tích và một tác nhân khác mang điện tích trái dấu. Sự tương tác này tạo thành
liên kết chéo giữa các đại phân tử, gây nên sự đông tụ của phức hợp tạo thành.
8


Các polyme tự nhiên và bán tổng hợp như alginat, gôm gellan, chitosan, pectin,
carboxymethyl cellulose… thường được ưu tiên sử dụng do tính tương thích sinh học
và có khả năng phân hủy sinh học. Các polyme này mang điện tích âm (hoặc dương)
trong cấu trúc, sau khi tạo liên kết chéo với các tác nhân mang điện tích trái dấu (Ca2+,

tripolyphosphat…), chúng hình thành nên một cấu trúc dạng mạng lưới không gian ba
chiều lưu giữ dược chất hoặc vi sinh vật [50].
1.3.3.2. Phương pháp nhũ tương hoá
Trong phương pháp này, pha không liên tục là hệ phân tán của sinh khối tế bào
trong dung dịch polyme và pha liên tục là dầu thực vật. Sử dụng chất nhũ hoá để tạo
thành nhũ tương nước trong dầu, khi đó các vi nang chứa VSV sẽ xuất hiện trong pha
dầu do khơng được hịa tan. Tạo vi nang bằng nhũ tương hóa dễ nâng cấp quy mơ và
thường được dùng để tạo vật liệu lõi vi nang bao gói/bẫy dược chất hoặc tế bào. Phương
pháp này cho kích thước vi nang 25 μm-2 mm nhỏ hơn phương pháp tách pha đông tụ.
Tuy nhiên vi nang thường có hình dạng kích thước không đồng đều [50].
Các phương pháp như phun sấy, đông khơ, phun đơng khơ ít được sử dụng hơn do
chi phí đắt đỏ, thiết bị phức tạp, phương pháp phun sấy cịn làm giảm khả năng sống sót
của vi sinh vật do ảnh hưởng của nhiệt độ [50].
1.3.3.3. Kỹ thuật phủ Chitosan
Nhằm tăng cường khả năng bảo vệ vi sinh vật trong vi nang, người ta thường tiến
hành phủ thêm các lớp polyme bên ngoài. Các lớp phủ này sẽ tương tác với bề mặt vi
nang tạo thành một lớp màng liên tục trên bề mặt vi nang. Lớp phủ này làm giảm tính
thấm của vi nang, giảm sự tiếp xúc của VSV với oxy trong quá trình bảo quản và làm
tăng sự ổn định của vi nang ở pH thấp và nhiệt độ cao [40], [59]. Bên cạnh đó lớp phủ
cịn giúp tạo ra một số đặc tính mới cho vi nang như khả năng bám dính, kiểm sốt giải
phóng VSV [21]. Các lớp bao phủ bề mặt vi nang có thể được tạo bởi nhiều cách khác
nhau, cụ thể là bao từng lớp (Layer-by-Layer), kỹ thuật được sử dụng thường là ngâm,
nhúng, phun hay tưới lên bề mặt vi nang các dịch bao thích hợp để tạo thành một hay
nhiều lớp bao trên bề mặt. Đối với vi nang chứa VSV, kỹ thuật hay được thực hiện nhất
là ngâm vi nang vào dung dịch polyme, dẫn đến sự hình thành lớp phủ và quá trình đồng
trùng hợp được tạo ra giữa bề mặt của vi nang và polyme bao phủ. Nguyên tắc của kỹ
thuật này dựa trên lực hút tĩnh điện hóa học giữa vật liệu tích điện âm và dương [19],
[21].
Chitosan là polyme thường được sử dụng để tạo lớp phủ vi nang alginat do khả
năng tích điện trái dấu của chitosan và alginat [1], [7]. Có 2 phương pháp chính để tạo

lớp phủ chitosan: một là phối hợp ngay trong q trình đơng tụ bằng cách bổ sung
9


chitosan/acid acetic vào dung dịch calci clorid; hai là phối hợp sau khi đông tụ bằng
cách ngâm vi nang trong dung dịch chitosan/acid acetic [1].
1.3.4. Một số nghiên cứu chế phẩm hướng giải phóng tại đại tràng trên thế giới và
tại Việt Nam
1.3.4.1. Một số nghiên cứu trên thế giới
Qikun Cheng và cộng sự (2021) đã tạo vi nang hướng giải phóng tại đại tràng sử
dụng cơ chế kích hoạt enzym [26]. Vi nang đa lớp tạo từ alginat và protamin có thể bảo
vệ vi khuẩn trong dạ dày và phân hủy từng lớp dưới xúc tác của trypsin trong ruột. Cơng
thức có hai lớp protamin cho thấy khả năng bảo vệ tốt nhất đối với Escherichia coli
MG1655 khỏi acid và muối mật, kiểm sốt sự giải phóng và kết dính của vi sinh vật.
Ansari (2017) nghiên cứu cải thiện khả năng sống sót của 2 chủng Lactobacillus
acidophilus và Lactobacillus rhamnosus trong mơi trường dịch tiêu hố mơ phỏng bằng
phương pháp vi nang hóa với Calci alginat-chitosan và Eudragit S100 nano. Kết quả cho
thấy nhờ lớp bao thứ 2 (Eudragit S100 nano) mà độ bền của hạt cũng như tỷ lệ sống sót
của vi sinh vật tăng lên so với vi nang đơn lớp [17].
1.3.4.2. Một số nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam các nghiên cứu về vi nang chứa probiotic hướng giải phóng đại tràng
vẫn cịn khá mới mẻ, các nghiên cứu về probiotic chủ yếu được thực hiện tại trường Đại
học Dược Hà Nội với các đề tài tăng cường khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật
của vi nang trong hệ tiêu hoá. Vi nang alginat-tinh bột khơng hồ hố-chitosan bao đa
lớp; vi nang đa nhân có lớp bao ngồi chứa chitosan giúp bảo vệ vi sinh vật trong môi
trường dạ dày mô phỏng và kéo dài thời gian giải phóng VSV trong dịch ruột mơ phỏng
[7], [10].
Ngồi ra cịn có các nghiên cứu về vi nang hướng giải phóng tại đại tràng được
thực hiện với một số dược chất như metronidazol, beberin,…Dược sĩ Trần Thị Kim Anh
(2019) tiến hành bào chế vi nang berberin clorid hướng giải phóng tại đại tràng bằng kỹ

thuật nhỏ giọt sử dụng Eudragit L100, tinh bột, alginat, chitosan và EC N7. Kết quả thử
độ hòa tan in vitro cho thấy vi nang khơng giải phóng dược chất trong 2 giờ đầu ở pH
1,2; giải phóng 18,5% dược chất sau 3 giờ thử ở pH 7,4 và giải phóng kéo dài ở pH 6,8
[2].

10


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Chủng Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 – Bộ môn Công nghệ sinh học Dược
2.1.2. Hoá chất, thiết bị dụng cụ
2.1.2.1. Hoá chất
Bảng 2.1. Danh mục hoá chất sử dụng
Tên hoá chất

Nguồn gốc

Tên hoá chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

Natri acetat

Trung Quốc

Pepton

Ấn Độ

Natri citrat

Trung Quốc

Cao thịt

Đức

Natri alginat

Ấn Độ

Cao nấm men

Đức

Calci clorid

Trung Quốc

KH2PO4

Trung Quốc

Acid acetic băng

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Chitosan

Đức

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

Thạch (Agar)

Việt Nam

Natri clorid

Trung Quốc

Tinh bột sắn

Việt Nam

Triamoni citrat

Trung Quốc

Nước cất

Việt Nam

2.1.2.2. Thiết bị
Bảng 2.2. Danh mục thiết bị sử dụng
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Cân kỹ thuật

Đức-Sartorius

Tủ cấy vô trùng

Nhật-Sanyo

Máy khuấy từ

Hàn Quốc-Wisd

Tủ sấy

Hàn Quốc-Daihan

Máy lắc ổn nhiệt

Trung Quốc-KWF

Thiết bị đông khô

Đức-Christ alpha

Máy ly tâm

Đức-Sartorius

Tủ âm sâu

Hàn Quốc-LG

Nồi hấp tiệt trùng

Nhật-ALP

Tủ ấm CO2

Nhật-Sanyo

2.1.2.3. Dụng cụ
Bảng 2.3. Danh mục dụng cụ sử dụng
Bình nón các loại

Pipet Pasteur

Ống đong các loại

Pipet chia vạch

Cốc có mỏ các loại

Pipet tips

Ống nghiệm có nắp

Lưới vớt hạt

Ống ly tâm

Đĩa petri
11


2.1.3. Các môi trường nghiên cứu
2.1.3.1. Môi trường MRS lỏng
Bảng 2.4. Môi trường MRS lỏng
Nguyên liệu

Lượng sử dụng

Nguyên liệu

Lượng sử dụng

Cao nấm men

5g

MnSO4.4H2O

0,005 g

Cao thịt

10 g

MgSO4.7H2O

0,2 g

Glucose

20 g

Natri acetat

5g

Pepton

10 g

K2HPO4

2g

Triamoni citrat

2g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

6,8-7,0

2.1.3.2. Môi trường MRS thạch
Môi trường MRS thạch = MRS lỏng + thạch agar (2%) (20 g thạch bột/1000 ml
môi trường).
2.1.4. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
• Dung dịch acid acetic 0,5% (kl/tt): cân 0,5 g acid acetic băng, pha loãng với nước
vừa đủ 100 ml.
• Dung dịch calci clorid 2% (kl/tt): hồ tan 2 g calci clorid trong 100 ml nước cất.
• Dung dịch chitosan 3% (kl/tt); pH 5,5-6,0: cân 3 g chitosan hoà tan vào trong 90
ml acid acetic 0,5%. Điều chỉnh pH khoảng 5,5-6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M,
thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml.
• Dung dịch chitosan 3%/calci clorid 2% (kl/tt) (dung dịch hỗn hợp P); pH 5,5-6,0:
cân 3 g chitosan hoà tan vào trong 90 ml acid acetic 0,5%. Cân 2 g calci clorid
hoà tan vào dung dịch trên. Điều chỉnh pH khoảng 5,5-6,0 bằng NaOH 1M và
HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml.
• Dung dịch natri citrat 2% (kl/tt). Cân 2 g natri citrat hồ tan trong nước cất vừa

đủ 100 ml.
• Nước cất hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút.
• Mơi trường dạ dày mô phỏng pH 2,5 [26]: Thêm từ từ HCl 1N vào 1000 ml nước
cất đến pH 2,5.
• Mơi trường ruột non mơ phỏng pH 6,8 [4]: Hồ tan 28,8 g dinatri hydrophosphat
và 11,45 g kali dihydrophosphat trong nước cất vừa đủ 1000 ml.
• Mơi trường đại tràng mơ phỏng pH 7,4 [4]: Hồ tan 0,6 g kali dihydrophosphat;
6,4 g dinatri hydrophosphat và 5,85 g natri clorid trong nước vừa đủ 1000 ml.

12


2.2. Nội dung nghiên cứu
❖ Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong công thức đến một số đặc tính của
vi nang.
- Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột hồ hoá đến khả năng tạo và một số đặc tính
của vi nang.
- Đánh giá ảnh hưởng lớp phủ Chitosan đến độ rã của vi nang.
❖ Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tới vị trí đại tràng.
- Tạo vi nang chứa vi sinh vật theo công thức alginat 2%-tinh bột hồ hố 5%, phủ
chitosan 3% sau q trình đơng tụ.
- Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang trong môi trường dạ dày mô
phỏng và dịch ruột mơ phỏng.
- Đánh giá khả năng giải phóng vi sinh vật của vi nang trong môi trường đại tràng
mô phỏng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm [4]
Áp dụng để tiệt khuẩn dung dịch nước, pipet tips, dụng cụ thủy tinh. Nguyên liệu
dụng cụ tiệt khuẩn được bọc giấy bạc, giấy báo hoặc đựng trong bình nón thủy tinh có
nút bơng. Tiến hành tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 115°C trong 20 phút.

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào [7]
❖ Hoạt hóa giống
Cân, đong các thành phần trong cơng thức mơi trường MRS lỏng (cơng thức nêu
trong mục 2.1.3). Hịa tan các thành phần thu được 100 ml môi trường. Phân chia môi
trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10 ml MRS lỏng. Đậy kín bằng nắp
ống nghiệm. Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn,
sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37-40°C. Cấy giống vào những ống nghiệm trên với
nồng độ 10% (kl/tt). Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24
giờ ở 37°C.
❖ Nhân giống
Pha môi trường MRS lỏng theo công thức nêu ở mục 2.1.3 trong các bình nón đậy
nút bơng. Đem hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt trùng. Để nguội
ở nhiệt độ phòng. Cấy giống với tỷ lệ 10% vào bình nón trong tủ cấy vơ trùng. Ủ bình
nón chứa vi sinh vật trong tủ ấm CO2 ở 37°C trong 24 giờ.
❖ Thu sinh khối
Hỗn dịch nhân giống sau 24 giờ ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, gạn bỏ
phần dịch trong thu sinh khối tế bào.
13


2.3.3. Phương pháp tạo vi nang
a) Tạo vi nang không chứa VSV
Chuẩn bị:
Hỗn hợp alginat 2%-tinh bột hồ hoá (x%) (kl/tt) (hỗn hợp Tx): Hấp tiệt khuẩn ở
115°C trong 20 phút, khuấy đều bằng máy khuấy từ cho đến khi đồng nhất.
Dung dịch calci clorid 2%; dung dịch chitosan 3%; dung dịch chitosan 3%/calci
clorid 2% (dung dịch hỗn hợp P) pha theo công thức nêu ở mục 2.1.4.
Tiến hành:
Vi nang Tx: Dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn hợp Tx
xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định. Dùng lưới vớt hạt

thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất.
Vi nang TxC-1: Được tạo thành bằng cách phối hợp chitosan ngay trong q trình
đơng tụ alginat. Cụ thể: dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn
hợp Tx xuống dung dịch hỗn hợp P, để yên 30 phút cho vi nang ổn định. Dùng lưới vớt
hạt thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất.
Vi nang TxC-2: Được tạo thành bằng cách phối hợp chitosan sau q trình đơng
tụ alginat. Cụ thể: dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn hợp Tx
xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định. Dùng lưới vớt hạt
thu vi nang, rửa sạch bằng nước cất. Chuyển vi nang sang dung dịch chitosan 3% kết
hợp khuấy từ trong 30 phút. Dùng lưới vớt hạt thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất.
b) Tạo vi nang chứa VSV
Chuẩn bị:
Hỗn dịch alginat 3%-tinh bột hồ hoá x%-vi sinh vật (hỗn dịch Tx-VSV): Ly tâm
100 ml hỗn dịch nhân giống sau 24 giờ, thu được sinh khối vi sinh vật. Phối hợp sinh
khối vi sinh vật vào trong 50 ml hỗn hợp Tx, thu được hỗn dịch Tx-VSV.
Dung dịch calci clorid 2% (kl/tt), dung dịch chitosan 3% (kl/tt), dung dịch chitosan
3%/calci clorid 2% (kl/tt) (dung dịch hỗn hợp P): Chuẩn bị theo công thức nêu ở mục
2.1.4, các dung dịch được hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút.
Tiến hành:
Dùng hỗn dịch Tx-VSV thay cho hỗn hợp Tx, thao tác tương tự mục a) thu được:
Vi nang Tx, TxC-1 và TxC-2 chứa VSV. Các nguyên liệu sử dụng vô khuẩn. Thao tác
thực hiện hồn tồn trong tủ cấy vơ trùng.

14


2.3.4. Phương pháp đông khô vi nang [7]
Tiền đông: vi nang được đựng trong đĩa petri hoặc lọ thủy tinh đã rửa sạch và tiệt
khuẩn, sau đó đơng lạnh trong tủ âm sâu -70°C trong 24 giờ cho đông rắn hồn tồn.
Làm khơ: các mẫu sau tiền đơng được làm khô trong buồng lạnh của máy đông

khô ở -50°C, áp suất 0,100 mbar trong 24 giờ.
Kết thúc q trình đơng khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, chuyển các mẫu vi nang từ
đĩa petri vào lọ thủy tinh kín, bảo quản ở nhiệt độ khoảng 2-8°C.
2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vi sinh vật [4]
❖ Chuẩn bị mơi trường pha lỗng và mơi trường đếm xác định số lượng VSV
Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS thạch (nêu ở
mục 2.1.3). Hòa tan các thành phần tan trong nước, chuyển dung dịch trên vào bình nón
thích hợp, phân tán thạch vào dung dịch. Đậy kín bằng nút bơng. Hấp tiệt khuẩn ở 115°C
trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình đựng mơi trường ra khỏi nồi hấp, phân
phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày
lớp thạch trên các đĩa khoảng 2 mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng. Chờ cho thạch
nguội và đơng rắn lại, đậy kín.
Chuẩn bị các ống nghiệm sạch mỗi ống chứa 9 ml nước cất, đậy kín, hấp tiệt khuẩn
ở 115°C trong 20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37-40°C.
❖ Phương pháp cấy đếm xác định số lượng VSV
Hút chính xác 1,00 ml dịch chứa tế bào VSV cần xác định số lượng vào ống nghiệm
thứ nhất chứa 9 ml nước cất đã chuẩn bị ở trên, lắc đều. Sau đó lại hút 1,00 ml dịch đã
đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ 2, lắc đều. Tiếp
tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ cuối cùng. Hút 0,2 ml dịch ở mỗi ống nghiệm
của 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, cấy lên bề mặt đĩa thạch đã được chuẩn bị, mỗi nồng
độ cấy trên 2 đĩa. Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 37°C. Sau 48 giờ, đếm số khuẩn lạc
mọc trong mỗi đĩa petri và lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc mọc trong các đĩa có cùng
nồng độ pha lỗng. Mỗi tế bào VSV được ni cấy trên đĩa thạch sẽ phát triển thành
một khuẩn lạc. Do đó, dựa vào kết quả xác định số lượng khuẩn lạc, ta có thể tính được
số lượng VSV có trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu theo công thức sau:
An10n+ An+110n+1+ An+210n+2
X=
3mV
Trong đó:
X: số VSV có trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu (CFU/g hoặc CFU/ml)

An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa cấy ở nồng độ pha lỗng 10n
m: khối lượng mẫu cân để xác định số lượng VSV (g)
V: thể tích dịch cấy trải lên mỗi đĩa petri (ml)
15


2.3.6. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật vi nang đông khô [12]
Cân 0,2 g vi nang rồi chuyển vào 20 ml dung dịch natri citrat 2%. Khuấy từ với
tốc độ khoảng 400 - 500 vòng/phút đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất.
Hút chính xác 1,00 ml dịch trên tiến hành pha lỗng, ni cấy để xác định số lượng VSV
sống sót theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5.
2.3.7. Phương pháp đánh giá độ rã của vi nang trong môi trường dịch tiêu hố mơ
phỏng
Hiện chưa có chun luận chính thức đánh giá độ rã của vi nang. Qua tham khảo
một số nghiên cứu [26], [82], [72] kết hợp đặc điểm của sinh lý đường tiêu hoá, và điều
kiện thực nghiệm cho phép ở bộ môn, đề tài lựa chọn điều kiện thử với các thông số cố
định như sau:
❖ Chuẩn bị:
Các môi trường: dịch dạ dày mô phỏng; dịch ruột mô phỏng; dịch đại tràng mô
phỏng pha theo công thức nêu ở mục 2.1.4.
❖ Tiến hành:
Ủ vi nang đông khô lần lượt qua môi trường dạ dày mô phỏng 2 giờ; dịch ruột mô
phỏng 4 giờ và đại tràng mô phỏng 3 giờ trong máy lắc quay tròn nhiệt độ 37°C, tốc độ
75 vòng/phút [7], [10]. Sau thời gian ủ ở từng môi trường, dùng lưới vớt hạt tách vi nang
ra khỏi dịch. Quan sát, nhận xét hình thái, cấu trúc, độ trương nở, độ rã của vi nang và
sự thay đổi dịch ủ.
2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật trong môi trường dạ dày
mô phỏng và dịch ruột mô phỏng [12]
Xác định lượng vi sinh vật sống sót trong vi nang sau khi ủ trong mơi trường dịch
tiêu hố mơ phỏng.

Chuẩn bị:
Mơi trường dạ dày mơ phỏng; môi trường dịch ruột mô phỏng pha theo công thức
nêu ở mục 2.1.4 hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, để nguội về nhiệt độ 37-40°C.
Tiến hành:
Ủ 0,2 g vi nang đông khô lần lượt qua từng 20 ml mơi trường dịch tiêu hố mơ
phỏng trong máy lắc ở 37°C, tốc độ 75 vòng/phút.
Sau thời gian ủ lần lượt ở từng môi trường dùng lưới vớt hạt, tách vi nang ra khỏi
dịch. Rửa vi nang 2 lần bằng nước cất tiệt khuẩn rồi chuyển vào 20 ml dung dịch natri
citrat 2% đã hấp tiệt khuẩn, để nguội. Khuấy từ với tốc độ khoảng 400 - 500 vòng/phút
đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất. Hút chính xác 1,00 ml dịch trên tiến
hành pha lỗng, ni cấy để xác định số lượng VSV sống sót trong vi nang theo phương
pháp nêu ở mục 2.3.5.
16


2.3.9. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng vi sinh vật trong môi trường đại
tràng mô phỏng
Xác định số lượng VSV giải phóng ra khỏi mơi trường đại tràng mô phỏng.
Chuẩn bị:
Môi trường dạ dày mô phỏng; dịch ruột mô phỏng; đại tràng mô phỏng pha theo
mục 2.1.4 hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, để nguội về nhiệt độ 37-40°C.
Tiến hành:
Ủ 0,2 g vi nang đông khô lần lượt đi qua từng 20 ml môi trường dịch tiêu hố mơ
phỏng trong máy lắc ở 37°C, tốc độ 75 vịng/phút.
Vi nang sau khi ủ 2 giờ trong mơi trường dạ dày mô phỏng và 4 giờ trong dịch ruột
mô phỏng được chuyển vào 20 ml môi trường đại tràng mơ phỏng tiếp tục lắc với tốc
độ 75 vịng/phút nhiệt độ 37°C trong 3 giờ. Sau mỗi giờ trong mơi trường đại tràng mơ
phỏng hút chính xác 1,00 ml dịch tiến hành pha lỗng, ni cấy để xác định số lượng
VSV sống sót giải phóng ra mơi trường đại tràng theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5.
2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Các kết quả
nghiên cứu được xử lý và biểu thị trong khóa luận dưới dạng: giá trị Log trung bình, độ
lệch chuẩn, n là số lần lặp lại thí nghiệm.

17